JPH04243896A - 環状のｈｉｖ主要中和決定基ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の主要中
和決定基（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ　ｎｅｎｔｒａｌｉｚｉ
ｎｇｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ，　ＰＮＤ）ペプチドは、
哺乳動物の抗ＨＩＶ免疫応答を生起することができると
されている。ＡＩＤＳウイルスのエンベロープ糖タンパ
ク質ｇｐ１２０のアミノ酸２９６と３４１の間にある高
度可変領域［Ｐａｔｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３１３，２
７７（１９８５）の番号づけ方法による。］は、これま
でに同定されているほとんどのＨＩＶ単離物においてア
ミノ酸４量体−ＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒｇ−（配列番号
：２）を含んでいる。加えて、このテトラマーのいずれ
の側からも約２０アミノ酸の範囲内にシステイン残基が
一般に見られる。少なくとも１つのよく知られた単離物
（ＨＩＶＩＩＩＢ）において、これらのシステインがジ
スルフィド結合していることが知られている。したがっ
て、この場合の中間アミノ酸（以下、「ループアミノ酸
」と称する。）は、環状構造を余儀無くされ、−ＧＰＧ
Ｒ−はそのループの先端に突き出している［Ｊａｖａｈ
ｅｒｉａｎら、ＰＮＡＳ　　ＵＳＡ８６，６７６８（１
９８９）］。

【０００２】哺乳類におけるＨＩＶ中和免疫応答の誘発
に向けて、ペプチドに基づく研究努力が重ねられたが、
それらは一般に直鎖状またはジスルフィド結合した環状
のペプチドの使用に限られてきた。直鎖状ペプチドには
、局所エネルギーが最小になるように多数の溶液三次元
コンホーメーションをとるエピトープに、受容体（ｒｅ
ｃｉｐｉｅｎｔ）　の免疫系がさらされるという難点が
ある。ジスルフィド結合を利用すれば、直鎖状ＰＮＤが
とり得るコンホーメーションの数を制限することができ
るが、ジスルフィドはある条件の下においては不安定な
ことがあり、ジスルフィドが切れれば直鎖状ペプチドと
なって上記難点を包含することになってしまうため、常
に完全に満足できるわけではない。とはいえ、このよう
なペプチドはスルフヒドリル含有ペプチドの酸化によっ
て容易に調製できるという利点がある。本発明の好適な
態様は、さらにＨＩＶ中和抗体の誘発に驚くほど有効で
ある。

【０００３】直鎖状合成ペプチドは溶液中あるいは固体
支持体上にて種々の方法で調製される。それらの原理や
手法を記載するすぐれた書物としては、次のようなもの
がある：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ
　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．，
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　（１９８４）；Ｓｏ
ｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ，Ｓｔｅｗａｒｔ　Ｊ．Ｍ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ
．，Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ
　（第２版、１９８４）；Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，
Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．，Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．，Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９７９）。 一般に、環状ペプチドが必要な場合は、少なくとも２つ
のスルフヒドリルを含有する直鎖状合成ペプチド（たと
えば２つのシステインを含有するペプチド）を酸化する
ことによって、ジスルフィド結合環を調製している。本
発明は、新しいジスルフィド結合環状ＨＩＶペプチドを
提供する。

【０００４】すなわち、本発明は、ジスルフィド結合環
状構造を有する新規なＨＩＶＰＮＤペプチドおよびそれ
らの誘導体、それらを製造する方法、およびそれらを使
用する方法を開示する。これらの環状ＨＩＶＰＮＤペプ
チド（ｃＰＮＤ）は、ループアミノ酸の両側にあるシス
テインを通じてジスルフィドを形成することにより調製
される。こうして形成されたｃＰＮＤは遊離ペプチジル
免疫原あるいはｃＰＮＤを含む共有結合体（ｃｏｖａｌ
ｅｎｔ　　ｃｏｎｊｎｇａｔｅ）免疫原を調製するため
の試薬として有用である。そのような結合体は哺乳類の
抗ペプチド、抗ＨＩＶまたはＨＩＶ中和免疫応答を生起
するのに有用である。これらの結合体は、１９９０年７
月１９日付け米国特許出願第５５５，５５８号およびそ
の他の同時係属中の出願にも記載されている。そのよう
な結合体を含む組成物はＨＩＶによる病気、たとえば後
天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）やＡＩＤＳ関連群（Ａ
ＲＣ）を予防するためのワクチンとして、あるいはＡＩ
ＤＳやＡＲＣを患らうヒトを治療するための免疫原とし
て用いることができる。加えて、そのような結合体は、
哺乳類のＨＩＶ中和免疫応答のペプチド顕在化に係わる
構造と機能の関係を解析するための有用な実験手段を提
供する。

【０００５】本発明は、構造（配列番号：１）

【化１２
】 を有する新規な環状ＨＩＶＰＮＤペプチド、又は製薬上
許容しうるそれらの塩に関する。式中、ｒは：ａ）水素
、又はｂ）

【化１３】 ［上記式中、Ｗは好ましくは−（ＣＨ２　）２　−又は
−（ＣＨ２　）３　−又はＲ６　であり、Ｒ６　は

【化
１４】 であり、Ｒ７　は低級アルキル、低級アルコキシ、又は
ハロである。］であり；Ｒ１　は：ａ）結合、又はｂ）
１個乃至５個のアミノ酸からなるペプチド（マーカー（
標識）アミノ酸好ましくはＮｌｅ、Ａｂｕを含んでいて
もよい。）であり；Ｒ２　は：３個乃至１０個のアミノ
酸から成るペプチドであり；Ｒ３　は：３個乃至１０個
のアミノ酸から成るペプチドであり；Ｒ５　は：ａ）−
ＯＨ、ｂ）１個乃至５個のアミノ酸から成るペプチド（
マーカーアミノ酸を含んでいてもよい。）、又はｃ）−
ＮＨ２　であり；Ｒ８　は１個乃至８個の炭素原子から
成る低級アルキルである。

【０００６】本発明のペプチドは、保護基化学を組みこ
む固相化学合成により作られた直鎖状ペプチドを環化す
ることにより調製される。環化は直鎖状ペプチドの合成
の間にループアミノ酸のアミノおよびカルボキシ末端に
不安定な保護基を有する反応性部位を組みこむことによ
り達成される。すなわち、本発明の一態様においては、
ループアミノ酸の両側のペプチドに組みこんだシステイ
ンのイオウがジスルフィドに酸化される。この環状ペプ
チドは、その後、ＥＬＩＳＡ検定における試薬、又は多
糖、タンパク質、多糖とタンパク質の両方、あるいは当
該環状ペプチドの免疫原性を高めるような他の物質から
成る免疫原性担体への結合のための試薬として用いるこ
とができる。このペプチドはまた、直接、非結合状態に
おいて、哺乳類における抗ペプチド、抗ＨＩＶ、または
ＨＩＶ中和免疫応答の顕在化のための免疫原として用い
ることができる。

【０００７】本発明のペプチドを用いる結合体の製造に
おいては、この分野において知られている多くの手段の
いずれかを用いて、担体タンパク質をペプチドと結合さ
せることができる。本発明の好適な態様においては、Ｎ
−マレイミドアルカン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル（ＮＨＳエステル）又はＮ−マレイミド−Ｒ６
　−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（Ｎ−マレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステルが好まし
い。）を、水性緩衝液（好ましくは約ｐＨ８の重炭酸塩
水溶液）又は約１当量のジエチルイソプロピルアミンを
含むＤＭＦ中において遊離ペプチドアミノ基と反応させ
、マレイミド化ペプチドを得る。このマレイミド化ペプ
チドは、次いでチオール化された担体、例えばタンパク
質または多糖、好ましくはナイセリア・メニンギチジス
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｂ
のＯＭＰＣ（これは主要な免疫高揚タンパク質（ＭＩＥ
Ｐ）である。）と反応させるか、又はポリリボシルリビ
トールホスフェートと反応させた後に担体タンパク質と
結合させる。

