JPH04229183A - プラスミドｐＧＡ１およびｐＧＡ２、組換え体プラスミド、プラスミドベクターおよび新規細菌 - Google Patents
プラスミドｐＧＡ１およびｐＧＡ２、組換え体プラスミド、プラスミドベクターおよび新規細菌Info
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- JPH04229183A JPH04229183A JP3216806A JP21680691A JPH04229183A JP H04229183 A JPH04229183 A JP H04229183A JP 3216806 A JP3216806 A JP 3216806A JP 21680691 A JP21680691 A JP 21680691A JP H04229183 A JPH04229183 A JP H04229183A
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- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、和合性である、コリネ
バクテリウム グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）からの新規プラ
スミドおよびそれから誘導されるプラスミドベクター（
ペンデルベクター）に関する。
バクテリウム グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）からの新規プラ
スミドおよびそれから誘導されるプラスミドベクター（
ペンデルベクター）に関する。
【０００２】
【従来の技術】プラスミドベクターは、遺伝子工学的菌
株改良の重要な前提である。コリネバクテリウムないし
はブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）のプラスミドベクターの構造は、一般にこれら細菌群
中に見出すことのできるクリプテイックプラスミドによ
る。
株改良の重要な前提である。コリネバクテリウムないし
はブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）のプラスミドベクターの構造は、一般にこれら細菌群
中に見出すことのできるクリプテイックプラスミドによ
る。
【０００３】コリネバクテリウムおよびブレビバクテリ
ウムのプラスミドベクターは、相応する遺伝子生産物な
いしは酵素を高度に表現し、これによってアミノ酸分離
を改善する、アミノ酸生合成の遺伝子をクローニングす
るために利用することができる。例として、コリネバク
テリウム グルタミクムのホスホエノールピルベート
・カルボキシラーゼ遺伝子のクローニングおよび過度表
現による、コリネバクテリウム グルタミクムによる
リシンの分離が挙げられる（ヨーロッパ特許出願番号第
８９１１４ ６３２．６号）。
ウムのプラスミドベクターは、相応する遺伝子生産物な
いしは酵素を高度に表現し、これによってアミノ酸分離
を改善する、アミノ酸生合成の遺伝子をクローニングす
るために利用することができる。例として、コリネバク
テリウム グルタミクムのホスホエノールピルベート
・カルボキシラーゼ遺伝子のクローニングおよび過度表
現による、コリネバクテリウム グルタミクムによる
リシンの分離が挙げられる（ヨーロッパ特許出願番号第
８９１１４ ６３２．６号）。
【０００４】プラスミドは、コリネ型のアミノ酸分離細
菌の群中では、文献の閲覧の際に反対の印象が生じうる
としても、極めて希にしか見出せない。即ち、正確に展
望する場合、種々の名前で記載されたプラスミドは、多
数の同じ性質を有し、同一とみなすことができることが
明らかになる。
菌の群中では、文献の閲覧の際に反対の印象が生じうる
としても、極めて希にしか見出せない。即ち、正確に展
望する場合、種々の名前で記載されたプラスミドは、多
数の同じ性質を有し、同一とみなすことができることが
明らかになる。
【０００５】例として、Ｃ．グルタミクムＡＪ１１５６
０からのプラスミドｐＡＭ２８６（ヨーロッパ特許（Ａ
）第７７５４８号）；Ｂ．ラクトフェルメンツム（ｌａ
ｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９からの
ｐＡＭ３３０（ヨーロッパ特許（Ａ）第７７５４８号）
、Ｂ．ラクトフェルメンツムＡＴＣＣ２１７９８からの
ｐＢＬ１（Ｓａｎｔａｍａｒｉａ、Ｒ．等．，“Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．”１３０，第２２３７頁〜
第２２４６頁（１９８４年））およびＢ．ラクトフェル
メンツムＡＴＣＣ２１０８６からのｐＸ１８（Ｙｅｈ，
Ｐ．等．，“Ｇｅｎｅ”第４７巻、第３０１頁〜第３０
８頁（１９８６年））が挙げられる。同じことは、Ｃ．
グルタミクムＡＴＣＣ１３０５８からのプラスミドｐＨ
Ｍ１５１９（ヨーロッパ特許（Ａ）第７８５３７号）、
Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ３１８０８からのｐＲＮ３．
１（ドイツ連邦共和国特許出願公開第３４０２８７６号
）およびＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１９２２３からのｐ
ＳＲ１（吉原、Ｍ等，“Ｊ．Ｂａｃｔ．”，第１６２巻
、第５９１頁〜第５９７頁（１９８５年））にもあては
まる。ここでも、それぞれのプラスミドに対し公表され
たデータは専門家に、同じプラスミド種でなければなら
ないことを示す。マーチン（Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｆ．等
．，“Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”第５巻，第１３
７頁〜第１４６頁（１９８７年））は、この想定を確認
している。
０からのプラスミドｐＡＭ２８６（ヨーロッパ特許（Ａ
）第７７５４８号）；Ｂ．ラクトフェルメンツム（ｌａ
ｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９からの
ｐＡＭ３３０（ヨーロッパ特許（Ａ）第７７５４８号）
、Ｂ．ラクトフェルメンツムＡＴＣＣ２１７９８からの
ｐＢＬ１（Ｓａｎｔａｍａｒｉａ、Ｒ．等．，“Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．”１３０，第２２３７頁〜
第２２４６頁（１９８４年））およびＢ．ラクトフェル
メンツムＡＴＣＣ２１０８６からのｐＸ１８（Ｙｅｈ，
Ｐ．等．，“Ｇｅｎｅ”第４７巻、第３０１頁〜第３０
８頁（１９８６年））が挙げられる。同じことは、Ｃ．
グルタミクムＡＴＣＣ１３０５８からのプラスミドｐＨ
Ｍ１５１９（ヨーロッパ特許（Ａ）第７８５３７号）、
Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ３１８０８からのｐＲＮ３．
１（ドイツ連邦共和国特許出願公開第３４０２８７６号
）およびＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１９２２３からのｐ
ＳＲ１（吉原、Ｍ等，“Ｊ．Ｂａｃｔ．”，第１６２巻
、第５９１頁〜第５９７頁（１９８５年））にもあては
まる。ここでも、それぞれのプラスミドに対し公表され
たデータは専門家に、同じプラスミド種でなければなら
ないことを示す。マーチン（Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｆ．等
．，“Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”第５巻，第１３
７頁〜第１４６頁（１９８７年））は、この想定を確認
している。
【０００６】しかし、このテーマに対する多くの刊行物
および特許出願は、コリネ型細菌に対するクローニング
系の開発のために適当であるプラスミドの多様性が重要
であることを示す。
および特許出願は、コリネ型細菌に対するクローニング
系の開発のために適当であるプラスミドの多様性が重要
であることを示す。
【０００７】たとえばアミノ酸分離菌株の開発のために
とくに重要なのは、１つの細胞内に並存しうるプラスミ
ドである。
とくに重要なのは、１つの細胞内に並存しうるプラスミ
ドである。
【０００８】このような和合性プラスミドは、生合成遺
伝子の組合せを同時に、所望の酵素活性を高め、たとえ
ばＬ−トレオニンまたはＬ−リシンのような所望生産物
の生成を改善する微生物中へ組入れるのを許容する。こ
のために殊に有利な前提はたとえば、それぞれの遺伝子
の釣合のとれた過表現を達成し、宿主の不必要な負荷を
さけるために、一方で高コピー数を有し、他方で低コピ
ー数を有する和合性プラスミドにおいて生じる。
伝子の組合せを同時に、所望の酵素活性を高め、たとえ
ばＬ−トレオニンまたはＬ−リシンのような所望生産物
の生成を改善する微生物中へ組入れるのを許容する。こ
のために殊に有利な前提はたとえば、それぞれの遺伝子
の釣合のとれた過表現を達成し、宿主の不必要な負荷を
さけるために、一方で高コピー数を有し、他方で低コピ
ー数を有する和合性プラスミドにおいて生じる。
【０００９】もちろん、同時に使用されるプラスミドの
十分な安定性も目指さねばならない。 文献から公知
であるように、プラスミドベクターの和合性研究（Ｍａ
ｒｔｉｎ，Ｊ．Ｇ．等．，上記引用文中、第１３９頁）
は存在せず、プラスミドベクターの安定性の研究も同じ
く殆んど存在しない。
十分な安定性も目指さねばならない。 文献から公知
であるように、プラスミドベクターの和合性研究（Ｍａ
ｒｔｉｎ，Ｊ．Ｇ．等．，上記引用文中、第１３９頁）
は存在せず、プラスミドベクターの安定性の研究も同じ
く殆んど存在しない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、殊に
コリネ型アミノ酸分離細菌の遺伝子工学的菌株改善のた
めの組織的ないしは方法的前提を技術水準を越えて改善
するために、和合性でありかつ十分な安定性を有するプ
ラスミドないしはプラスミドベクターを提供することで
ある。
コリネ型アミノ酸分離細菌の遺伝子工学的菌株改善のた
めの組織的ないしは方法的前提を技術水準を越えて改善
するために、和合性でありかつ十分な安定性を有するプ
ラスミドないしはプラスミドベクターを提供することで
ある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明の対象は、ＤＳＭ
番号５８１６で寄託された、コリネバクテリウム グ
ルタミクムＬＰ−６から単離され、約４．９Ｋｂの長さ
および次の制限切断位置を特徴とするプラスミドｐＧＡ
１である： 第 １ 表 制限酵素 切断位置の数
ＤＮＡフラグメント（Ｋｂ） Ａｐ
ａ Ｉ ０
− Ｂａｍ Ｈ Ｉ
２ ３．３ １．６
Ｂｃｌ Ｉ ０
− Ｂｇｌ Ｉ
０ − Ｂｇｌ
ＩＩ ０
− Ｂｓｔ Ｅ ＩＩ １
