JPH038512B2 - - Google Patents
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- JPH038512B2 JPH038512B2 JP57200897A JP20089782A JPH038512B2 JP H038512 B2 JPH038512 B2 JP H038512B2 JP 57200897 A JP57200897 A JP 57200897A JP 20089782 A JP20089782 A JP 20089782A JP H038512 B2 JPH038512 B2 JP H038512B2
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Description
本発明はヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下、
「hCG」と略称することもある。）の酵素免疫測定
法（以下、「EIA」と略称することもある。）に関
するものである。 従来、hCGのEIAについては次の２法が提案さ
れている。 (1) 競合法：酵素で標識した一定量のhCGを含有
する物質と、未知量のhCGを含有する物質とを
抗hCG抗体に対して競合的に結合させ、抗体と
結合した酵素の酵素活性もしくは抗体と結合し
なかつた酵素の酵素活性を測定し、その測定結
果を、予め既知量のhCGにおいて同様にして得
られた結果と対比することにより定量を行う方
法。 (2) サンドイツチ法：未知量のhCGを含有する物
質を、抗hCG抗体を用いて固定し、これに酵素
で標識した抗体を結合させて、その酵素活性を
測定し定量する方法。 本発明者は、上記(1)の競合法においては特定の
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識体と特定の抗体と
を用いると高感度で高特異性の微量定量が可能で
あることを見出した（特開昭56−138248号公報参
照）。また上記(2)のサンドイツチ法においては、
担体上に保持された抗体，抗原および標識剤を結
合させた抗体を用いるEIAにおいて、担体上に保
持される抗体と標識剤を結合する抗体とが互いに
抗原決定部位を重複しない２種の抗体であり、該
抗体のうち一方がhCGに特異的に反応する抗体で
あることを特徴とするhCGのEIAが高感度，高精
度，高特異性であることを見出した（特開昭57−
67858号公報参照）。 しかしながらこれらの方法においてもなお、約
0.1−2mIU以下の微量hCGを精度よく測定するこ
とは難しく、悪性腫瘍のより確かな診断と経過観
察あるいは正常人におけるその生理学的意義を決
定する上では、更に感度の高い測定法が必要とさ
れた。 本発明者は上記の事情に鑑み、更に検討を重ね
たところ、上記特異抗体を用いるサンドイツチ法
によるEIAにおいて、抗hCG抗体を用いてペルオ
キシターゼと結合させることにより得られる抗体
−酵素標識体が高感度，高精度の微量定量を可能
にすることを見出した。これに基づいてさらに研
究をした結果、本発明を完成した。 本発明は、(1)担体上に保持された抗体，抗原お
よび標識剤を結合させた抗体を用いる免疫化学的
測定法において、担体上に保持される抗体と標識
剤を結合させる抗体とが互いに抗原決定部位を重
複しない２種の抗体であり、担体上に保持される
抗体がヒト絨毛性ゴナドトロピンに特異的に反応
する抗体であり、標識剤としてペルオキシターゼ
を用いこれと抗体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結
合または２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ
示す。〕で表わされる化合物〔〕で結合させた
ものを用いることを特徴とするヒト絨毛性ゴナド
トロピンの免疫化学的測定法および(2)ペルオキ
シターゼと抗体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結
合または２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ
示す。〕で表わされる化合物〔〕で結合させた
もの、およびペルオキシターゼに結合させる抗
体と互いに抗原決定部位を重複せずかつヒト絨毛
性ゴナドトロピンに特異的に反応する抗体を担体
上に保持したものを含有するヒト絨毛性ゴナドト
ロピンの免疫化学的測定用試薬である。 本発明において用いられる担体上に保持された
抗体における担体としては、たとえば、ゲル粒子
（例、アガロースゲル〔例、セフアロース4B，セ
フアロース6B（フアルマシア・フアインケミカル
社（スエーデン）製〕，デキストランゲル〔例、
セフアデツクスＧ−75，セフアデツクスＧ−100，
セフアデツクスＧ−200（フアルマシア・フアイン
ケミカル社製）〕，ポリアクリルアミドゲル〔例、
バイオゲルＰ−30，バイオゲルＰ−60，バイオゲ
ルＰ−100（バイオラツド・ラボラトリーズ社（米
国））〕，セルロース粒子〔例、アビセル（旭化成
製），イオン交換セルロース（例、ジエチルアミ
ノエチルセルロース，カルボキシメチルセルロー
ス）〕，物理的吸着剤〔例、ガラス（例、ガラス
球，ガラスロツド，アミノアルキルガラス球，ア
ミノアルキルガラスロツド），シリコン片，スチ
レン系樹脂（例、ポリスチレン球，ポリスチレン
粒子）〕，イオン交換樹脂｛例、弱酸性陽イオン交
換樹脂〔例、アンバーライトIRC−50（ローム・
ハース社（米国）製），ゼオカープ226（パームチ
ツト社（西ドイツ）製）〕，弱塩基性陰イオン交換
樹脂〔例、アンバーライトIR−4B，ダウエツク
ス３（ダウケミカル社（米国）製）〕｝などが挙げ
られる。 本発明における担体上に保持された抗体におけ
る抗体は、標識剤を結合させた抗体における抗体
と互いに抗原決定部位を重複しない２種の抗体で
あり、hCGに特異的に反応する抗体であればよ
