JPH04235197A - 骨誘導活性物質の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、骨誘導活性物質（以
下、ＢＭＰとも称する）の精製方法に関し、より具体的
にはＢＭＰが存在する試料から特定のアフィニティーク
ロマトグラフィーを用いることにより効率よくそのＢＭ
Ｐを精製する方法に関する。ＢＭＰは骨折の治癒促進や
歯科領域への臨床応用が期待される生理活性タンパク質
である。

【０００２】

【従来の技術】骨誘導活性物質は、主として骨基質中に
存在し、皮下または筋肉内に移植すると異所性に軟骨と
骨を誘導する物質と定義される「骨誘導因子」として研
究されてきた。この物質は、古くはウリスト（Ｕｒｉｓ
ｔ）の　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１５０，　８９３〜８９９
　ページ（１９６５）に記載されるようにウシの正常骨
を塩酸で脱灰した骨基質を動物の筋肉内に移植すると、
そこに軟骨内骨化が起こるとの知見より注目を集めてき
た物質である。近年では、かかる活性を有するリコンビ
ナント体も細胞培養によって得られ（例えば、Ｗａｎｇ
ら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　
ＵＳＡ，　８７，２２２０〜２２２４ページ，　１９９
０）　、また天然に見い出される活性物質も数種の類縁
体の存在が確認されている。

【０００３】これらは、対応する組織中に極めて少量存
在するにすぎず、さらにその活性の検定に非常に時間を
要することにも起因し精製が困難であった。米国特許第
４，２９４，７５３　号および同４，４５５，２５６　
号明細書は、脱灰した骨組織からＢＭＰを可溶化する効
率のよい方法を提案し、さらに精製する手段としてセフ
ァロース６Ｂクロマトグラフィー、ＤＥＡＥイオン交換
クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動の使用を公表
するが必ずしも満足できるものでない。また、前記のよ
うに可溶化抽出した試料から活性成分を精製する手段と
しては、その他、分別沈澱、ゲル濾過、ハイドロキシア
パタイトを用いるクロマトグラフィー、高性能液体クロ
マトグラフィーなどが使用されている（例えば、特開昭
６２−１１１９３３号公報参照）。しかしながら、使用
に耐える純度の標品まで精製するには、少なくとも５な
いし６段階のクロマト処理工程を要し、さらに、比較的
時間のかかるゲル濾過工程を含むので精製の迅速化が図
れない。

【０００４】他方、ウシの骨基質中の活性成分を単一成
分まで精製した比較的効率のよい方法としては、久保木
らにより第６３回日本生化学大会（平成２年９月１３日
）で報告された、グアニジン塩のような可溶化画分の抽
出試料を、順次（ｉ）ハイドロキシアパタイトカラムク
ロマトグラフィー、（ｉｉ）ヘパリン−セファロースＣ
Ｌ−６Ｂカラムクロマトグラフィー、（ｉｉｉ）セファ
クリル　Ｓ−３００ＨＲ　カラムクロマトグラフィー（
ゲル濾過）、（ｉｖ）　ＣＭ−５２カラムクロマトグラ
フィー（カチオン交換）、（ｖ）ハイドロキシアパタイ
トカラムクロマトグラフィー、（ｖｉ）　ＹＭＣジオー
ル−３００ＨＰＬＣ　および（ｖｉｉ）　逆相ＨＰＬＣ
で処理する方法が知られている。また、同氏らは平成２
年１１月２９日、仙台市で開催された第３８回国際歯科
研究学会日本部会において、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ
　Ａ）　セファロースアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いて上記精製方法の工程を短縮できる改良法を公
表したが、その方法についてそれほど詳細には発表され
なかったものの長い処理時間を要するゲル濾過処理を必
要とすることは疑いない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述してきた従来法は
、少量の標品調製には適するものもあるが、迅速に、か
つ多量にＢＭＰ含有試料を処理するにはさらに改良され
た方法の提供が望まれるであろう。従って、本発明の目
的は、カラム操作性に優れ、迅速なＢＭＰの精製を行う
ことができる改良された方法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らも、上記久保
木らとは独立に、Ｃｏｎ　Ａ−セファロースを用いるＢ
ＭＰの精製方法を検討してきたが、市販のＣｏｎ　Ａ−
セファロースカラムをそのまま用いるとその操作中にセ
ファロースに固定化されたＣｏｎ　Ａが溶離してくる傾
向があることを見い出した。そこで、Ｃｏｎ　Ａ−担体
へのＢＭＰの吸着特性に悪影響を及ぼすことなく、その
操作安定性を向上すべく研究したところ、Ｋ．Ｐ．Ｃａ
ｍｐｂｅｌｌらがＪ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２５
６，　４６２６〜４６３２ページに特定の糖タンパク質
の精製に用いるようにアガロース上に固定したタンパク
質（酵素）の脱離を防止する方法（Ｒ．　Ｋｏｗａｌら
、Ａｎａｌｔ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１０２，　７２
〜７６ページ、１９８０）　に準じ一定の架橋剤でＣｏ
ｎ　Ａ−担体を予備処理すると、ＢＭＰの吸着特性に殆
ど悪影響を及ぼすことなく、そして操作中に固定化Ｃｏ
ｎ　Ａの溶離を伴うことなくＢＭＰの精製が可能である
ことを見い出し本発明を完成した。

