JPH02472A - Ｌ―グルタミン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は遺伝子の新規形質発現方法に関する。

さらに詳細には本発明は少なくとも一種の遺伝子を含む
ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体で、かつ両Ｄ
ＮＡの少なくとも一方が宿主菌株に対して外来性である
組換え体ＤＮＡを用いコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属に属する微生物から選ばれる宿主菌株
を形質転換して得られる形質転換株を培地に培養し、該
遺伝子の形質を発現させることを特徴とする遺伝子の形
質発現方法に関する。

組換え遺伝子技法は大ｔｌ！菌を宿主として確立され、
現在までにソマトスタチン、インシュリン、ヒト生長ホ
ルモン、ヒトインターフェロン−α、ヒトインターフェ
ロン−β、口締病ワクチンなどのベブタイドやワクチン
などの製造が可能であることが示された。生理活性の高
いこれらベブタイドやワクチンの発現の宿主として大腸
菌は多くの場合十分であると考えられるが、さらに高い
生産性、菌体外への分泌、グリコジル化を求めあるいは
菌体内毒素の混入を避けるため、酵母や枯草菌なども宿
主として開発されてきている。

ペプタイド、蛋白質などの生理活性物質を生産する場合
は、上記のような既に組換えＤＮＡ技法が確立されてい
るか、その基礎が整っている菌株を利用すればより）が
、アミノ酸、核酸、ビタミン、抗生物πなどの物質の工
業的生産性の向上を組換えＤＮＡ技法により行う場合に
は、同技法を従来使用されているそれぞれの生産菌に適
用する工夫が必要である。

コリネバクテリウム・グルタミクムは微生物によるアミ
ノ酸の工業的！！２造に最初に用いられた微生物で、以
後コリネバクテリウム属を含むコリネフォルムバクテリ
アによるグルタミン酸、リジン、アラニン、ヒスチジン
、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、スレ
オニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、グルタミン
、プロリン、アルギニンなどのアミノ酸の工業的生産が
開発され、今日ではほとんどのアミノ酸は微生物により
生産されるに至っている。

従ってこれら微生物における組換えＤＮＡ技法の確立は
、今後アミノ酸生産の向上のために極めて重要であると
考えられる。

組換えＤＮＡ技法は、例えば （１）　　制限酵素による目的遺伝子を含むＤＮＡの断
片化 （２）同一制限酵素によるベクターＤＮＡの単一切断に
よる直鎖状化 （３）　　上記（１）、（２）の生成物の混合によるア
ニーリングとＤＮＡリガーゼを用いる連結による組換え
体ＤＮＡの作成 （４）上記組換え体ＤＮＡの宿主菌株への導入（形質転
換） （５）目的遺伝子を含む組換え体の選択と選択されたク
ローンの純化 の各段階によりなる。このようにして得られる組換え体
保有株の造成の効率は、上記各段階の積ともいうべきも
ので各段階を検証する手段を準備し、各段階の効率を知
りこれを向上することなしには目的遺伝子の発現可能な
形質転換株を得ることができない。またこのようにして
目的遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有する形質転換株が
得られたとしても、該遺伝子が宿主菌株に対して外来性
である場合には該遺伝子の発現に際し種々のｒ４望があ
ることが知られており〔“化学と生物″１８．１１０〜
１１８　（１９７ｇ）　）その発現を行わせることは非
常に困雑である。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物を宿主として用い、これに該宿主に対して外
来性である目的遺伝子またはベクターを含む組換え体Ｄ
ＮＡを導入して該目的遺伝子の形質を発現させた例は今
まで全く知られていない。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物を宿主とする組換えＤＮＡ技法においても、
これら微生物中で自律複製し、選択可能な表現型を存し
、多くの遺伝子のクローニングに用いうるベクター系の
造成と、効率のよい形質転換系の確立が必要である。さ
らに上記したような障壁の解消方法の確立が必要である
。

本発明者らは先にコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物中で自律複製し、選択可能
な表現型と適当なりローニング部位を有するプラスミド
ベクターを造成する一方効率の高い形質転換系を開発し
た〔特顆昭５６−５８１８６（特開昭５７−１８３７９
９）　、同５６−５８１８７　（特開昭５７１８６４９
２）　、同５６−６５７７７　（特開昭５７−１８６４
８９＞　　３゜そこで本発明者らは該プラスミドベクタ
ーに既に知られているインビトロにおけるＤＮＡ組換え
技法（Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　４．２３７，２２４）
を用い、アミノ酸の生合成に関与する外来性遺伝子を含
むＤ　Ｎ　Ａ断片を連結し、開発した形質転換系を用い
てコリネバクテリウム・グルタミクムし一２２株または
その誘導株を形質転換したところ、該外来性遺伝子が該
宿主中で形質を発現され、アミノ酸などの有用物質の生
産の増大に利用することができることを見出し本発明を
完成するに至った。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明は少なくとも一種の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベ
クターＤＮＡとの組換え体で、かつ両Ｄ　Ｎ　Ａの少な
（も一方が宿主菌株に対して外来性である組換え体ＤＮ
Ａを用いコリネバクテリウム嘱またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換し
て得られる形質転換株を培地に培養し、該遺伝子の形質
を発現させる方法を提供する。

本発明に用いる遺伝子を含むＤＮＡ断片としては、真核
生物、原核生物、ウィルス、バクテリオファージまたは
プラスミドに由来し少なくとも一種の完全な遺伝子を含
むＤＮＡ断片があげられる。

真核生物に由来する遺伝子としては哺乳類とくにヒトの
インターフェロン、インシュリン、生長ホルモンなどの
ベプタイドをコードする遺伝子などがあげられる。原核
生物に由来する遺伝子としては細菌とくにエッ／エリヒ
ア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、
バチルス属またよスタフィロコッカス属に属する細菌の
菌株に由来する遺伝子で、細胞の代謝、とくに合成活性
に関与する遺伝子などがあげられる。細胞の代謝または
合成活性とは、アミノ酸、ビタミン、核酸または抗生物
質などの合成ならびにその合成に関与する代謝系を意味
し、本発明においてはアミノ酸トくにグルタミン酸、リ
ジン、スレオニン、ヒスチジンまたはトリプトファンの
生合成活性が好適にあげられる。

また目的とするペプタイド、蛋白質などのアミノ酸組成
が知られているときは、相当するＤＮＡを合成して用い
ることもできる。ＤＮＡ合成方法はたとえば、に、１ｔ
ａｋｕｒａ　ｅｔ　ＬＬ　５ｃｉｅｎｃｅ　１９Ｊ！、
１０５６（１９７７）に記載の方法に従って行なうこと
ができる。

本発明に用いるベクターとしては、宿主菌と和合性（ｃ
ｏｍｐａｔ　１ｂｌｅ）で自律増殖できるものでなくて
はならない。具体例としては本発明者らがコリネバクテ
リウム属に属する微生物から採取した、または採取した
ものを誘導して造成したｐｃＧｌ〔特願昭５６−１８１
０１（特開昭５７−１３４５００）　）　、ρＣＧ２〔
特願昭５６−１３３５５７　（特開昭５８−３５１９７
）］　、ｐＣＧ４〔特願昭５６−５８１８６　（特開昭
５７−１８３７９９）　）、ｐＣＥ５３、ｐＣＥ５４、
ｐｃＧｌｌ、ｐＣＣｏＩ２ｐ［！ｔｈｒｌなどがあげら
れる。

これらプラスミドを保有する菌株はそれぞれ下記の寄託
番号で工業技術院微生物工業技術研究所ならびに米国ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れている。

プラスミド　　　Ｆ［！ＲＭ−Ｐ　　　　　ＡＴＣＣｐ
　ＣＧ　１　　　　５８６５　　　　　３１８０Ｂｐ　
ＣＧ　２　　　　５９５４　　　　　３１８３２ｐ　Ｃ
Ｇ　４　　　　５９３９　　　　　３１８３０ｐ　ＣＥ
５４　　　　　　　　　　３９０１９ｐ　ＣＧ　ＩＩ　
　　　　　　　　　　３９０２２ｐ　ＣＢｌｏｔ　　　
　　　　　　　　３９０２０ｐＥｔｈｒ　ｌ　　　　　
　　　　　　３９０２１好適にはｐｃＧｌｌ　、ｐＣＥ
５４が用いられる。ｐｃａｌｌは本発明者らが先に開示
〔特願昭５６−１８１０１（特開昭５７−１３４５００
）　）　したプラスミドで、コリネバクテリウム・グル
タミクム２２５−５７　（ＡＴＣＣ３１８０８、ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ５８６５）から分離されたプラスミドｐｃＩｌ；
　ｌにおける制限酵素Ｂｇｊ！ＩＩのただ一つの切断部
位に、コリネバクテリウム・グルタミクム２２５−２５
０　（ＡＴＣＣ３１８３０、ＦＥＲＭ−Ｐ５９３９）か
ら分離されたプラスミドｐＣＧ４のストレプトマイシン
および／またはスペクチノマイシン耐性（Ｓｍ”／５ｐ
ｅｃ’）遺伝子を含むＢａｍＨ１断片を両者の同一接着
末端を利用して結合させたプラスミドである。

ｐｃＧｌｌは、分子１約６．８Ｋｂのプラスミドで単一
な制限部位としてＢｇｊＮＩ、Ｐｓｔ　ｌを有しＳｍ’
／５ｐｅｃ”の表現型を与える。

ｐＥＣ５４は次のようにして作成することができる。

まず、ｐｃｃ２をその保存菌コリネバクテリウム・グル
タミクム２２５−２１８株（ＦＥＲＩＪ−Ｐ５９５４　
、ＡＴＩ：Ｃ３１８３２＞の培養画体から特願昭５６−
１３３５５７　（特開昭５８３５１９７）に開示した方
法で、ｐｃ＾２２をその保を大腸菌の培養菌体から通常
用いられる方法でａ縮単離する。両プラスミドＤＮＡを
各分子中１箇所の切断点をもつ制限酵素たとえばＰｓｔ
　Ｉで完全消化して直鎖状化した後、プラスミド分子の
両端に単鎖として突き出た同一接着末端で両ＤＮＡ分子
の連結した和合分子を生成させるためにＴ４ファージＤ
　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼを作用させる。このＤＮＡ混成物
中からの両プラスミド分子の和合連結した組換え体プラ
スミドの取得は、−旦、ｐＧ＾２２に由来する薬剤耐性
で選択されるコリネバクテリウム属あるいはブレビバク
テリウム嘱閑種の形質転換株を分離し、これら形質転換
株の保有するプラスミドを解析することによって達成さ
れる。

ＤＮＡ混成物による形質転換は、本発明者らが先に開示
したコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属
菌種のプロトプラストを使用する形質転換法〔特願昭５
６−５８１８７（特開昭５７−１８６４９２）および特
願昭５６−６５７７７（特開昭５７−１８６４８９）　
）により実施することができる。選択に用いる薬剤はｐ
ｃ＾２２に由来する薬剤耐性遺伝子のうち、ｐＧＡ２２
との連結部位となるため挿入不活化されるアンピシリン
耐性遺伝子を除いた他の耐性遺伝子に対応するテトラサ
イクリン（Ｔｃ）、クロラムフェニコール（Ｃｍ）ある
いはカナマイシン（Ｋｍ　）を使用すればよい。形質転
換株はＤＮＡ無添加系で受容菌プロトプラストが正常細
胞へ復帰増殖できない濃度の薬剤（通常、テトラサイク
リン０．４−１．６Ｊｔｇ／ｒｎｌ、クロラムフェニコ
ール２．５−５■／ｍｌにヨヒカナマイシンｌ　ＯＯ−
８００■／ｍｌ）を含む高張寒天培地上で復帰するコロ
ニーを分離するか、あるいは、−旦非選択的に再生培地
上で正常細胞に復帰増殖させた後にかき集め、この再懸
濁液を受容菌正常細胞が生育できない濃度の薬剤（通常
、テトラサイクリン０．５−４■／巾１、クロラムフェ
ニコール２−１５■／ｍ１およびカナマイシン２−２５
μｇ／ｍｌ）を含む寒天培地上で生育するコロニーを分
離することによって得られる。テトラサイクリン、クロ
ラムフェニコールあるいはカナマイシン耐性（Ｔｃ”、
　Ｃｍ”、　Ｋｍ”とそれぞれいう）により選択された
形質転換株の中には、ｐＧ＾２２由来の他の薬剤耐性形
質をも同時に獲得しているものがある。

