JPH0832244B2 - ヘテロポリマ−系蛋白質 - Google Patents

ヘテロポリマ−系蛋白質

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JPH0832244B2
JPH0832244B2 JP59504232A JP50423284A JPH0832244B2 JP H0832244 B2 JPH0832244 B2 JP H0832244B2 JP 59504232 A JP59504232 A JP 59504232A JP 50423284 A JP50423284 A JP 50423284A JP H0832244 B2 JPH0832244 B2 JP H0832244B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は組換えDNA技術を用いてヘテロポリマータン
パク質を生産することに関する。
組換えDNA技術によつて、各種のポリペプチド鎖が細
菌、酵母および培養哺乳動物細胞のような宿主細胞内で
発現されてきた。J.C.フイツデス（Fiddes）およびH.M.
グツドマン（Goodman）のネイチヤー（Nature）第281
巻,351〜356頁（1979年）およびJ.C.フイツデスおよび
H.M.グツドマンのネイチヤー第286巻,684〜687頁（1980
年）はヒト絨毛膜生殖腺刺激ホルモン（hCG）のαおよ
びβサブユニツトのそれぞれのクローニングについて述
べている。
カナメ（Kaname）の米国特許第4383036号はhCGの生産
方法を開示しており、この方法はヒトリンバ芽球細胞を
実験動物に移植し、その実験動物から前記細胞を採取し
てインビトロで培養し、この培養物から蓄積したhCGを
得るものである。
発明の要約 一般に、本発明は１つの観点によれば複数のサブユニ
ツトから構成される生物学的に活性なヘテロポリマータ
ンパク質を提供し、各サブユニツトはそのサブユニツト
をコードする異種DNAを含むところの自律的に複製する
（すなわち、宿主細胞の染色体に組込まれていない）発
現ベクターを有する細胞により合成される。
好適な実施態様では、真核細胞を用いてタンパク質を
合成し、このタンパク質が翻訳後に、最適にはグリコシ
ル化によつて、修飾される。このタンパク質はホルモ
ン、最適にはhCG、黄体形成ホルモン（LH）または卵胞
刺激ホルモン（FSH）などの性ホルモンもしくは甲状腺
刺激ホルモン（TSH）のような分泌タンパク質である。
他の観点によれば、本発明は第１の発現ベクターを含
む細胞を提供し、この細胞がそのベクターによつて少な
くとも部分的にコードされる生物学的に活性なヘテロポ
リマータンパク質を生産することができる。好適な実施
態様では、第２の自律的に複製する発現ベクターがその
タンパク質の第２部分をコードするか、あるいは単一の
発現ベクターがそのタンパク質の少なくとも２つのサブ
ユニツトをコードする。タンパク質はhCGまたはヒト黄
体形成ホルモン（LH）であり、ベクターは複製ウイルス
またはプラスミドであり、細胞はサルまたはマウスの細
胞である。hCGまたはLHの異なるサブユニツトの転写がS
V40後期プロモーターの支配下にある。または、タンパ
ク質のαサブユニツトの転写がSV40初期プロモーターの
支配下にありかつβサブユニツトの転写かマウスメタロ
チオネインプロモーターの支配下にあるか、あるいは両
方のサブユニツトの転写がマウスメタロチオネインプロ
モーターの支配下にある。そしてこのマウスメタロチオ
ネインプロモーターを含む発現ベクターがウシ乳頭腫ウ
イルス（BPV）ゲノムの少なくとも69％の形質転換領域
を含む。
また別の観点によれば、本発明は２つの異なる異種タ
ンパク質をコードする２つの遺伝子を含む自律的に複製
する発現ベクターを提供し、これらの遺伝子は２つの異
なるプロモーター（最適には、メタロチオネインプロモ
ーターおよびBPVプロモーター）の支配下にあり、別々
のプロモーターを使用することにより有害な組換えの可
能性が都合よく最小限に抑えられる。
本明細書で用いる“サブユニツト”という用語はタン
パク質の一部分を意味し、この部分またはその同族体も
しくは類似体が本来別個のmRNAによつてコードされるも
のである。従つて、例えばIgG免疫グロブリンの重鎖お
よび軽鎖はそれぞれサブユニツトであると考えられる。
一方、インシユリンは２つのペプチド鎖で構成される
が、これらのペプチド鎖は本来１つのmRNAによつてコー
ドされ、翻訳後に自然に開裂されて２つのペプチド鎖と
なるので、サブユニツトであるとは考えない。
“発現ベクター”という用語は、宿主細胞内での発現
を可能にするところの調節配列の支配下にある異種DNA
（ベクターに対して異種のDNA）を含むクローニングベ
クターを意味する。この種のベクターには複製ウイル
ス、プラスミドおよびフアージが含まれる。
本発明は形質転換細胞の単一培養による生物学的に活
性なヘテロポリマータンパク質の生産を可能にする。同
一細胞内でヘテロポリマータンパク質の両サブユニツト
が生産されることにより、別々の培養からのサブユニツ
トを再結合させて活性なヘテロポリマー分子を構成する
必要がない。この方法はまたタンパク質の活性または安
定性のために必要な翻訳後修飾（例えば、タンパク質の
グリコシル化および加水分解処理）を単一培養中に受け
るところのタンパク質の生産を可能にする。
自律的に複製する発現ベクターの使用は、宿主染色体
の調節配列による望ましくない影響が意図するコーデイ
