JPH0424555A - 抗レンチナン抗血清及びレンチナンの免疫学的測定法 - Google Patents
抗レンチナン抗血清及びレンチナンの免疫学的測定法Info
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- JPH0424555A JPH0424555A JP12883290A JP12883290A JPH0424555A JP H0424555 A JPH0424555 A JP H0424555A JP 12883290 A JP12883290 A JP 12883290A JP 12883290 A JP12883290 A JP 12883290A JP H0424555 A JPH0424555 A JP H0424555A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、レンチナンに対する抗血清及びそれを利用し
たレンチナンの免疫学的測定方法に関する。
たレンチナンの免疫学的測定方法に関する。
現在癌の臨床の場で使用されているレンチナンは、β−
（ｌ→６）結合の分枝をもつβ−（ｌ→３）−Ｄ−グル
カンで、その生物活性は、生体内防御反応を賦活する物
質として特徴づけられている。レンチナンの臨床での効
果をモニタリングする一つの指標として、投与したレン
チナンの体内動態を検討する手段の開発は従来から望ま
れていた。現在、基礎実験及び臨床においては、レンチ
ナンの測定にはカブトガニ血球ライセードを利用したト
キシカラーテスト法を用いている°が、操作がかなり厳
密で、エンドトキシンフリーのサンプルしか測定できな
いのに加え、肝臓障害のある患者血清は、擬陽性となり
測定できない、または、透析したサンプルは、透析膜由
来の多糖体が微量に含まれるため、正の誤差がでるとい
う特異性にも問題がある。そのために、レンチナンに特
異的な抗体を得、これを利用する免疫学的測定方法を確
立することは、患者血中濃度及び組織内分布といった体
内動態を検討するため、有用な手段となり得る。しかし
ながら、レンチナンは抗原性がきわめて低くそのもの自
身を免疫して抗体を誘導することは不可能であった。
（ｌ→６）結合の分枝をもつβ−（ｌ→３）−Ｄ−グル
カンで、その生物活性は、生体内防御反応を賦活する物
質として特徴づけられている。レンチナンの臨床での効
果をモニタリングする一つの指標として、投与したレン
チナンの体内動態を検討する手段の開発は従来から望ま
れていた。現在、基礎実験及び臨床においては、レンチ
ナンの測定にはカブトガニ血球ライセードを利用したト
キシカラーテスト法を用いている°が、操作がかなり厳
密で、エンドトキシンフリーのサンプルしか測定できな
いのに加え、肝臓障害のある患者血清は、擬陽性となり
測定できない、または、透析したサンプルは、透析膜由
来の多糖体が微量に含まれるため、正の誤差がでるとい
う特異性にも問題がある。そのために、レンチナンに特
異的な抗体を得、これを利用する免疫学的測定方法を確
立することは、患者血中濃度及び組織内分布といった体
内動態を検討するため、有用な手段となり得る。しかし
ながら、レンチナンは抗原性がきわめて低くそのもの自
身を免疫して抗体を誘導することは不可能であった。
また、このような物質の抗血清を得る場合、得られた抗
血清が、その物質の持つ生理活性を中和することができ
るかが重要な問題で、生理活性を中和することができれ
ば、その活性の作用機作解明に有用な手段となり得る。
血清が、その物質の持つ生理活性を中和することができ
るかが重要な問題で、生理活性を中和することができれ
ば、その活性の作用機作解明に有用な手段となり得る。
現在までのところ、抗腫瘍多糖体において、その生理活
性を中和することのできる抗血清が得られたという文献
はなく、このような抗血清を得ることは従来から望まれ
ていた。さらに、レンチナンの生理活性において基礎的
及び臨床的に、最も重要なのはｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫
瘍活性である。この抗腫瘍活性を中和することができる
抗血清が得られれば、抗腫瘍活性の作用機作の解明に有
用な手段となり従来から開発が望まれていたが、現在ま
で、そのような効果を示す抗血清の報告はない、このよ
うな抗血清が得られれば、抗腫瘍多糖体の作用機作にお
いて、解明が進むのみならず、抗腫瘍多糖体が体内でど
のような挙動を示すのかを明かにすることによって、臨
床の場で望まれているレンチナンの効果をモニタリング
方法の確立にも役に立つと考えられている。
性を中和することのできる抗血清が得られたという文献
はなく、このような抗血清を得ることは従来から望まれ
ていた。さらに、レンチナンの生理活性において基礎的
及び臨床的に、最も重要なのはｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫
瘍活性である。この抗腫瘍活性を中和することができる
抗血清が得られれば、抗腫瘍活性の作用機作の解明に有
用な手段となり従来から開発が望まれていたが、現在ま
で、そのような効果を示す抗血清の報告はない、このよ
うな抗血清が得られれば、抗腫瘍多糖体の作用機作にお
いて、解明が進むのみならず、抗腫瘍多糖体が体内でど
のような挙動を示すのかを明かにすることによって、臨