こうして得られる形質転換株の保有するプラスミドＤＮ
Ａは、本発明者らが特願昭５６−１８１０１（特開昭５
７−１３４５００）および特願昭５６−６５７７７（特
開昭５７−１８６４８９）に開示した方法で培養菌体か
ら単＃Ｉ精製でき、さらに各種制限酵素で消化して生成
するＤ　Ｎ　Ａ　Ｗｔ片をアガロースゲル電気泳動で解
析する常法により構造を知ることができる。

形質転換株の一株から分離されたプラスミドでｐＣε５
４である。

ｐＣε５４は大きさ約１４．５Ｋｂのプラスミドで、単
一制限品位としてεｃｏＲＩ　ｓ　Ｓａｌ　Ｉ　、　Ｓ
ｍａ　Ｉ　、　Ｘｈｏ　ｌなどを存し、Ｔｃ’、　Ｃ＋
＋＋”、　Ｋｍ”の表現型を与える。

Ｘｈｏ　ｌはにが遺伝子中にあり、いわゆる挿入不活化
（ＤＮＡ断片の挿入により当該表現型の発現が妨げられ
る現象）による選択も可能である。

プラスミド保育菌株からのプラスミドの採取は、たとえ
ば特願昭５６−１８１０１（特開昭５７−１３４５００
）、同５６−５８１８６（特開昭５７−１８３７９９）
および同５６−１３３５５７　（特開昭５８−３５１９
７）に記載の方法に従って行えばよい。

遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体
の作製は、公知の試験管内組換えＤ　Ｎ　Ａ技法を駆使
することにより実施できる。

試験管内のＤＮΔ組換えは、通常、目的の遺伝子を含む
供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡの切断と再結合により行
われる。ＤＮＡの切断は、制限酵素を用いれば容易にで
きる。試験管内組換えに使われる制限酵素は生物種を問
わずすべての２本鎮ＤＮＡ上で特定の塩基配列部分を認
識し切断する。

その塩基配列は、制限酵素の種類により異なっている。

従って適当な制限酵素を使用することにより目的の遺伝
子は発現機能を損うことなく一つのＤＮＡ切断片として
切り出される。同一制限酵素により切断された供与体Ｄ
ＮＡとベクターＤＮＡの切断片の末端構造は同一構造を
もち、ある種の制限酵素の場合には１本鎖が突き出た接
着末端を与え、別の制限酵素では、平滑末端を与える。

いずれの末端であれ同一制限酵素で切断する限り供与体
ＤＮＡの切断片とベクターＤＮＡの切断片は、Ｔ４ファ
ージＤＮＡリガーゼにより連結することができる。

両ＤＮＡを異なる制限酵素で切断した場合も、例えば、
接着末端をＤＮＡポリメラーゼで修復して２本鎖として
、平滑末端になおしてから結合したり、ターミナルトラ
ンスフェラーゼで相捕的なホモポリマーを付与して接着
末端としてから結合したり、あるいは、ある種の制限酵
素切断部位を含んだ合成オリゴヌクレオチドリンカーを
連結させてから、その内部を切断して接着末端を作って
から結合させることができる。これらの連結法により目
的の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤ　Ｎ　Ａ切断
片の組換え体が生成する。

リガーゼ反応により目的の組換え体以外に他の組換え体
も生成するが、目的の組換え体を取得するにはこのＤＮ
Ａ混成液を用いてコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属菌種を直接形質転換し、目的の遺伝子の遺
伝情報に由来する遺伝形質を付与された形質転換株を選
択分離し、その培養菌体から抽出単離することによって
達成できる。コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属菌種を直接形質転換しないで例えば大腸菌のよ
うな他の微生物の宿主ベクター系にて目的の遺伝子を一
旦クローン化し、しかる後にコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属菌種のベクターとの組換え体を
試験管内で作製してからコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌種を形質転換し前記と同様に形質
転換株を選択分離しても組換え体を取得できる。

組換え体製造のためには下記文献の記載が広く応用でき
る。

Ｓ、　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ、　、ｒ　ＬＬ　Ｕ、　Ｓ、　
Ｐａｔｅｎｔ　４．２３７．２２４、遺伝子操作実験法
〔高木康敬榎著、講談社サンエンティフィー／り　（１
９８０）　〕、！Ｊｅｔｈｏｄ　ｉｎεｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ６８、　　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　ｅｄ
ｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｒａｙ　１１ｕ、　＾ｃａｄｅｍ＋ｃ
Ｐｒｅｓｓ　１９７９ 本発明の宿主微生物としては、コリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属に属しＤＮＡ取り込み能を有
する菌株ならばいかなる菌株を用いてもよい。好適には
本発明者らが先に特願昭５６１５１４６４　（特開昭５
８−５６６７８）において開示したリゾチーム感受性微
生物を用いる。具体的な菌株の一例としては次の菌株が
あげられる。

寄託番号 ＦＥＲＭ−Ｐ　　　　　八ＴＣＣ コリネバクテリウム・グルタミクム　Ｌ−１５５９４６
３１８３４コリネバクテリウム・１１−キュリス　Ｌ−
１０３５９４７３１８６６九ビバクテリウＬ・デイパリ
カラム　Ｌ−２０４５９４８３１８６７プレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム　Ｌ−３１２５９４９３１
８６８宿主微生物の組換え体ＤＮＡによる形質転換はｌ
）培養細胞からのプロトプラストの調製、２）プロトプ
ラストの組換え体ＤＮＡによる形質転換処理、３）プロ
トプラストの正常細胞への復帰再生と形質転換株の選択
、からなる工程にて行われる。具体的方法の例を以下に
示す。

■）培養細胞からのプロトプラストの調製プロトプラス
ト形成は、微生物を細胞壁溶解酵素リゾチームに感受性
にする条件下で増殖させ、この培養細胞を高張液中でリ
ゾチーム作用させ細胞壁を溶解除去することによって行
われる。微生物をリゾチーム感受性型細胞にするには各
種細胞壁合成阻害剤が用いられる。例えば、微生物培養
の対数増殖期の中途で生育を抑制しないかあるいは半抑
制する濃度のペニシリンを添加し、さらに数世代増殖さ
せることによって微生物細胞をリゾチーム感受性にする
ことができる。

このとき使用する培地は微生物が増殖できる培地であれ
ばよく、例えば栄養培地ＮＢ（粉末ブイヨン２０ｇ１酵
母エキス５ｇを純水ＩＩ！に含み、ｐＨ７，２に調整し
た培地）あるいは半合成培地ＳＳＭ〔グルコース１０ｇ
、　ＮＨ４Ｃｌ　　４　ｇ、尿素２ｇ、酵母エキスｌ　
ｇＳＫＨ２ＰＯ，１ｇ、　Ｋ２１１Ｐ０４３ｇ、　Ｍｇ
ＣＬ・６Ｈ２００，４ｇ　、　　Ｆｅ５ｏ４４ｕ２ｏ　
　１０ｍｇ５　ＭｎＳ口＜・４−６ＨＪ０、２　ｍｇＳ
ＺｎＳＯ＜’７Ｈ２０ｏ、　９　ｍｇ、　ＣｕＳＯ４’
５１１ｚＯｏ、　４　ｍｇ。

Ｎａ２Ｂ１口ｉ・ｌ０ＬＤ　　　０．０　９ｆｆ１ｇ、
　　（ＮＨｓ）ｓｌＪｏｔＯｚ＜・４Ｈ＊００、０４　
ｍｇ、ピオチン３０■、サイアミン塩酸塩１ｍｇを水ｌ
Ｉに含み、ｐＨ１，２に：Ａ整した培地〕などが用いら
れる。

この培地に微生物を接種し、振盪培養する。

比色計によって６６０ｎｍにおける吸光度（０口）を測
定し対数増殖期の初期（ＯＤ＝　０．１−０．４　）に
培養液中０．１〜２．０単位／ｍ　Ｉの濃度になるよう
にペニシリンＧなどのペニシリン類を添加する。培養を
さらに続けて、００が０．３〜０．５に増加したところ
で細胞を集菌し３３Ｍ培地で洗浄する。次いで細胞を適
当な高張培地、例えばＰＦＭ培地（ＳＳＭ２倍希釈液中
にシヨ糖０．４　Ｍ、　ＭｇＣ１２・６Ｈ３００、ＯＩ
Ｍを含み、ｐＨ７，０〜８．５に調整した培地）あるい
はＲＣＧ培地〔グルコース５ｇ１カゼイン加水分解物５
ｇ、酵母エキス２５　ｇ　、　ＫＪＰｏ、　３．５ｇ　
、　ＫＬＰＯ４１，５ｇＳＭｇＣ’ｉ・６ｔ＋、ｏ　　
０．４１ｇＦｅ５Ｏｓ’７１１ｚ０１１０ｌ１．　Ｍ１
１ＳＯ４−４〜６１１２０　２　ｍｇ、　ＺｎＳＯ４’
７１１２０　０．９　ｆｆ１ｇ、Ｃｕ５Ｏ＊・５１（ｚ
Ｏｏ、４　ｍｇ、Ｎａ２Ｂ４０ｔ　・ＩＯＬ口０、０９
　ｍｇ、　（ＮＨＪｓＭＯｔＯ７ａ・４Ｌ００．０４　
ｇｉｇ、ビオチン３０河、サイアミン塩酸塩２　ｍｇ　
、コハク酸二ナトリウム１．３５　ｇを水１１に含み、
ｐＨ７，０〜８．５に調整した培地〕に再斐濁する。こ
の細胞懇濁液に最終濃度０．２〜ｌＯ町／ｍｌ　となる
ようにリゾチームを加え３０〜３７℃で反応する。プロ
トプラスト化は反応時間が進むにつれて進行し、その経
過は光学顕微鏡で観察できる。顕微鏡下でほとんどの細
胞がプロトプラスト化されるに要する時間は、細胞培養
時の添加ペニシリン濃度および用いるリゾチームの濃度
によって変わるが、前記条件にて３〜２４時間である。

生成したプロトプラストは低張条件で破裂死するので、
プロトプラストの形成度は低張条件で生残する正常細胞
の残存度で間接的に知ることができる。通常、正常細胞
はりゾチーム処理供試正常細胞の約ｌ０−４の残存度に
抑えることができる。

このようにして調製したプロトプラストは適当な高張寒
天培地上でコロニー形成能（再生能）を有する。この寒
天培地としては栄養培地、半合成培地あるいは数種類の
アミノ酸を補充した合成培地に０．３〜０．８Ｍコハク
酸二ナトリウムおよび０．５〜６％ポリビニルピロリド
ン（分子ｆｆｔｌＯ，０００あるいは４０．０００）を
含有させたものが好適に用いられる。