い。 該hCGに特異的に反応する抗体としては、たと
えばエンドクリノロジー（Endocrinology），
第104巻（1979年），第396頁に記載されているよ
うな抗体が挙げられる。即ち、hCG−β鎖のＣ末
端側のhCGに特異的なペプチドと牛アルブミンや
牛チログロブリンなどキヤリアー用タンパクとを
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミドなど水溶性カルボジイミドを用い
て得た縮合物をフロインドの完全アジユバンドも
しくは不完全アジユバンドと共に人以外の温血動
物たとえばウサギに頻回接種して抗体を形成せし
め、これを採取することによりhCGに特異的に反
応する抗血清を得ることができる。 特開昭56−138248に記載されたhCGに特異的に
反応する抗hCG抗体、すなわち担体上に不溶化し
た一般式〔〕 Ｈ−R1−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−
Leu−Pro−Gln−OH 〔XI〕 〔式中、R1は で示されるペプチドの14位のGlyを含む１〜14個
の部分ペプチド鎖を表わす。〕で示されるペプチ
ドに抗hCG抗体を含有する体液を接触させ、つい
で特異的に吸収された抗hCG抗体を溶出すること
により得られた抗hCG抗体が挙げられる。 該hCGに特異的に反応する抗体としては、さら
に、前記一般式〔〕で表わされるペプチドと
キヤリア用タンパクとをグルタルアルデヒド
（「GLA」と略称することもある。）の存在下に縮
合せしめた縮合生成物を人以外の温血動物に接種
して抗体を形成せしめ、これを採取することによ
り得られた抗体が挙げられる。 ここにおいてキヤリア用タンパクとは、単独で
は抗体産性を誘導することができないペプタイド
などハプテン（低分子量物質）に対する抗体を産
生させるためにハプテンと結合させて用いられる
ものをいい、その例としてはたとえば牛血清アル
ブミン，牛ガンマグロブリン，牛チログロブリ
ン，破傷風トキソイド，ヘモシアニンおよびポリ
アミノ酸などが挙げられる。 一般式〔〕で表わされるペプチドとキヤリア
用タンパクとをGLAの存在下に結合させるには、
公知の方法〔例、ホルモン・アンド・メタボリツ
ク・リサーチ（Hormone and Metabolic
Research），第８巻（1976年），第241頁〕によつ
て実施し得る。一般式〔〕で表わされるペプチ
ドとキヤリア用タンパクの使用量比は１対１ない
し２対１が適当であり、反応Ωは7.3前後が良好
な結果を与える場合が多い。また反応に要する時
間は２〜６時間がよい場合が多いが、特に３時間
が適当である。この様にして調製した縮合生成物
は常套手段で４℃前後で水に対して透析し、凍結
乾燥して保存することができる。 以上の様にして製造した縮合生成物は人以外の
温血動物に接種される。上記hCGに特異的に反応
する抗体の製造に用いられる人以外の温血動物と
しては、たとえば哺乳温血動物（例、ウサギ、ヒ
ツジ、ラツト、マウス、モルモツト、ウシ、ウ
マ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、ハト、アヒル、
ガチヨウ、ウズラ）などが挙げられる。該縮合生
成物を人以外の温血動物に接種する方法として
は、動物に接種する縮合生成物は抗体産生するに
有効な量でよく、たとえばウサギに１回２mgを等
容量（１ml）の生理食塩水およびフロインドの完
全アジユバンドで乳化して、背部ならびに後肢掌
皮下に４週間おきに５回接種すると抗体を産生さ
せ得る場合が多い。 このようにして、温血動物中に形成された抗体
を採取する方法としては、たとえばウサギでは、
通常最終接種後７日から12日の間に耳静脈から採
血し、遠心分離して血清として得られる。 hCGの特異抗体の製造に用いられる担体上に保
持された抗原における担体としては、前記した担
体と同様のものが挙げられる。 担体に抗原もしくは抗体を保持させるには、公
知の常套手段を応用し得るが、たとえば“代謝”，
第８巻（1971年），第696頁に記載されているプロ
ムシアン法，GLA法などが挙げられる。また、
より簡易な方法として物理的に担体表面に吸着さ
せてもよい。 前記一般式〔〕で表わされるペプチドの具体
例としてはたとえばhCG−βのＣ末端ペプチド
〔XI〕（123−145）〔Ｈ−Ala−Pro−Pro−Pro−
Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−
Pro−Gly−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Iie−
Leu−Pro−Gln−OH〕が挙げられ、これはたと
えば特開昭56−138248号公報に記載の方法により
製造することができる。 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、その他に関し略号で表示する場合、
それらはIUPAC−IUB Commission on
Biological Nomenclature による略号あるいは
当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を次に挙げる。また、アミノ酸などに関し
光学異性体がありうる場合は、特に明示しなけれ
ばＬ体を示すものとする。 Ala：アラニン Pro：プロリン Ser：セリン Leu：ロイシン Arg：アルギニン Gly：グリシン Asp：アスパラギン酸 Thr：スレオニン Ile：イソロイシン Gln：グルタミン 本発明で用いられる種々のペプチドは、ペプチ
ド合成の公知の常套手段で製造しうる。固相合成
法、液相合成法のいずれによつてもよいが、液相
合成法が有利な場合が多い。そのようなペプチド
合成の手段としては、たとえば“The
Peptides”、第１巻（1966）、Schroder and
Lubke著、Academic press，New York，U.S.