ング領域へ及ばないようにする。
本発明の他の利点および特徴は次の好適な実施態様の
説明ならびに請求の範囲から明らかになるであろう。
好適な実施態様の説明 今や、本発明の好適な実施態様について説明するが、
最初にその図面について簡単に説明する。
図面 第１図はαhCG cDNAクローン、SV40ウイルスDNAの一
部およびプラスミドpBR322の塩基配列を含むプラスミド
ｐαSVHVP1の作製を示す図面である。
第２図はβhCG cDNAクローン、SV40DNAの領域およびp
BR322の一部（宿主大腸菌に対してアンピシリン耐性を
付与する領域を含む）を組込んだプラスミドｐβSVVP1
の作製を示す図面である。
第３図はSV40DNAにαおよびβhCG cDNAクローンを挿
入したプラスミドｐαβSVVP1の作製を示す。
第４図はプラスミドpRF375およびpRF398の作製を示
す。
第５図はプラスミドRF398αt2の作製を示す。
第６図はβhCG cDNAクローン内の88bpプローブの位置
を示す。
第７図はβLHの制限酵素地図、および第８図のプラス
ミドの作製において使用する断片を示す。
第８図は完全な成熟βLH cDNAクローンを含むプラス
ミドLH520H/Bの作製を示す。
第９図はウイルスベクターｐαLHSVVP1の作製を示
す。
第10図はLHのβサブユニツトをコードするBPV含有プ
ラスミドpCL28XhoLHBPVの作製を示す。
構造 本発明のクローニングベクターは前述の発明の要約の
ところで説明した一般構造を有している。好適なベクタ
ーは図面に示す構造のものであり、以下に詳しく説明す
る。
クローニングベクターの作製 hCGのαおよびβサブユニツトをコードするcDNA クローンの分離 本明細書において使用する技術は全てマニエテイス
（Maniatis）らのモレキユラークローニング：実験手引
書（Molecular Cloning:ALaboratory Manual）、コール
ド・スプリング・ハーバー研究所（1982年）に詳細に記
載されており、上記文献は参照することによりここに引
用される。
胎盤組織から次の方法を用いてRNAを抽出する。フエ
ノール:1mM EDTA含有100mM酢酸Na（pH5.5）の1:1混合物
中で上記組織をホモジナイズし、20分間60℃に加温す
る。氷上で10分間冷却した後、遠心分離にかけて相を分
離する。加温したフエノールで２回以上抽出を繰り返
し、続いてクロロホルムで２回抽出する。
2.5容量のエタノールを添加することにより最後の水
相からRNAが沈殿する。
ポリA+mRNAを分離するために、胎盤RNAを10mMトリス
−HCl緩衝液（pH7.5）−0.5MNaCl中のオリゴ（dT）−セ
ルロースカラムに通じ、同じ溶液で洗つた。ポリA+mRNA
は10mMトリス−HCl（pH7.5）、1mMEDTA、0.05％SDSで溶
出し、エタノールで２回沈殿させた。初期収量は組織1g
当たり全RNA1.5〜20mgであり、このうちの約２％がポリ
A+mRNAである。
胎盤cDNAライブラリーは胎盤mRNAの逆転写、大腸菌DN
AポリメラーゼＩ（大型断片）を用いる第２鎖の合成、S
1ヌクレアーゼによる処理、および末端デオ、シヌクレ
オチジル転移酵素によるホモポリマー（dC）の末端付加
（tailing）を行うことによつて作製される。これらの
方法は全て慣用技術によつて行われる。
一般的な製造例では、mRNAの１本鎖（ss）cDNAへの転
化20〜30％、第２鎖合成後のS1ヌクレアーゼ消化に対す
る耐性70％、および長さが10〜25個の塩基からなるdC
“テイル”が得られる。次に、これのcDNA分子をプラス
ミドpBR322のDNA断片（プラスミドpBR322をPstIで消化
し、これにdG“テイル”を付加したもの）とアニールす
る。その後これらの組換えプラスミドを用いて大腸菌細
胞を形質転換し、cDNAライブラリーを作る（テトラサイ
クリン耐性に基づいて形質転換細胞を選択する）。
ヒトαhCGクローンを同定するために、ハイブリダイ
ゼーシヨン用プローブとしてマウスα甲状腺刺激ホルモ
ン（TSH）クローンの219bp断片を使用する。このプロー
ブはその塩基配列の77％がヒトクローンと相同である。
このプローブをニツクトランスレーシヨン（nick trans
lation）によつて放射能でラベルし、相同の程度を考慮
する条件下にcDNAライブラリーとハイブリダイズさせ
る。強くハイブリダイズするクローンを制限酵素マツピ
ングによつて分析し、αhCGの完全なコーデイング配列
を含むクローンがDNAの塩基配列決定により証明され
る。
プラスミドｐαSVHVP1の作製 第１図に示すように、プラスミドα970H/Bを作製する
ためにαhCG断片を含むcDNAクローンをNcoIで消化す
る。このNcoI部位（翻訳開始の信号を発するATGコドン
のちようど５′側）を修復して合成Hind IIIリンカーへ
結合させる。同様に、このクローン３′非翻訳領域内の
天然Hind III部位を切断し、大腸菌DNAポリメラーゼク
レノウ（Klenow）で修復し、その後合成BamHIリンカー
へ結合させる。この断片をプラスミドpBR322のHind III
部位とBamHI部位との間でクローン化してプラスミドα5
74H/Bを作製する。このプラスミドはBamHIで消化し、ア
ルカリ性ホスフアターゼで処理し、その後ポリアクリル
アミドゲルにより分離したSV40DNAの396bpSau3A断片
（0.07〜0.14図単位）へ結合させる。この結合混成物を