床の場で望まれているレンチナンの効果をモニタリング
方法の確立にも役に立つと考えられている。
本発明は、レンチナンに反応する抗血清を得ること、お
よびレンチナンの免疫学的測定方法を確立することを課
題とする。
よびレンチナンの免疫学的測定方法を確立することを課
題とする。
本発明者らは上記課題を解決するため種々検討した結果
、レンチナンにある種の蛋白、例えばアルブミン、ヘモ
グロビン、ヘモシアニン等の蛋白を結合させ、レンチナ
ン−蛋白複合体を合成し、これを抗原として動物に免疫
し抗レンチナン抗体を誘導することに成功し、さらにこ
の抗レンチナン抗血清を使用してレンチナンの免疫学的
測定方法を確立α本発明を完成す、６ツ到、７，７ウオ
ンに蛋白を結合させる反応は、１）レンチナンに臭化脂
肪酸を反応させ、カルボキシル基を導入し、カルボジイ
ミド法により蛋白を結合させる。と２）レンチナンに過
ヨウ素酸ナトリウムを反応させ、酸化開裂しアルデヒド
基を導入し蛋白とシッフ塩基の型で結合させる。という
２種類の既知の反応を用いることが可能である。しかし
ながら、１）の場合には、反応過程で強アルカリ処理を
伴うためにレンチナンが反応過程で変性し、得られたレ
ンチナン−蛋白複合体を動物に免疫しても、反応以前の
元のレンチナンに対する抗体は、誘導されず、２）の場
合はレンチナンを酸化する際の過ヨウ素酸の濃度により
、レンチナンと蛋白が結合しなかったり、または結合し
たとしてもレンチナン分子の酸化開裂が著しく、得られ
たレンチナン−蛋白複合体を免疫しても、複合体中のレ
ンチナン分子と反応前の元のレンチナン分子とはがなり
異なるため、レンチナン自身に対する抗体を含む抗血清
を得ることは、困難である。本発明においては、レンチ
ナンに過ヨウ素酸ナトリウムを反応させ（１〜３０ｍＭ
濃度が使用可能であり、特に２〜５ｍＭが望ましい）、
蘂蕃藷酸化開裂しアルデヒド基を導入し蛋白とシッフ塩
基の型で結合させたレンチナン−蛋白複合体を抗原とし
て動物に免疫することにより、レンチナンに反応する抗
血清を得ることができる。
、レンチナンにある種の蛋白、例えばアルブミン、ヘモ
グロビン、ヘモシアニン等の蛋白を結合させ、レンチナ
ン−蛋白複合体を合成し、これを抗原として動物に免疫
し抗レンチナン抗体を誘導することに成功し、さらにこ
の抗レンチナン抗血清を使用してレンチナンの免疫学的
測定方法を確立α本発明を完成す、６ツ到、７，７ウオ
ンに蛋白を結合させる反応は、１）レンチナンに臭化脂
肪酸を反応させ、カルボキシル基を導入し、カルボジイ
ミド法により蛋白を結合させる。と２）レンチナンに過
ヨウ素酸ナトリウムを反応させ、酸化開裂しアルデヒド
基を導入し蛋白とシッフ塩基の型で結合させる。という
２種類の既知の反応を用いることが可能である。しかし
ながら、１）の場合には、反応過程で強アルカリ処理を
伴うためにレンチナンが反応過程で変性し、得られたレ
ンチナン−蛋白複合体を動物に免疫しても、反応以前の
元のレンチナンに対する抗体は、誘導されず、２）の場
合はレンチナンを酸化する際の過ヨウ素酸の濃度により
、レンチナンと蛋白が結合しなかったり、または結合し
たとしてもレンチナン分子の酸化開裂が著しく、得られ
たレンチナン−蛋白複合体を免疫しても、複合体中のレ
ンチナン分子と反応前の元のレンチナン分子とはがなり
異なるため、レンチナン自身に対する抗体を含む抗血清
を得ることは、困難である。本発明においては、レンチ
ナンに過ヨウ素酸ナトリウムを反応させ（１〜３０ｍＭ
濃度が使用可能であり、特に２〜５ｍＭが望ましい）、
蘂蕃藷酸化開裂しアルデヒド基を導入し蛋白とシッフ塩
基の型で結合させたレンチナン−蛋白複合体を抗原とし
て動物に免疫することにより、レンチナンに反応する抗
血清を得ることができる。
レンチナンに結合する抗体の存在の証明は、レンチナン
と抗血清を加え放置し、抗原抗体複合体形成による沈降
反応により明らかであり、また他の多糖体との交差反応
性は、カードラン、デキストラン等の多糖体と抗血清を
混合し、抗原抗体複合体形成による沈降反応が起こらな
いことにより、レンチナンに対し特異性の高いことが確
認される。
と抗血清を加え放置し、抗原抗体複合体形成による沈降
反応により明らかであり、また他の多糖体との交差反応
性は、カードラン、デキストラン等の多糖体と抗血清を
混合し、抗原抗体複合体形成による沈降反応が起こらな
いことにより、レンチナンに対し特異性の高いことが確
認される。
本発明の抗血清は、レンチナンの生理活性の一部である
補体活性化反応、抗腫瘍活性等をこの抗血清が中和でき
る。すなわち、抗血清とレンチナンを混合し、一定時間
放置後、この混合物は、レンチナンの持つ生理活性が消
失している。
補体活性化反応、抗腫瘍活性等をこの抗血清が中和でき
る。すなわち、抗血清とレンチナンを混合し、一定時間
放置後、この混合物は、レンチナンの持つ生理活性が消
失している。
レンチナンのｒｎ ｖｉｔｒｏでの生理活性の一つとし
て補体活性化反応があり、これはレンチナンの抗腫瘍活
性の一役を担うと考えられている。この補体活性化反応
の測定原理は以下の通りである。
て補体活性化反応があり、これはレンチナンの抗腫瘍活
性の一役を担うと考えられている。この補体活性化反応
の測定原理は以下の通りである。
抗体が結合した赤血球は補体を加えることにょり溶血す
る。これには、２種類の機構があり、１つは補体の古典
的経路と呼ばれ、ＣＩ、Ｃ４゜Ｃ２，Ｃ３，Ｃ３−Ｃ９
