JPH04229193A - エタノール分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床化学およびエタノ
ールを定量的にアッセイするための要素に関する。

【０００２】

【従来の技術】水性体液、特にヒトの体液中のエタノー
ルの定性的および定量的測定方法は、医学上および法規
制上使用される。

【０００３】医学上、血中のエタノールの測定は肝機能
不全およびアルコール中毒を診断する上で重要である。 法規制上、そのようなアッセイは、自動車運転手が酒酔
い運転をしているのかどうか決定するのに使用される。

【０００４】東ドイツ特許第　ＤＤ２５６，１９６Ａ１
号明細書は、生物学的流体中のエタノール含有量を測定
するための試験ストリップを公表している。上記試験ス
トリップは、下記の一連の化学反応に基づいている。

【０００５】

【化１】

【０００６】上式中ＭＴＴは〔３−（４，５−ジメチル
チアゾリル−２）２，５−ジフェニルテトラゾリウム〕
である。

【０００７】この試験ストリップは、 （１）１−メトキシ−フェナジンメトスルフェートのよ
うな電子移動に適する化合物； （２）テトラゾリウム塩、特に　ＭＴＴ〔３−（４，５
−ジメチル（チアゾリル−２）２，５−ジフェニルテト
ラゾリウム〕および／または　ＩＮＴ〔２−（４−ヨー
ドフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−ジフ
ェニルテトラゾリウム〕； （３）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）；（４）
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋　）
　；ならびに （５）緩衝液（ｐＨ１〜４）、特にグリシン／塩酸緩衝
液および緩衝液（ｐＨ７〜９）、特にセミカルバジド緩
衝液；を包含する。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】課題は、上述の要素が
、室温で１〜２週間保存後エタノールの定量的アッセイ
に適さないことである。エタノールの定量的なアッセイ
用に作製される上記化学薬品の組み込まれた乾式多層要
素は、わずか３週間保存後でもエタノール濃度の値の予
測を一貫して下まわる。加えて、上記従来技術の要素は
、アスコルビン酸のような血清成分から妨害を受ける。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、テトラゾリウ
ム塩、アルコールデヒドロゲナーゼ、　ＮＡＤ＋　およ
び電子移動剤を含んでなるエタノールを定量的にアッセ
イするための多層分析要素であって、電子移動剤を含ん
でなる層が負に荷電された反復基を有するポリマーをも
包含し、そして　ＮＡＤ＋　が別の層に存在することを
特徴とする多層分析要素を提供することにより前述の課
題を解決する。

【００１０】また、好ましい態様では、前述の要素は、
試験試料中のいずれかのアスコルビン酸によって生ずる
アスコルビン酸の妨害を除去するアスコルビン酸オキシ
ダーゼも包含する。

【００１１】以下、本発明を具体的に説明する。限定さ
れるものでないが、本発明の要素の有用な態様は、下記
の配置および含有量で示される要素を含有する。

【００１２】

【表１】

【００１３】上記要素は、良好な精密度および許容され
る正確度で、０〜　５００ｍｇ／ｄｌの範囲内にある生
物学的流体中のエタノール分析に適する。一般に、負に
荷電された基（例えば、カルボン酸基もしくはスルホン
酸基）を含むいずれかのポリマーもしくはコポリマーが
、本発明の実施において有用であろう。有用な酸根類と
しては、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、メサ
コン酸およびエタンスルホン酸が挙げられる。

【００１４】好ましいポリマー類は、下記、ポリ（メチ
ルアクリレート−コ−２−スルホ−１，１−ジメチルエ
チルアクリルアミド−コ−２−アセトアセトキシエチル
メタクリレート）；ポリ（２−ヒドロキシエチルメタク
リレート−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパ
ンスルホン酸ナトリウム塩−コ−アセトアセトキシエチ
ルメタクリレート）；ポリ（アクリルアミド−コ−２−
スルホ−１，１−ジメチルエチルアクリルアミド）；お
よびポリ（アクリルアミド−コ−２−アクリルアミド−
２−メチルプロパンスルホン酸、ナトリウム塩）である
。好ましいポリマー塗布量は０．６ｇ／ｍ２　である。 有用な範囲は０．１〜４ｇ／ｍ２　である。有用な電子
移動剤は、一般式