通常、半合成培地ＲＣＧＰ培地ＣＲＣＧ培地に３％のポ
リビニルピロリドン（分子ｆｆ１ｌ（１，０００）　と
１．４％の寒天を添加した培地、ｐＨ７，２）を用いる
ことができる。培養は２５〜３５℃で行うのが好ましい
。

再生コロニーの出現が認められるのに要する培養日数は
菌株により差があるが、釣菌できるまでの大きさになる
のは１０〜１４日である。

ＲＣＧＰ培地でのプロトプラストの再生は菌種、培養中
途ペニシリン添加濃度およびリゾチーム処理濃度によっ
て異なるが、リゾチーム処理供試正常細胞あたりｌｏ−
２〜１０−’の効率である。

２）プロトプラストへの組換え体ＤＮＡによる形質転換 プロトプラストへの組換え体ＤＮＡの取り込みは細胞が
プロトプラスト状態を保持できる高張液中でプロトプラ
ストと組換え体ＤＮＡとを混合し、これにＤＮＡ取り込
み媒介作用のあるポリエチレングリコール（ＰＥＧ、平
均分子量１．５４０〜６．０００）あるいはポリビニル
アルコール（ＰＶＡ、ｍ合Ｉ！５００〜１，５００）と
二価金属陽イオンを加えて処理することによって行われ
る。高張条件を与える安定化剤としては、微生物のプロ
トプラストの保持に一般に使われるものでよく、例えば
ショ糖やコノ１り酸二ナトリウムを用いることができる
。ＰＥＧおよびＰＶＡの使用可能な濃度範囲は最終濃度
で各々５〜６０％、１〜２０％である。二ｆｌＩｆ金属
陽イオンは最終濃度１−１００ｍＭの（ａ　４　Ｎ−１
Ｍｇ”、Ｍｎ”、Ｂａ”５　ｒ　＋−などが効果的で単
独あるいは併用することができる。処理の温度は０〜２
５℃が好適である。

３）プロトプラストの正常細胞への復帰再生と形質転換
株の選択 組換え体ＤＮＡで形質転換処理したプロトプラストの再
生は、前記のプロトプラストの再生と同様に、コハク酸
二ナトリウムとポリピロリドンを含有する高張寒天培地
（例えばＲＣＧＰ培地）上にプロトプラストを塗布し、
正常細胞が生育できる温度、一般に２５〜３５℃で培養
することによって行われる。形質転換株は供与体ＤＮＡ
に由来する遺伝子が菌に付与する形質について選択する
ことによって取得できる。この特徴的形質獲得に基づく
選択は、高張寒天培地上で再生と同時に行ってもよく、
あるいは−旦非選択的に再生させてから再生正常細胞を
集め普通の低張寒天培地上で行ってもよい。

本発明における具体的に好適な宿主菌株として示したリ
ゾチーム感受性菌株を用いる場合には形質転換は上記工
程ｌ）におけるペニシリン処理を行なわずに単に培養増
殖させた細胞を直接リゾチーム処理する以外は上記工程
ｌ）〜３）と同様に行えばよい。リゾチーム感受性微生
物を用いる場合の形質転換株は再生菌あたり■０−４〜
１０−’の高頻度で得られる。

形質転換株は通常の栄養培地に培養することにより導入
した組換え体Ｄ　Ｎ　Ａの形質を発現させることができ
る。組換え体ＤＮＡに遺伝子ＤＮＡまたはベクターＤＮ
Ａ由来の性質が付与されている場合は、その性質にあわ
せて培地に薬剤を補給するときもある。

本発明の形質発現方法により生産されるアミノ酸などの
有用物質の採取は、発酵液からのこれらの物質を採取す
る常法により行なわれる。

本発明によりコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウ
ム属微生物におけるアミノ酸、核酸、ビタミン、抗生物
質、酵素、ベブタイド、蛋白質の生産性の増大または新
たな生産性の付与が可能となった。また微生物の代謝活
性を強化し、基質の利用能を増大させ、新たな代謝活性
を与え、新しい基質の利用性を与えるなどの製造法の改
良も可能になった。

さらに本発明における特徴は、異種遺伝子あるいは外来
性の組換えＤＮＡをコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属微生物において発現させるのに成功した
点にある。すなわち、実施例に示すような大腸菌のスレ
オニンオペロン、フォスホエノールピルビン酸カルボキ
ンラーゼ（ｐｐｃ）遺伝子、枯草菌およびブドウ状球菌
で発現する遺伝子ｐＵ８１１０　［Ｋｅｇｇｉｎｓに、
！Ｊ、、　　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ
ｌＡｃａｄ、　Ｓｃｉ、、口、Ｓ、＾、７Ｌ　１４２３
（１９７８）　）のカナマイシン耐性遺伝子、コリネバ
クテリウム・グルタミクムのリジン生合成に関与する遺
伝子、ブレビバクテリウム・フラブムのアンスラニレー
ト合成酵素遺伝子がコリネバクテリウム属菌において発
現した。

例示したいずれの遺伝子も単にコリネバクテリウム・グ
ルタミクムのプラスミドに連結した形で導入されており
、コリネバクテリウム・グルタミクムで発現させるため
の特殊な操作は施していない。また、遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を、コリイ・バクテリウム・グルタミクムのプラ
スミドに対して、いずれの向きに連結しても、コリネバ
クテリウム・グルタミクム内で発現することから、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムは、導入された遺伝子の
転写・翻訳の開始点を正確に認識し、転写・翻訳を遂行
できる機能をもつことが明白である。周知のように全て
の遺伝子は、正確に転写・翻訳が開始されるために必要
な塩基配列のレベルで類似性のある部位を有しているこ
とを考慮すると、コリネバクテリウム・グルタミクムは
、例示した遺伝子以外の遺伝子の転写・翻訳開始点をも
認識して発現しうろことが容易に推察される。

グルタミン酸高生産能を有するいわゆるグルタミン酸生
産菌は、主な菌学的性質を同じくしているにもかかわら
ず、産業上の重要性から各研究者により、種々の囲包が
付されており属名までもコリネバクテリウム属あるいは
ブレビバクテリウム属などさまざまである。しかしなが
ら、これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やＤＮＡの
塩基組成が画一的であることから、同一の菌種であるこ
とが指摘されていた。さらに、最近、これらの菌種間に
は、７０〜８０％以上のＤＮＡの相同性があることが明
らかにされ、非常に近縁な微生物であることが明白であ
る（Ｋｏｍａｔｓｕ、　Ｙ、　：Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　
ｔｈｅＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　　Ｎｏ、５５．　　１（１
９８０）　　、および５ｕｚｕｋｉ、　Ｋ、、　にａｎ
ｅｋｏ、　Ｔ、、　ａｎｄにｏｍａｇａｔａ。

に、　　：　　Ｉｎｔ、　　Ｊ、　５ｙｓｔ、　　Ｂａ
ｃｔｅ口ｏ１．．３１．　１３１（１９８１）参照〕。

本明細書では組換えＤＮＡ実験に使用できる宿主が規制
されているため、本発明の有用性はコリネバクテリウム
・グルタミクムし−２２の誘導法を宿主として示したが
上記の事実を踏まえれば、グルタミン酸生産菌全般にそ
のまま適用できることが容易に類推される。組換え体Ｄ
ＮＡがこれら菌種において安定に保持され、発現される
ためにはＤＮＡの相同性など宿主菌の性質における若干
の相違は問題でなく、これら菌種が当該プラスミドの自
律複製と導入遺伝子の発現を可能にする機能を有してい
ればよい。しかるに、これらの菌種がこの両機能を共有
していることは、本発明者らが、先に開示〔特願昭５６
−５８１８６（特開昭５７−１８３７９９）　　）　し
たコリネバクテリウム・グルタミクム２２５−２５０か
ら分離され、ストレプトマイシンおよび／またはスペク
チノマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＣＧ４が
コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属菌種
など、グルタミン酸生産菌内で同じく複製でき、また、
その耐性遺伝子が発現される〔特顆昭５６−５８１８７
（特開昭５７−１８６４９２）　）ことから明らかであ
る。従って、本発明を適用し得る宿主菌としては、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムに限らず、コリネバクテ
リウム属およびブレビバクテリウム属菌種を含むグルタ
ミン酸生産菌全てが包括される。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１．　リジン生産菌コリネバクテリウム・グルタ
ミクム＾ＴＣＣ２１５４３のリジン生合成に関与する遺
伝子のコリネバクテリウム・グルタミクムでのクローン
化と、その遺伝子の発現を利用したコリネバクテリウム
・グルタミクムによるリジンの生産： （１）　　コリネバクテリウム・グルタミクム＾ＴＣ［
：２１５４３の染色体ＤＮＡとベクターｐｃＧ１１のｍ
製：コリネバクテリウム・グルタミクム＾ＴＣＣ１３０
３２から誘導され、リジンアナログである５−（２−ア
ミノエチル）−システィン（以下ＡＥＣと略す）に耐性
を有するリジン生産性変異株コリネバクテリウム・グル
タミクムＡＴＣＣ２１５４３の染色体ＤＮＡを次のよう
にして抽出単離する。

４０　Ｑｍｌ半合成培地ＳＳＭ〔グルコース２０ｇ。

（ＮＨ４）ｚｓＯ＊　ｌＯｇ、尿素３ｇ、酵母エキスＩ
ｇ。

にＩＩ、ＰＬ　　１　ｇＳＪｌ！２’６ＨｚＯｏ、　４
　ｇＳＦｅＳＯｓ’７Ｈｔ０１０ＩＩ１ｇ、　　！ｎｓ
Ｏ＊・４−６）１ｚＯｏ、２　ｍｇ、　　Ｚｎ５Ｏｎ’
７Ｈ２０ｏ、９ｍｇ％Ｃｕ５Ｌ’５ＨａＯｏ、　４　ｍ
ｇ％ＮａＪ４０ｔ−ＩＱＩＬ２０　ｏ、　０９ｍｇ、　
（ＮＬ）ｓＭｏＪ□、’４ＬＯｏ、　０４　ａｌｇ、ビ
オチン３０μｇ、サイアミン塩酸塩ｌｆｆ１ｇを水１１
に含みｐＨ１７，２に調整した培地〕にスレオニンを１
００　Ｉ１ｇ／ｍｌとなるように補った培地に種培養を
接種して３０℃で振盪培養する。東京光電比色計で６６
０ｎｍにおける吸光度（００）を測定し、ＯＤ　０．２
になった時点で培養液中０，５単位／ｍ　ｌの濃度とな
るようにペニシリンＧを添加する。さらに培養を継続し
ＯＤ約０．６になるまで生育させる。

培＃液から菌体を集菌し、ＴＥＳＩＪ！街液（（１，（
１３Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下
トリスと略す）　、０．００５Ｍ　ＥＤＴ＾、０．０５
ＭＮａＣｌ　：　ｐＨ８，０）で洗浄後、リゾチーム液
（２５％シＢ糖、０．　Ｉ　！Ｊ　ＮａＣｌ２．０．０
５Ｍ）リス、０．８ｍｇ　７ｍ　ｌリゾチーム：　ｐＨ
８，０以下同じ）　ｌ（１ｍｌに懸濁し３７℃で４時間
反応させる。集菌した菌体から斉藤らの方法（Ｓａｉｔ
ｏ、　ｆ（、ｅｔ　ａｌ：　１３ｉｏｃｈｉｌｌＢＩｏ
ｐｈｙｓ、＾Ｃｔａ、　７２　、６１９（１９６３）　
：ｌに従って高分子染色体ＤＮＡを単離する。