【０００８】このような結合体は哺乳類の抗ペプチド、
抗ＨＩＶ、又はＨＩＶ中和免疫応答を誘発し、ＨＩＶ病
たとえばＡＩＤＳやＡＲＣを予防するためのワクチンの
調製、あるいはＡＩＤＳやＡＲＣをわずらったヒトの治
療に有用である。

【０００９】かくして本発明の目的は、遊離免疫原とし
て、又は結合体免疫原を製造するための試薬として有用
であり、哺乳類の抗ペプチド、抗ＨＩＶ、又はＨＩＶ中
和免疫応答の解明、又は抗ＨＩＶワクチンもしくはＡＩ
ＤＳを患ったヒトの治療のための免疫原として用いられ
る組成物の製造に使用される、新規かつ環状のＨＩＶＰ
ＮＤペプチドを提供することである。別の目的は、ジス
ルフィド結合構造を通じてＨＩＶＰＮＤペプチドを環化
する方法を提供することである。

【００１０】定義及び略語ＡＡ検定　　　　ペプチド又
はタンパク質を遊離アミノ酸に酸加水分解し次に定量す
るアミノ酸分析Ａｃｍ　　　　　　アセタミドメチルチ
オール保護基活性化　　　　　　続いて望ましい反応を
起こすことができるようにペプチド、タンパク質又はポ
リサッカライド部分とその部分を誘導化することができ
る試薬との反応ＡＩＤＳ　　　　後天性免疫不全症候群
アミノ酸　　　　酸とアミノ官能基の両方を有する分子
；一般構造Ｈ２　Ｎ−ＣＨＲ−ＣＯＯＨ（Ｒ基はアミノ
酸本体を定義する）を有する２０種の一般のα−アミノ
酸がある。これらのアミノ酸はＤ又はＬ立体化学形を有
することができ、小文字の１文字略語又はアミノ酸名の
前に接頭辞Ｄによって特にことわらない限りアミノ酸は
天然又はＬ配置を有する。２０種の一般のアミノ酸名及
びＲ基の構造は本明細書では次の表に従って単一の文字
コードで確認される。アミノ酸名　　　　　　３文字コ
ード　　１文字コード　　　　側鎖（Ｒ）アラニン　　
　　　　　　　　　Ａｌａ　　Ａ　　　　　　　　　　
−ＣＨ３アルギニン　　　　　　　　　Ａｒｇ　　　　
　　　　　　　　Ｒ　　　　　　　　　　−（ＣＨ２）
３ＮＨＣＨＮＨ２ＮＨ２＋アスパラギン　　　　　　　
Ａｓｎ　　　　　　　　　　　　Ｎ　　　　　　　　　
　−ＣＨ２ＣＯＮＨ２アスパラギン酸　　　　　Ａｓｐ
　　　　　　　　　　　　Ｄ　　　　　　　　　　−Ｃ
Ｈ２ＣＯＯＨシステイン　　　　　Ｃｙｓ　　　　　　
　　　　　　Ｃ　　　　　　−ＣＨ２ＳＨ　　グルタミ
ン酸　　　　　　　Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　　Ｅ
　　−（ＣＨ２）２ＣＯＯＨグルタミン　　　　　　　
　　Ｇｌｎ　　　　　　Ｑ　　　　　　　　　　−（Ｃ
Ｈ２）２ＣＯＮＨ２グリシン　　　　　　　　　　Ｇｌ
ｙ　　　　　　　　　　　　Ｇ　　　　　　　　　　−
Ｈヒスチジン　　　　　　　　　Ｈｉｓ　　　　　　　
　　　　Ｈ　　　　　　　　　　−ＣＨ２−　イミダゾ
ールイソロイシン　　　　　　　Ｉｌｅ　　　　　　　
　　　　　Ｉ　　　　　　　　　　−ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ
Ｈ２ＣＨ３ロイシン　　　　　　　　　　　Ｌｅｕ　　
　　　　　　　　　　Ｌ　　　　　　　　　　−ＣＨ２
ＣＨ（ＣＨ３）２リシン　　　　　　　　　　　　　Ｌ
ｙｓ　　　　Ｋ　　　　　　　　　　−（ＣＨ２）４Ｎ
Ｈ３＋メチオニン　　　　　　　　　Ｍｅｔ　　　　　
　　　　　　　Ｍ　　　　　　　　　　−（ＣＨ２）２
ＳＣＨ３フェニルアラニン　　　Ｐｈｅ　　　　　　　
　　　　　Ｆ　　　　　　　　　　−ＣＨ２−　フェニ
ルプロリン　　　　　　　　　　　Ｐｒｏ　　　　　　
　　　　　　Ｐ　　　　　　　　−　α，Ｎ−（ＣＨ２
）３セリン　　　　　　　　　　　　　Ｓｅｒ　　　　
　　　　　　　　Ｓ　　　　　　　　　　−ＣＨ２ＯＨ
トレオニン　　　　　　　　　Ｔｈｒ　　　　　　　　
　　Ｔ　　　　　　　　　　−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３トリ
プトファン　　　　Ｔｒｐ　　　　　　　　　　　　Ｗ
　　　　　　　　　　−ＣＨ２−　インドールチロシン
　　　　　　　　　　　Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　
　Ｙ　　　　　　　　　　−ＣＨ２−　フェニル−ＯＨ
バリン　　　　　　　　　　　　　Ｖａｌ　　　　　　
　　　　　　Ｖ　　　　　　　　　　−ＣＨ（ＣＨ３）
２抗体　　　　　　　　　　　　特定の抗原を結合する
ことができる哺乳類Ｂ細胞によって産生されるタンパク
質ＡＲＣ　　　　　　　　　　ＡＩＤＳ関連群ＡＺＴ　
　　　　　　　　　アジドチミジン、抗−ＡＩＤＳ化合
物２種間　　　　　　　　　　別々に誘導されたパート
ナーの反応から生じる分子鎖；スペースペーサー　　　
　サーにより生成した結合体の分析用分解はスペーサー
を放出及び定量し、共有結合の程度の尺度を与える。 キャップ形成　　　　低分子との反応による結合体の反
応部位の脱離Ｃｂｚ　　　　　　　　　　ベンジルオキ
シカルボニル結合体　　　　　　　　　　少なくとも１
つの因子が望ましい抗原（例えばＨＩＶＰＮＤ）であり
、別の因子が担体である互いに共有結合した不連続の化
学因子の複合体コアアミノ酸　　　　哺乳類に於てＨＩ
Ｖ−中和免疫応答を誘発するのに不可欠なＨＩＶＰＮＤ
のアミノ酸ＤＰＰＡ　　ジフェニルホスホリルアジドＥ
ＬＩＳＡ　　　　　　酵素結合イムノソルバントアッセ
イＦｍｏｃ　　　　　　　　９−フルオレニルメチルオ
キシカルボニルＨＩＶ　　　　　　　　　　ヒト免疫不
全ウイルス、多くのレンチウイルス群及びＡＩＤＳ及び
関連症に包含される主張した病因物質；ＨＩＶはまたＨ
ＴＬＶ（ヒト細胞リンパ球栄養性ウイルス）ＬＡＶ（リ
ンパ腺症関連ウイルス）及びＡＲＶ（ＡＩＤＳ関連ウイ
ルス）免疫原　　　　　　　　　　哺乳類免疫応答の刺
激物質として有用な分子免疫学的に等　　　　哺乳類に
於てＨＩＶ中和免疫応答例えば等価なペプチドエピト価
なペプチド　　ープを認識することができる抗体を誘発
する機能を共通して有する環状又は線状ペプチド標識ア
ミノ酸　　　　他のペプチド又はタンパク質アミノ酸に
よって生じるシグナルによる妨害がないＡＡ検定に於て
シグナルを有するアミノ酸Ｍｔｒ　　　　　　４−メト
キシ−２，３，６−トリメチルフェニルスルホニルＮＥ
Ｍ　　　　　　　　　　Ｎ−エチルマレイミドＯＭＰＣ
　　　　　　　　免疫エンハンサー及びペプチド担体と
して用いられるナイセリアメニンギチジス（Ｎｅｉｓｓ
ｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　髄膜炎菌）の外
膜タンパク質複合体（Ｏｕｔｅｒ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　
Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｍｐｌｅｘ）ペプチド　　　　　
　　　アミド（ペプチド）結合により結合したアミノ酸
の重合体ＰＥＰ　　　　　　　　　　ペプチドＰＮＤ　
　　　主要中和決定基；ＰＮＤを含有する免疫原を接種
したときに哺乳類受容体に於てＨＩＶ中和抗体に高親和
性結合することができ、ＨＩＶ中和抗体を高めることが
できるペプチジル配列による名称ＰｎＰｓ６Ｂ　　　　
ストレプトコッカスニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ肺炎レンサ球菌）莢膜ポ
リサッカライドＰＲＯ　　　　　　　　　　免疫原タン
パク質タンパク質　　　　　　高分子ペプチドＰＲＰ　
　　　　　　　　　ポリリボシル−リビトールホスフェ
ートＰＳＡ　　　　通常重合体の単量体単位に繰り返し
リン酸単位を有するアニオンポリサッカライド樹脂　　
　　　　　　　　　　固相ペプチド合成の固形支持体マ
トリックスワング（ｗａｎｇ）：コポリスチレン−１％
ジビニルベンゼン樹脂への４−（ヒドロキシメチル）フ
ェノキシメチル結合はバッチＦｍｏｃ固相ペプチド合成
に用いられ最後に樹脂から９５％ＴＦＡ切断し、同時に
酸感受性側鎖保護基を脱保護する。サスリン：コポリス
チレン−１％ジビニルベンゼン樹脂への４−（ヒドロキ
シメチル）−３−メトキシフェノキシメチル結合はバッ
チＦｍｏｃ固相ペプチド合成に用いられ最後に樹脂から
１％ＴＦＡ／ＣＨ２　Ｃｌ２　切断してそのままの酸不
安定側鎖保護基を脱離する。ペプシンＫＡ：ケイソウ土
に吸着したポリアミド樹脂への４−（ヒドロキシメチル
）フェノキシメチル結合は連続流動カラムＦｍｏｃ固相
ペプチド合成に使用される。ペプチドは上のワング樹脂
で記載した通り樹脂から切断する。ペプシンＫＨ：ケイ
ソウ土に吸着したポリアミド樹脂への４−（ヒドロキシ
メチル）−３−メトキシメチル結合はＦｍｏｃ固相ペプ
チド合成に使用される。側鎖保護ペプチドは上のサスリ
ン樹脂で記載した通り樹脂から切断する。“骨格”　　
　　　　　　キャリヤー分子を基礎にした複数ペプチド
エピトープを有する免疫原ＳＣＭＨＣ　　　　　　Ｓ−
カルボキシメチルホモシステアミン、共有結合体免疫原
の分解によって脱離され、ＡＡ検定によって定量化可能
な酸安定な２種間スペーサーＺ　　　　　　　　　　　
　　　ベンジルオキシカルボニル