４．９ Ｃｌａ Ｉ
１ ４．９
Ｄｒａ Ｉ ０
− Ｅｃｏ Ｒ Ｉ
１ ４．９ Ｅｃ
ｏ Ｒ Ｖ ０
− Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
４ ２．４ １．１
１．０５
０．３ Ｋｐ
ｎ Ｉ ０
− Ｍｌｕ Ｉ
３ ２．４５ ２．
２５ ０．２ Ｐｖｕ ＩＩ
２ ３．２５
１．６５ Ｓａｌ Ｉ
０ − Ｓｐｈ Ｉ
１ ４．
９ Ｓｓｔ Ｉ ０
− Ｘｂａ Ｉ
２ ２．５
２．４ Ｘｈｏ Ｉ
０ −コリネバクテリウム
グルタミクムＬＰ−６は、カナダ国ＧＯＫ７Ｐ４のケ
ベック・ラバル大学（Ｑｕｅｂｅｃ Ｌａｖａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ケベック１０のフェリックス
・ド・ヘレルの細菌ウイルス寄託センター（Ｆｅｌｉｘ
ｄ´Ｈｅｒｅｌｌｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎ
ｔｅｒ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉｒｕ
ｅｓ）に番号ＨＥＲ１２２９で指名された。Ｃ．グルタ
ミクム菌株ＬＰ−６は、ドイツ連邦共和国のブラウンシ
ュワイグ在ドイツ微生物寄託局（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ
Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎ
ｉｓｍｅｎ）において、ブダペスト条約によりＤＳＭ５
８１６として寄託された。
番号５８１６で寄託された、コリネバクテリウム グ
ルタミクムＬＰ−６から単離され、約４．９Ｋｂの長さ
および次の制限切断位置を特徴とするプラスミドｐＧＡ
１である： 第 １ 表 制限酵素 切断位置の数
ＤＮＡフラグメント（Ｋｂ） Ａｐ
ａ Ｉ ０
− Ｂａｍ Ｈ Ｉ
２ ３．３ １．６
Ｂｃｌ Ｉ ０
− Ｂｇｌ Ｉ
０ − Ｂｇｌ
ＩＩ ０
− Ｂｓｔ Ｅ ＩＩ １
４．９ Ｃｌａ Ｉ
１ ４．９
Ｄｒａ Ｉ ０
− Ｅｃｏ Ｒ Ｉ
１ ４．９ Ｅｃ
ｏ Ｒ Ｖ ０
− Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
４ ２．４ １．１
１．０５
０．３ Ｋｐ
ｎ Ｉ ０
− Ｍｌｕ Ｉ
３ ２．４５ ２．
２５ ０．２ Ｐｖｕ ＩＩ
２ ３．２５
１．６５ Ｓａｌ Ｉ
０ − Ｓｐｈ Ｉ
１ ４．
９ Ｓｓｔ Ｉ ０
− Ｘｂａ Ｉ
２ ２．５
２．４ Ｘｈｏ Ｉ
０ −コリネバクテリウム
グルタミクムＬＰ−６は、カナダ国ＧＯＫ７Ｐ４のケ
ベック・ラバル大学（Ｑｕｅｂｅｃ Ｌａｖａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ケベック１０のフェリックス
・ド・ヘレルの細菌ウイルス寄託センター（Ｆｅｌｉｘ
ｄ´Ｈｅｒｅｌｌｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎ
ｔｅｒ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉｒｕ
ｅｓ）に番号ＨＥＲ１２２９で指名された。Ｃ．グルタ
ミクム菌株ＬＰ−６は、ドイツ連邦共和国のブラウンシ
ュワイグ在ドイツ微生物寄託局（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ
Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎ
ｉｓｍｅｎ）において、ブダペスト条約によりＤＳＭ５
８１６として寄託された。
【００１２】もう１つの対象は、ＤＳＭ番号５８１６で
寄託された、コリネバクテリウムグルタミクムＬＰ−６
から単離され、約１９．５Ｋｂの長さおよび次の制限切
断位置を特徴とする、ｐＧＡ１と和合性のプラスミドｐ
ＧＡ２である： 第 ２ 表 制限酵素 切断位置の数
ＤＮＡフラグメント（Ｋｂ） Ｂ
ａｍ Ｈ Ｉ ３
１３．６ ４．１５ １．７５
Ｅｃｏ Ｒ Ｉ ２
１８．５ ０．９６ Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ ５ ６．
６１ ５．７２ ３．３１
２．０４ １．８２ Ｈｐａ Ｉ
１
１９．５ Ｋｐｎ Ｉ
１ １９．５ Ｍｌｕ Ｉ
３
１５．８ ２．８４ ０．８２ Ｓｃａ
Ｉ １
１９．５ Ｓｍａ Ｉ
４ １４．５ ３．
３４ １．００
０．
６５ Ｘｈｏ Ｉ ０
−プラスミドＤＮＡは、寄託され
た菌株から、専門家に公知の方法に従って単離すること
ができる。
寄託された、コリネバクテリウムグルタミクムＬＰ−６
から単離され、約１９．５Ｋｂの長さおよび次の制限切
断位置を特徴とする、ｐＧＡ１と和合性のプラスミドｐ
ＧＡ２である： 第 ２ 表 制限酵素 切断位置の数
ＤＮＡフラグメント（Ｋｂ） Ｂ
ａｍ Ｈ Ｉ ３
１３．６ ４．１５ １．７５
Ｅｃｏ Ｒ Ｉ ２
１８．５ ０．９６ Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ ５ ６．
６１ ５．７２ ３．３１
２．０４ １．８２ Ｈｐａ Ｉ
１
１９．５ Ｋｐｎ Ｉ
１ １９．５ Ｍｌｕ Ｉ
３
１５．８ ２．８４ ０．８２ Ｓｃａ
Ｉ １
１９．５ Ｓｍａ Ｉ
４ １４．５ ３．
３４ １．００
０．
６５ Ｘｈｏ Ｉ ０
−プラスミドＤＮＡは、寄託され
た菌株から、専門家に公知の方法に従って単離すること
ができる。
【００１３】プラスミドｐＧＡ１は高いコピー数（細胞
あたり約５０）を有するが、ｐＧＡ２には低いコピー数
（約５）が測定される。
あたり約５０）を有するが、ｐＧＡ２には低いコピー数
（約５）が測定される。
【００１４】このプラスミドの宿主としては、コリネ型
細菌、殊にアミノ酸生産菌が使用される。
細菌、殊にアミノ酸生産菌が使用される。
【００１５】コリネ型細菌の例は次のものである：ブレ
ビバクテリウム フラブム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、殊にＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツム（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、殊にＡ
ＴＣＣ１３８６９コリネバクテリウム カルナエ（Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、
殊にＡＴＣＣ１５９９１ コリネバクテリウム グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、殊にＡＴ
ＣＣ１３０３２コリネバクテリウム メラセコラ（Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌ
ａ）、殊にＡＴＣＣ１７９６５コリネバクテリウム
テルモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、 殊にＦ
ｅｒｍ Ｐ−９２４４ 本発明によるプラスミドはコリネ型細菌の細胞内で増殖
するので、該細菌は、プラスミド中へ挿入された異質遺
伝子の情報を宿主中で増幅することができる。
ビバクテリウム フラブム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、殊にＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツム（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、殊にＡ
ＴＣＣ１３８６９コリネバクテリウム カルナエ（Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、
殊にＡＴＣＣ１５９９１ コリネバクテリウム グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、殊にＡＴ
ＣＣ１３０３２コリネバクテリウム メラセコラ（Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌ
ａ）、殊にＡＴＣＣ１７９６５コリネバクテリウム
テルモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、 殊にＦ
ｅｒｍ Ｐ−９２４４ 本発明によるプラスミドはコリネ型細菌の細胞内で増殖
するので、該細菌は、プラスミド中へ挿入された異質遺
伝子の情報を宿主中で増幅することができる。
【００１６】組換えられたプラスミドＤＮＡの宿主細胞
中への組込みは、望ましくは複合プラスミド（プラスミ
ドベクター）を介して行なわれ、その構成のためには、
耐性遺伝子を有する、Ｅ．コリ中で増殖するベクター、
たとえばｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＳＣ
１０１、ｐＢＲ３２２、ｐＩＰ５５、Ｒ１６、Ｒ１、Ｒ
Ｐ４およびｐＩＥ５４５がとくに適当である。
中への組込みは、望ましくは複合プラスミド（プラスミ
ドベクター）を介して行なわれ、その構成のためには、
耐性遺伝子を有する、Ｅ．コリ中で増殖するベクター、
たとえばｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＳＣ
１０１、ｐＢＲ３２２、ｐＩＰ５５、Ｒ１６、Ｒ１、Ｒ
Ｐ４およびｐＩＥ５４５がとくに適当である。
【００１７】このような構成の原理は、ヨーロッパ特許
（Ａ）第９３０１１号およびヨーロッパ特許（Ａ）第８
２４８５号に記載されている。
（Ａ）第９３０１１号およびヨーロッパ特許（Ａ）第８
２４８５号に記載されている。
【００１８】とくに適当なのは、図４による制限地図を
特徴とする、プラスミドｐＧＡ１とＥ．コリベクターｐ
ＨＳＫｍ１からなるペンデルベクターｐＨＳ２−１であ
る。
特徴とする、プラスミドｐＧＡ１とＥ．コリベクターｐ
ＨＳＫｍ１からなるペンデルベクターｐＨＳ２−１であ
る。
【００１９】ベクターｐＨＳＫｍ１は、トランスポゾン
Ｔｎ９０３のカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたＥ．
コリベクターｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ
，Ｃおよび協力者、，（“Ｇｅｎｅ”第３３巻，第１０
３頁〜第１１９頁（１９８５年））に記載されている）
の誘導体である。
Ｔｎ９０３のカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたＥ．
コリベクターｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ
，Ｃおよび協力者、，（“Ｇｅｎｅ”第３３巻，第１０
３頁〜第１１９頁（１９８５年））に記載されている）
の誘導体である。