という経路で溶血を起こすもの、他方は選択的経路でＨ
因子、Ｂ因子等により調節を受けて生じるＢｂによりＣ
３がＣ３ａとＣ３ｂとに分解し、Ｃ３ｂが生じることに
よりＣ３−Ｃ９の一連の反応が起きるという経路で溶血
を起こす。いずれの経路もＣ３がＣ３ａとＣ３ｂとに分
解することによって生じたＣ３ｂの量が活性に影響する
。Ｃ３は分子内にチオールエステル結合を持ち、補体活
性化物質により活性化され、Ｃ３ａとＣ３ｂ分解する際
にＣ３ｂ分子内の千オールエステル結合が開裂し、近傍
に存在する細胞上のアミノ基またはヒドロキシル基とア
ミド結合またはエステル結合することによって細胞表面
に結合、その後、一連のＣ３−Ｃ９の反応が起こり細胞
に穴を開ける。しかしながら、近傍に細胞がないとＣ３
ｂは不活化されてしまう。そこで、モルモット血清と補
体活性化物′１ｔ（ザイモザン、レンチナン等）をあら
かじめインキュベートしＣ３をＣ３ａとＣ３ｂとに分解
Ｃ３ｂを不活化し、その後抗体結合ヒツジ赤血球を加え
、溶血活性の消失を測定することによってその物質の補
体活性化能を検討することができる。
る。これには、２種類の機構があり、１つは補体の古典
的経路と呼ばれ、ＣＩ、Ｃ４゜Ｃ２，Ｃ３，Ｃ３−Ｃ９
という経路で溶血を起こすもの、他方は選択的経路でＨ
因子、Ｂ因子等により調節を受けて生じるＢｂによりＣ
３がＣ３ａとＣ３ｂとに分解し、Ｃ３ｂが生じることに
よりＣ３−Ｃ９の一連の反応が起きるという経路で溶血
を起こす。いずれの経路もＣ３がＣ３ａとＣ３ｂとに分
解することによって生じたＣ３ｂの量が活性に影響する
。Ｃ３は分子内にチオールエステル結合を持ち、補体活
性化物質により活性化され、Ｃ３ａとＣ３ｂ分解する際
にＣ３ｂ分子内の千オールエステル結合が開裂し、近傍
に存在する細胞上のアミノ基またはヒドロキシル基とア
ミド結合またはエステル結合することによって細胞表面
に結合、その後、一連のＣ３−Ｃ９の反応が起こり細胞
に穴を開ける。しかしながら、近傍に細胞がないとＣ３
ｂは不活化されてしまう。そこで、モルモット血清と補
体活性化物′１ｔ（ザイモザン、レンチナン等）をあら
かじめインキュベートしＣ３をＣ３ａとＣ３ｂとに分解
Ｃ３ｂを不活化し、その後抗体結合ヒツジ赤血球を加え
、溶血活性の消失を測定することによってその物質の補
体活性化能を検討することができる。
上記の測定方法を利用し、レンチナンとモルモット血清
をインキュベートする際に、抗血清を加えることによっ
て、この抗血清はレンチナンの補体活性化反応が中和で
きることを確認することができる。
をインキュベートする際に、抗血清を加えることによっ
て、この抗血清はレンチナンの補体活性化反応が中和で
きることを確認することができる。
抗腫瘍活性に対する中和効果は、腫瘍細胞を接種したマ
ウスにレンチナンと本発明の抗血清を同時に投与した際
にレンチナンのＩｌｌ瘍増抑効果が低減することによっ
て確認することができる。
ウスにレンチナンと本発明の抗血清を同時に投与した際
にレンチナンのＩｌｌ瘍増抑効果が低減することによっ
て確認することができる。
本発明の抗血清を使用し、レンチナンに対する特異的免
疫反応を利用してレンチナンの濃度を測定することが可
能である。この抗血清中の抗体を部分精製し、プラスチ
ックプレートに付着させ、サンプル中のレンチナンが、
酵素、蛍光あるいは放射標識レンチナンと抗体との結合
を阻害することを利用した結合阻害試験法、または付着
させた抗体に結合したサンプル中のレンチナンを、付着
させた抗体を得た動物とは、別の動物から得た抗体で検
出するサンドイッチアッセイ法として測定することがで
きる。
疫反応を利用してレンチナンの濃度を測定することが可
能である。この抗血清中の抗体を部分精製し、プラスチ
ックプレートに付着させ、サンプル中のレンチナンが、
酵素、蛍光あるいは放射標識レンチナンと抗体との結合
を阻害することを利用した結合阻害試験法、または付着
させた抗体に結合したサンプル中のレンチナンを、付着
させた抗体を得た動物とは、別の動物から得た抗体で検
出するサンドイッチアッセイ法として測定することがで
きる。
以下、本発明について具体的に説明する。なお、以下に
記す実施例は、本特許請求の範囲を限定するものではな
い。
記す実施例は、本特許請求の範囲を限定するものではな
い。
実施例１ レンチナンに対する抗血清の作製１） 抗原
の調製 レンチナン（以下ｒＬＮＴ、と略す）（４■／＋＋１）
と６ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａｌＯａ）と
を等量混合し、４°Ｃ１−昼夜、遮光下、攪拌しながら
酸化した。酸化後、エチレングリコールを加えて、過剰
のＮａ１Ｏ４を分解し、反応液を４°Ｃの蒸留水で一昼
夜透析した。透析内液に牛血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎ
ｅ ５ｅｒｕｓ＋ Ａｌｂｍｉｎ： ｒ Ｂ Ｓ Ａ
Ｊと略す）（１７■／ｌｌｌ！！、）を最初の反応液の
１／４量加え水酸化ナトリウムにてｐＨ＝９．５とし４
°Ｃで一昼夜反応させた。結合反応後、反応液に１■／
１ａｌｌの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を最
初の反応液の１／１０量加え、４°Ｃで一昼夜攪拌しな
がら還元反応を行った。還元反応後、過剰のＮａＢＨ４