用いて大腸菌をアンピシリン耐性へと形質転換し、これ
らの形質転換体から目的のプラスミドα970H/Bを同定す
る。
プラスミドQ2７はSV40をそのHpaII部位で切断し、S1
ヌクレアーゼで消化することにより平滑末端を作り、Ec
oRIリンカーへ結合させ、EcoRIで消化し、得られた1436
bpの断片をpBR322のEcoRI部位内でクローン化すること
により作製される。
第１図に示すように、Q2７はEcoRIで完全消化しかつH
indIIIで部分消化し、0.72〜0.94図単位の断片を分離し
てα970H/B（EcoRIおよびHindIIIで消化してアルカリ性
ホスフアターゼで処理したもの）内でクローン化する。
この結合混成物を用いて大腸菌を形質転換し、制限酵素
マツピングによりこれらの形質転換体から目的のプラス
ミドｐαSVLを固定する。
ｐαSVLをEcoRIで消化し、０〜0.72図単位のSV40断片
（SV40複製開始点および完全な初期領域を含み、その両
末端がEcoRI末端であるもの）へ結合させてプラスミド
ｐαSVHVP1を作製し、これを大腸菌の形質転換体から分
離する。
プラスミドｐβSVVP1の作製 ニユーヨーク州コールドスプリングハーバーにあるコ
ールドスプリングハーバー研究所のジヨンC.フイツデス
（John C.Fiddes）からβhCGをコードする579bpのcDNA
クローンを入手した〔フイツデスらのネイチヤー第286
巻,684〜687頁（1980年）を参照〕。この断片の各末端
は合成BamHIリンカーへ結合させる。これをHgaI制限酵
素で消化した後両末端をクレノウDNAポリメラーゼで修
復し、EcoRI部位が信号ペプチドコーデイング配列のATG
コドンに対して約10bp5′と側となるように合成EcoRIリ
ンカーへ結合させる。BamHI部位は該コーデイング配列
の末端をマークするナンセンスコドン（終止コドン）に
対して約60bp3′側にある。第２図に示すように、この5
66bpのEcoRI−BamHI断片を分離し、pBR322のEcoRI部位
とBamHI部位との間でクローン化してプラスミドｐβ556
R/Bを得る。
プラスミドpSVHR（第２図）を作製するために、SV40D
NAをHindIIIで部分消化して線状分子となし、これをS1
ヌクレアーゼで消化して平滑末端を作り、合成EcoRIリ
ンカーへ結合させ、そしてEcoRIおよびBamHIで消化す
る。SV40複製開始点および初期領域を含む0.94〜0.14図
単位のこの断片はEcoRI−BamHI断片としてのpBR322内で
クローン化する。
さらに、第２図に示すように、EcoRIメチラーゼによ
つて触媒される反応でプラスミドｐβ556R/BのEcoRI部
位をメチル化し、その後このプラスミドをNdeIで切断す
る。S1ヌクレアーゼ処理したNdeI平滑末端はEcoRIリン
カーへ結合させ、EcoRIでの消化により活性化し、その
後BamHIで消化する。
EcoR
I部位からBamHI部位までのpSVHRのSV40断片を分離し、
ｐβ556R/Bの消化断片を含む反応混合物中で結合させ
る。結合の後、この混成物をSalIで消化して、pBP322の
EcoRI（NdeI）からBamHIまでの断片を再び組込んだプラ
スミドを除く。この消化結合混成物を用いて大腸菌を形
質転換し、ｐβSVVP1を同定し、分離する。
プラスミドｐαβSVVP1の作製 第３図に示すように、pBR322/KpnはpBR322をEcoRIで
消化し次にS1ヌクレアーゼで消化することによつてその
唯一のEcoRI部位を欠失させ、その後この部位にKpnIリ
ンカーを挿入することによつてpBR322から誘導される。
さらに、第３図に示すようにSV40DNAをAvaIIで消化す
る。得られた断片の接着末端をクレノウDNAポリメラー
ゼで修復して平滑末端を形成し、その後この混合物はポ
リアクリルアミドゲルで分画化する。このゲルから複製
開始点および唯一のKpnI部位を含む0.64〜0.77図単位の
682bp断片を分離し、合成HindIIIリンカーへ結合させ、
そしてHindIIIおよびKpnIで消化する。
得られた断片はpBR322/Kpnへ結合させる。266bpのKpn
I−HindIII断片（SV40後期プロモーターを含む）を組込
んだp266を分離する。p266はHindIIIおよびBamHIで切断
し、細菌のアルカリ性ホスフアターゼで処理する。
さらに第３図に示すように、ｐβSVVP1/Bを次のよう
にして作製する:pβSVVP1（第２図）をEcoRIで切断し、
続いて結合させてpBR322配列を除く。その後このDNAをB
amHIで切断し、pBR322のBamHI部位内でクローン化す
る。
次いで、得られたプラスミドｐβSVVP1/BをHindIIIと
BamHIとで消化し、1003塩基対のHindIII−BamHI断片をp
266へ結合させてプラスミドｐβVP1266を得る。このプ
ラスミドにおいてβhCG cDNAは、そのRNA転写物があた
かもウイルスVP1転写物であるかのようにそれがスプラ
イシング（splicing）される状態で、SV40後期プロモー
ターから下流に位置する。
αhCG cDNAはHindIII断片としてのｐβVP1266（その
HindIII部位を切断し、細菌のアルカリ性ホスフアター
ゼで処理したもの）内に挿入する。この結合から誘導さ
れた大腸菌形質転換体を制限酵素マツピングによつてス
クリーニングし、目的の構造を有するプラスミドを分離
する。このプラスミドでは正しい方向でαhCG cDNAがV