【００２０】これおよび他の、ｐＧＡ１に基づくペンデ
ルベクターは、コリネ型細菌、殊にコリネバクテリウム
グルタミクム中で安定であるだけでなく、他の起源
のプラスミド、たとえばコリネバクテリウム グルタ
ミクムＡＴＣＣ１３０５８からのｐＨＭ１５１９および
ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツムＡＴＣＣ
１３８６９からのｐＡＭ３３０、殊にコリネバクテリウ
ム カルナエＤＳＭ２０１４７からのｐＣＣ１とも共
存する。
ルベクターは、コリネ型細菌、殊にコリネバクテリウム
グルタミクム中で安定であるだけでなく、他の起源
のプラスミド、たとえばコリネバクテリウム グルタ
ミクムＡＴＣＣ１３０５８からのｐＨＭ１５１９および
ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツムＡＴＣＣ
１３８６９からのｐＡＭ３３０、殊にコリネバクテリウ
ム カルナエＤＳＭ２０１４７からのｐＣＣ１とも共
存する。
【００２１】このことは、記載の事例は高コピー数を有
するプラスミドないしはベクターであるので驚異的であ
る。
するプラスミドないしはベクターであるので驚異的であ
る。
【００２２】証明はこの方法で行なわれた：プラスミド
ｐＡＭ３３０を有するブレビバクテリウム ラクトフ
ェルメンツムＡＴＣＣ１３８６９は、チールバッハ（Ｔ
ｈｉｅｒｂａｃｈ）等（“Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．”）により記載されたよう
に、ｐＨＳ２−１−ＤＮＡで形質転換した。
ｐＡＭ３３０を有するブレビバクテリウム ラクトフ
ェルメンツムＡＴＣＣ１３８６９は、チールバッハ（Ｔ
ｈｉｅｒｂａｃｈ）等（“Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．”）により記載されたよう
に、ｐＨＳ２−１−ＤＮＡで形質転換した。
【００２３】形質転換の研究は、双方のプラスミドが共
存しうることを示した。
存しうることを示した。
【００２４】プラスミドｐＧＡ１の可動性誘導体は、シ
エ−ファ−（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）等，（“Ｊ．Ｂａｃｔ
．”，第１７２巻，第１６６３頁〜第１６６６頁（１９
９０年））に記載されているような接合法を用いて、プ
ラスミドｐＨＭ１５１９を有するコリネバクテリウム
グルタミクムＡＴＣＣ１３０５８中へ導入した。トラ
ンス接合個体の研究は、双方のプラスミドは共存しうる
ことを示した。
エ−ファ−（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）等，（“Ｊ．Ｂａｃｔ
．”，第１７２巻，第１６６３頁〜第１６６６頁（１９
９０年））に記載されているような接合法を用いて、プ
ラスミドｐＨＭ１５１９を有するコリネバクテリウム
グルタミクムＡＴＣＣ１３０５８中へ導入した。トラ
ンス接合個体の研究は、双方のプラスミドは共存しうる
ことを示した。
【００２５】プラスミドｐＧＡ２も、可動性ペンデルベ
クターの構成のために適当である。ｐＧＡ２のＤＮＡ配
列と可動性Ｅ．コリベクターｐＫ１８：：ｍｏｂからも
、コリネバクテリウム グルタミクム中で増殖するペ
ンデルベクターｐＦＢＨ２が構成される。
クターの構成のために適当である。ｐＧＡ２のＤＮＡ配
列と可動性Ｅ．コリベクターｐＫ１８：：ｍｏｂからも
、コリネバクテリウム グルタミクム中で増殖するペ
ンデルベクターｐＦＢＨ２が構成される。
【００２６】
【実施例】１．コリネバクテリウム グルタミクムＬ
Ｐ−６からのｐＧＡ１の単離および特性決定コリネバク
テリウム グルタミクム菌株ＬＰ−６は、カナダ国Ｇ
ＩＫ７Ｐ４のケベックラバル大学の、ケベック３ １
０在“フェリックス・ド・ヘレル細菌ウイルスの寄託セ
ンター”により番号ＨＥＲ１２２９で指名された。Ｃ．
グルタミクム菌株ＬＰ−６は、ドイツ連邦共和国ブラウ
ンシュワイブにおけるドイツ微生物寄託局において、ブ
ダペスト条約によりＤＳＭ５８１６として寄託された。
Ｐ−６からのｐＧＡ１の単離および特性決定コリネバク
テリウム グルタミクム菌株ＬＰ−６は、カナダ国Ｇ
ＩＫ７Ｐ４のケベックラバル大学の、ケベック３ １
０在“フェリックス・ド・ヘレル細菌ウイルスの寄託セ
ンター”により番号ＨＥＲ１２２９で指名された。Ｃ．
グルタミクム菌株ＬＰ−６は、ドイツ連邦共和国ブラウ
ンシュワイブにおけるドイツ微生物寄託局において、ブ
ダペスト条約によりＤＳＭ５８１６として寄託された。
【００２７】プラスミドＤＮＡは、菌株ＬＰ−６から、
たとえばヨーロッパ特許出願第３１８６６３号およびバ
ーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、ＨＣ）およびドーリイ
（Ｄｏｌｙ、Ｊ．）（“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，第７巻，第１５１３頁〜第１
５２３頁（１９７９年））により記載されているような
専門家に公知の方法によって単離された。こうして得ら
れたＤＮＡ溶液は、アガロースゲル電気泳動（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ，Ｔ．等，１９８２年、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ”：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバー）によっ
て特性決定された。このＤＮＡ溶液は、ｐＧＡ１および
ｐＧＡ２と呼ばれる２種のプラスミドを含有していた。 プラスミドｐＧＡ１は約４．９Ｋｂの長さを有し、プラ
スミドｐＧＡ２は約１９．５Ｋｂの長さを有していた。 制限酵素Ｓａｌ Ｉでの処理により、プラスミドｐＧＡ
２は切断されるが、ｐＧＡ１は完全のままであった。
たとえばヨーロッパ特許出願第３１８６６３号およびバ
ーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、ＨＣ）およびドーリイ
（Ｄｏｌｙ、Ｊ．）（“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，第７巻，第１５１３頁〜第１
５２３頁（１９７９年））により記載されているような
専門家に公知の方法によって単離された。こうして得ら
れたＤＮＡ溶液は、アガロースゲル電気泳動（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ，Ｔ．等，１９８２年、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ”：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバー）によっ
て特性決定された。このＤＮＡ溶液は、ｐＧＡ１および
ｐＧＡ２と呼ばれる２種のプラスミドを含有していた。 プラスミドｐＧＡ１は約４．９Ｋｂの長さを有し、プラ
スミドｐＧＡ２は約１９．５Ｋｂの長さを有していた。 制限酵素Ｓａｌ Ｉでの処理により、プラスミドｐＧＡ
２は切断されるが、ｐＧＡ１は完全のままであった。
【００２８】これによって得られたＤＮＡ溶液に、Ｃｓ
Ｃｌ／エチジウムブロミド密度勾配遠心法（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ，Ｔ．等（１９８２年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ）を行ない、こうしてプラスミドｐＧＡ１を単離した
。
Ｃｌ／エチジウムブロミド密度勾配遠心法（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ，Ｔ．等（１９８２年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ）を行ない、こうしてプラスミドｐＧＡ１を単離した
。
【００２９】プラスミドｐＧＡ１は、制限酵素Ａｐａ
Ｉ、Ｂａｍ Ｈ Ｉ、Ｂｃｌ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｂｓ
ｔ Ｅ ＩＩ、Ｃｌａ Ｉ、Ｄｒａ Ｉ、Ｅｃｏ Ｒ
Ｉ、Ｅｃｏ ＲＶ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｍ
ｌｕ Ｉ、Ｐｖｕ ＩＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｓｐｈ Ｉ、Ｓ
ｓｔ Ｉ、Ｘｂａ ＩおよびＸｈｏ Ｉで処理し、ＤＮ
Ａフラグメントの長さをアガロースゲル電気泳動で測定
した。かかる標準は、たとえば制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩ
Ｉで切断されたエシエリキア・コリ・ファージλ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｐｈａｇｅλ）の
ＤＮＡであり、このものは米国ゲイザーーズバーグ（Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）にあるベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ社（Ｆｉｒｍａ Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）か
ら入手することができる。第１表は、試験された制限酵
素のプラスミドｐＧＡ１における制限切断位置の数およ
び得られたＤＮＡフラグメントの長さを記載する。２つ
および３つの制限酵素によるｐＧＡ１の消化および得ら
れたＤＮＡフラグメントの長さ測定によって、図１に示
したプラスミドの制限地図を作製することができた。プ
ラスミドｐＧＡ１は４．９Ｋｂの長さを有する。
Ｉ、Ｂａｍ Ｈ Ｉ、Ｂｃｌ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｂｓ
ｔ Ｅ ＩＩ、Ｃｌａ Ｉ、Ｄｒａ Ｉ、Ｅｃｏ Ｒ
Ｉ、Ｅｃｏ ＲＶ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｍ
ｌｕ Ｉ、Ｐｖｕ ＩＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｓｐｈ Ｉ、Ｓ
ｓｔ Ｉ、Ｘｂａ ＩおよびＸｈｏ Ｉで処理し、ＤＮ
Ａフラグメントの長さをアガロースゲル電気泳動で測定
した。かかる標準は、たとえば制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩ
Ｉで切断されたエシエリキア・コリ・ファージλ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｐｈａｇｅλ）の