【００１１】本発明は
、構造（配列番号：１）

【化１５】 を有する新規な環状ＨＩＶＰＮＤペプチド又は製薬上許
容し得るその塩に関する。式中、ｒは：ａ）水素、又は
ｂ）

【化１６】 ［上記式中、Ｗは好ましくは−（ＣＨ２　）２　−又は
−（ＣＨ２　）３　−又はＲ６　であり、Ｒ６　は

【化
１７】 であり、Ｒ７　は低級アルキル、低級アルコキシ、又は
ハロである。］であり；Ｒ１　は：ａ）結合、又はｂ）
１個乃至５個のアミノ酸から成るペプチド（マーカーア
ミノ酸を含んでいてもよい。）であり；Ｒ２　は：３個
乃至１０個のアミノ酸から成るペプチドであり；Ｒ３　
は：３個乃至１０個のアミノ酸から成るペプチドであり
；Ｒ５　は：ａ）−ＯＨ、ｂ）１個乃至５個のアミノ酸
から成るペプチド（マーカーアミノ酸を含んでいてもよ
い。）、又はｃ）−ＮＨ２　であり；Ｒ８は：１個乃至
８個の炭素原子から成る低級アルキルである。

【００１２】低級アルキルというは、他様に定義されな
い限り、１個乃至８個の炭素を有する直鎖状又は有枝鎖
状のアルキルである。以下において、アミノ酸−Ｒ２　
−ＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒｇ−Ｒ３　−（配列番号：１
）は環状ペプチドのループを形成することになるため、
ループアミノ酸と称することにする。

【００１３】本発明の一態様においては、構造（配列番
号：３）

【化１８】 を有する環状ペプチドが、構造（配列番号：３）

【化１
９】 を有する直鎖状ペプチドの環化によって製造される。式
中、Ｘ１　は：ａ）セリン、ｂ）プロリン、ｃ）アルギ
ニン、ｄ）ヒスチジン、ｅ）グルタミン（これが好まし
い。）、又はｆ）トレオニンから選ばれるＲ２　の構成
成分であり；Ｘ２　は：ａ）イソロイシン（これが最も
好ましい。）、ｂ）アルギニン（これも好ましい。）、
ｃ）バリン、又はｄ）メチオニンから選ばれるＲ２　の
構成成分であり；Ｘｎ　はＲ２　の構成成分であって、
アミノ酸または８個以下のアミノ酸から成るペプチドで
あり；Ｘ３　は：ａ）アラニン、ｂ）アルギニン、又は
ｃ）バリンから選ばれるＲ３　の構成成分であり；Ｘ４
　は：ａ）フェニルアラニン、ｂ）イソロイシン、ｃ）
バリン、又はｄ）ロイシンから選ばれるＲ３　の構成成
分であり；Ｘｍ　はＲ３　の構成成分であって、アミノ
酸又は８個以下のアミノ酸から成るペプチドである。Ｘ
２　は好ましくはイソロイシンである。

【００１４】本発明の新規な環状ペプチドは、実質的に
２段階の工程によって製造される：最初に、直鎖状ペプ
チドを、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ９０５０又はＡＢＩ−４３１
Ａペプチドシンセサイザー上にて９−フルオレニルメチ
ロキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学および試薬として適
当に側鎖保護したＦｍｏｃ−アミノ酸ペンタフルオロフ
ェニルエステルを用いるか、又は誘導体化Ｗａｎｇ樹脂
、Ｆｍｏｃ化学および試薬としての側鎖保護Ｆｍｏｃ−
アミノ酸対称無水物（工程中に作られる。）を用いて合
成する。