一方、ベクタープラスミドとして用いるｐｃＧｌｌは、
コリネバクテリウム・グルタミクムし一２２株の誘導株
ＬＡ１０３のｐｃｃ　１１保有株ＬＡ１０３／ＩＩＣＧ
　１１（ＡＴＣＣ３９０２２）から次のようにして単離
する。

４ＱＱｍｌＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス
５ｇを水ｌｅに含みｐＨ７，２に調整した培地）で３０
℃で振盪培養しＯＤ約０．７になるまで生育させる。菌
体を集菌し、ＴＥＳ緩衝液で洗浄後、リゾチーム液ＩＱ
ｍｌに懸濁し、３７℃で２時間反応させる。反応液に５
Ｍ　ＮａＣ（１２，４＋＋＋ｌ、　０．５Ｍ２ＤＴＡ（
ｐＨ８，５）　　０．６ｍｌ、　４％ラウリル硫酸ナト
リ１）ムと０．１ＭＮａＣＲからなる溶液４．４ｍｌを
順次添加し、緩やかに混和してから氷水中に１５時間置
く。

溶菌物全体を遠心管に移し４℃で６０分間、６９、４０
０　Ｘ　ｇの遠心分離にかけ上澄液を回収する。

これに重量百分率１０％相当のポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）　６．０（１０（牛丼化学薬品社製）を加え
、静かに混和して溶解後、氷水中に置く。１０時間後１
．５００　Ｘ　ｇで１０分間遠心分離してベレットを回
収する。ＴＢＳ緩衝緩衝液５壱ｌえてペレットを静かに
再溶解してからｌ、　５　ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマ
イド２．０１１１１を添加し、これに塩化セシウムを加
えて静かに溶解し密度を１．５８０に合わせる。この溶
液を１０５．　（１（１０ｘ　ｇ　、　１８℃テ４８時
間超遠心分離にかける。この密度勾配遠心により共有結
合で閉じられた環状のＤＮＡは、紫外線照射することに
よって遠心チューブ中下方の密度の高いバンドとして見
出される。このバンドを注射器で遠心チューブの側面か
ら抜きとることによってｐｃＧｌｌ　Ｄ　Ｎ八が分離さ
れる。次いで分画液を等容重のイソプロピルアルコール
液〔容Ｎ百分率９０％イソプロピルアルコール、ｌＯ％
ＴＢＳ緩衝液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシウム
を含む）〕で５回処理してエチジウムブロマイドを抽出
除去し、しかる後にＴＢＳ緩衝液に対して透析する。

（２）　　コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ
２１５４３のリジン生合成に関与する遺伝子のクローン
化 上記で調製したｐｃＧ１１プラスミドＤＮＡ３．ｑを含
む制限酵素Ｂｇｊ’ｎ用反応液（ＩＯｍＡｌ　ｌ−リス
塩酸、７ｍＭ　ＭｇＣ１ｘ　、６０ｍＭ　　ＮａＣｊ！
、　？＋ｎｌＪ　２−ノルカプトエタノール、ｐＨ７、
５）　６０ｍに６単位のＢｇｌｌＵ　（全酒造社製）を
添加し、３７℃で６０分間反応後６５℃で１０分間加温
して反応を停止する。一方コリネバクテリウム・グルタ
ミクム＾ＴＣＣ２１５４３の染色体ＤＮＡ８ｘｒを含む
制限酵素ＢａｍＨＩ反応液（ｌｏｍＭ　トリス塩酸、７
ｍＭ　ＭｇＣｉ７２．１００ｍＭ　ＮａＣｊ！、　２ｍ
Ｍ２−１　ルカフ）　ｘ９　ノール、０．０１％ウシ血
清アルブミン、ｐＨ８，０）　１４０Ａ１＋に４単位の
Ｂａ１ｔｌＨＩを添加し、３７℃で６０分間反応後、６
５℃で１０分間加温して反応を停止させる。

画情化物を混合し、Ｔ４１Ｊガーゼ用緩衝液（トリス塩
酸６６０ｍＭＳＭｇＣＬ　　６６ｍＭ　、ジチオスレイ
トール１００ｍＭ　、　ｐＨ７，６）　４１ｂｄ！、Ａ
ＴＰ（５ｍＭ）　４０ｍ、Ｔ４リガーゼ（全酒造社製、
１単位／１ｄ）０．３ｄおよびＨ，０１２０ｍを加え、
１２℃で１６時間反応させる。この混合物をＴＥＳ緩衝
液で飽和したフェノール４００ｍで２回抽出し、ＴＢＳ
緩衝液に対して透析してフェノールを除外する。

このリガーゼ反応混合物を、コリネバクテリウム・グル
タミクム上−２２株から誘導させたＡＥＣ感受性のＬＰ
４株の形質転換に供する。

形質転換はＬＰ４株のプロトプラストを用いて行なう。

ＬＰ４株の種培養をＮＢ培地に植菌し３０℃で振盪培養
する。ＯＤｏ、６になった時点で集菌し、該細胞をＲＣ
ＧＰ培地〔グルコース５ｇ１カザミノ酸５ｇ、酵母エキ
ス２．５　ｇ　、　ＫＪＰＯ４３，５ｇ、　　に）１２
ＰＯ４１，５ｇ、ＭｇＣＬ・６Ｈ，ロ　０．４１ｇ　、
　Ｆｅ５Ｏａ’７ＨＪ　１１）＋ｇ％Ｍｎ５Ｏａ・４〜
６Ｈ２０２ｆｆ１ｇ、Ｚｎ５Ｏ＜４Ｈｚロ　０．９　ｍ
ｇ、　　（ＮＨ＊）ｓｌｌｏｔ０２ｓ−４Ｈｚ０　０．
０　４ｍｇ５ビオチン３０埒、サイアミン塩酸塩２■、
コハク酸二ナトリウム１３５　ｇ　、ポリビニルピロリ
ドン（分子！１１００００）３０　ｇを水１１に含む培
地〕に１ｍｇ／ｍｌのりゾチームを含む液（ｐＨ７，６
）に約１０’細胞／ｍ　ｌとなるように懸濁し、Ｌ型試
験管に移して３０℃で５時間緩やかに振盪反応してプロ
トプラスト化する。

このプロトプラスト菌液Ｑ、５ｍｌを小試験管にとり２
５００　Ｘ　ｇで５分間遠心分離しＴＳＩＪＣ緩衝液（
１０＋ｎＭ塩化マグネシウム、３０ｍＭ塩化カルシウム
、５０ｍＭ　）リス、４００ｍＭショ糖、ｐＨ７，５）
ｌｉｔに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＩＪＣ緩衡液Ｑ、
１ｍＭに再懸濁する。この菌液に２倍高濃度のＴＳＩＪ
Ｃ緩衝液と上記リガーゼ反応ＤＮＡ混合物の１対１混合
液ｌｏｏｍを加えて混和し、次いで７５ＭＣ緩衝液中に
２０％Ｐ　Ｅ　Ｇ６．０００を含む液Ｑ、３ｍｌを添加
して混合する。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，２）　
２ａ＋ｌを添加し、２．５００　Ｘ　ｇで５分間遠心分
離にかけて上澄み液を除去し、沈降したプロトプラスト
を１ｌＴＩｌのＲＣＧＰ培地に懸濁してから０．２１１
１１をスペクチノマイシン４００１１ｇ／ｍｌを含むＲ
ＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ培地に１．４％寒天を含む培
地、ｐＨ７，２）に塗抹し、３０℃で７日間培養する。

寒天培地上に生育した閑全量をかき集め生理食塩水で洗
浄後、１ｍＭの生理食塩水に懸濁する。

この菌液をスレオニン２ｍｇ／ｍｌ　、＾εＣ２ＩＴ１
ｇ／ＩＩＩＩおよびストレプトマイシン１２．５■／ｍ
ｌ相当を含有する最少寒天培地Ｍｌ（グルコース１０　
ｇ　。

Ｎｌｌ、Ｈ，Ｐｏ、　　１　　ｇ、　　にＣｊ！０．２
ｇ％　Ｍｇ５Ｏｓ・７Ｈ２００，２ｇ　Ｓ　Ｆｅ５０．
４Ｈ２０１０ｍｇ、　　■ｎ５Ｏｓ・４〜６Ｈ２０ｏ、
２ｍｇ、　　２ｎＳ口、４８２０　　Ｑ、９　ｍｇ、Ｃ
ｕＳ口、・５Ｌ０　０．４　ｍｇ。

％ａ、［１，口、１ＯＪ０　０．０　９　ｍｇ、　　（
ＮＬ）ｓＭＯｖ口ｚ＜・４ＨＪＯ，０４ｍｇ、ビオチン
５０■、ｐ−アミノ安息香酸２．５ｔａｇｓサイアミン
塩酸塩ｌａｇ、寒天１６ｇを水Ｂ中に含みＰＨ７，２に
調整した培地〕上に再塗布して３０℃で３日培養する。

出現したコロニーの中からＡＢＣ，スベクチノマイシン
およびストレプトマイシンに耐性の株が得られる。

これらの形質転換株の保有するプラスミドは、前記のｐ
ｃＧｌｌを単離したのと同様の方法で単離される。これ
らのプラスミドＤＮＡ　１■を用い、ｐｃＧｌｌ上に切
断部位のある制限酵素５ｃｏＲＩで完全消化後、アガロ
ースゲル電気泳動で解析し、生成断片の和から分子１を
同定した。分子量は同一アガロースゲル上で同時に泳動
したラムダファージＤＮＡの制限酵′素旧ｎｄＩ［Ｉ消
化で生成する分子量既知の各断片の泳動距離で描かれる
標準曲線に基づいて算定する。形質転換株の一株から得
られたプラスミドｐＡｅｃ　５は分子！　１０．７にｂ
でｐｃＧｌｌの８ｇＪ！ＩＩ切断部位に３，９ＫｂのＤ
ＮＡ断片が挿入された組換え体プラスミドである。

ｐＡｅｃ５ＤＮＡを用い上記と同様な方法でＬＰ４株の
プロトプラストを形質転換しスペクチノマイシン耐性で
選択される形質転換株は同時にＡＢＣ耐性形質を付与さ
れたεｃｏＲＩの切断様式で判定されるｐＡｅｃ　５と
同一のプラスミドを保有している。即ちｐＡｅｃ　５に
コリネバクテリウム・グルタミクム＾ＴＣＣ２１５４３
のＡＢＣ耐性形質を支配する遺伝子がクローン化されて
いることが明らかである。ｐＡｅｃ　５保育園株は米国
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＣｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅ口ｕｎｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＫＩ
Ｔ＾ＴＣＣ３９０３２として寄託されている。

（３）ρへｅｃ５保有株によるリジンの生産コリネバク
テリウム・グルタミクムし一２２株から誘導されたＬＰ
４株のｐＡｅｃ　５保有株（ＡＴＣＣ３９０３２）と非
保有株のリジン生産試験を行なう。ＮＢ寒天培地上で生
育させた菌を１白金耳ずつ５ｍＭの生産培地ＰＩ（グル
コース１００ｇ、（ＮＨ４）　ｌ５Ｏ４２４，５ｇ、　
ＫＨ，ＰＯ，１ｇＳｕｇｓＯ，−７Ｎ２０　０．４　ｇ
。