を塩酸で分解し、溶液のｐＨを中性に調製して、４°Ｃ
で一昼夜蒸留水にて透析した。反応中不溶物が生じたの
で遠心分離し、蒸留水で洗浄した後、リン酸緩衝住理食
塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ５ａｌ
ｉｎｅ ；ｒＰＢＳ（−）Ｊと略す）に懸濁４ ”Ｃで
保存した。
の調製 レンチナン（以下ｒＬＮＴ、と略す）（４■／＋＋１）
と６ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａｌＯａ）と
を等量混合し、４°Ｃ１−昼夜、遮光下、攪拌しながら
酸化した。酸化後、エチレングリコールを加えて、過剰
のＮａ１Ｏ４を分解し、反応液を４°Ｃの蒸留水で一昼
夜透析した。透析内液に牛血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎ
ｅ ５ｅｒｕｓ＋ Ａｌｂｍｉｎ： ｒ Ｂ Ｓ Ａ
Ｊと略す）（１７■／ｌｌｌ！！、）を最初の反応液の
１／４量加え水酸化ナトリウムにてｐＨ＝９．５とし４
°Ｃで一昼夜反応させた。結合反応後、反応液に１■／
１ａｌｌの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を最
初の反応液の１／１０量加え、４°Ｃで一昼夜攪拌しな
がら還元反応を行った。還元反応後、過剰のＮａＢＨ４
を塩酸で分解し、溶液のｐＨを中性に調製して、４°Ｃ
で一昼夜蒸留水にて透析した。反応中不溶物が生じたの
で遠心分離し、蒸留水で洗浄した後、リン酸緩衝住理食
塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ５ａｌ
ｉｎｅ ；ｒＰＢＳ（−）Ｊと略す）に懸濁４ ”Ｃで
保存した。
水溶性画分は、アミコン社製限外濾過装置で、ＹＭ１０
膜用いて濃縮後、未反応のＢＳＡと分離するため、高速
液体クロマトグラフィーにてゲル濾過し、ＬＮＴ−ＢＳ
Ａ複合体画分を溶出した。
膜用いて濃縮後、未反応のＢＳＡと分離するため、高速
液体クロマトグラフィーにてゲル濾過し、ＬＮＴ−ＢＳ
Ａ複合体画分を溶出した。
高速液体クロマトグラフィーは、東ソー社製ＴＳＫｇｅ
ｌ Ｇ３０００ＳＷ （７５ｍｍ１Ｄ Ｘ ６０ ｃｍ
）分析用カラム及びＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ （
２１，７ｍｍ１Ｄ Ｘ ６０ ｃｍ）分取用カラムを用
い、ＰＢＳ （−）を溶出溶媒とし、上記水溶性画分の
ゲル濾過高速液体クロマトグラフィーを行った。分析に
は、ＵＶ検出器及び示差屈折計を用い、ＬＮＴがボイド
ボリュームに溶出され、ＵＶ吸収を持たないことを確認
し、またＢＳＡは、ボイドボリュームには、溶出されな
いことを確認した。上記ＬＮＴ−ＢＳＡ水溶性画分を分
析しボイドボリュームに相当する溶出位置にＵＶ吸収を
持つ蛋白と糖のピークが一敗する画分があることが４１
ｉｌされ、ＬＮＴとＢＳＡが結合したことが証明され
た。そのボイドボリュームに溶出してくる両分を分取用
カラムにて、分画分取し限外濾過にて濃縮して、ＬＮＴ
−ＢＳＡ複合体溶液（２９２ｕｇ ｐｒｏｔｅｌｎ／
ｓｊ！、 ３８０ ｕ ｇｓｕｇａｒ／ｍｌ１）とし
、これを免疫原とした。得られたＬＮＴ−ＢＳＡの収率
、糖含量及びタンパク含量は表−１に記載した。
ｌ Ｇ３０００ＳＷ （７５ｍｍ１Ｄ Ｘ ６０ ｃｍ
）分析用カラム及びＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ （
２１，７ｍｍ１Ｄ Ｘ ６０ ｃｍ）分取用カラムを用
い、ＰＢＳ （−）を溶出溶媒とし、上記水溶性画分の
ゲル濾過高速液体クロマトグラフィーを行った。分析に
は、ＵＶ検出器及び示差屈折計を用い、ＬＮＴがボイド
ボリュームに溶出され、ＵＶ吸収を持たないことを確認
し、またＢＳＡは、ボイドボリュームには、溶出されな
いことを確認した。上記ＬＮＴ−ＢＳＡ水溶性画分を分
析しボイドボリュームに相当する溶出位置にＵＶ吸収を
持つ蛋白と糖のピークが一敗する画分があることが４１
ｉｌされ、ＬＮＴとＢＳＡが結合したことが証明され
た。そのボイドボリュームに溶出してくる両分を分取用
カラムにて、分画分取し限外濾過にて濃縮して、ＬＮＴ
−ＢＳＡ複合体溶液（２９２ｕｇ ｐｒｏｔｅｌｎ／
ｓｊ！、 ３８０ ｕ ｇｓｕｇａｒ／ｍｌ１）とし
、これを免疫原とした。得られたＬＮＴ−ＢＳＡの収率
、糖含量及びタンパク含量は表−１に記載した。
ｓｕｐ、 ６９．９ ４５．７ ５４
．３ ６．１ｐｐｔ、 ３０．１ ６
２．９ ３Ｂ、１ １５．０ｓｕｐ、： Ｗ
ａｔｅｒ ５ｏｌｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎｐｐｔ
、： Ｗａｔｅｒ １ｎｓｏｌｂｌｅ ｆｒａｃ
ｔｉｏｎ傘： ｍｏｌ ｏｆ ＢＳＡ ／ ｓ
ｏｌ ｏｆ ＬＮＴ １ｎＹ１ｅｌｄ： ｓｇ
ｏｆ ｓｕｇａｒ ｉｎ ＬＮＴ−ＢＳＡａｇ
ｏｆ ｕｓｅｄ ＬＮＴ ＬＮＴ−ＢＳＡ ／ ２） 抗レンチナン抗血清の作製 上記の条件下で調製したＬＮＴ−ＢＳＡ複合体溶液０．
５ 鴎ｌをフロイントの完全アジュバント（Ｐｒｅｕｎ
ｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎＬ ：
Ｆ ＣＡ） ０．５ ｍｌと混合し乳化した