【００１５】次に、直鎖状ペプチドを、溶液中又はその
まま固相樹脂につけた状態で、ループを形成することに
なる配列の両端にシステイン残基を組込み、これをジス
ルフィドに酸化することにより環化する。好適な態様で
は、ペプチドを（ａ）Ｈ２　Ｏ２　、（ｂ）メタノール
やＣＨ３　ＣＮのような有機溶媒における大気中酸素、
（ｃ）約０．１〜０．５％ＴＦＡを含むＣＨ３　ＣＮ水
溶液、又は（ｄ）約０．１Ｍフェリシアン化物にさらす
ことにより、環化を行う。最も好適には、有機溶媒中カ
ラムクロマトグラフィー又はこの分野において知られて
いる他の適当な手段によって酸素スカベンジャーを除去
した後に大気中酸素にさらす。

【００１６】得られた生成物は高速原子衝突質量分析［
ＦＡＢ−ＭＳ］、逆相ＨＰＬＣ、アミノ酸分析又は核磁
気共鳴分光分析（ＮＭＲ）を用いて同定することができ
る。

【００１７】かくして、本発明のペプチドが製造される
。以下の（ｉ）および（ｉｉ）においてさらに詳しく述
べる：

【００１８】ｉ．固相でのペプチドの環化：ループアミ
ノ酸の両側にＣ１　およびＣ２　を含む直鎖状ペプチド
（Ｃ１　およびＣ２　はともにシステイン又は側鎖に遊
離スルフヒドリル基を含む他のアミノ酸である。）を既
知の合成法によって製造する（前記参照）。完成した環
状ＰＮＤにおいて、スルフヒドリルを含む側鎖（−Ｒ８
　−ＳＨ）は完成した前記環状ＨＩＶＰＮＤ構造の−Ｒ
８　−Ｓ−基を形成することになる。組みこむアミノ酸
が反応性側鎖（Ｒ基）を有するときは適当にＲ基が保護
された形で用いる。たとえば、ヒスチジンはトリフェニ
ルメチル（Ｔｒｔ）又はＢｏｃで保護し、アルギニンは
４−メトキシ−２，３，６−トリメチルフェニルスルホ
ニル（Ｍｔｒ）で保護する。

【００１９】好ましくは、樹脂はＡｃｍ保護された形の
Ｃ２　がすでについている形、たとえばＦｍｏｃ−Ｌ−
Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｏ−Ｗａｎｇ樹脂のような形で購入
する。ループアミノ酸のアミノ末端側に組込まれるシス
テインもＡｃｍ誘導体であることができる。Ｃ１　また
はＣ２　のいずれか一方は、担体分子との結合体の形成
に用いられたり後に続くアミノ酸分析のためのマーカー
アミノ酸の役目を果たす（たとえばノルロイシン又はオ
ルニチンが用いられるとき）他のアミノ酸（それぞれＲ
１　又はＲ５　）と結合してもよい。

【００２０】アセトアミドメチル化されたシステインの
イオウは、室温で約１５時間、樹脂とコンパチブルな溶
媒たとえば１〜５０％濃度の有機酸、好ましくは無水ジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ）中約１０％酢酸中で、各
Ａｃｍ基について約４倍過剰モルの重金属塩たとえば酢
酸第二水銀［Ｈｇ（ＯＡｃ）２　］と反応させる。得ら
れる重金属チオエーテルたとえばペプチドの酢酸第二水
銀チオエーテルＰＥＰ（Ｓ−ＨｇＯＡｃ）を次いで洗浄
し乾燥する。ＤＭＦ中過剰硫化水素を加えると不溶性金
属硫化物たとえば硫化第二水銀（ＨｇＳ）と遊離スルフ
ヒドリル基を有するペプチドを生ずる。次いで、この遊
離スルフヒドリルを前記の方法の１つを用いて酸化する
。 別法として、Ａｃｍ保護チオールをメタノール／ＤＭＦ
溶媒中においてヨウ素で処理することにより直接環状ジ
スルフィドに変換してもよい。

【００２１】ｉｉ．溶液中でのペプチドの酸化：固相環
化について上記した方法と実質的に同じ方法が行われる
が、２つの変法がある：もしペプチドをペプシンＫＡ樹
脂から切り離すのであれば（９５％ＴＦＡ／４％エタン
ジチオール／１％チオアニソール）、不安定な酸側鎖の
保護基も除去され、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）は必要な遊離−Ｓ
Ｈ基を与える。しかしながら、もしＣｙｓ（Ａｃｍ）保
護を用いる場合には、直鎖状ペプチドが樹脂に結合した
状態または離れている状態のいずれかにおいて、酢酸第
二水銀／硫化水素開裂により遊離−ＳＨ基にすることが
独立した工程として必要となる。

【００２２】しかしながら、Ｃｙｓ（Ａｃｍ）保護とサ
スリン又はペプシンＫＨ樹脂を用い、直鎖状の完全に保
護されたペプチドを１％ＴＦＡ／ＣＨ２　Ｃｌ２　で樹
脂から切り離す方法もある。次いで、酢酸第二水銀／硫
化水素で選択的にＣｙｓ（Ａｃｍ）を遊離−ＳＨ基形に
変換し、その他の部分は保護した状態でペプチドを環化
する。このとき、ペプチドをその場でＮ末端を選択的に
マレイミド化してもよい。不安定な酸側鎖の保護基は９
８％ＴＦＡ／２％チオアニソールで開裂し、環状ペプチ
ドをＨＰＬＣで単離する。ただし、好ましくは、ペプチ
ドを樹脂から切り離し、前記方法の１つで環化する。最
も好ましくは、１０乃至４０℃で約１乃至５０時間空気
酸化を行う。

【００２３】以下の実施例は本発明の環状ペプチドをさ
らに説明し、そのようなペプチドをどのように製造し使
用するかをより具体的に示すためのものである。ただし
、それらの実施例を本発明の範囲を限定するものと解釈
すべきでない。

【００２４】実施例１　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　ｃＰＮＤ３３の調
製（配列番号：４）１．下記配列の合成