【０００７】従って、本発明によれば、骨誘導活性物質
（ＢＭＰ）が存在する試料を架橋剤で予備調製した固定
化コンカナバリンＡ水不溶性吸着体で処理することを特
徴とする骨誘導活性物質の精製方法が提供される。

【０００８】以下、本発明を具体的に説明する。本明細
書にいう「骨誘導活性物質」は、先に定義したごとく、
動物の骨基質中に存在し、皮下または筋肉内に移植する
と異所性に軟骨と骨を誘導する活性を示す物質であって
、骨誘導因子骨形成タンパク質または骨形成活性を有す
るタンパク質とも称されている。かかる物質が存在する
試料としては、それらが本発明の固定化コンカナバリン
Ａ（Ｃｏｎ　Ａ）水不溶性吸着体（もしくは担体）で直
接処理できるものであればその活性濃度を問わないが、
好ましくは前述の米国特許第４，４５５，２５６号明細
書に記載されるような、脱灰処理が施され、さらにＢＭ
Ｐが可溶化処理された水性調製物が挙げられる。より具
体的には、供与体の骨を微粉砕し、その骨粉を塩酸等に
より脱灰処理した試料から調製される。本発明のＣｏｎ
　Ａ水不溶性吸着体による処理をより効果的にするには
、それ自体公知のタンパク質の精製方法により前記試料
の目的とする活性をさらに高めることが望ましい。特に
、この精製工程には、ゲル濾過工程を含めることなくヘ
パリン−セファロースクロマトグラフィーおよびハイド
ロキシアパタイトクロマトグラフィーで処理した溶出液
を用いるのが好ましい。

【０００９】固定化コンカナバリンＡ水不溶性吸着体と
は、通常のカラムクロマトグラフィーの担体として用い
られる担体、特に親水性の水不溶性多糖類に、当該技術
分野で既知の、例えばＣＮＢｒ法等によりコンカナバリ
ンＡを固定化したものである。代表的なものとしては、
ファルマシア社からＣｏｎ　Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　
として市販されているものが挙げられる。

【００１０】これらを予備調製するのに用いる架橋剤と
しては、通常タンパク質の架橋に用いられている架橋剤
であって、タンパク質のペンダントアミノ基、水酸基ま
たはカルボキシル基と容易に反応する官能基を２個以上
担持する多官能性化合物が挙げられ、特にアミノ基と容
易に、反応する官能基を有するグルタールアルデヒドお
よびグリシジルエーテルなどが好ましい。これらの予備
調製、すなわち架橋化は当該技術分野で既知の方法に準
じて行うことができるが、かかる吸着体のカラム操作安
定性を確保し、かつＢＭＰの吸着特性に悪影響を及ぼさ
ない条件で行わねばならない。例えば、架橋剤としてグ
ルタールアルデヒドを用いてＣｏｎ　Ａ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ　を架橋化する条件は、ほぼ前述のＫ．Ｐ．Ｃａ
ｍｐｂｅｌｌらの条件に従うことができる。