ＤＮＡであり、このものは米国ゲイザーーズバーグ（Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）にあるベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ社（Ｆｉｒｍａ Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）か
ら入手することができる。第１表は、試験された制限酵
素のプラスミドｐＧＡ１における制限切断位置の数およ
び得られたＤＮＡフラグメントの長さを記載する。２つ
および３つの制限酵素によるｐＧＡ１の消化および得ら
れたＤＮＡフラグメントの長さ測定によって、図１に示
したプラスミドの制限地図を作製することができた。プ
ラスミドｐＧＡ１は４．９Ｋｂの長さを有する。
【００３０】菌株ＬＰ−６におけるｐＧＡ１のコピー数
は、次のようにして決定された：菌株ＬＰ−６を、標準
Ｉブイヨン（ドイツ連邦共和国、ダルムスタット在メル
ク社から入手）中で、定常の成長相のはじまるまで培養
し、細胞数を測定した。培養懸濁液１．５ｍｌから、ビ
ルンボア（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．）およびドーリ
イ（Ｄｏｌｙ．Ｊ）（“Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ”第７巻，第１５１３頁〜第１５
２３頁（１９７９年））により記載されたようにして、
プラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドＤＮＡ溶液の
一定部分量および上記したλ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ Ｄ
ＮＡスタンダードの既知量とを、アガロースゲル電気泳
動にかけ、引き続きエチジウムブロミドでの染色を行な
った。ｐＧＡ１ ＤＮＡバンドのＵＶ照射の際の蛍光
を、λ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡフラグメントの蛍
光と比較し、こうしてｐＧＡ１ＤＮＡの量を半定量的に
測定した。こうして、コピー数（細胞あたりのプラスミ
ド分子の数）は約５０と決定された。
は、次のようにして決定された：菌株ＬＰ−６を、標準
Ｉブイヨン（ドイツ連邦共和国、ダルムスタット在メル
ク社から入手）中で、定常の成長相のはじまるまで培養
し、細胞数を測定した。培養懸濁液１．５ｍｌから、ビ
ルンボア（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．）およびドーリ
イ（Ｄｏｌｙ．Ｊ）（“Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ”第７巻，第１５１３頁〜第１５
２３頁（１９７９年））により記載されたようにして、
プラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドＤＮＡ溶液の
一定部分量および上記したλ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ Ｄ
ＮＡスタンダードの既知量とを、アガロースゲル電気泳
動にかけ、引き続きエチジウムブロミドでの染色を行な
った。ｐＧＡ１ ＤＮＡバンドのＵＶ照射の際の蛍光
を、λ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡフラグメントの蛍
光と比較し、こうしてｐＧＡ１ＤＮＡの量を半定量的に
測定した。こうして、コピー数（細胞あたりのプラスミ
ド分子の数）は約５０と決定された。
【００３１】２．コリネバクテリウム グルタミクム
ＬＰ−６からのｐＧＡ２の単離および特性決定プラスミ
ドｐＧＡ１およびｐＧＡ２を有するプラスミドＤＮＡ含
有溶液を、前記１項に記載したようにして製造した。両
種のプラスミドを、アガロース電気泳動によって分離し
、プラスミドｐＧＡ２を電気溶離（Ｅｌｅｃｔｒｏｅｌ
ｕｔｉｏｎ；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ等（１９８２年），
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ）によって単離した。
ＬＰ−６からのｐＧＡ２の単離および特性決定プラスミ
ドｐＧＡ１およびｐＧＡ２を有するプラスミドＤＮＡ含
有溶液を、前記１項に記載したようにして製造した。両
種のプラスミドを、アガロース電気泳動によって分離し
、プラスミドｐＧＡ２を電気溶離（Ｅｌｅｃｔｒｏｅｌ
ｕｔｉｏｎ；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ等（１９８２年），
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ）によって単離した。
【００３２】プラスミドｐＧＡ２を、制限酵素Ｅｃｏ
Ｒ Ｉ、Ｂａｍ Ｈ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｓｃａ Ｉ、Ｈ
ｐａ Ｉ、Ｍｌｕ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
およびＸｈｏＩで処理し、ＤＮＡフラグメントの長さを
、上記１項に記載したようにして測定した。第２表は、
試験した制限酵素のプラスミドｐＧＡ２における制限切
断位置の数および得られるＤＮＡフラグメントの長さを
記載する。２つおよび３つの制限酵素によるｐＧＡ２の
消化および得られるＤＮＡフラグメントの長さ測定によ
って、第２表に記載したプラスミドの制限カードを作製
することができた。プラスミドｐＧＡ２は１９．５Ｋｂ
の長さを有する。
Ｒ Ｉ、Ｂａｍ Ｈ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｓｃａ Ｉ、Ｈ
ｐａ Ｉ、Ｍｌｕ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
およびＸｈｏＩで処理し、ＤＮＡフラグメントの長さを
、上記１項に記載したようにして測定した。第２表は、
試験した制限酵素のプラスミドｐＧＡ２における制限切
断位置の数および得られるＤＮＡフラグメントの長さを
記載する。２つおよび３つの制限酵素によるｐＧＡ２の
消化および得られるＤＮＡフラグメントの長さ測定によ
って、第２表に記載したプラスミドの制限カードを作製
することができた。プラスミドｐＧＡ２は１９．５Ｋｂ
の長さを有する。
【００３３】菌株ＬＰ−６におけるｐＧＡ２のコピー数
は次のようにして決定された：菌株ＬＰ−６を、標準Ｉ
ブイヨン（ドイツ連邦共和国、ダルムスタット、メルク
社から入手）中で、定常の成長相がはじまるまで培養し
、細胞数を測定した。培養懸濁液１．５ｍｌから、プラ
スミドＤＮＡを、ビルンボアおよびドーリイ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第７巻，
第１５１３頁〜第１５２３頁（１９７９年））により記
載されたようにして単離した。プラスミドＤＮＡ溶液の
一定部分量および上記したλ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
ＤＮＡスタンダードの既知量を、アガロースゲル電気泳
動にかけ、引き続きエチジウムブロミド染色を行なった
。ｐＧＡ２ ＤＮＡバンドのＵＶ照射の際の蛍光を、
λ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡフラグメントの蛍光
と比較し、こうしてｐＧＡ２ＤＮＡの量を半定量的に測
定した。こうして、コピー数（細胞あたりのプラスミド
分子の数）は約５と決定された。
は次のようにして決定された：菌株ＬＰ−６を、標準Ｉ
ブイヨン（ドイツ連邦共和国、ダルムスタット、メルク
社から入手）中で、定常の成長相がはじまるまで培養し
、細胞数を測定した。培養懸濁液１．５ｍｌから、プラ
スミドＤＮＡを、ビルンボアおよびドーリイ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第７巻，
第１５１３頁〜第１５２３頁（１９７９年））により記
載されたようにして単離した。プラスミドＤＮＡ溶液の
一定部分量および上記したλ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
ＤＮＡスタンダードの既知量を、アガロースゲル電気泳
動にかけ、引き続きエチジウムブロミド染色を行なった
。ｐＧＡ２ ＤＮＡバンドのＵＶ照射の際の蛍光を、
λ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡフラグメントの蛍光
と比較し、こうしてｐＧＡ２ＤＮＡの量を半定量的に測
定した。こうして、コピー数（細胞あたりのプラスミド
分子の数）は約５と決定された。
【００３４】
制限酵素 切断位置の数
ＤＮＡフラグメント（Ｋｂ） Ｂａｍ
Ｈ Ｉ ３
１３．６ ４．１５ １．７５ Ｅｃｏ
Ｒ Ｉ ２
１８．５ ０．９６ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
５ ６．６１ ５．
７２ ３．３１
２．０４
１．８２ Ｈｐａ Ｉ
１ １９．５ Ｋｐｎ Ｉ
１ １
９．５ Ｍｌｕ Ｉ ３
１５．８ ２．８４
０．８２ Ｓｃａ Ｉ １
１９．５ Ｓｍａ Ｉ
４ １４．５
３．３４ １．００
０．６５ Ｘｈｏ Ｉ
０ −第２表：制限エンドヌク
レアーゼを用いるプラスミドｐＧＡ２の特性決定 ３．ｐＧＡ１とエシエリキア・コリベクターｐＨＳＫｍ
１からなるペンデルベクターｐＨＳ２−１の構成プラス
ミドｐＨＳＫｍ−１は、ヤニシュ・ペロン（Ｙａｎｉｓ
ｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．等（Ｇｅｎｅ、第３３巻，第１
０３頁〜第１１９頁（１９８５年））により記載された
、スエーデン国ウプサラ在ファルマシア（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）社で得られる専門家に公知のＥ．コリベクター
ｐＵＣ１８の誘導体であり、この中へトランスポゾンＴ
ｎ９０３のカナマイシン耐性遺伝子（岡、Ａ．等、“Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．”，第１４７巻，第２１７頁〜第
２２６頁（１９８１年））が挿入された。
ＤＮＡフラグメント（Ｋｂ） Ｂａｍ
Ｈ Ｉ ３
１３．６ ４．１５ １．７５ Ｅｃｏ
Ｒ Ｉ ２
１８．５ ０．９６ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
５ ６．６１ ５．
７２ ３．３１
２．０４
１．８２ Ｈｐａ Ｉ
１ １９．５ Ｋｐｎ Ｉ
１ １
９．５ Ｍｌｕ Ｉ ３
１５．８ ２．８４
０．８２ Ｓｃａ Ｉ １
１９．５ Ｓｍａ Ｉ
４ １４．５
３．３４ １．００
０．６５ Ｘｈｏ Ｉ