【化２０】 （Ｃ１３５　Ｈ２２０　Ｎ４２Ｏ３３Ｓ２　，式量＝３
０２３．６）上記２６量体（２６ｍｅｒ）をＭｉｌｌｉ
ｇｅｎ＃９０５０シンセサイザーを使用し、一部ラセミ
化したＦｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＰＫＡ樹脂
（ＭｉｌｌｉｇｅｎバッチＢ　　０９０４２６，０．０
８１ｍｅｑ　／ｇ）２．４７ｇ（０．２００ｍｅｑ　）
を用いて合成した。理論収率は６０４ｍｇである。 この樹脂を等体積のグラスビーズ（Ｓｉｇｍａ　１５０
−２１２μｍ　）と混合した。混合物を２つの直列に接
続された１×１０ｃｍカラムに一杯に充填した。試薬は
Ｆｍｏｃ−Ｐｆｐエステル（ｄＨＢｔであるトレオニン
を除く。）を、Ｎ−メチルピロリジン溶媒中４倍過剰モ
ル量用いた。側鎖保護は、Ｔｙｒ（ｔｅｒｔ−ブチル）
；Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）；Ａｒｇ（Ｍｔｒ）；Ｈｉｓ（Ｂｏ
ｃ）；Ｔｈｒ（ｔｅｒｔ−ブチル）；Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）
とした。 手法を修正して、Ｌｙｓ７　；Ｉｌｅ９　；Ｉｌｅ１１
；Ｇｌｙ１２；Ｐｒｏ１３；Ｇｌｙ１４；Ａｒｇ１５；
Ｐｈｅ１７；Ｔｙｒ１８；Ｔｈｒ１９；Ｔｈｒ２０；Ｉ
ｌｅ２３；Ｉｌｅ２４とはダブルカップリングさせた。 アシル化リサイクル時間は、Ｇｌｙ１４およびＡｌａ１
６を除くすべてのユニットについて３０分から６０分に
延長し、Ｉｌｅ９　（２×）；Ｉｌｅ１１（２×）；Ｉ
ｌｅ２３（２×）およびＩｌｅ２４（２×）については
９０分に延長した。誘導化樹脂をＣＨ２　Ｃｌ２　で洗
浄し風乾した遊離末端アミンとして保持した。乾燥誘導
化樹脂とグラスビーズとの混合物を、密閉フラスコ中２
３℃の９５％ＴＦＡ、４％エタンジチオール、１％ＣＨ
３　ＳＰｈ（３０ｍＬ）中に再懸濁させ、振動トレイ上
で８時間静かに攪拌した。次いで、明黄色混合物を濾過
し、不溶物を１００％ＴＦＡ（３×２０ｍＬ）で十分に
抽出した。合わせた暗橙色の濾液を蒸発処理し、薄い黄
褐色の油状ガムを得た。この物質をエーテル（２０ｍＬ
）で摩砕するとただちに無色の固体となり、これをフィ
ルターに移してさらにエーテル（３×２０ｍＬ）で摩砕
した。乾燥後、粗生成物を微細な無色の粉末として得た
（５８３ｍｇ）。０．４６×２５．０ｃｍ　　Ｖｙｄａ
ｃ　　Ｃ１８カラム上分析用逆相ＨＰＬＣ［０．１％Ｔ
ＦＡ／２２％ＣＨ３　ＣＮ水溶液，λ＝２１５ｎｍ，Ａ
＝０．０５，２．０ｍＬ／分］に従って、０．１％ＴＦ
Ａ／２０％ＣＨ３　ＣＮ水溶液５０μＬ　中に溶解した
約５０μｇ　の試料を分析すると、４μＬ　のインジェ
クションで主成分（３６．２９分）および後から溶出す
る少量成分の存在を示した。この試料の３０ｍｇさらに
５０ｍｇのアリコートを、２つの直列に接続した２．２
１×２５．０ｃｍ分取用Ｖｙｄａｃ　　Ｃ１８カラムに
インジェクションして［６０分間にわたるリニアグラジ
エント：０．１％ＴＦＡ／２３−２７％ＣＨ３　ＣＮ，
λ＝２１５ｎｍ，Ａ＝３．００，１０ｍＬ／分］、上記
２成分を別々に捕集した。全体で、先に溶出する物質（
４４．４５分）３５．２ｍｇおよび後から溶出する物質
８．２ｍｇが凍結乾燥により回収された。主成分のＦＡ
Ｂ−ＭＳで［Ｍ＋Ｈ］＋　＝３０２２．１および［Ｍ＋
Ｎａ］＋＝３０４４．２が得られた。これは質量計算値
と一致する。

【００２５】２．環状ジスルフィドｃＰＮＤ３３の調製
（配列番号：４）

【化２１】 ａ．Ｋ３　Ｆｅ（ＣＮ）６　誘導酸化直鎖状２６量体ジ
チオール化合物（３５．０ｍｇ）を２３℃で脱気蒸留水
（３８ｍＬ）に溶解し、ｐＨ２．７３の清澄な無色溶液
を得た。 ０．１Ｎ　　ＮＨ４　ＯＨでｐＨを８．５に調節し、溶
液を窒素雰囲気で被った。この物質の少量をただちに分
析用逆相ＨＰＬＣにかけ、より早いピークの存在により
酸化が進行していることが裏づけられた。磁性攪拌を行
いながら、新しく調製した０．０１Ｍ　　Ｋ３　Ｆｅ（
ＣＮ）６　溶液を窒素下２３℃で動力式皮下注射器によ
り加えた。少量をＨＰＬＣで分析したところ、出発物質
はすべてより早く溶出する物質に変換していることがわ
かった。この反応混合物（ｐＨ８．３）を１０％酢酸水
溶液と混合し、攪拌してｐＨを４．０とした。この溶液
を濾過して不溶物を除去し、微黄色の溶液を蒸発処理し
た後に凍結乾燥して約２７．９ｍｇの淡黄色粉末を得た
。この物質を０．１％ＴＦＡ／２０％ＣＨ３　ＣＮに溶
解し、分取用ＨＰＬＣでグラジエント溶出した。大きな
早く溶出するピークと遅れて溶出するピーク（４：１）
を別々に捕集し、凍結乾燥して６．１ｍｇの早く溶出す
る成分と１．５ｍｇの遅れて溶出する成分を得た。早く
溶出する成分のＦＡＢ−ＭＳ分析：［Ｍ＋Ｈ］＋　３０
１９．７；［Ｍ＋Ｎａ］＋　３０４２．５；遅れて溶出
する成分のＦＡＢ−ＭＳ分析：［Ｍ＋Ｈ］＋　３０２０
．０；［Ｍ＋Ｎａ］＋　３０４１．５；これらのすべて
は環化ｃＰＮＤ３３の質量に正確に対応する。遅れて溶
出する物質はＤ−システインカルボキシ末端ジアステレ
オマーである。生成物のアミノ酸分析では当該環化生成
物の予想アミノ酸組成が得られ、遅れて溶出する物質が
Ｄ−システイン含有ジアステレオマーであることが確認
された。ｂ．空気酸化上記（１）で調製された直鎖２６
量体（８６ｍｇ、２８．４μｍｏｌｅｓ　）を０．１％
ＴＦＡ／２０％アセトニトリル水溶液（２８４ｍＬ）に
２３℃で溶解し、この溶液を空気に開放して静置した。 環化を逆相ＨＰＬＣでモニタしたところ、試料はほとん
ど完全に前記早く溶出する物質に変換しており、出発直
鎖状物質はｔ＝２４時間までにほぼ完全に消滅したこと
がわかった。無色透明なこの溶液を約８ｍＬまで蒸発濃
縮し、その時点で上記８６ｍｇの試料と同様に調製され
た試料１０ｍｇをさらに加えた。合わせた試料を約９ｍ
Ｌまで蒸発濃縮した。くもった無色の溶液を、２つの直
列に接続された２．１２×２５．０ｃｍ　　Ｖｙｄａｃ
　　Ｃ１８カラムで２回に分けてＨＰＬＣ分離にかけた
。２つの画分すなわち早く溶出するピークと遅れて溶出
するピークを別々に捕集した。各ピークを別々に蒸発し
凍結乾燥して、それぞれ３０．１ｍｇおよび９．７ｍｇ
の早い物質および遅れる物質を得た。早く溶出した物質
を他に調製された早く溶出する環化物質と合わせ、全体
で４７．５ｍｇのわずかに青味がかったふわふわした粉
末を得た。この物質のＨＰＬＣ分析では単一のピークが
得られた。