【００１１】このような吸着体でＢＭＰを含有する試料
を処理する工程は、例えば吸着体を弱アルカリ性、好ま
しくは約ｐＨ８の適当な緩衝液で平衡化し、次いでデオ
キシコール酸塩水溶液で平衡化した後、同様な緩衝液で
置換した前記試料を前記吸着充填カラムにかけ、これを
前記水溶液で洗浄し、次いで通常、Ｃｏｎ　Ａ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ　への吸着物を溶離するのに用いる溶離液
、例えば、メチル−α−Ｄ−マンノピラノシド液等で溶
出すればよい。場合により、このようなクロマトグラフ
ィー処理を繰り返してもよく、また、透析、限外濾過な
どの濃縮工程を介して別のアフィニティークロマトグラ
フィー処理を行ってもよい。なお、本発明のＣｏｎ　Ａ
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　処理以外の操作はそれ自体公知
の方法によって実施することができる。

【００１２】こうして得られる精製ＢＭＰ液は、最終の
処理工程に応じて、例えば透析、濃縮工程を行い、凍結
乾燥標品または適当な安定剤、防腐剤を加えた濃厚液状
態で保存することができる。かかる標品は、具体的には
後述するインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）試験によりその活
性を評価することができ、そしてその標品は　１００μ
ｇのオーダーの投与により骨形成が認められる程精製さ
れていた。

【００１３】なお、各精製工程の最適の組み合わせは、
前記インビボ試験によるか、セイェヂン（Ｓｅｙｅｄｉ
ｎ）らの、　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，　９７，　
１９５０〜１９５３ページ、１９８３、に記載されるよ
うなインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）　試験によりＢＭ
Ｐ活性を測定しながら検討を加えることによって容易に
決定することができる。また簡便な方法としては、処理
液中のアルカリホスファターゼ活性をポーゼン（Ｐｏｓ
ｅｎ）らのＭｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｂｏｎｅ　Ｄｉｓｅａ
ｓｅ，　Ｖｏｌ．１．（Ａｖｉｏｌｉ　Ｌ．Ｖ．　ら編
、ＮＹ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　１４１　
ページ、１９７７）に記載のベッシー−ローリー（Ｂｅ
ｓｓｙ−Ｌｏｗｒｙ）法により追跡してもよい。

【００１４】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらの説明に限定されるもので
ない。 例１（参考）：試料の調整 （１）１才−２才令の子牛の大腿骨より骨端部を切断し
骨幹部のみとし、次いで骨膜と骨髄を可及的速やかに除
去したのち、冷凍下で１ｍｍ〜２ｍｍの大きさに粉砕し
骨粉を調整した。この骨粉を、０．９％　ＮａＣｌ　溶
液にて１６時間洗浄し、蒸留水にて洗浄後　１００％エ
タノールにて２時間脱水、次いでクロロホルム／メタノ
ール（１／１）で６時間脱脂を行い、再度脱脂のみ、１
２時間行った。この骨粉を数回蒸留水にて洗浄後、０．
５Ｎ　ＨＣＬ　で７２時間徹底的に脱灰を行ったものを
室温で乾燥を行い試料を調整した。