【００１５】

【化２】

【００１６】（上式中、Ｒ１　はアルキル基を表わして
もよくそしてＲ２　はアルコキシ基もしくは水素原子を
表わしてもよい）で示され、好ましくは、特定の試料中
で起こる化学反応と予期されるエタノール量との化学量
論に基づいて考えられる触媒濃度の１−メトキシ−５−
メチル−フェナジニウム−メチルスルフェート（１−メ
トキシ−フェナジン−メトスルフェート）および５−エ
チル−フェナジニウム−メチルスルフェート（フェナジ
ン−エトスルフェート）である。

【００１７】テトラゾリウム塩、電子キャリア成分、と
しては、例えば、３−（４，５−ジメチル−チアゾリル
−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム；２−（４
−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５
−フェニルテトラゾリウム；２，３，５−トリフェニル
テトラゾリウム；ニトロブルーテトラゾリウム；ブルー
テトラゾリウム；テトラニトロブルーテトラゾリウム；
およびチオカルバミルニトロブルーテトラゾリウムなど
が挙げられる。また、これらの塩類は化学量論量で使用
される。

【００１８】酵素アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ
）　は、化学量論量で使用される。ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋　）　は、エタノールか
らアセトアルデヒドへ転化する酸化剤として作用し、テ
トラゾリウム塩を着色ホルマザン色素へ還元するＮＡＤ
Ｈを生成する。

【００１９】使用に適する緩衝液の具体例としては、グ
リシン／塩酸緩衝液、セミカルバジド／グリシン緩衝液
、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、フタル酸緩衝液、クエ
ン酸緩衝液およびホウ酸／コハク酸緩衝液などがある。 好ましい緩衝液は　０．０２５〜０．２モル濃度のセミ
カルバジド／グリシン緩衝液およびグリシン／塩酸緩衝
液である。

【００２０】本発明の要素を使用して、動物もしくはヒ
ト、しかし好ましくはヒトの生物学的流体中のエタノー
ルを定性的および定量的にアッセイすることができる。 限定されるものでないが、このような流体類としては、
全血、血漿、血清、リンパ液、胆汁、尿、脊髄液、痰お
よび汗など、ならびに便分泌物が挙げられる。また、ヒ
トの組織もしくは動物の組織、例えば骨格筋、心臓、腎
臓、肺、脳、骨髄および皮膚などの流体調製物もアッセ
イすることができる。

【００２１】本発明の要素類は、いずれかの所望の幅の
延伸テープ類、シート類、スライド類もしくはチップ類
を包含する種々の形の形状でありうる。

【００２２】要素は手動または自動化されたアッセイ技
術で使用できる。一般的に、要素の使用に際して供給ロ
ール、チップパケットもしくは他の供給源から要素を取
り、そして要素を試験する液体（例えば、　２００μｌ
まで）試料と物理的に接触せしめることにより、上記試
料と試薬類が要素内で混合されて連続的に相互作用する
結果、エタノール測定が行われる。このような接触は、
いずれかの適当な方法、例えば、要素を試料中へ浸漬す
るかまたは浸すことにより、また好ましくは、手動もし
くは機械により適当な分配手段で一滴の試料を要素にス
ポットすることにより達成できる。

【００２３】試料塗布後、発色を促進するためにその要
素は５分間以内インキュベーションされる。インキュベ
ーションとは、本発明者らは色調測定前５分以内、試薬
類を相互に接触した状態で単に維持することを意味する
。

【００２４】本発明の乾式分析要素は、多層である。層
の１つは層開機能を有する。ある態様では、要素は、少
なくとも２つの異なる区画を有する追加の試薬層と供に
組み合わせた試薬／展開層を包含する。すべての前述の
層は支持体上に塗布される。一般に、これらの層は流体
中で相互に接触しており、これは、流体、試薬および反
応生成物（例えば、着色色素）が隣接区画の重なった部
分の間を通過もしくは輸送されうることを意味する。換
言すれば、要素を水性流体と接触せしめる場合、本発明
の分析組成物のすべての試薬類が前述のように連続的に
混合され、そして組成物のように要素中を容易に移動で
きる。各層が分離しているか、または２つ以上の区画が
要素の単一層中の別々の領域にあってもよい。また、上
述したものの適当な要素成分は、例えば、米国特許第　
４，０４２，３３５号、同　４，１３２，５２８号およ
び同　４，１４４，３０６号明細書にも記載されている
。