【００２６】実施例２ＯＭＰＣのｃＰＮＤ３３との結合
１．３−マレイミドプロピオン酸無水物の調製３−マレ
イミドプロピオン酸（２２６ｍｇ）を無水酢酸５ｍＬで
おおい、混合物を１３０℃で３．７５時間加熱した後、
室温で一晩エージングした。溶液を濃縮して油状とした
。このＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３　）は、ホモ無水
物と酢酸およびマレイミドプロピオン酸の混合無水物と
の混合物であることを示した。出発物質の酸はカルボニ
ルに隣接するメチレンを２．６８ｐｐｍ　に中心をもつ
トリプレットとして示すが、無水物ではこれらの共鳴が
２．８１ｐｐｍ　に現れる。分別昇華を、最初７０℃、
０．２ｍｍ次いで１２０℃、０．２ｍｍで行って精製し
た。後者の画分をＣＤＣｌ３　中に溶解することによっ
て装置から除去し、その溶液を蒸発処理して純粋なホモ
無水物３４ｍｇを得た。 これをＣＤＣｌ３　およびシクロヘキサンから再結晶さ
せ、融点１４３−１４７℃の物質を得た。計算値（Ｃ１
４Ｈ１２Ｎ２　Ｏ７　）：Ｃ，５２．５１；Ｈ，３．７
８；Ｎ，８．７５。実測値：Ｃ，５１．７３；Ｈ，３．
６７；Ｎ，８．１６。２００ＭＨＺ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ
３　）：２．８３（２Ｈ，ｔ），３．８４（２Ｈ，ｔ）
，６．７３（２Ｈ，ｓ）。

【００２７】２．ｃＰＮＤ３３の“選択的”アシル化ｃ
ＰＮＤ３３（２２．５ｍｇ；これは７０％ペプチドとす
れば１５．７５ｍｇあるいは５．２１２マイクロモルに
相当する。）を、０．１Ｍ　　ｐＨ５．２５モルホリノ
エタンスルホン酸バッファー１２．０ｍＬに溶解し、氷
浴中で冷却した。この溶液の分析および反応の進行を、
２５％アセトニトリル水溶液を用いる２５ｃｍ　　ＯＤ
Ｓカラム（溶離剤は０．１％トリフルオロ酢酸）でのＨ
ＰＬＣで追跡した。マレイミドプロピオン酸無水物（２
．０ｍｇ，６．２５マイクロモル）を乾燥テトラヒドロ
フラン０．６００ｍＬに溶解し、この溶液０．５ｍＬ（
無水物５．２マイクロモルに相当する。）を上記ペプチ
ド溶液に加えた。３０秒後に、７マイクロリットルを採
取してＨＰＬＣで調べた。この分析を０．２５、０．５
０、１．２５、２．２５および３．０時間において繰り
返した。３．５時間後に、溶液を凍結乾燥した。凍結乾
燥物を２０％アセトニトリル水溶液２．０ｍＬに溶解し
、０．２ミクロンのフィルターで濾過し、２１．２ｍｍ
×２５ｃｍ　　Ｚｏｒｂａｘ　　Ｃ−１８カラムで０．
７００ｍＬずつ３回に分けて分取用クロマトグラフィー
にかけた。次の溶離プログラムを用いた：流速＝１０ｍ
Ｌ／分；２５％アセトニトリル水溶液／０．１％ＴＦＡ
によるイソクラチック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）　溶離（
１２分間）；２８％アセトニトリルへのグラジエント（
１０分間）；３５％アセトニトリルへのグラジエント（
８分間）。末期画分を濃縮および凍結乾燥により単離し
、回収出発物質（最後から２番目の画分）８．９ｍｇお
よび分子量３１７２を示すマススペクトル（ＦＡＢ）を
有する生成物（すなわちｃＰＮＤ３３のモノマレイミド
プロピオニル誘導体）９．６ｍｇを得た。この生成物を
さらに配列分析にかけ、リシンの不存在を見い出した（
配列の不存在は末端アミノのアシル化を意味する）。 この結果は、ほとんどの（すべてではないが）マレイミ
ドプロピオニル部分はカルボキシ末端は隣接するリシン
に結合していることを示す。

【００２８】３．マレイミド化ｃＰＮＤ３３のチオール
化ＯＭＰＣとの共結合（ｃｏｃｏｎｊｎｇａｔｉｏｎ）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　Ａ．小規模実験３−マレイミ
ドプロピオン酸（ＭＰＡ）水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を調
製した。これを次のように標定した：Ｎ−アセチルシス
テイン溶液（０．２マイクロモル／ｍＬ，ｐＨ８．０　
　ＰＯ４　バッファー中）２．９８ｍＬに上記マレイミ
ドプロピオン酸溶液０．０２ｍＬを加えた。１０分間の
エージングの後、Ｅｌｌｍａｎ試薬０．１００ｍＬを加
えた。これを参照ビーム中に置き、“ブランク”（試料
を水で置きかえて調製）をサンプルビーム中に置いて、
４１２ｎｍでＯ．Ｄ．を測定した。このＥｌｌｍａｎ“
吸光度”法により、３−マレイミドプロピオン酸の力価
５．０マイクロモル／ｍＬが得られた。前記マレイミド
化ペプチド（ＭＰＰ）（９．６ｍｇ／水０．８００ｍＬ
）を同様にして標定し、２．７マイクロモル／ｍＬの力
価を得た。Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトンで
チオール化したＯＭＰＣをＥｌｌｍａｎ法で標定し、力
価０．７７５マイクロモルＳＨ／ｍＬを得た。反応小瓶
（ＲｅａｃｔｉＶｉａｌ）中のこのチオール化ＯＭＰＣ
　　０．５ｍＬに上記ＭＰＡ溶液０．０４４ｍＬを加え
、室温で１０分間エージング後、上記ＭＰＰ溶液０．０
４４ｍＬを加えた。結合体の沈殿は見られなかった。Ｂ
．大規模実験上記チオール化ＯＭＰＣ溶液８．５ｍＬ（
６．６マイクロモルのＳＨ）にＭＰＡ溶液（４．２５マ
イクロモルまたは６５％のＭＰＡ）を加え、１０分間の
エージングの後、ＭＰＰ溶液０．８５ｍＬ（２．３マイ
クロモルまたは３５％ＭＰＰ）を加えた。溶液を４℃で
１６時間エージングしたところ、その後沈殿が見られた
。５Ｎ　　ＮａＯＨ　　０．００５ｍＬでｐＨを８．１
３に調整することにより沈殿を再懸濁させた。３時間の
エージングの後、少量の沈殿を低速遠心分離で除去した
。その後、４３Ｋｒｐｍ　、４℃で２時間の超遠心分離
を２回行うことにより結合体を精製した。ペレットは、
Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーで０．０３ＭのｐＨ８ホス
フェートバッファー中に再懸濁させた。この最終結合体
溶液をタンパク質（ｆｄ：０．９２ｍｇ／ｍＬ）および
アミノ酸分析にかけた（Ｎｌｅ＝６０．３５ナノモル／
ｍＬ，すなわちペプチド；β−アラニン１３９．６ナノ
モル，＝結合体中の全マレイミド化合物）。これはタン
パク質へのペプチド負荷が２０．４重量％であることに
相当する。この結合体をラビット中で試験したところ、
ＨＩＶ中和抗体を有効に増大させることがわかった。

【００２９】実施例３ジスルフィド結合したｃＰＮＤ４
の固相合成直鎖状ＰＮＤペプチドを、ＡＢＩ−４３１Ａ
ペプチドシンセサイザーを用いてＷａｎｇ樹脂上で、Ｆ
ｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｏ−Ｗａｎｇ樹脂（０
．６１ｍｅｑ　／グラム）から出発して合成した。Ｆｍ
ｏｃ化学およびＦｍｏｃ−アミノ酸が対称的な無水物（
４倍過剰、ｉｎ　ｓｉｔｕ　製造）を０．２５ミリモル
スケールで試薬として用い、７４５ｍｇのペプチドを生
成させた（配列番号：５）：