P2と入れ替わり、その下流にβhCG cDNAが続き、これ
はVP1と入れ替わつた。
このようにして分離したプラスミドの１つであるｐα
βVP1を使用してｐαβSVVP1の作製を完成させる。この
プラスミドをKpnIで切断し、KpnIで切断した全SV40ゲノ
ムをこの部位へ結合させることにより挿入する。大腸菌
の形質転換後に目的の構造を有するプラスミドｐαβSV
VP1を単離する。このプラスミドはhCGのαおよびβサブ
ユニツトの両方をコードするDNAを含み、従つて宿主哺
乳動物細胞内で両サブユニツトを発現することができ、
こうして生物学的に機能性のグリコシル化ヘテロダイマ
ーhCGが生産される（グリコシル化は翻訳後に起こ
る）。
プラスミドpRF375およびpRF398の作製 第４図に示すように、ネズミメタロチオネインプロモ
ーター、SV40DNAおよびpBR322配列を含むプラスミドCL2
8〔プラスミドJYMMT（Ｅ）と同一；ハマー（Hamer）ら
のJ.Mol.Applied Gen.1,273〜288（1983）を参照〕を制
限エンドヌクレアーゼBglIIで切断する。この部位にαh
CGまたはβhCGのいずれかのcDNAクローン（それらの
５′末端に約10および30bpの非翻訳領域、ならびにそれ
らの３′末端に約220および60bpの非翻訳領域を含む）
を挿入する。これらのクローンは末端に合成BamHIリン
カーを付加することにより遺伝子操作されたものであ
る。
得られたプラスミドpRF302（α）またはpRF394（β）
は制限酵素BamHIおよびSalIで消化してSV40DNA配列を除
く。
全BPVゲノムおよびpBR322配列の一部を含むプラスミ
ドpB2−２をBamHIおよびSalIで消化してBamHI/SalI末端
をもつBPVゲノムを得る。この断片はメタロチオネイン
−hCG配列を含むpRF302（α）およびpRF394（β）へ結
合させる。
大腸菌の形質転換後にプラスミドpRF375およびpRF398
を同定して分離する。これらはマウスメタロチオネイン
プロモーターの支配下にあるαhCGまたβhCGをコードす
る。
プラスミドRF398αt2の作製 第５図に示すように、プラスミドｐαt2はαhCG574Hi
ndIII断片をプラスミドpVBt2内でクローニングすること
により誘導される〔V.B.レデイー（Reddy）らのPNAS79,
2064〜2067（1982）を参照〕。SV40初期プロモーターの
支配下にあるαhCG cDNAを含むｐαt2はEcoRIで消化す
る。５′側の突き出た一本鎖部分はS1ヌクレアーゼ消化
によつて除き、その後平滑末端結合により合成BamHIリ
ンカーを付加する。
プラスミドRF398（第４図）はBamHIで消化して細胞フ
ルカリ性ホスフアターゼで処理する。ｐαt2の1735bpBa
HI断片をRF398内に挿入する。大腸菌の形質転換体から
プラスミドRF398αt2を分離する。こうして、このプラ
スミドはマウスメタロチオネインプロモーターの支配下
にある転写単位内にβhCG cDNAを、そしてSV40初期プ
ロモーターによつて支配される転写単位内にαhCG cDN
Aを有する。
黄体形成ホルモン（LH）cDNAクローンの発現 ヒト下無体cDNAライブラリーの作製 4Mチオシアン酸グアニジン、1M2−メルカプトエタノ
ール、0.05M酢酸Na（pH5.0）および0.001MEDTAを含む溶
液20ml中で凍結下垂体５〜10gをホモジナイズすること
により、ヒト下垂体からRNAを調整する。ホモジネート1
ml当たりCaC1gを加え、この懸濁液を2000rpmで15分間
遠心分離にかける。上清はCsCl溶液〔最終容量35ml中に
1M酢酸Na（pH5）1.25ml、0.4MEDTA62.5μｌおよびCsCl3
9.8gを含有する〕の15mlクツシヨン上に注意しながらの
せて層状となし、ベツクマン超遠心分離器のTi70ロータ
ーを用いて20℃、45000rpmで18〜24時間遠心する。この
密度勺配中に薄膜として肉眼視できるRNAを注射器で取
り出し、希釈し、２容量のエタノールを加えることによ
り沈殿させる。溶解および再沈殿を３回繰り返した後、
RNA沈殿物をH2Oに溶解し、濃度原液を加えることにより
0.01MトリスーHCl（pH7.5）および0.5MNaClとなるよう
に調整する。その後、胎盤RNAの場合に述べたようにオ
リゴdT−セルロースカラムを２回通過させることによ
り、この調整物からポリA+mRNAを分離する。
ヒト下垂体cDNAライブラリーは胎盤ポリA+mRNAについて
先に述べたごとく下垂体ポリA+mRNAから作製されるが、
この場合は第２鎖cDNA合成のために、大腸菌DNAポリメ
ラーゼＩ（大型断片）とトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写
酵素の両方を順次使用する。最初クレノウ（Klenow）か
用いられる。フエノール抽出によつて反応を停止させ
る。遠心分離した抽出物の水相をバイオゲルＡ−5mの5m
lカラムに加える。高分子量の物質を含む画分をプール
し、濃縮し、２容量のエタノールで沈殿させ、乾燥し、
そして逆転写のために100mMトリスーHCl（pH8.3）、10m
MMgCl2、140mMKCl、20mM2−メルカプトエタノール、４
種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフエート各々1m
Mを含む溶液に溶解する。逆転写酵素はcDNA1μｇ当たり
約20単位加える。その後２本鎖cDNAはS1ヌクレアーゼで