【００１５】（２）脱灰骨基質より４種のプロテアーゼ
阻害剤（１００ｍＭ　６−アミノ−カプロン酸、５ｍＭ
　　塩酸ベンザミジン、０．５ｍＭ　　フェニルメチル
スルホニルフルオライド、５ｍＭ　　Ｎ−エチルマレイ
ミド）を含む１０倍容（ｖｏｌ／ｗｔ）　の４Ｍ　　塩
酸グアニジン／５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＬ（ｐＨ７
．４）にて２４時間２回抽出を行い、ガーゼにて濾過後
、濾液を１２，０００ｒｐｍ（１７，０００×ｇ）で２
０分間遠心し抽出残査を除去した。上清を０．４５μｍ
ミリポアフィルターにて濾過し、これをＧ−Ｅｘｔ　と
した。このＧ−Ｅｘｔ　をセルロースチューブを用い蒸
留水に対して透析を行った。透析後、３０，０００ｒｐ
ｍ（７０，０００×ｇ）で３０分間超遠心を行い、水不
溶性画分を分離し凍結乾燥した。

【００１６】例２：アフィニティークロマトグラフィー
（１）ヘパリン−セファロースクロマトグラフィー２．
５ｇの凍結乾燥したＧ−Ｅｘｔ　を、０．１Ｍ　ＮａＣ
ｌを含む６Ｍ尿素／５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＬ（ｐ
Ｈ７．０）　（緩衝液Ａ）に再溶解し、ヘパリン−セフ
ァロース（Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）　が装填されたカラム（２．６×４
０ｃｍ）にアプライした。カラムは、５倍容の０．１Ｍ
　ＮａＣｌ　を含む緩衝液Ａで洗浄し、次いで０．１５
Ｍ　ＮａＣｌと０．５Ｍ　ＮａＣｌ　をそれぞれ含む緩
衝液Ａで溶出した。０．５Ｍ　ＮａＣｌ　画分に活性が
みられ、これらを次の段階の精製に用いた。

【００１７】（２）ハイドロキシアパタイトクロマトグ
ラフィー 上述したように溶出した　１５０ｍｌのタンパクを０．
５Ｍ　ＮａＣｌ　と１０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰ０４を含む緩
衝液Ａで平衡下したハイドロキシアパタイト・ウルトロ
ゲル（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ−Ｕｌｔｒｏｇｅ
ｌ）（ＬＫＢ，　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｔｓ）　カラム（２
．２×２５ｃｍ）　に直接アプライした。このカラムを
、５倍容の０．５Ｍ　ＮａＣｌ　と１０ｍＭ　Ｎａ２Ｈ
ＰＯ４を含む緩衝液Ａで洗浄し、次いで１００ｍＭ，　
２００ｍＭ，　５００ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４　を含む緩
衝液Ａで段階的に溶出した。この内、１００ｍＭ　Ｎａ
２ＨＰＯ４　を含む緩衝液Ａで溶出したタンパク質画分
に活性がみられた。

【００１８】（３）予備調製コンカナバリンＡ−セファ
ロース４Ｂクロマトグラフィー 上述のＫ．　Ｐ．　Ｃａｍｂｅｌｌ　らの、　Ｊ．　Ｂ
ｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２５６，　４６２６ページ、
（１９８１）に記載するように、Ｃｏｎ　Ａ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ　４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、０．２
５Ｍ　　α−メチル−Ｄ−マンノースの存在下、０．０
３％グルタールアルデヒドで処理した。この予備調製Ｃ
ｏｎ　Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂを、樹脂の５倍容
の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化
し、次いで５倍容の１％デオキシコール酸ナトリウム液
で平衡化した。

【００１９】上述の画分を、１％デオキシコール酸ナト
リウムに対して透析し、緩衝液で置換した後に前記予備
調製Ｃｏｎ　Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　カラムにかけた
。カラムを５倍容の５％デオキシコール酸ナトリウム液
で洗浄し、次いで０．５Ｍメチル−α−Ｄ−マンノピラ
ノシド液で溶出した。