０ −第２表：制限エンドヌク
レアーゼを用いるプラスミドｐＧＡ２の特性決定 ３．ｐＧＡ１とエシエリキア・コリベクターｐＨＳＫｍ
１からなるペンデルベクターｐＨＳ２−１の構成プラス
ミドｐＨＳＫｍ−１は、ヤニシュ・ペロン（Ｙａｎｉｓ
ｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．等（Ｇｅｎｅ、第３３巻，第１
０３頁〜第１１９頁（１９８５年））により記載された
、スエーデン国ウプサラ在ファルマシア（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）社で得られる専門家に公知のＥ．コリベクター
ｐＵＣ１８の誘導体であり、この中へトランスポゾンＴ
ｎ９０３のカナマイシン耐性遺伝子（岡、Ａ．等、“Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．”，第１４７巻，第２１７頁〜第
２２６頁（１９８１年））が挿入された。
【００３５】プラスミドｐＨＳＫｍ１は、次に記載した
ようにして構成された。トランスポゾンＴｎ９０３のカ
ナマイシン耐性遺伝子（Ｒｏｓｅ，Ｒ．Ｅ．；“Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，第１
６巻，第３５６頁（１９８８年））を有するプラスミド
ｐＡＣＹＣ１７７は、エシエリキア・コリＡＴＣＣ３７
０３１から、ヨーロッパ特許（Ａ）第３１８６６３号に
記載されたようにして単離された。プラスミドｐＡＣＹ
Ｃ１７７を、制限酵素Ｈａｅ ＩＩで切断し、カナマイ
シン耐性遺伝子を有する１４３０ｂｐの長さのＤＮＡフ
ラグメントは電気溶離（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ等、（１
９８２年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌ
ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ）によって単離した。 プラスミドｐＵＣ１８はＨａｅ ＩＩで部分的に切断し
、長さ１４３０ｂｐのＨａｅ ＩＩ ＤＮＡフラグメ
ントと混合し、得られるＤＮＡ混合物をＴ４−ＤＮＡリ
ガーゼで処理した。米国ゲイザースバーグ在のベセスダ
・リサーチ・ラボラトリイズ社から入手したエシエリキ
ア・コリＤＨ５αのコンピテント細胞を、連結反応混合
物で形質転換した。カナマイシン耐性形質転換細胞を、
カナマイシン２０μｇ／ｍｌを補充したＬＢ寒天（トリ
プトン：１０ｇ／ｌ；酵母エキス：５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ
：１０ｇ／ｌ；寒天１２ｇ／ｌ）上で選択した。形質転
換細胞からｐＨＳＫｍ１と呼ばれるプラスミドを単離し
た。制限分析によって、カナマイシン耐性遺伝子の挿入
された長さ１４３０ｂｐのＤＮＡフラグメントの配列お
よび挿入位置を決定した。プラスミドｐＨＳＫｍ１の制
限地図は図３に示されている。
ようにして構成された。トランスポゾンＴｎ９０３のカ
ナマイシン耐性遺伝子（Ｒｏｓｅ，Ｒ．Ｅ．；“Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，第１
６巻，第３５６頁（１９８８年））を有するプラスミド
ｐＡＣＹＣ１７７は、エシエリキア・コリＡＴＣＣ３７
０３１から、ヨーロッパ特許（Ａ）第３１８６６３号に
記載されたようにして単離された。プラスミドｐＡＣＹ
Ｃ１７７を、制限酵素Ｈａｅ ＩＩで切断し、カナマイ
シン耐性遺伝子を有する１４３０ｂｐの長さのＤＮＡフ
ラグメントは電気溶離（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ等、（１
９８２年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌ
ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ）によって単離した。 プラスミドｐＵＣ１８はＨａｅ ＩＩで部分的に切断し
、長さ１４３０ｂｐのＨａｅ ＩＩ ＤＮＡフラグメ
ントと混合し、得られるＤＮＡ混合物をＴ４−ＤＮＡリ
ガーゼで処理した。米国ゲイザースバーグ在のベセスダ
・リサーチ・ラボラトリイズ社から入手したエシエリキ
ア・コリＤＨ５αのコンピテント細胞を、連結反応混合
物で形質転換した。カナマイシン耐性形質転換細胞を、
カナマイシン２０μｇ／ｍｌを補充したＬＢ寒天（トリ
プトン：１０ｇ／ｌ；酵母エキス：５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ
：１０ｇ／ｌ；寒天１２ｇ／ｌ）上で選択した。形質転
換細胞からｐＨＳＫｍ１と呼ばれるプラスミドを単離し
た。制限分析によって、カナマイシン耐性遺伝子の挿入
された長さ１４３０ｂｐのＤＮＡフラグメントの配列お
よび挿入位置を決定した。プラスミドｐＨＳＫｍ１の制
限地図は図３に示されている。
【００３６】上記１．項に記載されたプラスミドｐＧＡ
１を、制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分的に消化し、線形にし
、一度切断した形のプラスミドを電気溶離によって単離
した。こうして得られたＤＮＡを、Ｂａｍ Ｈ Ｉで線
形にしたｐＨＳＫｍ１−ＤＮＡと混合し、得られるＤＮ
Ａ混合物をＴ４ ＤＮＡリガーゼで処理した。エシエ
リキア・コリＤＨ５αを連結反応混合物で形質転換し、
形質転換細胞を、カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）、Ｘ
−Ｇａｌ（５−ブロム−４−クロル−β−インドリル−
Ｄ−ガラクトピラノシド、４０μｇ／ｍｌ）およびＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
、２０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ寒天上で選択した。 形質転換細胞の約５％は、記載した寒天上で無色であっ
た。ゾンデとしてのプラスミドｐＧＡ１によるコロニー
ハイブリッド法を、ｌａｃＺの相補性を示さなかった約
９００の形質転換細胞を用いて実施した。コロニーハイ
ブリッド法には、ｐＧＡ１をニックトランスレーション
（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．等、（１９８２年）、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ）を用いてビオチン化ヌクレオシド三
リン酸（ビオチン−７−ｄＡＴＰ）で標識し、米国ゲイ
ザースバーグ在ベセスダ・リサーチ・ラボラトリイス社
のＢｌｕＧＥＮＥ核酸検出システムを用いて、ストレプ
トアビジン（ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ）により結合
されたアルカリ性ホスファターゼを検出した。ＤＮＡの
標識付けは、ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）等（米国、“Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，第
８０巻，第６６３３頁〜第６６３７頁（１９８１年））
が記載したように実施し、コロニーハイブリッド法はト
レーバー（Ｔｒｅｖｏｒ、Ｇ．Ｔ．）等（Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ、第３巻，第２５９
頁以降（１９８５年））により記載されたように実施し
た。試験した９００の形質転換細胞のうち、７０が正の
反応を与えた。形質転換細胞から、ｐＨＳ２−１と呼ば
れるプラスミドを単離し、制限酵素を用いて地図を作製
した。プラスミドｐＨＳ２−１の制限地図は図４に示さ
れている。
１を、制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分的に消化し、線形にし
、一度切断した形のプラスミドを電気溶離によって単離
した。こうして得られたＤＮＡを、Ｂａｍ Ｈ Ｉで線
形にしたｐＨＳＫｍ１−ＤＮＡと混合し、得られるＤＮ
Ａ混合物をＴ４ ＤＮＡリガーゼで処理した。エシエ
リキア・コリＤＨ５αを連結反応混合物で形質転換し、
形質転換細胞を、カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）、Ｘ
−Ｇａｌ（５−ブロム−４−クロル−β−インドリル−
Ｄ−ガラクトピラノシド、４０μｇ／ｍｌ）およびＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
、２０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ寒天上で選択した。 形質転換細胞の約５％は、記載した寒天上で無色であっ
た。ゾンデとしてのプラスミドｐＧＡ１によるコロニー
ハイブリッド法を、ｌａｃＺの相補性を示さなかった約
９００の形質転換細胞を用いて実施した。コロニーハイ
ブリッド法には、ｐＧＡ１をニックトランスレーション
（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．等、（１９８２年）、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ）を用いてビオチン化ヌクレオシド三
リン酸（ビオチン−７−ｄＡＴＰ）で標識し、米国ゲイ
ザースバーグ在ベセスダ・リサーチ・ラボラトリイス社
のＢｌｕＧＥＮＥ核酸検出システムを用いて、ストレプ
トアビジン（ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ）により結合
されたアルカリ性ホスファターゼを検出した。ＤＮＡの
標識付けは、ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）等（米国、“Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，第
８０巻，第６６３３頁〜第６６３７頁（１９８１年））
が記載したように実施し、コロニーハイブリッド法はト
レーバー（Ｔｒｅｖｏｒ、Ｇ．Ｔ．）等（Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ、第３巻，第２５９
頁以降（１９８５年））により記載されたように実施し
た。試験した９００の形質転換細胞のうち、７０が正の
反応を与えた。形質転換細胞から、ｐＨＳ２−１と呼ば
れるプラスミドを単離し、制限酵素を用いて地図を作製
した。プラスミドｐＨＳ２−１の制限地図は図４に示さ
れている。
【００３７】４．コリネバクテリウム グルタミクム
におけるペンデルベクターｐＨＳ２−１の複製プラスミ
ドｐＨＳ２−１を、エシエリキア・コリＤＨ５α／ｐＨ
Ｓ２−１から単離し、コリネバクテリウム・グルタミク