処理し、ホモポリマーの末端付加を行い、そして先に述
べたごとくクローン化する。
βLHcDNAクローンの単離 25μg/mlのテトラサイクリンを含む栄養寒天板上に増
殖させたコロニー（細胞集団）はニトロセルロースフイ
ルターへ移す。0.5MNaOHで処理することによりコロニー
をその場で溶解し、そして1.5MNaClを含む0.5Mトリスー
HCl（pH7.4）で中和する。遊離したDNAを真空オーブン
中80℃で２時間ベーキングすることによりフイルターに
固定する。このフイルターは成熟hCGβ鎖の16から45ま
でのアミノ酸（この部分は30個のアミノ酸のうちβLHポ
リペプチドのこの領域と共通のアミノ酸を29個有する）
に対応するβhCGクローンの32Pでラベルした88bp断片と
のハイブリダイゼーシヨンによつてスクリーニングする
（第６図参照）。ハイブリダイゼーシヨンは50％ホルム
アミド、0.75MNaCl、0.075Mクエン酸Na（pH7.0）、2.5
％デキストランサルフエート、0.1％ポリビニルピロリ
ドン、0.1mg/mlウシ血清アルブミン、および少なくとも
105cpm/フイルターの32Pでラベルした88bpβhCG断片を
含む溶液中32℃で一晩実施する。オートラジオグラフイ
ーを行う前に、フイルターを37℃において0.15MNaCl、
0.015Mクエン酸Naで数回洗う。陽性の単離クローンのう
ちの１つであるLH12（第７図）をこの後使用する。LH12
は長さが365bpであり、プレβ信号配列の15個のアミノ
酸および成熟βLHポリペプチドの105個のアミノ酸をコ
ードする塩基配列を含んでいる。このヌクレオチドの塩
基配列を決定する。LH12は完全な成熟βLHをコードしな
いので、32Pでラベルしたハイブリダイゼーシヨンプロ
ーブとしてLH12の240bpNcoI−PvuII断片（第７図）を用
いて、ヒト下垂体cDNAライブラリーの以後のスクリーニ
ングを行う。このスクリーニングによつてクローンLH6
（第７図）を単離する。LH6はmRNAの非翻訳部分からmRN
AのポリＡ“テイル”の27個のＡ残基までに対応する領
域を含むのでβLHの完全な３′末端を有する。５′方向
へLH12を越えて伸びるクローンは１つも見出されない。
組合せた完全な成熟βLHコーデイング領域のDNA塩基配
列の決定は、文献に発表されたβLHのアミノ酸配列デー
タとはそのアミノ酸配列が２つの点で相違することを示
している：すなわち42位はメチオニンであり、55位はバ
リンである。また、成熟βLHはcDNAの塩基配列に基づく
と121個のアミノ酸を含む。 完全な信号ペプチドコー
デイング配列と完全な成熟βLH配列を含むクローンは、
第７図に示す制御酵素断片を使つて、第８図のようにし
て作製される。プラスミドβ579Hから104bpのEcoRI−Dd
eI断片を分離し、LH12プラスミドから分離した181bpのD
deI断片（その後PstIで消化したもの）へ結合させる。1
5℃で一晩結合させた後、この結合混成物をEcoRIおよび
PstIで消化し、７％ポリアクリルアミドゲルで分画化
し、ゲルから目的の256bp断片を分離する。この断片は2
0個のアミノ酸からなる信号ペプチドのコーデイング配
列を与えるようにβhCG信号配列とプレβLHの信号配列
とを融合させたものである。
256bpのEcoRI−PstI断片は、EcoRIおよびPstIで消化
したpBR322内でクローン化してプラスミドLHβ260を得
る。第８図に示す146bpのEcoRI−NcoI断片をポリアクリ
ルアミドゲルから分離し、これは以下に述べるようなプ
ラスミド作製の際にあとで使用する LH6プラスミド（第８図）をSau3aで消化し、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動によつて390bp断片を分離す
る。次にこの断片はHincIIで消化し、BamHIリンカー結
合させ、BamHIで消化し、そしてプラスミドpAPP内のBam
HI部位でクローン化する。pAPPはpBR322をAvaIで消化
し、５′末端側の突き出た部分をdNTPおよび大腸菌の大
型断片DNAポリメラーゼＩを用いて修復し、PvuIIで消化
し、そしてこのプラスミドを閉環してPvuII切断部位を
除くことによりpBR322から誘導される。pAPPのBamHI部
位へ340bpのBamHI断片を結合させることにより分離した
プラスミドLH6BをEcoRIおよびPvuIIで消化し、細菌アル
カリ性ホスフアターゼで処理する。この断片は先に述べ
たLHβ260の146bpEcoRI−NcoI断片および第８図に示す
プラスミドLH12から分離した241bpNcoI−PvuII断片の混
合物へ結合させる。この結合混合物はアンピシリン耐性
へと大腸菌を形質転換するのに用いる。形質転換体から
プラスミドLH520H/Bを分離する。LH520H/Bはハイブリツ
ド信号ペプチド配列をもつ完全なβLHコーデイング配列
を含んでいる。
ｐαLHSVVP1の作製 先に述べたプレαおよびプレβhCGクローンに対して
行つたようにして、SV40を基礎とするベクター内でこの
プレβLHクローンを発現させるために、プレβコーデイ
ング配列のATGコドンに非常に接近してEcoRI切断部位を
配置することが望ましい。このことは、LH520H/BをHgaI
で消化し、５′末端側の突出部分を修復し、合成EcoRI
リンカーへ結合させ、EcoRIおよびBamHIで消化し、そし
て分離した496bpのEcoRI−BamHI断片をEcoRIおよびBamH