Ｆｅ５０＜’７１１２０１０ｍｇ、　ＭｎＳＯ４’４〜
６Ｈｚ０１０ｍｇ、ビオチン５０■、サイアミン塩酸塩
２０ｈｇ、パントテン酸カルシウム５００Ｉｔｇ、ニコ
チン酸５００　Ｉｉｇ、大豆加水分解物１０ｇ、炭酸カ
ルシウム３０ｇを水ｌ！に含みｐＨ７，２に調整した培
地〕の入った試験管に植菌し３０℃で７５時間振盪培養
する。培養後、培地中のし一リジン生成量を酸性−銅ニ
ンヒドリン反応を用いる比色法によって測定した結果を
第１表に示す。

第　　　　ｌ　　　　表 菌　　　株　　　　　　Ｌ−リジン生成量（ｍｇ／ｍｌ
） Ｐ−４ 実施例２．　大腸菌のスレオニン生合成に関与する遺伝
子のクローン化とその遺伝子の発現を利用したコリネバ
クテリウム・グルタミクムによるスレオニンの生産： （１）　　大腸菌スレオニンオペロンを含有するＤＮＡ
断片のクローン化とコリネバクテリウム・グルタミクム
への導入： クローン化は犬ｐＪＪ菌の宿主ベクター系にて実施する
。ベクターとして用いたρＧ＾２２は本プラスミドを作
製したアンらが用いている方法〔＾ｎ、Ｇ、　ｅｔ　ａ
ｌ　：　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　Ｌ４Ｑ、　４０
０（１９７９）　）に従い、本プラスミドを保有する大
腸菌に一１２株亜株の培養菌体から単離する。供与ＤＮ
Ａとなる高分子染色体ＤＮＡは大腸菌に１２株（＾Ｔ［
：Ｃ２３７４０）の培養菌体からスミスのフェノール抽
出法［Ｓｍ＋ｔｈ１Ｍ、　Ｇ、　　：　１Ｊｅｔｈｏｄ
　ｉｎＥｎｚｙ−ｍｏｌｏｇｙ、　１２．　ｐａｒｔ＾
、　５４５（１９６７）　）に従って単離する。

ｐＧＡ２２プラスミドＤＮＡ４Ｎを含む制限酵素１１＋
ｎｄ（［反応液（ＩＯｍＭ　）リス塩酸、７ｍ！Ｊ　！
ＪｇＣｌ　２゜６０ｄ　ＮａＣＲ、ｐＨ７，５）　６０
ｕｆＩに０．４単位のＨｉｎｄｌｌ［（宝酒造社製、６
単位／屑）を添加し３７℃で３０分間反応後６５℃で１
０分間加温して反応を停止する。ｐＧＡ２２には２ケ所
のＨｉｎｄｌｌＩ切断部位が存在するが、同一条件でＨ
Ｉｎｄｍ消化した試料をアガロースゲル電気泳動で調べ
た結果、−断片に切断されていることが確認される。別
に、染色体ＤＮＡ８１１ｇを含む制限酵素旧ｎｄ１１反
応液１４０屑に４筆位の旧ｎｄＩＩＩを添加し３７℃で
６０分間反応後６５℃で１０分間加温して反応を停止さ
せる。

画情化物を混合し、Ｔ４リガーゼ用緩所液４０４、＾Ｔ
Ｐ（５ｍＭ）４０ｍ、　Ｔ　４リガーゼ０．３４および
Ｈ，０１２０ｍを加え、１２℃で１６時間反応させる。

この混合物をＴＢＳ緩衝液で飽和したフェノール４００
ｄで２回抽出し、ＴＢＳ緩衝液に対して透析してフェノ
ールを除去する。

このリガーゼ反応混合物を大腸菌に一１２株亜株ＧＴ−
３ＣＪ、　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１１７．　１３
３−１４３（１９７４）　　）（ホモセリンおよびジア
ミノピメリン酸要求性）の形質転換に供与する。

ＧＴ−３株のコンピテント・セル（ＤＮＡ取り込み能を
有する菌株）はダジエルトらの方法［Ｄａｇｅｒｔ、　
！Ｊ、、　ｅｔ　ａ上：　Ｇｅｎｅ、　６．２３（１９
７９）　：１で調製する。即ち１０ｈｇ／ｍｌとなるよ
うにジアミノピメリン酸を補ったＬ培地（バタトトリブ
トン１０　ｇ　、酵母エキス５ｇを水１βに含みｐＨ７
，２に調整した培地）　５Ｑｍｌに植菌し、０００．６
になるまで３７℃で培養する。培養液を氷水で１０分間
冷却してから遠心集菌する。冷却した０、１Ｍ塩化カル
シウム２０＋１１１に再懸濁し、０℃に２０分間置く。

細胞を再遠心し、Ｏ，１Ｍ塩化力ルウシウム０．５ｍｌ
に懸濁し０℃で１８時間置く。

塩化カルシウム処理した菌液４００ｍに前記リガーゼ反
応混合物２００ｍを添加混合し、０℃に１０分間置いて
から３７℃で５分間加温する。次いでＬ培地９１＋１１
を添加し、３７℃で２時間振盪培養する。生理食塩水で
２回遠心洗浄後、１２．５ｇｇ／ｍｌＦ目当のカナマイ
シンを添加したＭ９最少寒天培地（ブドウ糖２　ｇ　、
　ＮＩＩ＋ＣＩ！　　１　ｇ　、　Ｎａ２１１Ｐ０４６
　ｇ１Ｋ１１２Ｐ０４　３　ｇ、　！ＪｇＳＬ・７１１
２０　ｏ、　１　ｇ、　ＣａＣＬ’２＋１．Ｏ１５ｍｇ
、サイアミン塩酸塩４ｍｇおよび寒天１５ｇを水ｉｆに
含み、ｐ）１７．２に調整した培地）に塗布し３７℃で
３日培養する。出現したただ一つのコロニーは、アンピ
シリン２５ｇ／ｉｔ、クロラムフェニコール２５■／ｍ
ｆあるいはカナマイシン２５ｇ／ｍｌを含むし寒天培地
上でも生育することが確認される。

この形質転換株の培養菌体から上記（１）で１］ＧＡ２
２を単離したのと同一の方法によりプラスミドＤＮＡを
単離する。このプラスミドＤＮＡを用い制限酵素消化と
アガロースゲル電気泳動で解析した結果、第１図にＩ）
ＧＨ２として示した構造を有している。ρＧ＾２２に挿
入されたＤＮＡ断片は既にクローン化された大腸菌オペ
ロン含有ＤＮＡ断片（Ｃｏｓｓａｒｔ、　Ｐ、、　ｅ４
　ａｌ　：　！Ｊｏｌｅｃ、　Ｇｅｎ、。

Ｇｅｎｅｔ、、　ＬＬ５．３９（１９７９）参照〕と同
一の制限酵素切断部位を有していることからｐＧＨ２が
スレオニンオペロンを含有することが確認される。

次にｐｃＧｌｌとｐＧ）１２の組換え体を作製する。ま
ず、ｐｃＧｌｌ　とｐＧＨ２を各々Ｂｇｌｌ、およびＢ
ａｍＨＩで適正条件下完全消化する。各プラスミドＯＮ
＾２μｇを含む消化物を混合し、総容量２０ｈ＋２に対
してＴ４リガーゼ用緩衡液４０ｄ、ΔＴ　Ｐ　（５ｍＭ
）４０ＪｄＩ、Ｔ４リガーゼ０．２μＱおよびＨ，０１
２０ｍを加え１２℃で１６時間反応させる。この混合物
をＴ　Ｂ　Ｓ　緩衝液で飽和したフェノール４００ρで
２回抽出しＴＢＳ緩衝液に対して透析してフェノールを
除去する。続いて２倍高濃度の７３ＭＣ緩衝液と前記リ
ガーゼ反応混合物の１対１混合液１００ＪｉＩｌを供与
ＤＮＡとして用い、実施例１（ｌ〕と同様な方法でコリ
ネバクテリウム・グルタミクムＬＡ２０１株（ＬＡ１０
３の誘導株、ホモセリン、ロインン要求株）のプロトプ
ラストを形質転換した後、ＲＣＧＰ寒天培地に塗抹し、
３０℃で６日間培養して再生増殖させる。寒天培地上全
面に生育した菌をかき集め、生理食塩水で遠心洗浄後、
ロイシン５０■／＋ｎｌを補充した最少寒天培地Ｍｌ上
に再塗布して、３０℃で３日間培養する。出現したロロ
二一の中からカナマイシン１２．５■／ｍｌあるいはス
ペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＮ８寒天培地
上で生育できる株が得られる。

これらの形質転換株から実施例１　（１）記載のエチジ
ウムブロマイド、セシウムクロライド密度勾配遠心によ
りプラスミドを単離する。

これらのプラスミドＤＮＡ０．５ｇを用い各種制限酵素
による単独消化および二種類の制限酵素による二重消化
で生成するＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で解析
し、分子量およびプラスミド分子中の各制限酵素切断部
位を同定する。−株から得られたプラスミドをｐ［、ｔ
ｈｒ　１　と命名した。制限酵素Ｐｓｔ　ｒ　、Ｅｃｏ
ＲＩ、およびＸｈｏ　１の切断部位で特徴づけられる構
造を第３図に示す。ｐＥｔｈｒ　１　はｐｃＧｌｌにρ
Ｇ１１２のスレオニンオペロンを含む、［ｌａｍＨＩ切
断片を結合した構造を有することが判明した。

ｐＥｔｈｒ　Ｉ　ＤＮＡを用いて、コリネバクテリウム
・グルタミクムＬＡ１０３株を前記と同様に再形質転換
した結果、ホモセリン非要求性とカナマイシンおよびス
ペクチノマイシン耐性形質が連関して導入され、それら
の形質転換株は、各種制限酵素切断様式で特徴づけられ
るｐＢｔｈｒ　ｌ　と同一のプラスミドを保有している
。ホモセリンデヒドロゲナーゼの欠失に起因するＬＡ１
０３株のホモセリン要求性がｐＢｔｈｒ　ｌによりホモ
セリン非要求性に復帰するのは、大腸菌スレオニンオペ
ロン上にあるホモセリンデヒドロゲナーゼが発現してい
るためにほかならない。

（２）　　ｐＨ４ｈｒ　ｌ保有株の造成コリネバクテリ
ウム・グルタミクムし一２２株より誘導したスレオニン
生産菌、コリネバクテリウム・グルタミクムし八−１０
６（メチオニン要求性、ＡＢＣ耐性、α−アミノ−β−
ヒドロキシ吉草酸耐性）のｐＢｔｈｒ　１保有株は、Ｌ
Ａ−１０６のプロトプラストをｐＢｔｈｒ　１で形質転
換することによって得られる。

プロトプラストはＬＡ　−２０６株を半合成培地ＳＳＭ
に１０ｈｇ／ｍｌ相当のメチオニンを補った培地で培養
し、ＯＤ約０．６まで生育させた細胞を実施例１（２）
と同様な工程で処理することにより調製する。形質転換
も実施例１（２）と同様に行ないスペクチノマイシン４
００　ｔａｇ　７ｍ　Ｉを含むＲＣＧＰ寒天培地上で選
択して形質転換株を取得する。

ｐＥｔｈｒｌ保有菌株は米国アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍｇｌｕＬａｍｉｃｕｉに１９＾ＴＣＣ３９０３４とし
て寄託されている。