試料をウサギの背部に１週間毎に４回皮下注射した。最
終免疫後１週間目に頚動脈より全採血し遠心分離して血
清を得（６５ｍ１）、抗ＬＮＴ抗血清とした。また、対
照血清（ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ ５ｅｒｕ量
）として正常ウサギの血清も同様の方法にて採取した。
．３ ６．１ｐｐｔ、 ３０．１ ６
２．９ ３Ｂ、１ １５．０ｓｕｐ、： Ｗ
ａｔｅｒ ５ｏｌｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎｐｐｔ
、： Ｗａｔｅｒ １ｎｓｏｌｂｌｅ ｆｒａｃ
ｔｉｏｎ傘： ｍｏｌ ｏｆ ＢＳＡ ／ ｓ
ｏｌ ｏｆ ＬＮＴ １ｎＹ１ｅｌｄ： ｓｇ
ｏｆ ｓｕｇａｒ ｉｎ ＬＮＴ−ＢＳＡａｇ
ｏｆ ｕｓｅｄ ＬＮＴ ＬＮＴ−ＢＳＡ ／ ２） 抗レンチナン抗血清の作製 上記の条件下で調製したＬＮＴ−ＢＳＡ複合体溶液０．
５ 鴎ｌをフロイントの完全アジュバント（Ｐｒｅｕｎ
ｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎＬ ：
Ｆ ＣＡ） ０．５ ｍｌと混合し乳化した
試料をウサギの背部に１週間毎に４回皮下注射した。最
終免疫後１週間目に頚動脈より全採血し遠心分離して血
清を得（６５ｍ１）、抗ＬＮＴ抗血清とした。また、対
照血清（ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ ５ｅｒｕ量
）として正常ウサギの血清も同様の方法にて採取した。
得られた抗血清中にＬＮＴに対する抗体が含まれるかの
確認は、Ｋａｂａ ｔとＭａｙｅｒの定量免疫沈降反応
（Ｋａｂａｔ Ｌ Ｍａｙｅｒ″ｌ１ｓｂａＬ ＆ Ｍ
ａｙｅｒ’ｓ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｓｍｕ
ｎｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙ ” ２ｎｄ、 Ｅｄ、
、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ。
確認は、Ｋａｂａ ｔとＭａｙｅｒの定量免疫沈降反応
（Ｋａｂａｔ Ｌ Ｍａｙｅｒ″ｌ１ｓｂａＬ ＆ Ｍ
ａｙｅｒ’ｓ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｓｍｕ
ｎｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙ ” ２ｎｄ、 Ｅｄ、
、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ。
ＴｈｏｍａｓｌＳｐｒｉｎｇ目ｅｌｄ、 ｐ２２ （１
９６１） ）を一部改良して行った。ＬＮＴ−ＢＳＡ複
合体（５−１００μｇ）、ＬＮＴ （５−２００μｇ）
あるいはＢＳＡ（５−１００μｇ）をホウ酸緩衝液（０
，０５Ｍ。
９６１） ）を一部改良して行った。ＬＮＴ−ＢＳＡ複
合体（５−１００μｇ）、ＬＮＴ （５−２００μｇ）
あるいはＢＳＡ（５−１００μｇ）をホウ酸緩衝液（０
，０５Ｍ。
ｐＨ−７，９： ＢＢＳ） １００μｌに溶解した抗
原溶液と抗ＬＮＴ抗血清あるいは対照血清（正常ウサギ
血清）２０μｌを１．５ｍｆ用遠心分離用チューブに入
れ、４°Ｃ，３日間反応させた０反応後、遠心分離して
抗原抗体沈降物を氷冷したＰＢＳ （−）６００μｎで
３回洗浄し、０．０５ ＮのＮａＯＨ１６０μ！で抗原
抗体沈降物を溶解し、バイオラド社製Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａｓ５ａｙ試薬４０μ！を加え、沈降物の蛋白量を定
量した。その結果、正常血清にＬＮＴを添加した場合に
は、免疫複合体形成による沈降反応は起こらないのに対
し、抗ＬＮＴ抗血清にＬＮＴを添加した場合にのみ免疫
複合体形成による沈降反応が認められたため、この抗血
清中には、ＬＮＴ自身に反応する抗ＬＮＴ抗体が含まれ
ていることが確認された。
原溶液と抗ＬＮＴ抗血清あるいは対照血清（正常ウサギ
血清）２０μｌを１．５ｍｆ用遠心分離用チューブに入
れ、４°Ｃ，３日間反応させた０反応後、遠心分離して
抗原抗体沈降物を氷冷したＰＢＳ （−）６００μｎで
３回洗浄し、０．０５ ＮのＮａＯＨ１６０μ！で抗原
抗体沈降物を溶解し、バイオラド社製Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａｓ５ａｙ試薬４０μ！を加え、沈降物の蛋白量を定
量した。その結果、正常血清にＬＮＴを添加した場合に
は、免疫複合体形成による沈降反応は起こらないのに対
し、抗ＬＮＴ抗血清にＬＮＴを添加した場合にのみ免疫
複合体形成による沈降反応が認められたため、この抗血
清中には、ＬＮＴ自身に反応する抗ＬＮＴ抗体が含まれ
ていることが確認された。
実施例２ 抗ＬＮＴ抗血清のＬＮＴのｉｎ ｖｉｔｒ。
での生理活性（補体活性化反応）に対
（Ｚｙｓｏｓａｎ Ａ； ｒ Ｚ Ｙ Ｍ Ｊと略す）
をそれぞれ２μ１ｇ／ｍｌになるように注射用蒸留水に
溶解または懸濁した。対照群溶液には、注射用蒸留水を
用いた。
をそれぞれ２μ１ｇ／ｍｌになるように注射用蒸留水に
溶解または懸濁した。対照群溶液には、注射用蒸留水を
用いた。