Iで消化しかつ細菌アルカリ性ホスフアターゼで処理し
たpBR322内でクローン化することにより達成される。こ
の結合混成物を用いて形質転換させた大腸菌からプラス
ミドPLH496R/Bを分離し、このプラスミドは発現しよう
とする496bp断片の出所源として使用する。
プラスミドｐαβVP1（このプラスミドの作製およびh
CGの両サブユニツトを発現させる際のこのプラスミドの
使用については既に述べており、第３図を参照された
い）はEcoRIおよびBamHIで消化し、これらの両酵素で消
化したプラスミドPLH496R/Bを含む反応混合物中で結合
させる（第９図参照）。大腸菌の形質転換体からプラス
ミドｐαLHVP1を同定する。第９図に示すように、ｐαS
VHVP1（第１図）から完全なSV40ウイルス初期領域をと
り出し、そしてこの領域をKpmIおよびSalIで消化したｐ
αLHVP1内にKpnI−SalI断片として結合されることによ
り挿入してプラスミドｐαLHSVVP1を得る。このプラス
ミドをBamHIで切断して再結合させることにより、ウイ
ルスαLHSVVP1が形成される。このウイルスはSV40後期
プロモーターの支配下にある特異なβLHサブユニツトお
よび共通（LH,hCG,FSHおよびTSHに共通）のαサブユニ
ツトのためのクローン化cDNAを含んでいる。これらのク
ローン化cDNAは、共通のα挿入物がウイルスVP1タンパ
ク質コーデイング配列と入れ替わりかつβLH挿入物がウ
イルスVP2コーデイング配列と入れ替わるような状態で
位置づけられる。
BPVを基礎とする発現系へのβLHcDNA（信号ペプチドの
βhCG5′末端を含む）の挿入 LH520H/B（第８図）をHindIIIおよびBamHIで消化し、
大腸菌DNAポリメラーゼ（クレノウ）で処理し、合成Sal
Iリンカーへ結合させ、SalIで消化し、そしてpBR322のS
alI部位内でクローン化する。得られたプラスミドLH530
Salは第10図に示すプラスミドCL28のマウスメタロチオ
ネイン遺伝子内に挿入するためのLHcDNAクローンの出所
源として使用する。
CL28はBglIIで切断し、S1ヌクレアーゼで処理し、Xho
Iリンカーへ結合させる。XhoIでの消化、結合およびBgl
IIでの消化後にこの反応混合物を用いて大腸菌を形質転
換させ、プラスミドCL28Xhoを得る。このプラスミドはB
amHIおよびSalIで消化し、プラスミドpB2−２（第４
図）のBamHI＋SalI消化物へ結合させてプラスミドCL28X
hoBPVを得る。後者のLH挿入物は次にSalI断片としてCL2
8XhoBPVのXhoI部位内へ結合させる。なぜなら、SalI消
化物の５′突出部分がXhoI消化物のそれに相補的である
からである。XhoIで消化してバツクグラウンドを除いた
後、大腸菌を形質転換させ、そしてBPVを基礎とするプ
ラスミド内にマウスメタロチオネインプロモーターの支
配下にある（ハイブリツド）プレβLH挿入物を含む目的
のプラスミドpCL28XhoLHBPVを分離する。
宿主サル細胞のトランスフエクシヨンおよび感染 ヘテロポリマータンパク質生産用の真核細胞内へのウ
イルス含有ベクターの組込みは一般に次のようにして達
成される。最初に、ウイルスDNAおよびホモポリマータ
ンパク質をコードするDNAが例えば大腸菌内に保持され
るプラスミド内に組込まれる場合、そのプラスミド配列
（例えばpBR322配列）を除き、得られたDNAを結合させ
てウイルス領域およびヘテロポリマータンパク質をコー
ドする塩基配列１つまたはそれ以上を含む環状DNAを形
成する。この環状DNAは一般に複製ウイルスを生じるの
に必要な全ての遺伝情報を含むとは限らず、他の必要な
塩基配列（例えば、ウイルス外殻のタンパク質をコード
する配列）がヘテロポリマータンパク質をコードする塩
基配列の１つまたはそれ以上によつて置換される。プラ
スミドDNAを欠いた環状DNAは、そのDNAが適当な宿主哺
乳動物細胞内に入つて複製することができるように、そ
れが誘導されるところの自然界に存在するウイルスDNA
に類似した大きさでなければならない。
この環状DNAはその後の感染に使用するウイルス株を
つくるために宿主細胞をトランスフエクシヨンするのに
用いる。ウイルスを形成するのに必要なDNAが一部失わ
れているので、複製ウイルスを生ずるためにはその欠損
機能を十分コードするヘルパーウイルスDNAの助けをか
りてトランスフエクシヨンを行わなければならない。
トランスフエクトされた宿主細胞はそれが複製ウイル
スによつて溶解されるまで増殖を続け、インキユベート
される。得られた複製ウイルス株（ヘルパーウイルスを
含む）は次にヘテロポリマータンパク質生産用の宿主細
胞を感染させるのに使用する。一般に、感染したタンパ
ク質生産用宿主細胞は最後にはウイルスによつて溶解さ
れるので、宿主細胞の新しいバツチ分を感染させるため
にウイルスを再び利用する必要があり、その故にこのウ
イルス株は保持される。
先に述べた特定の組換えDNA配列は次のようにして宿
主細胞をトランスフエクトし、その後感染させるのに使
用される。
上記のSV40含有プラスミドからpBR322配列を除いてト
ランスフエクシヨン用ウイルスDNAをつくる。ｐαSVHVP
1およびｐαBSVVP1の場合に、これはBamHIで消化後断片
の環化を助ける条件下で結合させてαSVHVP1およびαβ
SVVP1を（他の生産物の中から）得ることにより達成さ
れる。ｐβSVVP1の場合には、EcoRIでの消化およびその