（３）　　ｐＥｔｈｒ　ｌ保有株によるスレオニンの生
産上記のようにして得たＬＡ−１０６株のｐＢｔｈｒ　
１保有株（ＡＴＣＣ３９０３４）と非保有株のスレオニ
ン生産試験を行なう。ＮＢ寒天培地上で生産させた菌を
１白金耳ずつ５ｍＭの生産培地Ｐ２（グルコース１００
　ｇ、　（ＮＨｉ）ｔｓＯ＜　２０ｇ、にＨ２ＰＯ４０
，５ｇ−に２ＨＰＯ４０，５ｇ　Ｓ　ＭｇＳ口４’？）
１２０　　１　ｇ　、Ｆｅ５０．−７８，０１１ｂ＋ｇ
、　Ｍｎ５Ｏｉ・４−６Ｈｚ０　１０ｍｇ、ビオチン１
００題、炭酸カルシウム２０ｇ１メチオニン１００＋ｇ
を水１１に含みＩ）８７．２に調整した培地〕の入った
試験管に植菌し３０℃で７５時間振盪培養する。

培養後、培養を液をペーパークロマトグラフィーにかけ
ニンヒドリン発色後、比色定置してＬ−スレオニン生成
量を測定した。結果を第２表に示す。

第　　　　２　　　　表 ＬＡ−１０６ ６，１ ＬＡ　−１０６／ｐ８ｔｈｒ　１　　　　１３．４実施
例３゜ 大腸菌のフォスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
（ＰＰＣ）遺伝子を含む組換え体プラスミドを保有する
コリネバクテリウム・グルタミクムによるグルタミン酸
の生産： （１）　　大腸菌のＰＰＣ遺伝子（本遺伝子は大腸菌で
Ｇｌｕ−をＧｌｕ”にすることが知られているグルタミ
ン酸生合成に関与する遺伝子である）を含有するＤＮＡ
断片のクローン化とコリネバクテリウム・グルタミクム
への導入： クローン化は大腸菌の宿主・ベクター系にて実施する。

ベクターとして用いたｐ８Ｒ３２２は実施例１（１）で
ｐＧ＾２２を調製したのと同一の方法で大腸菌に’−１
２株亜株０培養菌体から単離する。供与ＤＮＡとなる高
分子染色体ＤＮＡは実施例２（＋１で大腸菌に一１２株
（ＡＴＣＣ２３７４０）から調製したものを使用する。

９８Ｒ３２２プラスミドＤＮＡ３ｇおよび染色体ＤＮＡ
９ｄを含む制限酵素５ａｉｌ用反応液（ｌＱｍＭ　）リ
ス塩酸、７ｍＭ　ＭｇＣｊ！　２．１００ｍＭ　ＮａＣ
１２。

７ｍＭ　　２−メルカプトエタノール、ｏ、ｏｉ％ウシ
血清アルブミン、ｐＨ７，５）２００ρにｌＯ単位の５
ａｌｒ（宝酒造社製）を添加し、３７℃で６０分間反応
後、６５℃で１０分間加温して反応を停止させる。この
混合消化物にＴ４リガーゼ用ｔ１衝液４０ρ、Ａ　Ｔ　
Ｐ　（５ｍＭ）　４０ρ、Ｔ４リガーゼ０．４ρおよび
水１２０ｐを加え、１２℃で１６時間反応させる。この
混合物をＴＥＳ緩衝液で飽和したフェノール４００屑で
２回抽出し、ＴＢＳ緩衝液に対して透析しフェノールを
除去する。

このリガーゼ反応混合物を大腸菌に一１２株亜株ＰＰＣ
２（Ｇｌａｎｓｄｏｒｆｆ、　Ｎ、、　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、　５１．　１５７（１９６５））　（ａｒｇ−、ｔ
ｈｒ、　１ｅｕ−、ｔｕｓ−、Ｔｈ１−、　ＰＰＣ−。

ＳＴ”）の形質転換に供する。ＰＰＣ２株のコンピテン
ト・セルは２ｍｇ／ｍｌのグルタミン酸を補ったし培地
で培養し、実施例２（１）でＧＴ−３株のコンピテント
・セルを得たのと同様に調製する。形質転換は前記リガ
ーゼ反応混合物２００ｍを使用し、実施例２（１）と同
様に行う。Ｌ培地９ｍｌを添加し、３７℃で２時間振盪
培養して形質発現させる。次いで生理食塩水で２回遠心
洗浄後、アルギニン、スレオニン、ロインン、ヒスチジ
ン各５０４　／ｍ　ｌを補ったＭ９最少寒天培地に塗布
し、３７℃で３日間培養する。出現したコロニーをアン
ピシリン２５■／ｍｌあるいはテトラサイタリン２５　
ｇ　／ｍ　＋を含むＬ寒天培地上にレプリカし、３７℃
で２４時間培養してアンピシリン耐性でテトラサイクリ
ン感受性のものを選び出す。

これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様の方法で
プラスミドＤＮＡを単離する。形質転換株の一株から得
られたプラスミドｐＰＣｌを制限酵素消化とアガロース
ゲル電気泳動で解析した結果、ｐ８Ｒ３２２のＳａｌ　
ｌ切断部位に４．４ＫｂのＤＮＡ断片が挿入されたゲノ
ムサイズ８．８にｂの組換え体プラスミドであることが
判明した。

このｐｐｃ　ｌ　プラスミドを用いてＰＰＣ２株を前記
と同様な方法で形質転換し、アンピシリン耐性で選択さ
れる形質転換株は全てグルタミン酸非要求性で、制限酵
素切断様式で特徴づけられるｐｐｃ　Ｉ　と同一構造の
プラスミドを保有している。このことはｐＰＣ１プラス
ミド上に大腸菌のＰＰＣ遺伝子がクローン化されている
ことを示す。

クローン化されたＰＰＣ遺伝子をコリネバクテリウム・
グルタミクムに導入するために、ｐＣＧ　１１とｐＰＣ
ｔの組換え体を宿主大腸菌で調製する。

ｐｃＧｌｌおよびｐｐｃ　１プラスミドＤＮＡを各々２
爬含む制限酵素Ｐｓｔｌ用反応緩衝液（２０ｍＭ　）　
リス塩酸、１０ｍ１Ｊ　ＭｇＣ１ｘ　、５０ｍ１１（Ｎ
Ｈ，）２ｓＯ４，０，０１％ウシ血清アルブミン、ｐｔ
１７．５）　２００ｔｄｌに４単位のＰｓｔＩ（宝酒造
社製）を添加し、３０℃で６０分間反応後、６５℃で１
０分間加温して反応を停止させる。この反応混合物にＴ
４１Ｊガーゼ用緩衝液４０ｇ、ΔＴ　Ｐ　（５ｍＭ＞　
４０ｔｔｌＳＴ　４リガーゼ０．２度および水１２０ρ
を加え、１２℃で１６時間反応させる。前記と同様にフ
ェノール抽出後、透析してフェノールを除去する。この
リガーゼ反応混合物１ｏｏＩｉ１を使用し、前記と同様
にＰＰＣ２株を形質転換した。

生じたコロニーから前記の方法でプラスミドを分離し、
その大きさをアガロースゲル電気泳動で調べた。大きさ
が約１５〜１６にｂのプラスミドを選択し、そのプラス
ミドで再度ＰＰＣ２株を形質転換しＰＰＣ遺伝子の存在
を確認した。先の形質転換株の一株から得られたプラス
ミドｐεｐｐｃ　１を制限酵素消化とアガロースゲル電
気泳動で解析した結果、ｐｃＧｌｌとｐＰｃｌが両者の
Ｐｓｔ　ｌ切断部位で和合連結したゲノムサイズ１５．
６Ｋｂの組換え体プラスミドであることが明示された。

こうして大腸菌で調製されたｐｅｐｐｃ　ｔ　プラスミ
ドＤＮＡを用い、コリネバクテリウム・グルクミクムＬ
−２２株から誘導されたＬＰ４株を形質転換する。形質
転換は実施例１（２）と同様に行い、形質転ＩＩ！株は
スベクチノマイシン４００■／の１を含むＲＣＧＰ寒天
培地上で生育するコロニーの中から取得される。これら
の形質転換株から単離されるプラスミドを制限酵素５ａ
ｉｌあるいはｐｓｔ　１の単独消化または両者の２重消
化し、アガロースゲル電気泳動で解析することにより１
１Ｂ＋１１）Ｃｉを保有していることが［Ｈされる。

ｐＥｐｐｃ　１保育園株は米国アメリカン・タイプ傘カ
ルチャー譬コレクション１ごＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｕ　ｉｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｋ−１８＾ＴＣＣ３９
０３３として寄託されている。

（２）　　ｐＥ９ｐＣ１保有株によるグルタミン酸の生
産：コリネバクテリウム・グルタミクムし一２２株から
誘導されたＬＰ４株のｐＥｐｐｃ　ｌ保有株（ＡＴＣＣ
３９０３３）　と罪作を株のグルタミン酸生産試験を行
った。ＮＢ寒天培地上で生育させた菌をかき集め、生理
食塩水で洗浄後、５ｎ＋ｌの生産培地Ｐ３（グルコース
５０ｇ、　（Ｎ）１４）２ＳＯ４３ｇ、尿素３　ｇＳＫ
Ｈ，ＰＯ，０，５ｇ、　Ｋ２１（ＰＯ４０，５ｇ。

！ＪｇＳＯ＜・７Ｈ２０ｏ、　５　ｇ　、　Ｆｅ５Ｏｓ
−７Ｌ０１０ｍｇ、　！ｎｓＯ＋・４〜６８，０１０ｍ
ｇ、ビオチン３眉、サイアミン塩酸塩５００■、フェノ
ールレッド１０ｍｇを純水１ｐに含み、ｐＨ１，２に調
整した培地〕の入った試験管に植菌し、３０℃で振盪培
養する。培養中、２０％尿素液をＱＪｍｌずつ３回添加
し、４０時間培養する。培養後、培養済液をペーパーク
ロマトグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定
量してＬ−グルタミン酸の生成催を測定した。

結果を第３表に示す。

第　　　３　　　表 Ｐ−４ １０，１ 実施例４．　ブレビバクテリウム・フラブムＡＴＣＣ１
４０６７のアンスラニル酸合成酵素遺伝子のコリネバク
テリウム・グルタミクムでのクローン化と発現： ブレビバクテリウム・フラブムＡＴＣＣ１４０６７の染
色体ＤＮＡを実施例１（１）と同様の方法で調製する。

ベクターとして用いるｐＣＥ５３は実施例１　（１）で
ｐｃＧｌｌをＫＬＨＩ、たのと同様の方法でその保存株
コリネバクテリウム・グルタミクムし一２２株の培養菌
体から単離する。ｐＣε５３は本発明者らが先に開示し
たコリネバクテリウム・グルタミクムのプラスミドｐｃ
ＧＩ　Ｃ特願昭５６−１８１０１（特開昭５７−１３４
５００）　）と大腸菌のプラスミドｐＧ＾２２〔静、　
Ｇ、　ｅｔ　ａｌ　：Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　
１４０．４００（１９７９）参照〕を和合連結させたプ
ラスミドである。詳しくはｐｃＧ　ｌ上に１ケ所しかな
いＢｇＩＵ切断部位とｐＧ＾２２上に２ケ所あるＢａｍ
ＨＩ切断部位のうちテトラサイクリン耐性遺伝子内でな
いＢａｍｔｌ　Ｉ切断部位とで、両制限酵素の同一接着
末端を利用して連結したものである。