これらの溶液に、正常ウサギ血清、抗ＬＮＴ抗血清、Ｐ
ＢＳ （−）を等量混合し３７”Ｃ，２時間放置しサン
プルを調製した。
ＢＳ （−）を等量混合し３７”Ｃ，２時間放置しサン
プルを調製した。
ゼラチンベロナール緩衝液（Ｇｅｌａｔｉｎ ｖｅｒｏ
ｎａｌｂｕｆｆｅｒ； ｒ Ｇ Ｖ Ｂ ” Ｊと略
す）にて、補体として正常モルモット血清（Ｇｕｉｎｅ
ａ Ｐｉｇ Ｓｅｒｕｍ ； ｒ Ｇ ＰＳ」と略す
）を１０倍希釈し、ＧＰＳ溶液に調製したサンプルを等
量混合して３７°Ｃ，１時間振とうした。
ｎａｌｂｕｆｆｅｒ； ｒ Ｇ Ｖ Ｂ ” Ｊと略
す）にて、補体として正常モルモット血清（Ｇｕｉｎｅ
ａ Ｐｉｇ Ｓｅｒｕｍ ； ｒ Ｇ ＰＳ」と略す
）を１０倍希釈し、ＧＰＳ溶液に調製したサンプルを等
量混合して３７°Ｃ，１時間振とうした。
振とうした溶液を１０倍希釈し、その１００μ！にｌＸ
ｌ０”／ｓｊ！になるようにＧＶＢ”°ニテ調製した抗
体感作ヒツジ赤血球溶液（以下、ＥＡ ｃｅｌｌと略す
）（日本バイオテスト社製）を１００μ！加えた。３７
°Ｃ，１時間振とう後、１５００ｒｐｍ、 １０分間遠
心、上清１５０μｌを９６穴平底マイクロプレートに移
し、４０５１−の吸光度をマイクロプレートリーダーで
測定した。１００％溶血は、ＥＡｃｅ１１１００＃ｊ！
に注射用蒸留水１００μｆを加えたものを、またブラン
クとしては、ＥＡ ｃｅｌｌｌｏｏ、ｕｊ！にＧＶＢ”
を１００μｆを加え遠心シた溶液とした。
ｌ０”／ｓｊ！になるようにＧＶＢ”°ニテ調製した抗
体感作ヒツジ赤血球溶液（以下、ＥＡ ｃｅｌｌと略す
）（日本バイオテスト社製）を１００μ！加えた。３７
°Ｃ，１時間振とう後、１５００ｒｐｍ、 １０分間遠
心、上清１５０μｌを９６穴平底マイクロプレートに移
し、４０５１−の吸光度をマイクロプレートリーダーで
測定した。１００％溶血は、ＥＡｃｅ１１１００＃ｊ！
に注射用蒸留水１００μｆを加えたものを、またブラン
クとしては、ＥＡ ｃｅｌｌｌｏｏ、ｕｊ！にＧＶＢ”
を１００μｆを加え遠心シた溶液とした。
その結果、表−２に示すように、ＥＡ ｃｅｌｌ溶液に
ＧＰＳのみを添加した場合の溶血活性を１００％とした
場合、ＧＰＳにＬＮＴあるいはＺＹＭを添加し、あらか
じめインキュベートした場合の溶血活性は、それぞれ５
．０％、１．２％とＧＰＳの溶血活性がそれぞれ９５．
０％、９８．８％消失した。
ＧＰＳのみを添加した場合の溶血活性を１００％とした
場合、ＧＰＳにＬＮＴあるいはＺＹＭを添加し、あらか
じめインキュベートした場合の溶血活性は、それぞれ５
．０％、１．２％とＧＰＳの溶血活性がそれぞれ９５．
０％、９８．８％消失した。
これに対し、ＬＮＴに抗ＬＮＴ抗血清を加えＧＰＳとイ
ンキュベートした場合は、ＧＰＳによる溶血活性は６７
．８％となり、この抗血清は、ＬＮＴのＧＰＳ中の補体
の活性化を約７０％阻害した。
ンキュベートした場合は、ＧＰＳによる溶血活性は６７
．８％となり、この抗血清は、ＬＮＴのＧＰＳ中の補体
の活性化を約７０％阻害した。
対照として用いた正常ウサギ血清では、ＧＰＳによる溶
血活性は、１６．８％でありＬＮＴの補体の活性化は、
８０％以上保たれていた。従って、この抗血清は、ＬＮ
Ｔのｉｎ ｖｉｔｒｏでの生理活性の一つである補体の
活性化反応を中和できる抗体を含む抗血清であることが
証明された。
血活性は、１６．８％でありＬＮＴの補体の活性化は、
８０％以上保たれていた。従って、この抗血清は、ＬＮ
Ｔのｉｎ ｖｉｔｒｏでの生理活性の一つである補体の
活性化反応を中和できる抗体を含む抗血清であることが
証明された。
実施例３ 抗ＬＮＴ抗血清のＬＮＴのｉｎ ｖｉｖｏで
の抗腫瘍活性に対する中和効果 動物実験モデルを用い、この抗血清がＬＮＴのｉｎ ｖ
ｉｖｏでのザルコーマ１８０腫瘍に対する腫瘍効果を中
和できるかどうかを検討した。
の抗腫瘍活性に対する中和効果 動物実験モデルを用い、この抗血清がＬＮＴのｉｎ ｖ
ｉｖｏでのザルコーマ１８０腫瘍に対する腫瘍効果を中
和できるかどうかを検討した。
ＩＣＲマウスに、ザルコーマ１８０Ｍｍ［−３Ｘ１０６
／マウスの割合で皮下移植し、移植後１５日目に、ＬＮ
Ｔ （２■／＋ｗｆりにＰＢＳ （−）、正常ウサギ血
清、抗ＬＮＴ抗血清をそれぞれ等量混合し、４°Ｃ９−
昼夜放置した溶液を、ＬＮＴ量にして１０■／ｋｇとな
るように復腔内投与した。
／マウスの割合で皮下移植し、移植後１５日目に、ＬＮ
Ｔ （２■／＋ｗｆりにＰＢＳ （−）、正常ウサギ血
清、抗ＬＮＴ抗血清をそれぞれ等量混合し、４°Ｃ９−
昼夜放置した溶液を、ＬＮＴ量にして１０■／ｋｇとな
るように復腔内投与した。
腫瘍移植後５週間後のそれぞれの群の腫瘍増殖を腫瘍移
植のみの対照群と比較した。
植のみの対照群と比較した。
その結果、表−３に示すように、ＬＮＴとＰＢＳ （−
）あるいは正常ウサギ血清の混合物を投与した群は、対
照群と比較して腫瘍増殖阻止率で、それぞれ８９．０％
、８０．１％といずれの場合も８０％以上のＬＮＴによ
る腫瘍増殖抑制効果が認められるのに対し、ＬＮＴに抗
ＬＮＴ抗血清を混合した物を投与した群では、腫瘍増殖
阻止率４１．２％とＬＮＴによる腫瘍増殖抑制活性は約
半分に滅弱した。したがって、この抗血清は、ＬＮＴの
１ｎｖｉν０での抗腫瘍活性をも中和することができる
抗体を含むものと考えられる。
）あるいは正常ウサギ血清の混合物を投与した群は、対
照群と比較して腫瘍増殖阻止率で、それぞれ８９．０％