ムＡＴＣＣ１３０３２のスフェロプラストを用いてチー
ルバッハ（Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ）等（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，第２９巻，第
３５６頁〜第３６２頁（１９８８年））により記載され
たようにして形質転換した。形質転換細胞を、カナマイ
シン（１５μｇ／ｍｌ）を含有していたＳＢ寒天上で選
択した。１２の形質転換細胞からプラスミドＤＮＡを単
離し、制限酵素Ｅｃｏ Ｒ ＩおよびＭｌｕ Ｉで切断
することにより特性表示した。プラスミドＤＮＡは、エ
シエリキア・コリから単離したｐＨＳ２−１と同じ大き
さを有し、同じ制限地図を示した。
におけるペンデルベクターｐＨＳ２−１の複製プラスミ
ドｐＨＳ２−１を、エシエリキア・コリＤＨ５α／ｐＨ
Ｓ２−１から単離し、コリネバクテリウム・グルタミク
ムＡＴＣＣ１３０３２のスフェロプラストを用いてチー
ルバッハ（Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ）等（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，第２９巻，第
３５６頁〜第３６２頁（１９８８年））により記載され
たようにして形質転換した。形質転換細胞を、カナマイ
シン（１５μｇ／ｍｌ）を含有していたＳＢ寒天上で選
択した。１２の形質転換細胞からプラスミドＤＮＡを単
離し、制限酵素Ｅｃｏ Ｒ ＩおよびＭｌｕ Ｉで切断
することにより特性表示した。プラスミドＤＮＡは、エ
シエリキア・コリから単離したｐＨＳ２−１と同じ大き
さを有し、同じ制限地図を示した。
【００３８】５．コリネバクテリウム グルタミクム
ＡＴＣＣ１３０３２中でのペンデルベクターｐＨＳ２−
１の安定性 コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３
２／ｐＨＳ２−１を、グルコース４ｇ／ｌおよび付加的
にカナマイシン１０μｇ／ｍｌを補足したスタンダード
Ｉブイヨン（ドイツ連邦共和国、ダルムスタット在メル
ク社から入手）中で、３０℃、１５０ｒ．ｐ．ｍ．で、
定常の成長相に到達するまで培養した。カナマイシンを
有する上記の培養基からなる培養液５０ｍｌとカナマイ
シンなしの上記の培養基からなる培養液５０ｍｌとに、
それぞれ１：１００００の割合で予試培養液を接種し、
上記したように、定常の成長相に到達するまで培養した
。 細菌培養液の光学密度は、波長６６０ｎｍにおいて７〜
８であった。
ＡＴＣＣ１３０３２中でのペンデルベクターｐＨＳ２−
１の安定性 コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３
２／ｐＨＳ２−１を、グルコース４ｇ／ｌおよび付加的
にカナマイシン１０μｇ／ｍｌを補足したスタンダード
Ｉブイヨン（ドイツ連邦共和国、ダルムスタット在メル
ク社から入手）中で、３０℃、１５０ｒ．ｐ．ｍ．で、
定常の成長相に到達するまで培養した。カナマイシンを
有する上記の培養基からなる培養液５０ｍｌとカナマイ
シンなしの上記の培養基からなる培養液５０ｍｌとに、
それぞれ１：１００００の割合で予試培養液を接種し、
上記したように、定常の成長相に到達するまで培養した
。 細菌培養液の光学密度は、波長６６０ｎｍにおいて７〜
８であった。
【００３９】引き続き、カナマイシン含有細菌培養液を
、新しいカナマイシン含有ブイヨン上へ移種し、カナマ
イシンの不在で成長した細菌培養液を同じ割合でカナマ
イシン不含の新しいブイヨンを移種した。このような移
種を合計１６回実施して、菌株をカナマイシンの存在な
いしは不含で約２１０世代培養した。その後、試料をス
タンダードＩ寒天（ドイツ連邦共和国、ダルムスタット
在メルク社から入手）上で平板培養し、３０℃で恒温に
保った。こうして形成した個々のコロニーを、スタンダ
ードＩ寒天およびカナマイシン１０μｇ／ｍｌで補足し
たスタンダードＩ上へ移種した。カナマイシンの不在で
の２１０世代の培養の場合には試験した１８１の単独コ
ロニーのうち１８１がカナマイシン耐性であり、カナマ
イシンの存在での培養の場合には試験した８４の単独コ
ロニーのうちの８４がカナマイシン耐性であった。それ
ぞれ１２の単独コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し
、制限酵素Ｅｃｏ Ｒ ＩおよびＭＩｕ Ｉでの切断に
よって特性表示した。プラスミドＤＮＡはｐＨＳ２−１
の大きさを有し、ｐＨＳ２−１に特徴的な制限地図を示
した。
、新しいカナマイシン含有ブイヨン上へ移種し、カナマ
イシンの不在で成長した細菌培養液を同じ割合でカナマ
イシン不含の新しいブイヨンを移種した。このような移
種を合計１６回実施して、菌株をカナマイシンの存在な
いしは不含で約２１０世代培養した。その後、試料をス
タンダードＩ寒天（ドイツ連邦共和国、ダルムスタット
在メルク社から入手）上で平板培養し、３０℃で恒温に
保った。こうして形成した個々のコロニーを、スタンダ
ードＩ寒天およびカナマイシン１０μｇ／ｍｌで補足し
たスタンダードＩ上へ移種した。カナマイシンの不在で
の２１０世代の培養の場合には試験した１８１の単独コ
ロニーのうち１８１がカナマイシン耐性であり、カナマ
イシンの存在での培養の場合には試験した８４の単独コ
ロニーのうちの８４がカナマイシン耐性であった。それ
ぞれ１２の単独コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し
、制限酵素Ｅｃｏ Ｒ ＩおよびＭＩｕ Ｉでの切断に
よって特性表示した。プラスミドＤＮＡはｐＨＳ２−１
の大きさを有し、ｐＨＳ２−１に特徴的な制限地図を示
した。
【００４０】６．コリネバクテリウム カルナエ（Ｃ
．ｃａｌｌｕｎａｅ）ＤＳＭ２０１４７からのプラスミ
ドｐＣＣ１とペンデルベクターｐＨＳ２−１との共存コ
リネバクテリウム カルナエＤＳＭ２０１４７を、コ
リネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
／ｐＨＳ２−１から単離したｐＨＳ２−１プラスミドＤ
ＮＡで、チールバッハ等（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，第２９巻，第３５６頁〜
第３６２頁（１９８８年）が記載したように形質転換し
た。形質転換細胞を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）
を含有していたＳＢ寒天上で選択した。２０の形質転換
細胞を、カナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を補足したス
タンダード栄養寒天上で分離した。それぞれ１つの単独
コロニーを取出し、プラスミドＤＮＡを単離した。タイ
プＤＳＭ２０１４７／ｐＨＳ２−１の試験した２０の単
独コロニーのうち１７中のプラスミドｐＣＣ１をアガロ
ースゲル電気泳動によって検出された；試験したすべて
のコロニー中にプラスミドｐＨＳ２−１が存在していた
。
．ｃａｌｌｕｎａｅ）ＤＳＭ２０１４７からのプラスミ
ドｐＣＣ１とペンデルベクターｐＨＳ２−１との共存コ
リネバクテリウム カルナエＤＳＭ２０１４７を、コ
リネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
／ｐＨＳ２−１から単離したｐＨＳ２−１プラスミドＤ
ＮＡで、チールバッハ等（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，第２９巻，第３５６頁〜
第３６２頁（１９８８年）が記載したように形質転換し
た。形質転換細胞を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）
を含有していたＳＢ寒天上で選択した。２０の形質転換
細胞を、カナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を補足したス
タンダード栄養寒天上で分離した。それぞれ１つの単独
コロニーを取出し、プラスミドＤＮＡを単離した。タイ
プＤＳＭ２０１４７／ｐＨＳ２−１の試験した２０の単
独コロニーのうち１７中のプラスミドｐＣＣ１をアガロ
ースゲル電気泳動によって検出された；試験したすべて
のコロニー中にプラスミドｐＨＳ２−１が存在していた
。
【００４１】同様にして、対照としてコリネバクテリウ
ム カルナエＤＳＭ２０１４７のスフェロプラストを
製造し、ＳＢ寒天上で再生した。再生した２０の単独コ
ロニーをスタンダードＩ寒天培養基上で分離した。それ
ぞれ１つの単独コロニーを取出し、プラスミドＤＮＡを
単離した。タイプＤＳＭ２０１４７の試験した２０の単
独コロニーのうちの１７に、プラスミドｐＣＣ１が検出
された。タイプＤＳＭ２０１４７／ｐＨＳ２−１の形質
転換細胞を、カナマイシンの存在ないしは不在で、約５
０世代、下記５．項に記載したようにして培養した。引
き続き、双方の培養液をスタンダードＩ寒天上で平板培
養し、３０℃で恒温に保った。それぞれ８つの単独コロ
ニーからプラスミドＤＮＡを単離した。試験した８つの
コロニーのうちそれぞれ８つにプラスミドｐＣＣ１およ
びｐＨＳ２−１を検出することができた。同様にして、
対照菌株ＤＳＭ２０１４７の再生した単独コロニーを約
５０世代培養し、引き続き８つの単独コロニーからプラ
スミドＤＮＡを単離した。試験した８つの単独コロニー
のうちそれぞれ８つに、プラスミドｐＣＣ１が検出され
た。試験は、プラスミドｐＣＣ１とｐＨＳ２−１とが共
存しうることを示した。
ム カルナエＤＳＭ２０１４７のスフェロプラストを
製造し、ＳＢ寒天上で再生した。再生した２０の単独コ
ロニーをスタンダードＩ寒天培養基上で分離した。それ
ぞれ１つの単独コロニーを取出し、プラスミドＤＮＡを
単離した。タイプＤＳＭ２０１４７の試験した２０の単
独コロニーのうちの１７に、プラスミドｐＣＣ１が検出
された。タイプＤＳＭ２０１４７／ｐＨＳ２−１の形質
転換細胞を、カナマイシンの存在ないしは不在で、約５
０世代、下記５．項に記載したようにして培養した。引
き続き、双方の培養液をスタンダードＩ寒天上で平板培
養し、３０℃で恒温に保った。それぞれ８つの単独コロ
ニーからプラスミドＤＮＡを単離した。試験した８つの
コロニーのうちそれぞれ８つにプラスミドｐＣＣ１およ
びｐＨＳ２−１を検出することができた。同様にして、
対照菌株ＤＳＭ２０１４７の再生した単独コロニーを約
５０世代培養し、引き続き８つの単独コロニーからプラ
スミドＤＮＡを単離した。試験した８つの単独コロニー
のうちそれぞれ８つに、プラスミドｐＣＣ１が検出され
た。試験は、プラスミドｐＣＣ１とｐＨＳ２−１とが共
存しうることを示した。
【００４２】７．菌株ＬＰ−６からのコリネバクテリウ
ム グルタミクムによるＬ−リシンの分離菌株ＬＰ−
６を、硫酸アンモニウム１２ｇ／ｌ、糖密２４０ｇ／ｌ
および大豆粉加水分解物６０ｍｌ／ｌからなり、そのｐ