【化２２】 ５％メタノール／無水ＤＭＦ中ヨウ素溶液（１ｍＬ）を
上記の乾燥誘導化Ｗａｎｇ樹脂に加え、室温で４時間攪
拌した。樹脂を濾過し、無水ＤＭＦで洗浄し（５×２ｍ
Ｌ）、最後に再びＤＭＦ（２ｍＬ）中に懸濁させた。０
．１Ｍチオ硫酸ナトリウム水溶液を２滴加え、数秒間攪
拌した。樹脂を９５％ＤＭＦ水溶液（３×２ｍＬ）、無
水ＤＭＦ（２ｍＬ）、メチレンクロリド（３×２ｍＬ）
およびエーテル（３×２ｍＬ）の順で洗浄し、乾燥した
。ＤＭＦ中２０％ピペリジンで２０分間処理してＦｍｏ
ｃや他の保護基を除去し、樹脂を洗浄して乾燥した。９
５％ＴＦＡ／４％エタンジチオール／１％チオアニソー
ル（１ｍＬ）で室温にて６時間処理することにより、ジ
スルフィド結合した環状ペプチドから樹脂をきり離した
。溶液を濾過し、樹脂をさらに１００％ＴＦＡ（３×１
ｍＬ）で洗浄し、合わせた濾液を蒸発乾固した。エーテ
ル可溶物を抽出（３×２ｍＬ）除去して廃棄した。２．
１２×２５ｃｍ　　Ｖｙｄａｃ　　Ｃ１８逆相カラムを
２本直列に用いた分取用ＨＰＬＣで、９０分間にわたる
ＣＨ３　ＣＮ２０％から２４％へのグラジエント溶離に
より、この条件において３６．６６分で溶出してくる鋭
いピークを単離した。この分取用ＨＰＬＣで得られた生
成物と既知のジスルフィド結合した環状標準との同時ク
ロマトグラフィーを分析用ＨＰＬＣで行なったところ、
単一のピークを得た。ＦＡＢ−ＭＳでは、［Ｍ＋Ｈ］＋
　＝１１７１が得られた。これはジスルフィド結合した
環状構造ｃＰＮＤ４（配列番号：５）と一致した。

【化２３】

【００３０】実施例４マレイミドプロピオニル−ｃＰＮ
Ｄ３３−ＯＭＰＣ−マレイミドプロピオン酸共結合体の
動物への接種方法　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　一連の接種においてアラム（ａｌｕｍ）をア
ジュバントとして用いた。接種物は上記共結合体（ｃｏ
ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）　を生理的食塩水に溶解して、最
終の結合体濃度を３００μｇ　／ｍＬとした。予め調製
したアラム（水酸化アルミニウムゲル）をこの溶液に加
え、最終のアルミニウムレベルを５００μｇ　／ｍＬと
した。結合体を室温にて２時間かけてこのアラムゲル上
に吸着させた。吸着に続いて、この結合体を有するゲル
を生理的食塩水で２回洗浄し、タンパク質濃度３００μ
ｇ　／ｍＬで食塩水中に再懸濁させた。アラム上に吸着
した結合体、またはＲｉｂｉアジュバントと調合した結
合体を、３００μｇ　ずつ３回、または１００μｇ　ず
つ３回、アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ　ｇｒｅ
ｅｎ　ｍｏｎｋｅｙ）に個別に接種した。各投与は筋肉
内注射で行った。投与は１箇月おきに行った（０週、４
週、８週）。これらの動物からは２週間ごとに採血した
。それぞれの採血から血清試料を調製し、以下の実施例
に記載されるように、特定の抗体の生成について評価し
た。

【００３１】実施例５抗ペプチドＩｇＧ抗体についての
血清の分析各血清試料をエンザイムリンクドイムノアド
ソルベントアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉ
ｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ，　ＥＬＩ
ＳＡ）で分析した。ポリスチレンのマイクロタイタープ
レートを４℃でリン酸塩緩衝した生理的食塩水（ＰＢＳ
）中にてウェル当り０．５μｇ　の合成ペプチド（ＯＭ
ＰＣに結合していないもの）でコートした。 次いで、各ウェルを０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０含有Ｐ
ＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄した。試験血清をその都度Ｐ
ＢＳ−Ｔで希釈してペプチド含有ウェルに加え、３６℃
で１時間、吸着されているペプチドと反応させた。ＰＢ
Ｓ−Ｔで洗浄後、アルカリホスファターゼと結合したヤ
ギの抗ヒトＩｇＧを試験ウェルに加え、３６℃で１時間
反応させた。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで十分に洗浄し
た。各ウェルは１０％ジエタノールアミン中０．１％ｐ
−ニトロフェニルホスフェート（ｐＨ９．８，０．５ｍ
Ｍ　　ＭｇＣｌ２　・６Ｈ２　Ｏを含有）を受け入れた
。生ずる反応を室温にて３０分間行わせ、その時点で３
．０Ｎ　　ＮａＯＨを加えて反応を停止させた。試験血
清中の抗体とペプチド基質との相互作用が大きいほど、
ウェル上に結合するアルカリホスファターゼの量は大き
い。このホスファターゼ酵素はｐ−ニトロフェニルホス
フェートが波長４０５ｎｍの光を吸収する分子状の物質
に分解するのを媒介する。したがって、ＥＬＩＳＡ反応
の終点における４０５ｎｍの吸光度とペプチドに結合し
た抗体の量との間には直接的関係が存在するのである。 マレイミドプロピオニル−ｃＰＮＤ３３−ＯＭＰＣ−マ
レイミドプロピオン酸共結合体を接種したすべてのサル
は、ペプチドに特異的に結合できる抗体を産生した。