、８０．１％といずれの場合も８０％以上のＬＮＴによ
る腫瘍増殖抑制効果が認められるのに対し、ＬＮＴに抗
ＬＮＴ抗血清を混合した物を投与した群では、腫瘍増殖
阻止率４１．２％とＬＮＴによる腫瘍増殖抑制活性は約
半分に滅弱した。したがって、この抗血清は、ＬＮＴの
１ｎｖｉν０での抗腫瘍活性をも中和することができる
抗体を含むものと考えられる。
実施例４ レンチナンの免疫学的測定法得られた抗血清
中の抗ＬＮＴ抗体を部分精製した。抗血清１ ｍｌを４
０％硫酸アンモニウムで塩析しＰＢＳ（−）で透析した
。続いてＰＢＳ （−）で平衡化したＤＥＡＥ−アフィ
ゲルブルー（バイオラド社製）カラム（２ｍｊりに通し
、イムノグロブリン含む非吸着画分を得た。さらに、こ
の画分をＢＳＡ吸着ＣＮＢｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ５
ｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（ファルマシア社製）に通し、
非吸着画分を得ることで、含有する抗ＢＳＡ抗体を除い
た。この溶液（４０ｍｆ）をＰＢＳ（−）で２０倍希釈
し、５０μＲ／ｗｅｌｌ ９６穴プレートに添加した。
中の抗ＬＮＴ抗体を部分精製した。抗血清１ ｍｌを４
０％硫酸アンモニウムで塩析しＰＢＳ（−）で透析した
。続いてＰＢＳ （−）で平衡化したＤＥＡＥ−アフィ
ゲルブルー（バイオラド社製）カラム（２ｍｊりに通し
、イムノグロブリン含む非吸着画分を得た。さらに、こ
の画分をＢＳＡ吸着ＣＮＢｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ５
ｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（ファルマシア社製）に通し、
非吸着画分を得ることで、含有する抗ＢＳＡ抗体を除い
た。この溶液（４０ｍｆ）をＰＢＳ（−）で２０倍希釈
し、５０μＲ／ｗｅｌｌ ９６穴プレートに添加した。
室温で２時間放置後、ＰＢＳ （）１５０μｆ／ｗｅｌ
ｌで洗浄、ＰＢＳ （−）で４倍希釈したブロックエー
ス（雪印社製） ３０．Ｏｕ ｌ ／ｗｅｌｌ加え、室
温で１時間放置した。ブロックエースを除き、各濃度の
ＬＮＴ溶液（１０−１００ｎｇ／ ｍｌ）を５０μｊ！
／ｗｅｌｌ加え、室温で２時間放置、ＰＢＳ （−）１
５０ ｕ １ ／ｗｅｌｌで洗浄後、ＬＮＴ−ＢＳＡを
ビオチン化キット（アマジャム社製）にてビオチン化し
た溶液（１００ＩＩ ｇ／ ｍｌ）をＰＢＳ （−）に
て５００倍希釈したものを５０ ｕ ｌ ／ｗｅｌｌ加
え、室温で２時間放置、ＰＢＳ （−）１５０μ！／ｗ
ｅｌｌで洗浄後、ＰＢＳ （−）で１０００倍希釈した
ストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲ
ート（アマジャム社製）を５０μｌ／ｗｅｌｌ加え、室
温で１時間放置、ＰＢＳ （−） １５０μｆ／ｗｅｌ
ｌで洗浄後、アルカリホスファターゼサブストレート（
シグマ社製）１■／ｌｒｉ、を１００μＩｌ／１ｖｅｌ
ｌ添加、３０分後の吸光度（４０５ｒ＋ｎ＋）を測定し
た。
ｌで洗浄、ＰＢＳ （−）で４倍希釈したブロックエー
ス（雪印社製） ３０．Ｏｕ ｌ ／ｗｅｌｌ加え、室
温で１時間放置した。ブロックエースを除き、各濃度の
ＬＮＴ溶液（１０−１００ｎｇ／ ｍｌ）を５０μｊ！
／ｗｅｌｌ加え、室温で２時間放置、ＰＢＳ （−）１
５０ ｕ １ ／ｗｅｌｌで洗浄後、ＬＮＴ−ＢＳＡを
ビオチン化キット（アマジャム社製）にてビオチン化し
た溶液（１００ＩＩ ｇ／ ｍｌ）をＰＢＳ （−）に
て５００倍希釈したものを５０ ｕ ｌ ／ｗｅｌｌ加
え、室温で２時間放置、ＰＢＳ （−）１５０μ！／ｗ
ｅｌｌで洗浄後、ＰＢＳ （−）で１０００倍希釈した
ストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲ
ート（アマジャム社製）を５０μｌ／ｗｅｌｌ加え、室
温で１時間放置、ＰＢＳ （−） １５０μｆ／ｗｅｌ
ｌで洗浄後、アルカリホスファターゼサブストレート（
シグマ社製）１■／ｌｒｉ、を１００μＩｌ／１ｖｅｌ
ｌ添加、３０分後の吸光度（４０５ｒ＋ｎ＋）を測定し
た。
その結果、図−１に示すように、ＬＮＴＩＯ−１００μ
ｇ／ｍＥの間でビオチン化したＬＮＴ−ＢＳＡと抗体と
の結合阻害の程度に直線性があり、この範囲において、
ＬＮＴの定量が可能であることが証明された。また、こ
の抗体は、他の多糖体であるデキストラン、カードラン
とは、交差反応を示さず、従来ＬＮＴの定量に用いられ
てきたトキシカラーテストよりもＬＮＴに対する特異性
の高い測定法である。さらに、実施例１と同様の方法で
作製したマウスの抗レンチナン抗血清を利用することに
よって、ウサギ抗ＬＮＴ抗体を最初にプラスチックプレ
ートに付着させ、ＬＮＴ溶液を添加、その後マウス抗Ｌ
ＮＴ抗体を添加し、結合したマウス抗ＬＮＴ抗体をビオ
チン標識抗マウスイムノグロブリン抗体で検出するサン
ドイッチアッセイ法にも応用可能であった。
ｇ／ｍＥの間でビオチン化したＬＮＴ−ＢＳＡと抗体と
の結合阻害の程度に直線性があり、この範囲において、
ＬＮＴの定量が可能であることが証明された。また、こ
の抗体は、他の多糖体であるデキストラン、カードラン
とは、交差反応を示さず、従来ＬＮＴの定量に用いられ