Ｈをアンモニア水で約７．２に調節した培地中で培養し
た。１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに、上記の
培地を満たし、菌株ＬＰ−６を接種し、３０℃、３００
ｒ．ｐ．ｍ．で７２時間インキュベートした。Ｌ−リシ
ンの測定は、遠心分離の上澄み中でアミノ酸分析器を用
いて行なった。分離した、Ｌ−リシン・ＨＣｌの濃度は
０．９ｇ／ｌであった。
ム グルタミクムによるＬ−リシンの分離菌株ＬＰ−
６を、硫酸アンモニウム１２ｇ／ｌ、糖密２４０ｇ／ｌ
および大豆粉加水分解物６０ｍｌ／ｌからなり、そのｐ
Ｈをアンモニア水で約７．２に調節した培地中で培養し
た。１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに、上記の
培地を満たし、菌株ＬＰ−６を接種し、３０℃、３００
ｒ．ｐ．ｍ．で７２時間インキュベートした。Ｌ−リシ
ンの測定は、遠心分離の上澄み中でアミノ酸分析器を用
いて行なった。分離した、Ｌ−リシン・ＨＣｌの濃度は
０．９ｇ／ｌであった。
【００４３】８．ｐＧＡ２からのＤＮＡ配列と可動性エ
シエリキア・コリベクターｐＫ１８：：ｍｏｂからなる
可動性ペンデルベクターｐＦＢＨ２の構成プラスミドｐ
Ｋ１８：：ｍｏｂは、専門家に公知のエシエリキア・コ
リクローンベクターｐＫ１８（プリドモア（Ｐｒｉｄｍ
ｏｒｅ，Ｒ．Ｄ．）；Ｇｅｎｅ第５６巻、第３０９頁〜
第３１２頁（１９８７年））からの誘導体である。プラ
スミド１８：：ｍｏｂは、自己伝達性プラスミドＲＰ４
（ダッタ（Ｄａｔｔａ，Ｎ．等；Ｊ．Ｂａｃｔ．第１０
８巻，第１２４４頁〜第１２４９頁（１９７１年））の
移動にとって重要な領域を有し、次のようにして構成さ
れた：プラスミドＲＰ４の移動領域を有するプラスミド
ｐＳＵＰ１０２（シモン（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．等）、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１１
８巻，第６４０頁〜第６５９頁（１９８６年））を、エ
シエリキア・コリＳ１７−１（シモン等．，Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ，第１巻，第７８４頁〜第７９４頁（
１９８３年））から、専門家に慣用の方法、たとえばホ
ルメス（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．Ｓ．＆キグレイ（Ｑｕｉｇ
ｌｅｙ，Ｍ．）（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第
１１４巻，第１９３頁〜第１９７頁（１９８１年））に
より記載された方法に従って単離し、制限酵素Ａｌｕ
Ｉで部分的に切断した。プラスミドｐＫ１８を、制限酵
素Ｎａｅ Ｉで部分的に消化し、プラスミドｐＳＵＰ１
０２のＡｌｕＩ消化によって得られたＤＮＡフラグメン
トと一緒にし、得られるＤＮＡ混合物をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで処理した。コーエン（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ）等（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、米国、第６９巻，
第２１１０頁〜第２１１４頁（１９７２年））の処方に
より製造したエシエリキア・コリＳ１７−１のコンピテ
ント細胞を、連結反応混合物で形質転換し、細胞を、ピ
ナセイ・ブロース（Ｐｅｎａｓｓａｙ−Ｂｒｏｔｈ）（
米国デトロイト在Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）１７．５ｇ／ｌおよび寒天１５ｇ／ｌからなり、
カナマイシンが２５μｇ／ｌの最終濃度で添加されてい
たＰＡ寒天上に塗布した。カナマイシン耐性コロニーを
ＰＡ液体媒地で洗い流し、大量のＰＡ液体培地にとり、
サイモン（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ）等（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，第１巻，第７８４頁〜第７９４頁（１９８３年
））により記載された慣用法により、エシエリキア・コ
リＭＭ２９４（タルマジ（Ｔａｌｍａｄｇｅ，Ｋ）およ
びギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ），Ｇｅｎｅ第１２
巻，第２３５頁〜第２４１頁（１９８０年））との交差
のために使用した。選択培地（カナマイシン２５μｇ／
ｍｌおよびナリジキシン酸５０μｇ／ｍｌを有するＰＡ
寒天）から成長したトランス接合体からｐＳＵＰ１０２
ＤＮＡの挿入を有するプラスミドｐＫ１８の誘導体を単
離することができた。ここでｐＫ１８：ｍｏｂと記載さ
れたベクターは長さ１．１ＫｂのｐＳＵＰ１０２挿入を
有する。制限分析により、挿入された、移動領域を有す
るＤＮＡフラグメントの部位が確かめられた。プラスミ
ドｐＫ１８：：ｍｏｂの制限地図は図５に示されている
。
シエリキア・コリベクターｐＫ１８：：ｍｏｂからなる
可動性ペンデルベクターｐＦＢＨ２の構成プラスミドｐ
Ｋ１８：：ｍｏｂは、専門家に公知のエシエリキア・コ
リクローンベクターｐＫ１８（プリドモア（Ｐｒｉｄｍ
ｏｒｅ，Ｒ．Ｄ．）；Ｇｅｎｅ第５６巻、第３０９頁〜
第３１２頁（１９８７年））からの誘導体である。プラ
スミド１８：：ｍｏｂは、自己伝達性プラスミドＲＰ４
（ダッタ（Ｄａｔｔａ，Ｎ．等；Ｊ．Ｂａｃｔ．第１０
８巻，第１２４４頁〜第１２４９頁（１９７１年））の
移動にとって重要な領域を有し、次のようにして構成さ
れた：プラスミドＲＰ４の移動領域を有するプラスミド
ｐＳＵＰ１０２（シモン（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．等）、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１１
８巻，第６４０頁〜第６５９頁（１９８６年））を、エ
シエリキア・コリＳ１７−１（シモン等．，Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ，第１巻，第７８４頁〜第７９４頁（
１９８３年））から、専門家に慣用の方法、たとえばホ
ルメス（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．Ｓ．＆キグレイ（Ｑｕｉｇ
ｌｅｙ，Ｍ．）（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第
１１４巻，第１９３頁〜第１９７頁（１９８１年））に
より記載された方法に従って単離し、制限酵素Ａｌｕ
Ｉで部分的に切断した。プラスミドｐＫ１８を、制限酵
素Ｎａｅ Ｉで部分的に消化し、プラスミドｐＳＵＰ１
０２のＡｌｕＩ消化によって得られたＤＮＡフラグメン
トと一緒にし、得られるＤＮＡ混合物をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで処理した。コーエン（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ）等（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、米国、第６９巻，
第２１１０頁〜第２１１４頁（１９７２年））の処方に
より製造したエシエリキア・コリＳ１７−１のコンピテ
ント細胞を、連結反応混合物で形質転換し、細胞を、ピ
ナセイ・ブロース（Ｐｅｎａｓｓａｙ−Ｂｒｏｔｈ）（
米国デトロイト在Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）１７．５ｇ／ｌおよび寒天１５ｇ／ｌからなり、
カナマイシンが２５μｇ／ｌの最終濃度で添加されてい
たＰＡ寒天上に塗布した。カナマイシン耐性コロニーを
ＰＡ液体媒地で洗い流し、大量のＰＡ液体培地にとり、
サイモン（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ）等（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，第１巻，第７８４頁〜第７９４頁（１９８３年
））により記載された慣用法により、エシエリキア・コ
リＭＭ２９４（タルマジ（Ｔａｌｍａｄｇｅ，Ｋ）およ
びギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ），Ｇｅｎｅ第１２
巻，第２３５頁〜第２４１頁（１９８０年））との交差
のために使用した。選択培地（カナマイシン２５μｇ／
ｍｌおよびナリジキシン酸５０μｇ／ｍｌを有するＰＡ
寒天）から成長したトランス接合体からｐＳＵＰ１０２
ＤＮＡの挿入を有するプラスミドｐＫ１８の誘導体を単
離することができた。ここでｐＫ１８：ｍｏｂと記載さ
れたベクターは長さ１．１ＫｂのｐＳＵＰ１０２挿入を
有する。制限分析により、挿入された、移動領域を有す
るＤＮＡフラグメントの部位が確かめられた。プラスミ
ドｐＫ１８：：ｍｏｂの制限地図は図５に示されている
。
【００４４】上記２．項に記載したプラスミドｐＧＡ２
を制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、得られるｐＧＡ
２ ＤＮＡフラグメントを、あらかじめＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩで線状にしたプラスミドベクターｐＫ１８：：ｍｏ
ｂと混合した。得られるＤＮＡ混合物をＴ４ ＤＮＡ
リガーゼで処理し、引き続きエシエリキア・コリＤＨ５
αの形質転換のために使用した。形質転換細胞を、カナ
マイシン（２０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−Ｇａｌ（４０μｇ／
ｍｌ）およびＩＰＴＧ（２０μｇ／ｍｌ）が補足されて
いるＬＢ寒天上で選択した。すべての無色のコロニーを
、専門家に公知の、たとえばバーンボイム（Ｂｉｒｎｂ
ｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．）およびドーリイ（Ｄｏｌｙ，Ｊ）（
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第
７巻，第１５１３頁〜第１５２３頁（１９７９年））に
より記載されたようなプラスミド製剤を用いてプラスミ
ド含有量を調べ、プラスミド制限酵素を用いて特性表示
した。 単離したプラスミドの１つは長さ５．７ＫｂのｐＧＡ２
挿入を有し、ｐＦＢＨ２と呼ばれた。ｐＦＢＨ２の制限
地図は図６に示されている。
を制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、得られるｐＧＡ