【００３２】実施例６ＨＩＶの伝染力を特異的に中和す
る活性についての血清の分析ウイルス中和活性は、Ｒｏ
ｂｅｒｔｓｏｎ　ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
　２０：１９５−２０２（１９８８）に記載された検定
法で評価する。この検定法は試験血清の特異的ＨＩＶ中
和活性を測定するものである。この検定法はＭＴ−４細
胞（ヒトＴリンパ様細胞系）が容易にＨＩＶに感染し、
ウィルス複製期間の後その感染によって死滅することを
見い出したことに基づく。試験血清を、検定に先だって
５６℃で６０分間処理する。この処理はＨＩＶ複製の非
特異的阻害因子を除去するために必要である。熱処理し
た血清をその都度ＰＲＭＩ−１６４０細胞培養培地で希
釈し、ＨＩＶの標準感染投与量と混合した。投与量は検
定に先だって決定し、検定培養中のすべてのＭＴ−４細
胞を７〜８日後に死滅させるのに必要な最小量のウイル
スを含むものとする。 この血清とウイルスの混合物を３７℃にて１時間相互作
用させる。次いでこれを、ウシ胎児血清を１０％添加し
たＲＰＭＩ−１６４０成長培地中に懸濁した１×１０５
　のＭＴ−４細胞に加える。この培養を３７℃にて５％
ＣＯ２　雰囲気中で７日間インキュベートする。インキ
ュベーション期間の終りに、代謝される色素ＤＴＴを各
培養に加える。この色素は目視で黄色を呈する。生存細
胞が存在すれば、この色素は代謝されて分子状の種とな
り、目視で青色を呈するようになる。中和されたＨＩＶ
はターゲットＭＴ−４細胞中で複製できず、したがって
その細胞を殺すことはない。かくして、代謝性色素を加
えた後の青の発色により、正の中和を検定することがで
きる。アレイミドプロピオニル−ｃＰＮＤ３３−ＯＭＰ
Ｃ−マレイミドプロピオン酸共結合体で免疫したサルは
、すべてヒト免疫不全ウイルスを上記のように中和でき
る特異的抗体を産生した。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　構造（配列番号：１）【化１】 を有する環状のＨＩＶＰＮＤペプチド［式中、ｒは：ａ
   ）水素、又はｂ） 【化２】 （上記式中、Ｗは好ましくは−ＣＨ２　ＣＨ２　−、−
   （ＣＨ２　）３　−又はＲ６　であり、Ｒ６　は【化３
   】 であり、Ｒ７　は低級アルキル、低級アルコキシ、又は
   ハロである。）であり；Ｒ１　は：ａ）結合、又はｂ）
   １個乃至５個のアミノ酸から成るペプチド（マーカーア
   ミノ酸を含んでいてもよい。）であり；Ｒ２　は：３個
   乃至１０個のアミノ酸から成るペプチドであり；Ｒ３　
   は：３個乃至１０個のアミノ酸から成るペプチドであり
   ；Ｒ５　は：ａ）−ＯＨ、ｂ）１個乃至５個のアミノ酸
   から成るペプチド（マーカーアミノ酸を含んでいてもよ
   い。）、又はｃ）−ＮＨ２　であり；Ｒ８は：１個乃至
   ８個の炭素原子から成る低級アルキルである。］、又は
   製薬上許容しうるその塩。
2. 【請求項２】　　構造（配列番号：２）【化４】 を有する請求項１のペプチド［式中、Ｘ１　は：ａ）セ
   リン、ｂ）プロリン、ｃ）アルギニン、ｄ）ヒスチジン
   、ｅ）グルタミン、又はｆ）トレオニンから選ばれるＲ
   ２　の構成成分であり；Ｘ２　は：ａ）イソロイシン、
   ｂ）アルギニン、ｃ）バリン、又はｄ）メチオニンから
   選ばれるＲ２　の構成成分であり；Ｘｎ　はＲ２　の構
   成成分であって、アミノ酸又は８個以下のアミノ酸から
   成るペプチドであり；Ｘ３　は：ａ）アラニン、ｂ）ア
   ルギニン、又はｃ）バリンから選ばれるＲ３　の構成成
   分であり；Ｘ４　は：ａ）フェニルアラニン、ｂ）イソ
   ロイシン、ｃ）バリン、又はｄ）ロイシンから選ばれる
   Ｒ３　の構成成分であり；Ｘｍ　はＲ３　の構成成分で
   あって、アミノ酸又は８個以下のアミノ酸から成るペプ
   チドである。］、又は製薬上許容しうるその塩。
3. 【請求項３】　　構造（配列番号：３）【化５】 を有する請求項２のペプチド［式中、Ｘ１　は：ａ）ヒ
   スチジン、又はｂ）グルタミンから選ばれるＲ２　の構
   成成分であり；Ｘ２　は：ａ）イソロイシン、又はｂ）
   アルギニンから選ばれるＲ２　の構成成分であり；Ｘｎ
   　はＲ２　の構成成分であって、アミノ酸又は８個以下
   のアミノ酸から成るペプチドであり；Ｘ３　は：ａ）ア
   ラニン、ｂ）アルギニン、又はｃ）バリンから選ばれる
   Ｒ３　の構成成分であり；Ｘ４　は：ａ）フェニルアラ
   ニン、ｂ）イソロイシン、ｃ）バリン、又はｄ）ロイシ
   ンから選ばれるＲ３　の構成成分であり；Ｘｍ　はＲ３
   　の構成成分であって、アミノ酸又は８個以下のアミノ
   酸から成るペプチドである。］、又は製薬上許容しうる
   その塩。
4. 【請求項４】　　構造（配列番号：４）【化６】 を有する請求項３のペプチド。
5. 【請求項５】　　構造（配列番号：５）【化７】 を有する請求項３のペプチド。
6. 【請求項６】　　請求項１のペプチドを製造する方法に
   おいて、（ａ）側鎖保護アミノ酸およびＡｃｍ誘導体化
   システインをループアミノ酸−Ｒ２　−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
   −Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｒ３　−の両側に含む直鎖状ＨＩＶ
   ＰＮＤペプチドを合成し；（ｂ）Ａｃｍ誘導体化システ
   インをヨウ素と反応させ；（ｃ）すべてのアミノ酸保護
   基を除去し；（ｄ）ジスルフィド結合生成物を単離する
   ことから成る方法。
7. 【請求項７】　　構造（配列番号：３）【化８】 を有するペプチド［式中、Ｘ１　は：ａ）セリン、ｂ）
   プロリン、ｃ）アルギニン、ｄ）ヒスチジン、ｅ）グル
   タミン、又はｆ）トレオニンから選ばれるＲ２　の構成
   成分であり；Ｘ２　は：ａ）イソロイシン、ｂ）アルギ
   ニン、ｃ）バリン、又はｄ）メチオニンから選ばれるＲ
   ２　の構成成分であり；Ｘｎ　はＲ２　の構成成分であ
   って、アミノ酸又は８個以下のアミノ酸から成るペプチ
   ドであり；Ｘ３　は：ａ）アラニン、ｂ）アルギニン、
   又はｃ）バリンから選ばれるＲ３　の構成成分であり；
   Ｘ４　は：ａ）フェニルアラニン、ｂ）イソロイシン、
   ｃ）バリン、又はｄ）ロイシンから選ばれるＲ３　の構
   成成分であり；Ｘｍ　はＲ３　の構成成分であって、ア
   ミノ酸又は８個以下のアミノ酸から成るペプチドである
   。］、又は製薬上許容しうるその塩の製法において、（
   ａ）構造【化９】 を有する直鎖状のＡｃｍ−チオール保護ペプチドを製造
   し；（ｂ）工程（ａ）のペプチドをヨウ素と反応させ；
   （ｃ）すべてのアミノ酸保護基を除去し；（ｄ）ジスル
   フィド生成物を単離することから成る請求項６記載の方
   法。
8. 【請求項８】　　構造 【化１０】 を有するペプチドを製造する請求項７記載の方法。
9. 【請求項９】　　請求項１のペプチドを製造する方法に
   おいて、（ａ）側鎖保護アミノ酸を含みシステインをル
   ープアミノ酸−Ｒ２　−ＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒｇ−Ｒ
   ３　−の両側に有する直鎖状ＨＩＶＰＮＤペプチドを合
   成し；（ｂ）工程（ａ）の生成物を約０．１％ＴＦＡ／
   ２０％ＣＨ３　ＣＮ溶液中にて、もしくはメタノール中
   液体クロマトグラフィーでペプチドから酸素スカベンジ
   ャーを分離した後に１０乃至４０℃で約１乃至５０時間
   空気にさらすことにより酸化することから成る方法。
10. 【請求項１０】　　構造（配列番号：４）【化１１】 を有するペプチドを製造する請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】　　請求項１の化合物を使用することに
    より、哺乳類中に抗ペプチド、抗ＨＩＶ、又はＨＩＶ中
    和抗体を誘発する方法。
12. 【請求項１２】　　請求項１の化合物の免疫学的有効量
    を投与することにより、ＨＩＶに感染した哺乳類を治療
    する方法。