ｐＣＥ５３はｐＧ＾２２由来のカナマイシン耐性遺伝子
などの選択マーカーを有し、制限酵素５ａｌｌに対する
切断部位は１ケ所である。

上記で調製したｐＣε５３プラスミドＤＮＡ　３Ｊｉｇ
および染色体ＤＮＡ９■を含む制限酵素Ｓａｌ　Ｉ反応
液２００　ｍにＩＯ単位のＳａｌ　Ｉを添加し、３７℃
で６０分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停
止させる。この混合消化物にＴｌガーゼ用緩衝液４０頭
、Ａ　Ｔ　Ｐ　（５ｄ）　４０ρ、Ｔ４リガーゼ０．４
ｄおよびＨ２Ｏ１２０４を加え、１２℃で１６時間反応
させる。この混合物をＴＢＳ緩衝液で飽和したフェノー
ル４００ｍで抽出し、ＴＢＳ緩衝液に対して透析し、フ
ェノールを除去する。

このリガーゼ反応混合物を形ｆｆ転換に供する。

形質転換する受容菌としてコリネバクテリウム・グルタ
ミクムし一２２株から誘導されたアンスラニル酸要求性
変異株ＬＡ１０５（アンスラニル酸合成酵素欠損変異株
）を用いる。アンスラニル酸要求性変異株は、常法の変
異処理により、Ｍ１寒天培地上で生育できず、アンスラ
ニル酸（３０ｑ／ｍｌ相当）を補ったＭｌ寒天培地上で
生育できる菌を選択することによって取得される。ＬＡ
１０５株のプロトプラストの調製および形質転換は、生
育培地ＮＢに１００　ｇ／ｍｌ相当のアンスラニル酸を
補った培地を使用する以外は実施例１（２）と同様に行
う。形質転換株は、カナマイシン２００■／ｍ　！相当
を含むＩＩｃＧＰ寒天培地上で生育するコロニーとして
選択される。出現したコロニーの中からＭ１寒天培地上
で生育できる形質転換株が得られる。

これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様にプラス
ミドＤＮＡを単離する。形質転換株の一株から得られた
プラスミドρＴｒｐ　２−３を各種制限酵素消化とアガ
ロースゲル電気泳動で解析した結果、ρＣε５３の唯一
の５ａｌｌ切断部位に約７，１にｂの５ａｌｅ）ＮＡ切
断片が挿入されたプラスミドであることがわかった。

ｐＴｒｐ　２−３を用い、同様な方法でＬＡ１０５株を
再形質転換したところ、トリプトファン１１００ｕ／ｍ
　＋およびカナマイシン４００趨／ｍｌを含むＲＣＧＰ
寒天培地上で生育するコロニーは、同時にアンスラニル
酸非要求性となり、それらは、Ｓａｌｌの切断様式で判
定されるｐＴｒｐ　２−３と同一のプラスミドを保有し
ている。

以上の結果は、クローン化された約７．１にｂの５ａｌ
ｌＤＮΔ切断片にはブレビバクテリウム・フラブムＡＴ
ＣＣ１４０６７のアンスラニル酸合成酵素をコードする
遺伝子が存在し、それがコリネバクテリウム・グルタミ
クムＬＡ　ｌ　０５株中で発現していることを示す。

ｐＴｒｐ　２−３保育園株は米国アメリカン・タイプ・
カルチャーユコレクションにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
　ｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｋ２０＾ＴＣＣ３９０
３５として寄託されている。

プラスミドｐＣε５２を用いて上記と同様の処理を行い
、ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６７の
アンスラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を有するプ
ラスミドｐＴｒｐ　４−３を得る。

ｐｉＩＣ５２は本発明者らが先に開示したコリネバクｆ
’）ラム・グルタミクムのプラスミドｐｃＧＩ　Ｃ特願
昭５６−１８１０１（特開昭５７−１３４５００）　）
と大腸菌のプラスミドｐＧ＾２２〔＾ｎ、　　Ｇ、　　
ｅｔ　ａ上：　Ｊ、　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１４０、４００（１９７９）参照〕を和合連結させたプ
ラスミドである。詳しくはｐＣＧ　１上に１カ所しかな
いＢｇｊ’ＩＩ切断部位とｐＧ＾２２上に２カ所あるＢ
ａｍＨＩ切断部位のうちテトラサイクリン耐性遺伝子内
のＢａｍＨＩ切断部位とで、両制限酵素の同一接着末端
を利用して連結したものである。ｐｃＥ５２はｐＧＡ２
２由来のカナマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーを
有し、制限酵素Ｓａｔ　Ｉに対する切断部位は１カ所で
ある。

ｐＣε５２は実施例１　（１）でｐｃＧｌｌを単離した
のと同様の方法でｐｃＩＥ５２保有株コリネバクテリウ
ム・グルタミクムし一２２株の培養菌体から単離する。

上記と同様にトリプトファン生産性のコリネバクテリウ
ム・グルタミクムに３６株（ＦＥＲＩＩ　０Ｐ−４５１
）をｐＴｒｐ　４−３で形質転換する。得られた形質転
換株は米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク’
／　ヨンニＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ＋ｕｍ　ｇｌｕｔ
ａｍｉｃｕｍに３１゜ＡＴＣＣ３９２８０として寄託さ
れている。

ｐＴｒｐ　２−３保有株コリネバクテリウム・グルタミ
クムに２０．ＡＴＣＣ３９０３５およびｐＴｒｐ　４−
３保有株同に３１．ＡＴＣＣ３９２８０によるＬ−）リ
プトファン生産試験を下記のとおり行う。

菌株をＮＢ液体培地中で３０℃、１６時間振盪培養した
菌液０．５ｍｌを５ｍｌの生産培地Ｐ４Ｃ廃糖蜜１００
ｇ／　１、（ＮＨ，）　２３０４２０　ｇ　／　１、Ｋ
Ｈ２ＰＯ，０，５ｇ／ｌ、に２ＨＰＯ４０，５ｇ／ＣＭ
ｇ５Ｏ＜・７Ｌ００．２５ｇ／　ｊ！、　ＣａＣＯ３２
０ｇ／　１、ｐＨ１，２３の入った試験管に植菌し、３
０℃で９６時間振盪培養する。

培養後、培養ｐ液をペーパークロマトグラフィーにかけ
、ニンヒドリン発色後、比色定堡して、Ｌ−ト９ブトフ
ァンの生成量を測定する。

対照として、ＬＡ−１０５株およびＬＡＲ−１株を同様
に処理する。

結果を第４表に示す。

第　　　４　　　表 菌　　　　株　　　　　　　　　　　　　　　Ｌ−トリ
プトファン（ｍｇ／ｍ１）ＬＡ−１０５ ＬＡ−１０５／ｐＴｒｐ　　２−３（Ｋ２Ｏ，ＡＴＣＣ
３９０３５）　　　　　０．３　４ＬＡＲ−１０，４８ ＬＡＲ−１／ｐＴｒｐ　　４−３（Ｋ３１．　　ＡＴＣ
Ｃ３９２８０）　　　　　１．１　２実施例５．　１１
ＣＢＩＯＩの作製： （１）　　ｐｃＧｌｌ　とｐ［ｌＢ１１０の分離ｐｃＧ
１１　は、本プラスミドを保有するコリネバクテリウム
・グルタミクムＬＡ１０３／ｐｃＧ１１（ＡＴＣＣ３９
０２２＞を４００ｍ１ＮＢ培地でＯＤ約０．８になるま
で生育させ、その培養細胞から、実施例１　（１）でＩ
］ＣＧ２を単離したのと同一の方法で単離する。

ｐＵＢｌｌｏは、グリクヂンらの方法［Ｇｒｙｃｚａｎ
。

Ｔ、Ｊ、　ｅｊ　　ａｌ、　　：　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏ１１１３４．３１８（１９７８）参照〕により、本
プラスミドを保有するバチルス・サチルスＢＲ”’／ｐ
ＨＢ”’　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７５．１４２３（１
９７８）　）の培養菌体から単離する。

（２）　　ｐｃＧｌｌ　とｐＵＢｌｌｏの試験管内組換
え上記で調製したｐｃＧｌｌ　プラスミドＤＮＡ　２ｔ
ｔｇを含む制限酵素８ｇ（＃反応緩衝液（１０ｍＭ　ト
ＩＪス塩酸、？＋ｎＭ　　ＪＣｊ！２，６０ｍＭ　　Ｎ
ａＣ１，７ｍＭ　２−１ルカブトエタノール、　ｐＨ７
，５）　　１００ｔｔ！ｌに２単位のＢｇｆ■（宝酒造
社製、６単位／廣）を添加し、３７℃で６０分間反応さ
せる。また、ｐＵＢ１１０プラスミドＤＮＡ２ｇを含む
制限酵素［］ａｍＨＩ反応緩衝液（１０ｍＭ　）リス塩
酸、７ｍＭ　ＭｇＣ１＊　、１０（１ｍＭＮａＣ１，２
ｍＭメルカプトエタノール、０．０１％ウシ血清アルブ
ミン、ｐＨ８，０）　　１００ｍに２単位のＢａｍＨＩ
（宝酒造社製、６単位／４）を添加し、３７℃で６０分
間反応させる。

両制限酵素消化物を混合し、Ｔ４１Ｊガーゼ緩衝液４０
ρ、Ａ　Ｔ　Ｐ　（５＋＋＋Ｍ）４０ｍ、　Ｔ　４リガ
ーゼ０．２Ｊ１１！およびＨ，０１２０ｍを加え、１２
℃で１６時間反応させる。この混合物を、ＴＥＳｆｆ衝
液で飽和したフェノール４００ｇで２回抽出し、ＴεＳ
緩衝液に対して透析したフェノールを除外する。

（３）　　ｐｃＢＩＱｌの取得 ２倍高濃度のＴＳ１４１Ｊｌ衡液と上記リガーゼ反応混
合物の１対１混合液１００ＪＬ１を供与ＤＮＡとして用
い、実施例１（３）と同様な方法で、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムＬＡ１０３を形質転換し、カナマイシ
ン耐性株を選択する。出現したコロニーをカナマイシン
１２．５ｘ／ｆａｌするいはスペクチノマイノン１００
ｇ／ｍｌヲ含ムＮＢ寒天培地上にレプリカし、３０℃で
２日培養して生育した二重耐性形質転換株３株を任意に
選び、同−寒天培地上で純化する。この３株を４００ｄ
ＮＢ培地で、ＯＤ約０．８になるまで生育させ、集菌後
、その培養細胞から実施例１（１）記載のエチジウムブ
ロマイド−セシウムクロライド密度勾配遠心によりプラ
スミドを単離する。いずれの形質転換株からも３０〜３
５■のプラスミド０１１人が得られる。

これらのプラスミドＤＮＡを実施例１（３）と同じよう
に制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析し、分
子量と制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ　、　［！ｃｏＲｒ　。

１ｉｎｃｌＩおよびＢｇｆｆｌｌの切断点を同定する。

３株のプラスミドは全てｐ［：Ｇ１１とｐＵＢｌｌｏが
和合連結した構造を有し、そのうち二種は第２図にｐｃ
ＢＩＱｌで示した構造であるが、他の一種は結合向きが
逆向きである。

いずれのプラスミドを有する形質転換株もｐｃＧｌｌ由
来のスペクチノマイシン耐性形質とｐＵＢ１１０由来の
カナマイシン耐性形質を有している。

これらのプラスミドＤ　Ｎ　Ａを用い、コリネバクテリ
ウム・グルタミクムＣ１５６株を再形質転換した結果帰
られたカナマイシン耐性形質転換株は、スペクチノマイ
シン耐性形質を同時に獲得しており、各種制限酵素切断
様式で特徴付けられる供与プラスミドと同一のプラスミ
ドを保有している。