２ ＤＮＡフラグメントを、あらかじめＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩで線状にしたプラスミドベクターｐＫ１８：：ｍｏ
ｂと混合した。得られるＤＮＡ混合物をＴ４ ＤＮＡ
リガーゼで処理し、引き続きエシエリキア・コリＤＨ５
αの形質転換のために使用した。形質転換細胞を、カナ
マイシン（２０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−Ｇａｌ（４０μｇ／
ｍｌ）およびＩＰＴＧ（２０μｇ／ｍｌ）が補足されて
いるＬＢ寒天上で選択した。すべての無色のコロニーを
、専門家に公知の、たとえばバーンボイム（Ｂｉｒｎｂ
ｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．）およびドーリイ（Ｄｏｌｙ，Ｊ）（
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第
７巻，第１５１３頁〜第１５２３頁（１９７９年））に
より記載されたようなプラスミド製剤を用いてプラスミ
ド含有量を調べ、プラスミド制限酵素を用いて特性表示
した。 単離したプラスミドの１つは長さ５．７ＫｂのｐＧＡ２
挿入を有し、ｐＦＢＨ２と呼ばれた。ｐＦＢＨ２の制限
地図は図６に示されている。
【００４５】９．コリネバクテリウムＲＭ３中でのペン
デルベクターｐＦＢＨ２の複製 エシエリキア・コリＳ１７−１を、ｐＦＢＨ２−ＤＮＡ
（ＤＨ５α／ｐＦＢＨ２から単離）で形質転換し、得ら
れる形質転換細胞をカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を
有するＬＢ寒天上で選択した。タイプＳ１７−１／ｐＦ
ＢＨ２の形質転換細胞を、コリネバクテリウム グル
タミクムＲＭ３と接合するため、シエ−ファー等（ｊ．
Ｂａｃｔ．，第１７２巻、第１６６３頁〜第１６６６頁
（１９９０年）により記載されたように使用した。Ｃ．
グルタミクムＲＭ３のトランス接合体を、カナマイシン
（２０μｇ／ｍｌ）およびナリジキシン酸（５０μｇ／
ｍｌ）で補足したＬＢ寒天上で選択した。１２のトラン
ス接合体からプラスミドＤＮＡを単離し、種々の制限酵
素を用いて切断することによって特性決定した。単離し
たプラスミドＤＮＡは、エシエリキア・コリから単離し
たｐＦＢＨ２と同じ制限地図を示した。
デルベクターｐＦＢＨ２の複製 エシエリキア・コリＳ１７−１を、ｐＦＢＨ２−ＤＮＡ
（ＤＨ５α／ｐＦＢＨ２から単離）で形質転換し、得ら
れる形質転換細胞をカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を
有するＬＢ寒天上で選択した。タイプＳ１７−１／ｐＦ
ＢＨ２の形質転換細胞を、コリネバクテリウム グル
タミクムＲＭ３と接合するため、シエ−ファー等（ｊ．
Ｂａｃｔ．，第１７２巻、第１６６３頁〜第１６６６頁
（１９９０年）により記載されたように使用した。Ｃ．
グルタミクムＲＭ３のトランス接合体を、カナマイシン
（２０μｇ／ｍｌ）およびナリジキシン酸（５０μｇ／
ｍｌ）で補足したＬＢ寒天上で選択した。１２のトラン
ス接合体からプラスミドＤＮＡを単離し、種々の制限酵
素を用いて切断することによって特性決定した。単離し
たプラスミドＤＮＡは、エシエリキア・コリから単離し
たｐＦＢＨ２と同じ制限地図を示した。
【図１】プラスミドｐＧＡ１の、線形図での制限地図
【
図２】プラスミドｐＧＡ２の、線形図での制限地図
図２】プラスミドｐＧＡ２の、線形図での制限地図
【図
３】プラスミドｐＨＳＫｍ１の、円形図での制限地図 マルチプルクローニング位置は位置４００〜４５２の間
に延びている。
３】プラスミドｐＨＳＫｍ１の、円形図での制限地図 マルチプルクローニング位置は位置４００〜４５２の間
に延びている。
【図４】プラスミドｐＨＳ２−１の、線形図での制限地
図 ｐＧＡ１およびｐＨＳＫｍ−１部１は別個に示されてお
り、ｐＨＳ２−１のｐＧＡ１部は少なくとも６個のＨａ
ｅ ＩＩの制限切断位置を有する：
図 ｐＧＡ１およびｐＨＳＫｍ−１部１は別個に示されてお
り、ｐＨＳ２−１のｐＧＡ１部は少なくとも６個のＨａ
ｅ ＩＩの制限切断位置を有する：
【図５】プラスミドｐＫ１８の制限地図位置（２３７５
，Ｎａｅ Ｉ／ＡｌＵ Ｉ）および（１２７５，Ｎａｅ
Ｉ／ＡｌＵ Ｉ）間のＤＮＡ範囲は３つの制限切断部
位（図示せず）を有する。
，Ｎａｅ Ｉ／ＡｌＵ Ｉ）および（１２７５，Ｎａｅ
Ｉ／ＡｌＵ Ｉ）間のＤＮＡ範囲は３つの制限切断部
位（図示せず）を有する。
【図６】プラスミドｐＦＢＨ２の、線形図での制限地図
分子のｐＧＡ２部分は灰色の陰影により表わされかつｐ
Ｋ１８：：ｍｏｂ部分はハッチングによって表わされて
いる。
分子のｐＧＡ２部分は灰色の陰影により表わされかつｐ
Ｋ１８：：ｍｏｂ部分はハッチングによって表わされて
いる。
Ｂａ Ｂａｍ Ｈ ＩＢ
Ｂｓｔ Ｅ ＩＩＣ
Ｃｌａ ＩＥ
Ｅｃｏ Ｒ ＩＨ
Ｈｉｎｄ ＩＩＩＭ Ｍ
ｌｕ ＩＰｖ Ｐｖｕ ＩＩＳ
Ｓｐｈ ＩＸ
Ｘｂａ ＩＨｐ
Ｈｐａ ＩＫ Ｋｐ
ｎ ＩＳｃ Ｓｃａ Ｉａｍｐ
アンピシリン耐性遺伝子Ｋａｎ
カナマイシン耐性遺伝子ｌａｃＺ´
ｌａｃＺの相補性を許容するｌａｃＺ遺伝
子の５´末端部 ｏｒｉ 複製源 Ｓａ Ｓａｕ３ＡｌａｃＺ−α
ｌａｃＺの相補性を許容するｌａｃＺ遺伝子の
５´末端部 ｏｒｉＶ 複製源
Ｂｓｔ Ｅ ＩＩＣ
Ｃｌａ ＩＥ
Ｅｃｏ Ｒ ＩＨ
Ｈｉｎｄ ＩＩＩＭ Ｍ
ｌｕ ＩＰｖ Ｐｖｕ ＩＩＳ
Ｓｐｈ ＩＸ
Ｘｂａ ＩＨｐ
Ｈｐａ ＩＫ Ｋｐ
ｎ ＩＳｃ Ｓｃａ Ｉａｍｐ
アンピシリン耐性遺伝子Ｋａｎ
カナマイシン耐性遺伝子ｌａｃＺ´
ｌａｃＺの相補性を許容するｌａｃＺ遺伝
子の５´末端部 ｏｒｉ 複製源 Ｓａ Ｓａｕ３ＡｌａｃＺ−α
ｌａｃＺの相補性を許容するｌａｃＺ遺伝子の
５´末端部 ｏｒｉＶ 複製源
Claims (9)
- 【請求項１】 ＤＳＭ番号５８１６で寄託された、コ
リネバクテリウム グルタミクムＬＰ−６から単離さ
れた、約４．９Ｋｂの長さおよび次の制限切断位置：
制限酵素 切断位置の数
ＤＮＡフラグメント（Ｋｂ） Ａｐａ
Ｉ ０
− Ｂａｍ Ｈ Ｉ
２ ３．３ １．６ Ｂ
ｃｌ Ｉ ０
− Ｂｇｌ Ｉ
０ − Ｂｇｌ ＩＩ
０
− Ｂｓｔ Ｅ ＩＩ １
４．９ Ｃｌａ Ｉ
１ ４．９
Ｄｒａ Ｉ ０
− Ｅｃｏ Ｒ Ｉ
１ ４．９ Ｅｃｏ
Ｒ Ｖ ０
− Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ４
２．４ １．１ １．
０５
０．３ Ｋｐｎ
Ｉ ０
− Ｍｌｕ Ｉ
３ ２．４５ ２．２５
０．２ Ｐｖｕ ＩＩ
２ ３．２５ １．
６５ Ｓａｌ Ｉ
０ − Ｓｐｈ Ｉ
１ ４．９
Ｓｓｔ Ｉ ０
− Ｘｂａ Ｉ
２ ２．５
２．４ Ｘｈｏ Ｉ
０ −を特徴とする、プラスミド
ｐＧＡ１。 - 【請求項２】 ＤＳＭ番号５８１６で寄託された、コ
リネバクテリウム グルタミクムＬＰ−６から単離さ
れた、約１９．５Ｋｂの長さおよび次の制限切断位置：
制限酵素 切断位置の数
ＤＮＡフラグメント（Ｋｂ） Ｂａ
ｍ Ｈ Ｉ ３
１３．６ ４．１５ １．７５ Ｅ
ｃｏ Ｒ Ｉ ２
１８．５ ０．９６ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
５ ６．６１
５．７２ ３．３１
２．０４ １．８２ Ｈｐａ Ｉ
１ １９．５
Ｋｐｎ Ｉ １
１９．５ Ｍｌｕ Ｉ
３ １５．８
２．８４ ０．８２ Ｓｃａ Ｉ
１ １９．５
Ｓｍａ Ｉ ４
１４．５ ３．３４ １．００
０．６５ Ｘｈｏ Ｉ
０ −を
特徴とする、プラスミドｐＧＡ２。 - 【請求項３】 請求項１記載のプラスミドｐＧＡ１か
ら、少なくとも１つの異質ＤＮＡフラグメントを付加す
ることによって構成された、コリネ型細菌中で自律的複
製することが可能な組換え体プラスミド。 - 【請求項４】 請求項２記載のプラスミドｐＧＡ２か
ら、少なくとも１つの異質ＤＮＡフラグメントを付加す
ることによって構成された、コリネ型細菌中で自律的複
製することが可能な組換え体プラスミド。 - 【請求項５】 ａ）プラスミドｐＧＡ１またはｐＧＡ
２またはこれらのプラスミドから誘導されたＤＮＡ配列
、ｂ）Ｅ．コリ中で複製する、耐性遺伝子を有するベク
ターから誘導されたＤＮＡフラグメントから構成された
、請求項３または４による組換え体プラスミド（プラス
ミドベクター）。 - 【請求項６】 図４による制限地図を特徴とする、プ
ラスミドｐＧＡ１およびＥ．コリベクターｐＨＳＫｍ１
からなる、請求項５記載のプラスミドベクターｐＨＳ２
−１。 - 【請求項７】 図５および図６による制限地図を特徴
とする、ｐＧＡ２からのＤＮＡ配列および移動可能なＥ
．コリベクターｐＫ１８：：ｍｏｂからなる、請求項５
記載のプラスミドベクターｐＦＢＨ２。 - 【請求項８】 付加的に、コリネ型細菌中で表現可能
な遺伝子を含有する、請求項３から７までのいずれか１
項記載の組換え体プラスミド。 - 【請求項９】 請求項３から８までのいずれか１項記
載の組換え体プラスミドを含有する、コリネ型細菌。
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|---|---|---|---|
| DE4027453A DE4027453A1 (de) | 1990-08-30 | 1990-08-30 | Neue plasmide aus corynebacterium glutamicum und davon abgeleitete plasmidvektoren |
| DE4027453.5 | 1990-08-30 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0472869B1 (ja) |
| JP (1) | JP2603011B2 (ja) |
| DE (2) | DE4027453A1 (ja) |
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| PL341895A1 (en) | 1999-08-12 | 2001-02-26 | Ajinomoto Kk | Plasmide autonomously replicable in corynebacter bacteria |
| DE19953206A1 (de) * | 1999-11-05 | 2001-05-10 | Degussa | Plasmide aus Corynebacterium glutamicum und deren Verwendung |
| US20050112733A1 (en) * | 2000-03-20 | 2005-05-26 | Degussa Ag | Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene |
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