後の再結合により、pBR322配列が除かれβSVVP1が形成
されるのと同時にSV40後期プロモーターおよびVP1スプ
ライス領域がβhCG cDNA挿入物と平置される。同時に、
ptsA58Bam（pBR322のBamHI部位内でクローン化したtsA5
8SV40ウイルスDNA）はBamHIで切断し、結合させて自己
結合環を得る。類似方法がLHベクターに対して用いられ
る。個々のウイルス株は下記のようにしてつくられる。
先に述べたようにして切断しかつ結合したDNAをエタ
ノール沈殿させ、滅菌水に溶解する。約１μｇのptSA58
BamDNA（ヘルパーウイルス）および10μｇの組換えDNA
（αおよび／またはβhCG、もしくはLHをコードする）
を無菌試験管内で合わせ、2mlのTBS緩衝液〔G.キムラ
（Kimura）およびR.ダルベコ（Dulbecco）のバイロジー
（Virogy）,49,79〜81（1972）を参照〕および1mlの2mg
/mlDEAE−デキストラン溶液と混合し、そしてＴ−75フ
ラスコ内のTBS10mlで予め２回洗浄した全面サルCV−１
細胞の単層へ加える。細胞は時々振とうしながら37℃に
１〜２時間保ち、TBSで２回洗い、５％胎児ウシ血清を
含むDMEM10mlを係給し、そして40℃に10〜15日間保持す
る。細胞が完全に溶解した後、培地を試験管に移し、凍
結および解凍を５回繰り返し、そして3000rpmで５分間
遠心する。得られた上清は新しいCV−１細胞の感染用ウ
イルス株として役立つ。
ウイルスを感染させるために、Ｔ−150フラスコ内でC
V−１細胞を全面増殖させる。このフラスコにウイルス
株１種（上記のようにして作つたもの）1mlを加え、細
胞を40℃で５日間インキユベートする。
混合感染のために、CV−１細胞をＴ−150フラスコ内
で全面増殖させる。αSVHVP1ウイルスおよびβSVVP1ウ
イルスを1:1の比で混合し、この混合ウイルス1mlを使つ
て40℃でCV−１細胞を感染させる。
マウス細胞のトランスフエクシヨン 混合トランスフエクシヨンによつてヘテロダイマーhC
Gを生産するために、pRF375（αhCG）およびpRF398（β
hCG）のBPVプラスミド各々５μｇを混合し、担体として
サケ精子DNA10μｇを含む250mMCaCl2溶液0.5mlに加え
る。この混合物は280mMNaCl0.5ml,50mN HEPESおよび1.
5mM燐酸ナトリウム中で通気する。室温で30〜40分間燐
酸カルシウム沈殿物を形成させる。
トランスフエクシヨンの24時間前に、５×105個のマ
ウスC127細胞〔メリーランド州ベテスダ,NIH,国立ガン
研究所（National Cancer Institute）のデイーン・ハ
マー（Dean Hamer）博士から入手できる〕を100mmペト
リ皿またはＴ−75フラスコに入れる。外来性DNAを加え
る直前に新しい培地（ダルベツコ（Dulbecco）の修飾培
地,10％胎児ウシ血清）を細胞に供給する。それぞれの
皿（10ml）に燐酸カルシウム沈殿物1mlを加え、37℃で
６〜８時間細胞をインキユベートする。
培地を吸引し、室温で２分間燐酸緩衝食塩水（PBS）p
H7.0中の20％グリセロール5mlと置き換える。この細胞
をPBSで洗い、培地10mlを供給して37℃でインキユベー
トする。20〜24時間後培地を変え、その後の細胞の再供
給を３〜４日ごとに行う。個々のクローンはＴ−25cmフ
ラスコ内で増殖させる。７〜21日後に細胞クローンは分
析のためにさらに大きなフラスコに移すことができる。
単一トランスフエクシヨンによりヘテロダイマーhCG
を生産するために、プラスミドRF398αt2が混合トラン
スフエクシヨンで使用した上記の２つのプラスミドの場
合と同じ方法で使用される。
ヘテロダイマーLHを作るためには、hCGの場合に述べ
たようにして、プラスミドpRF375およびpCL28XhoLH BPV
を混合する。
興味あることには、βhCGまたはβLHをコードするベ
クターのみを含む培養細胞は、αサブユニツトをコード
する細胞が存在しないと実際にβサブユニツトを全く生
産しないが、αおよびβサブユニツトをコードする塩基
配列を含む細胞は、ヘテロダイマーを生産するばかりで
なく遊離のβサブユニツトも生産するということが観察
された。このことは、いかなる理由によるのか不明であ
るがαサブユニツトの存在がβサブユニツトを安定化さ
せるという別の利点を単一細胞培養での両サブユニツト
の生産が有するとの概念を支持するものである。
寄託 次に述べるものはメリーランド州ロツクビルのアメリ
カン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン（American T
ype Culture Collection）に寄託された。
αβSVVP1,ATCC VR2077; αSVHVP1,ATCC VR2075; βSVVP1 ,ATCC VR2075; 127細胞内のpRF375,ATCC CRL8401; C127細胞内のpRF398,ATCC CRL8401; pCL28XhoLHBPV大腸菌,ATCC 39475; C127細胞内のpRF398αt2。
用途 本発明の形質転換細胞系列は生物学的に活性なヘテロ
ポリマータンパク質を生産するために使用される。本発
明によつて作られるhCGは、例えばヒトの生殖に関係す
る多数のよく知られた医療用途を有している。
その他の実施態様 他の実施態様は次の請求の範囲に含まれるものであ