【００２０】（４）ヘパリン−セファロースクロマトグ
ラフィー 上述の画分をＹＭ−１０メンブランを用いる限外濾過装
置を用いて濃縮した。濃縮した溶液は、再び緩衝液Ａで
希釈し、ヘパリン−セファロース（Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅカラム）（１．６　×１５ｃｍ）　に
アプライし、５倍容の０．１Ｍ　ＮａＣｌ　を含む緩衝
液Ａで洗浄し、次いで０．５Ｍ　ＮａＣｌ　を含む緩衝
液Ａで溶出した。０．５Ｍ　ＮａＣｌ　画分を蒸留水で
数回透析した。析出した沈澱物がＢＭＰであった。

【００２１】例３：骨形成活性の評価試験（１）本発明
により得られたＢＭＰ１ｍｇを、タイプ１コラーゲン溶
液１ｍｌ（３ｍｇ／ｍｌ，ｐＨ３．０　：新田ゼラチン
（株））と混合し、エタノール沈澱させ、１０，０００
ｒｐｍ　で５分間遠心後３７℃の恒温槽で乾燥し、次い
で凍結乾燥してこれをさらにＮｏ．　５　のゲラチンカ
プセルに入れて移植ペレットを調製した。このペレット
をエーテル麻酔下にて、４週令の雄Ｓ．　Ｄ．系ラット
の大腿部筋嚢に移植した。４週間後、軟Ｘ−ｒａｙ　お
よび組織学的検査で骨形成が認められた。

【００２２】（２）本発明により得られたＢＭＰを１ｍ
ｇ／ｍｌとなるように６Ｍ尿素／０．０１Ｍ燐酸緩衝液
（ｐＨ７．２）に再溶解し、　ＢＭＰ：ＨＡＰ（Ｂｏｎ
ｅ　Ｃｅｒａｍ−Ｐ：住友セメント（株））＝１：２０
（重量比）の割合にて透析チューブ中で２４時間浸析し
、さらにこのチューブを蒸留水にて透析した後、ＨＡＰ
−ＢＭＰ溶液にＢＭＰ：コラーゲン＝１：１（溶液比）
となるようコラーゲンを加えた。この３種混合物をエタ
ノール沈澱させ、１０，０００ｒｐｍ　で５分間遠心後
３７℃の恒温槽で乾燥し、次いで凍結乾燥してＮｏ．　
５　のゲラチンカプセルに入れて移植ペレットを調製し
た。ただし、ここで用いられたＨＡＰは、多孔質で顆粒
状のものであり、顆粒サイズの違いによる骨誘導能に与
える影響を検索する目的で０．１−０．３ｍｍ、０．６
−０．９ｍｍ、０．９−１．５ｍｍの３種類を利用した
。このペレットをエーテル麻酔下にて４週令の雄Ｓ．　
Ｄ．　系ラットの大腿部筋嚢に移植した。４週間後、軟
Ｘ−ｒａｙ　および組織学的検査で骨形成が認められた
が、０．６−０．９ｍｍのＨＡＰ複合体の骨形成量が他
に比べて大きかった。

【００２３】

【発明の効果】本発明によれば、架橋剤で予備調製した
固定化コンカナバリンＡ水不溶性吸着体を用いる骨誘導
活性物質の精製方法が提供される。例えば、市販のＣｏ
ｎ　Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂをアフィニティーカ
ラムとして用いる従来法に比べ、カラム操作の安定性が
向上し、さらにゲル濾過法を使用することなく所期の目
的が達成されるので、骨誘導活性物質を有する多量の試
料の処理が可能になった。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　骨誘導活性物質が存在する試料を架橋
   剤で予備調製した固定化コンカナバリンＡ水不溶性吸着
   体で処理することを特徴とする骨誘導活性物質の精製方
   法。
2. 【請求項２】　　前記架橋剤がグルタルアルデヒドであ
   る請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】　　前記試料が、動物の硬組織を（１）脱
   灰処理する工程、（２）ヘパリン−セファロースクロマ
   トグラフィーで処理する工程、および（３）ハイドロキ
   シアパタイトクロマトグラフィーで処理する工程を含ん
   でなる方法によって調製した水性調製物である請求項１
   または２記載の方法。