実施例６゜ コリネバクテリウム・グルタミクムＣｌ５６株のし一ヒ
スチジン生合成に関与する遺伝子のクローン化および該
遺伝子の発現を利用したコリネバクテリウム・グルタミ
クム、コリネバクテリウム・ハーキユリス、ブレビバク
テリウム・フラブムおよびブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムによるし一ヒスチジンの生産： （１）　　コリネバクテリウム・グルタミクムＣ１５６
株の染色体ＤＮＡとプラスミドｐＣＧ　１１の調製＝１
、２．４−　）リアゾール−３−アラニン耐性でヒスチ
ジン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミクム
Ｃｌ５６株（ＦＥＲＭ　０Ｐ−４５３＞の染色体ＤＮＡ
を実施例１（１）と同様の方法で調製する。

一方、ベクタープラスミドとして用いるρＣＧＩＩは、
コリネバクテリウム・グルタミクムし一２２株の誘導株
Ｌ＾１０３のｐｃＧ１１保有株ＬＡ１０３／ｐＣＧｌｌ
（＾ＴＣＣ３９０２２）から実施例１（Ｉ）と同様にし
てＩＩＬ離する。

（２）　　コリネバクテリウム・グルタミクムＣ１５６
株のヒスチジン生合成に関与する遺伝子のクローン化： 上記で調製したｐｃＧｌｌ　プラスミドＤＮＡ３■およ
び上記染色体ＤＮＡ９ｇを含む制限酵素８ｇ１Ｕ用反応
液Ｃ１（１ｍＭ）リス（ｐＨ４７，５＞　、７ｍＭＭｇ
ＣＩ２．６０ｍＭ　ＮａＣＣ７ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール３２００ｇ＋に１０単位のＢｇｊ！ＩＩ（宝酒造
社製）を添加し、３７℃で６０分間反応後、６５℃で１
０分間加温して反応を停止させる。この混合消化物にＴ
４リガーゼ用榎衝液（トリス２００ｍＭ　。

１１ｇｃ　Ｒ２５（ｉｍＭ、ジチオスレイトール１００
ｆｆｌｌＪ１ｐＨ７、６　’）　４０μｓ、５ｍＭＡＴ
Ｐ溶液４０屑、Ｔ４リガーゼ（宝酒造社製、１単位／Ｊ
１１）０．３ｍおよび水１２０ｍを加え、１２℃で１６
時間反応させる。

Ｔ４４リガーゼ応混合物をコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＬＨ３３株（ヒスチジン要求性、リゾチーム感受
性）の形質転換に供する。

形質転換はＬＨ３３株のプロトプラストを用いて行う。

プロトプラストの調製は実施例１（２）と同様に行う。

プロトプラスト懸濁液Ｑ、５ｍｌを小試験管にとり２５
００　Ｘ　ｇで５分間遠心分離し、ＴＳＭｔＪｌｉ液（
１０ｍＭ塩化マグネシウム、３０ｍＭ塩化カルシウム、
５０１ＴＩＭトリス、４００ｍＭ　ショ糖、ｐＨ７，５
）　　１１１１１に再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＩＪＣ
緩衡液Ｑ、１ｍｌに再懸濁する。この懸濁液に２倍濃度
のＴＳＭＣ緩衝液と上記リガーゼ反応ＤＮＡ混合物のｌ
対１混合液１００ρを加えて混和し、次いでＴＳＭＣ１
ｌ衝液中に２０％Ｐ　Ｅ　Ｇ６．０００を含む液Ｑ、３
ｍ＋を添加して混合する。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ
７，２）２ω１を添加し、２．５００Ｘｇで５分間遠心
分離にかけて上澄み液を除去し、沈降したプロトプラス
トを１ｍｌのＲＣＧＰ培地に懸濁してからＱ、２ｍｌを
スペクチノマイシン４００■／ｍ　Ｉを含むＲＣＧＰ寒
天培地（ＲＣＧＰ培地に１．４％寒天を含む培地、ｐＨ
７，２）に塗抹し、３０℃で７日間培養する。

選択プレート上に生育したスペクチノマイシン耐性コロ
ニーをかき集め、生理食塩水を用いて２回遠心洗浄後、
スペクチノマイシン１００４ｇ　７ｍ　Ｉを含む最少寒
天培地Ｍ１に塗布して３０℃で２日間培養し、スベクチ
ノマイシン耐性でかつヒスチジン非要求性となった形質
転換株を選択する。

形質転換株の１株から実施例１（１）記載のエチジウム
ブロマイド・セシウムクロライド密度勾配遠心によりプ
ラスミドを単離する。各種制限酵素による単独消化およ
び２種類の制限酵素による二重消化で生成するＤＮＡ断
片をアガロースゲル電気泳動で解析し、このプラスミド
ＤＮＡの制限酵素切断様式を同定する。このプラスミド
をｐＰｌ８と命名した。ｐＰｌ８はｐｃＧｌｌ　のＢｇ
Ｊ’ＩＩ切断部位に約１０．６ＫｂのＤＮＡ断片が挿入
された構造である。

さらにｐＰｌ８　Ｄ　Ｎ　Ａを用いてＨ３３株［ＬＨ３
３株の親株（ヒスチジン要求性、リゾチーム耐性）　：
ＦＥＲＭ　０Ｐ−４５２）を再形質転換したところスベ
クチノマインン耐性株として選択される形質転換株のす
べてがヒスチジン非要求性となっていた。

これらのことより、ヒスチジン生産菌Ｃｌ５６株のヒス
チジン生合成に関与する遺伝子がクローン化されている
ことが明白である。

ヒスチジン生成に関与する遺伝子のクローニングは最初
から８３３株を宿主菌株として用いて行うこともできる
。

（■　ｐＰｌ８を保有するコリネバクテリウム・グルタ
ミクム菌株によるし一ヒスチジンの生産：コリネバクテ
リウム・グルタミクムＬＡ−１０３株（ＦＥＲＭ　Ｐ−
５９４７、＾ＴＣ（：３１８６６）をｐＰｌ８　Ｄ　Ｎ
　Ａで形質転換し、スベクチノマイシン４００ｇ／ｍｌ
を含むＲＣＧＰ寒天培地上で同薬剤耐性の形質転換株を
選択する。得られた形質転換株を純化後、上記と同様に
プラスミド単離、構造解析を行って、ｐＰｌ８と同じ構
造のプラスミドであることを確ｌ忍した。

ｐＰｌ（８保有株コリネバクテリウム・グルタミクムＬ
Ａ１０３／ｆｌＰＨ８は米国アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｋ３２．ＡＴＣＣ３９２８１
として寄託されている。

コリネバクテリウム・グルタミクムＬＡ１０３　／ｐｃ
Ｇ１１（ＡＴＣＣ３９０２２）および同ＬＡ１０３／１
１ＰＨ８（ＡＴＣＣ３９２８１）のＬ−ヒスチジン生産
試験を以下のとおり行う。

ＮＢ寒天培地上で３０℃−晩培養した上記の閑をそれぞ
れ１白金耳ずつ２００　ｇ／ｍｌのアルギニンおよびメ
チオニンを補った５１の生産培地Ｐ５Ｃ糖蜜１２％（糖
として）、ＫＨ２ＰＯ，０，２％、Ｋ２ＨＰＯ４０，１
％、Ｍｇ５Ｏ＜・７Ｌロ　　　０．０５％、ＮａＣｌ１
　０．２５％、（Ｎ）１．）　２ＳＯ４２，３％、尿素
０．２％、ＣａＣ０＝　　２％、ｐＨ７，４（アンモニ
アで調整）〕に植菌する。３０℃で７５時間培養後、培
地中のし一ヒスチジン生成量をスルフアニル酸（ボーリ
ー）試薬を用いる比色法１：Ｈ，Ｐａｕｌｙ。

Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒｓ　；　１．Ｐｈｙｓｉｏｌ
ｏ、　Ｃｈｅｍ、４２．５０８（１９０４）　、同９４
．２８４（１９１５）　）によって定１した。結果を第
５表に示す。

第　　　５　　　表 ＬＡ１０３／Ｉ）ＣＧＩＩ　　　　　　　ＯＬΔ１０３
／ｐＰＨ８（Ｋ３２）　　　　２．６（４）　　ｐ　Ｐ
　Ｈ８を保有する１リネバクテリウム・ハーキュリス、
ブレビバクテリウム・フラブムおよびブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムによるＬ−ヒスチジンの生産
： コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６８
、ブレビバクテリウム・フラブムＡＴＣＣ１４０６７お
よびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣ
Ｃ１３８６９にプラスミドｐＰＨ８を保有させるために
、各菌株を受容菌として形質転換を行う。

各菌株を３３Ｍ培地で増殖させ、ＯＤ６６００ｍが０．
２になったときにペニシリンＧを０．３単位／ｍｌとな
るように添加する。培養を続け、００６６０ｎｍが０．
６まで増加したところで集菌し、１ｍｇ／ａ＋１リゾチ
ームを含むＲＣＧＰ培地中で上記の記載と同様にプロト
プラストを形成させる。ｐＰＨ８を用い、上記の方法に
従い形質転換を行い、形質転換株をスベクチノマイシン
４００　ｇ／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地上で生育する
コロニーとして選択する。

純化したスペクチノマイシン耐性形質転換株の培養菌体
よりプラスミドＤＮＡを特開昭５７＝１８３７９９、同
５７−１３４５００の記載に従って調製し、これらがｐ
Ｐｌ（８と同じ構造を有することが制限酵素切断様式よ
り確認される。以上のこ々から、プラスミドｐ［：Ｇ１
１の誘導体であるプラスミドｐＰＨ３はコリネバクテリ
ウム・ハーキュリス、ブレビバクテリウム・フラブムお
よびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム中でも
複製可能であり、プラスミドｐｃＧ１１が広くこれら菌
種の細菌で使用可能であることがわかる。

ｐＰＨ３保有株であるコリネバクテリウム・ハーキュリ
スに３３、ブレビバクテリウム・フラブムに３４、およ
びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムに３５は
それぞれ米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションにＡＴＣＣ３９２ｇ２．３９２８３および３９２
８４として寄託されている。

これら菌株によるし一ヒスチジン生産試験を次のように
行う。

ＮＢ寒天培地上で３０℃−晩培養させたｐＰＨ８保有株
およびそれらの親株をそれぞれｌ白金耳ずつ５ｍｌの生
産培地Ｐ５に植菌する。３０℃で７５時間振盪培養後、
培地中のし一ヒスチジン生産量をボークー法によって比
色室ｌする。結果を第６表に示す。

第　　　６　　　表 菌　　　株　　　　　　Ｌ−ヒスチジン（ｍｇ／ｍｌ） 以上より、コリネバクテリウム・グルタミクム由来のヒ
スチジン生成゛に関与する遺伝子がコリネバクテリウム
・グルタミクム以外にコリネバクテリウム・ハーキュリ
ス、ブレビバクテリウム・フラブム、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムの諸菌種において発現し、ヒ
スチジンの生産に寄与していることが明らかであった。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＧＨ２の制限酵素地図を示す。 第２図はプラスミドｐｃｆｌｌ（ＩＩの制限酵素地図を
示す。 第３図はプラスミドｐ８ｔｈｒ　１の造成のフローチャ
ートを示す。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社梢 ｚ 蕗 図 属 ■ ｎａｍｌｌＩ／ＢｇｌＩＩ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
   し、大腸菌由来のフォスホエノールピルビン酸カルボキ
   シラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とコリネ
   バクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種中で自
   律複製可能なベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有
   する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−グルタミン
   酸を生成蓄積させ、該培養物からＬ−グルタミン酸を採
   取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。