る。例えば、他のヘテロポリマータンパク質（例えば、
卵胞刺激ホルモンまたは甲状腺刺激ホルモン）を生産す
ることができ、同様にヒトまたは動物の免疫グロブリン
もしくは免疫応答抗原も生産することができる。
ヘテロポリマータンパク質は１種の細胞によつて、ま
たは単一培養において生産される必要がないかも知れな
い。
その他の宿主細胞、ベクター、プロモーター、形質転
換用塩基配列、およびウイルスも使用できる。一般に、
使用する宿主細胞は使用するベクターによつて定まる。
例えば、ベクターが複製ウイルスDNAまたは非複製ウイ
ルスDNAである場合、宿主細胞はこれらのベクターによ
つて感染またはトランスフエクシヨンされ得る細胞であ
り、例えばSV40含有ベクターはサル宿主細胞、好ましく
はCV−１細胞を必要とする。クローニングベクターが原
核生物の調節配列を有するプラスミドである場合には、
原核生物の宿主細胞（例えば大腸菌）を使用する。クロ
ーニングベクターが真核生物の調節配列を有するプラス
ミドである場合には、適当な真核生物の宿主細胞（例え
ばマウスC127細胞）を使用する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/575 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (72)発明者 ベツク，アントン・カー アメリカ合衆国マサチユーセツツ州02167, チエスナツト・ヒル，クロスビー・ロード 42 (72)発明者 バーンステイン，エドワード・ジヨージ アメリカ合衆国マサチユーセツツ州02114, ボストン，ロングフエロー・プレイス ４，ナンバー 2005

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）複数のサブユニットから構成される
    生物学的に活性なホルモンの各サブユニットをコードす
    るDNAを、同一または別々の発現ベクターに挿入し、 （ｂ）該同一または別々のベクターで宿主の真核細胞を
    形質転換し、 （ｃ）該宿主細胞を該生物学的に活性なホルモンが発現
    する条件下で培養し、そして （ｄ）該ホルモンを回収することよりなる、 複数のサブユニットから構成され、生物学的に活性で、
    且つ翻訳後に修飾されたタンパク質ホルモンの製造方
    法。
  2. 【請求項２】発現ベクターが自律複製発現ベクターであ
    る、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】ホルモンがヘテロダイマータンパク質ホル
    モンである、請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】翻訳後の修飾がグリコシル化である、請求
    項１ないし３のいずれか１項記載の方法。
  5. 【請求項５】ホルモンが分泌ホルモンである、請求項１
    ないし４項のいずれか１項記載の方法。
  6. 【請求項６】ホルモンがヒトの生殖ホルモンである、請
    求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】ホルモンがhCGである、請求項６記載の方
    法。
  8. 【請求項８】ホルモンがLHである、請求項６記載の方
    法。
  9. 【請求項９】発現ベクターがプラスミドである、請求項
    １記載の方法。
  10. 【請求項１０】発現ベクターが複製ウイルスである、請
    求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】細胞が哺乳類動物細胞である、請求項１
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】宿主細胞がサルの細胞である、請求項11
    記載の方法。
  13. 【請求項１３】宿主細胞がマウスの細胞である、請求項
    11記載の方法。
  14. 【請求項１４】各サブユニットの翻訳が、SV40後記プロ
    モーターの支配下にある、請求項１記載の方法。
  15. 【請求項１５】発現ベクターまたは各発現ベクターがウ
    シ乳頭腫ウイルスゲノムの少なくとも69％の形質転換領
    域を含む、請求項14記載の方法。
  16. 【請求項１６】ホルモンがヘテロダイマータンパク質ホ
    ルモンであり、各サブユニットの翻訳が、それぞれのプ
    ロモーターの支配下にある、請求項１記載の方法。
  17. 【請求項１７】少なくとも一方のサブユニットの翻訳
    が、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、マ
    ウスメタロチオネインプロモーターまたはウシパピロー
    マウイルスのプロモーターの支配下にある、請求項16記
    載の方法。
  18. 【請求項１８】一方のサブユニットの翻訳がSV40後期プ
    ロモーターの支配下にあり、他方のサブユニットの翻訳
    がマウスメタロチオネインプロモーターの支配下にあ
    る、請求項17記載の方法。
JP59504232A 1983-11-02 1984-10-31 ヘテロポリマ−系蛋白質 Expired - Lifetime JPH0832244B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
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