てきたトキシカラーテストよりもＬＮＴに対する特異性
の高い測定法である。さらに、実施例１と同様の方法で
作製したマウスの抗レンチナン抗血清を利用することに
よって、ウサギ抗ＬＮＴ抗体を最初にプラスチックプレ
ートに付着させ、ＬＮＴ溶液を添加、その後マウス抗Ｌ
ＮＴ抗体を添加し、結合したマウス抗ＬＮＴ抗体をビオ
チン標識抗マウスイムノグロブリン抗体で検出するサン
ドイッチアッセイ法にも応用可能であった。
本発明によれば抗レンチナン抗血清を得ることができ、
本発明において得られた抗血清を使用することで、生体
内の存在を明かにし、レンチナンの抗腫瘍作用機作解明
をさらに進めるのに利用可能である。
本発明において得られた抗血清を使用することで、生体
内の存在を明かにし、レンチナンの抗腫瘍作用機作解明
をさらに進めるのに利用可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は実施例４において、レンチナンの免疫学的測定方
法の測定結果を示すグラフ図である。
法の測定結果を示すグラフ図である。
Claims (4)
- （１）レンチナンに対する抗血清
- （２）レンチナンに蛋白を結合させたレンチナン−蛋白
複合体を動物に免疫して得られる請求項１記載の抗血清 - （３）レンチナン−蛋白複合体が、レンチナンを酸化開
裂し、シッフ塩基の型で蛋白を結合させたものである請
求項２記載の抗血清 - （４）特許請求の範囲１項記載の抗血清が使用されるレ
ンチナンの免疫学的測定方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12883290A JPH0424555A (ja) | 1990-05-18 | 1990-05-18 | 抗レンチナン抗血清及びレンチナンの免疫学的測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12883290A JPH0424555A (ja) | 1990-05-18 | 1990-05-18 | 抗レンチナン抗血清及びレンチナンの免疫学的測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0424555A true JPH0424555A (ja) | 1992-01-28 |
Family
ID=14994510
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12883290A Pending JPH0424555A (ja) | 1990-05-18 | 1990-05-18 | 抗レンチナン抗血清及びレンチナンの免疫学的測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0424555A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000074916A (ja) * | 1998-08-31 | 2000-03-14 | Yukihiro Masayama | 抗体及びその製造方法並びに抗体を用いた抗原の定量方法及び免疫染色方法 |
| WO2005108979A1 (ja) * | 2004-04-16 | 2005-11-17 | Ajinomoto Co., Inc. | 末梢血単核球の多糖結合能測定キット |
-
1990
- 1990-05-18 JP JP12883290A patent/JPH0424555A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000074916A (ja) * | 1998-08-31 | 2000-03-14 | Yukihiro Masayama | 抗体及びその製造方法並びに抗体を用いた抗原の定量方法及び免疫染色方法 |
| WO2005108979A1 (ja) * | 2004-04-16 | 2005-11-17 | Ajinomoto Co., Inc. | 末梢血単核球の多糖結合能測定キット |
| JPWO2005108979A1 (ja) * | 2004-04-16 | 2008-03-21 | 味の素株式会社 | 末梢血単核球の多糖結合能測定キット |
| US7449452B2 (en) | 2004-04-16 | 2008-11-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for estimating immunostimulant activity of a polysaccharide |
| US7553824B2 (en) | 2004-04-16 | 2009-06-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Kit for determining polysaccharide-binding activity of mononuclear cells present in peripheral blood |
| JP4577660B2 (ja) * | 2004-04-16 | 2010-11-10 | 味の素株式会社 | 末梢血単核球の多糖結合能測定キット |
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