【００２５】有用な展開層は、米国特許第　４，２９２
，２７２号明細書に記載されるような適当なバインダー
物質と混合したまたは織物として織られた繊維物質、ポ
リマー組成物もしくは粒状物質、例えば米国特許第　３
，９９２，１５８号明細書に公表されるようなブラッシ
ングポリマー、米国特許第　４，２５８，００１号およ
び同　４，４３０，４３６号明細書ならびに特開昭５７
（１９８２）−１０１７６０号公報に記載されるような
バインディング接着剤と結合されているかまたは結合さ
れていないビーズを用いて製造できる。特に有用な展開
層は硫酸バリウムもしくは二酸化チタンを含んでなる。 一般に試料を直接展開層へ塗布するので、展開層は等方
性の多孔質であることが望ましく、これは粒子間、繊維
間もしくはポリマー鎖間の相互に連結した空間もしくは
空隙により生ずる細孔が層の各方向で同一であることを
意味する。

【００２６】また、本発明の要素類は、一般に種々の製
造上もしくは操作上有利に要素へ添加される１種以上の
別の添加剤を含むこともできる。このような添加剤とし
ては、界面活性剤、制菌剤、緩衝剤、溶剤、硬化剤およ
び当該技術分野で既知の他の物質が挙げられる。

【００２７】それぞれの層は、ポリエチレンテレフタレ
ートのような透明な支持体上に塗布できる。他の支持体
は当該技術分野において周知である。本発明の具体的な
態様を請求項１および請求項２との関連で以下に列挙す
る。

【００２８】３．負に荷電された反復基を有する上記ポ
リマーが、ポリ（メチルアクリレート−コ−２−スルホ
−１，１−ジメチルエチルアクリルアミド−コ−２−ア
セトアセトキシエチルメタクリレート）；ポリ（２−ヒ
ドロキシエチルメタクリレート−コ−２−アクリルアミ
ド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム塩−コ−
アセトアセトキシエチルメタクリレート）；ポリ（アク
リルアミド−コ−２−スルホ−１，１−ジメチルエチル
アクリルアミド）；およびポリ（アクリルアミド−コ−
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、
ナトリウム塩）からなる群より選ばれる、上記請求項の
いずれか１つの要素。

【００２９】４．上記テトラゾリウム塩が、３−（４，
５−ジメチル（チアゾリル−２）２，５−ジフェニルテ
トラゾリウム；２−（４−ヨードフェニル）−３−（４
−ニトロフェニル）−５−ジフェニルテトラゾリウム；
２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム；ニトロブル
ーテトラゾリウム；テトラニトロブルーテトラゾリウム
；チオカルバミルニトロブルーテトラゾリウムおよびブ
ルーテトラゾリウムからなる群より選ばれる請求項１も
しくは請求項２の要素。

【００３０】５．上記電子移動剤が、１−メトキシ−５
−メチル−フェナジニウム−メチルスルフェート、５−
メチルフェノジンメトスルフェート、フェノチアジンメ
トスルフェートおよびフェノジンエトスルフェートから
なる群より選ばれる請求項１もしくは請求項２の要素。

【００３１】６．上記層の１つに、さらにアスコルビン
酸オキシダーゼも含んでなる請求項１もしくは請求項２
の要素。

【００３２】７．上記アスコルビン酸オキシダーゼが、
上記アルコールデヒドロゲナーゼと同一の層にある請求
項６の要素。

【００３３】８．試薬／展開層ならびに第１区画および
第２区画を含んでなる試薬層の組み合わせを含んでなる
、水性流体中のエタノールの定量的アッセイ用多層要素
であって、上記試薬／展開層が、テトラゾリウム塩１〜
８ｇ／ｍ２および　ＮＡＤ＋　２〜８ｇ／ｍ２　を含ん
でなり；上記第１試薬区画が、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ　５，０００〜２０，０００Ｕ／ｍ２　を含んでな
り；上記第２試薬区画が、フェノチアジンメトスルフェ
ート０．０１〜０．２ｇ／ｍ２　およびポリ（メチルア
クリレート−コ−２−スルホ−１，１−ジメチルエチル
アクリルアミド−コ−２−アセトアセトキシエチルメタ
クリレート）０．１〜４ｇ／ｍ２　を含んでなる多層要
素。

【００３４】９．上記第１試薬区画が、アスコルビン酸
オキシダーゼ２０００〜１２，０００Ｕ／ｍ２　を含ん
でなる請求項８の要素。

【００３５】

【実施例】下記発明は、エタノール分析要素の分析能力
を長時間維持する本発明の有効性を具体的に示す。

【００３６】例１：負に荷電された反復基を有するポリ
マーを用いる要素およびそれを用いない要素による保存
性の比較本例は、２１℃で要素を保存後、負に荷電され
たポリマー、ポリ（メチルアクリレート−コ−２−スル
ホ−１，１−ジメチルエチルアクリルアミド−コ−２−
アセトアセトキシエチルメタクリレート）を含んでなる
要素を、上記ポリマーを含まない要素と比較するエタノ
ールアッセイを具体的に示すものである。上記ポリマー
を除いて、両要素は前述の配置および組成物を有する。

【００３７】ある様式の各要素を、試験されるまで凍結
保存〔−１８℃、相対湿度（ＲＨ）１５％〕した。次い
で、種々の濃度のエタノールを加えたヒトの血清を含む
溶液を要素にスポットした。３７℃で５分間インキュベ
ーション後、　５４０ｎｍで反射率濃度を測定した。こ
れらの反射率濃度から得られたエタノール濃度は、種々
の添加アルコール濃度より予測される濃度であった。

【００３８】上記ポリマーを含まない様式の要素は、３
週間室温（２１℃、ＲＨ１５％）で保存しており、そし
て上記ポリマーを含む様式の要素は、ＲＨ１５％で４週
間室温で保存した。次いで、これらの要素に同様のアル
コール添加溶液をスポットしてそして上述のようにアッ
セイを行った。さらに、得られた濃度の値を予測される
濃度の値と比較した。結果を表Ａに示す。

【００３９】

【表２】

【００４０】表Ａは、上記ポリマーを含まない要素はエ
タノール濃度の予測を一貫して下まわる（第２および第
３カラム）が、それに反し上記ポリマーを含む要素はよ
り正確である（第５および第６カラム）ことを示す。

【００４１】例２： 本例は、ポリマー、ポリ（アクリルアミド−コ−２−ア
クリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、ナトリ
ウム塩）を含む本発明の要素を上記ポリマーを含まない
要素と比較するエタノールアッセイを具体的に示すもの
である。例１に記載されるのと同様の保存条件およびア
ッセイ手段に従った。結果を表Ｂに示す。

【００４２】

【表３】

【００４３】再度、上記ポリマーを含まない要素はエタ
ノール濃度の予測を一貫して下まわる（第２および第３
カラム）が、上記ポリマーを含む試験要素はより正確で
あった（第５および第６カラム）。

【００４４】

【発明の効果】本発明の要素は、４週間保存後、エタノ
ールの定量的アッセイに有用である。上記要素は、血清
成分、例えばアスコルビン酸、メタノール、イソプロパ
ノール、ヘモグロビンおよびビリルビンによる妨害を受
けない。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　テトラゾリウム塩、アルコールデヒド
   ロゲナーゼ、　ＮＡＤ＋　および電子移動剤を含んでな
   るエタノールを定量的にアッセイするための多層分析要
   素であって、電子移動剤を含んでなる層が負に荷電され
   た反復基を有するポリマーをも包含し、そして　ＮＡＤ
   ＋　が別の層に存在することを特徴とする多層分析要素
   。
2. 【請求項２】　　一つの層がテトラゾリウム塩、および
   　ＮＡＤ＋　を含んでなり、第二の層がアルコールデヒ
   ドロゲナーゼ、電子移動剤および負に荷電された反復基
   を有するポリマーを含んでなる請求項１記載の多層要素
   。