A.あるいは“ペプチド合成”、泉屋ら著、丸善株
式会社（1975年）に記載された方法、たとえばア
ジド法、クロライド法、酸無水物法、混合無水物
法、DCC法、活性エステル法、ウツドワード試
薬Ｋを用いる方法、カルボジイミダゾール法、酸
化還元法、DCC／アデイテイプ（例、HONB，
HOBt，HOSu）法などがあげられる。 このようにして得られたhCGに特異的に反応す
る抗体を担体上に保持するには、公知の常套手段
を応用し得るが、たとえば前記した“代謝”，第
８巻（1971年），第696頁に記載されているブロム
シアン法，GLA法などが挙げられる。また、よ
り簡易な方法として物理的に担体表面に吸着させ
てもよい。 本発明の測定法でいう抗原としては、測定対象
となるhCGをいう。 本発明で用いられる標識剤を結合させた抗体に
おける抗体は、hCGに非特異的に反応するもので
あつて、前記担体上に保持された抗体と互いに抗
原決定部位を重複しないものが用いられる。 該hCGに非特異的に反応する抗体の例として
は、たとえば、人尿より公知の方法で精製した
hCGを、人以外の温血動物に接種してhCGに対す
る抗体を形成せしめ、さらに塩析により得たγ−
グロブリン画分をhCG−βのＣ末端ペプチドを結
合させた固相を充てんしたカラムを用いるアフイ
ニテイ−クロマトグラフイーにかけて素通り画分
を得、さらにhCGを結合させた固相を充てんした
カラムを用いるアフイニテイ−クロマトグラフイ
ーで精製して得られたhLHなど類似の構造を有
する蛋白ホルモンとも交差反応を示す抗体などが
挙げられる。 標識剤であるペルオキシダーゼとしては、種々
の起源のものを用いることができるが、その例と
してはたとえば西洋わさび，パイナツプル，イチ
ジク，甘藷，ソラマメおよびトウモロコシなどか
ら得られるペルオキシダーゼが挙げられ、特に西
洋わさびから抽出されたホースラデイツシユ・ペ
ルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）が好
ましい。 ペルオキシダーゼと抗体とを結合させる化合物
として、一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕
で表わされる化合物を用いるが、上記式中、Ｒで
表わされる２価の６員環状炭化水素残基として
は、飽和のもの，不飽和のもののいずれでもよ
い。飽和の２価の６員環状炭化水素の例として
は、たとえば１，２−，１，３−，１，４−シク
ロヘキシレンが挙げられ、不飽和の２価の６員環
状炭化水素残基の例としては、たとえば１，２
−，１，３−，１，４−フエニレンなどが挙げら
れる。 該化合物〔〕において、ｎとしては１ないし
５の整数が好ましく、特に１が好ましい。Ｒとし
ては２価の６員環状炭化水素残基が好ましく、特
に１，４−シクロヘキシレンが好ましい。 本発明の方法において用いられる化合物〔〕
は、たとえばザ・ジヤーナル・オブ・バイオケミ
ストリー（The Journal of Biochemistry）第
79巻233頁（1976年），ヨーロピアン・ジヤーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（European
Journal of Biochemistry）第101巻395頁（1979
年）、特開昭52−85163号公報、特開昭52−85164
号公報等に記載の方法あるいはこれらの方法に準
じて製造することができる。たとえば、一般式 〔式中、Ｘは水酸基またはハロゲン原子を示
す。ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表
わされるマレイミド化合物〔〕と一般式 〔式中、Ｙは水素原子またはアルカリ金属原子
を示す。〕で表わされるサクシンイミド化合物
〔〕とを脱水剤あるいは脱酸剤の存在下で反応
させることにより製造することができる。上記一
般式において、ハロゲン原子としては塩素，臭素
などが挙げられ、アルカリ金属原子としてはたと
えばナトリウム，カリウムなどが挙げられる。ま
た反応に用いられる脱水剤としてはたとえば、硫
酸，ジシクロヘキシルカルボジイミドなどが、脱
酸剤としてはたとえばピリジン，トリエチルアミ
ンなどが挙げられる。 前記化合物〔〕は、たとえば特開昭52−
85164号公報に記載の方法あるいはこれに準じて
製造することができる。たとえば一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕 で表わされる化合物〔〕を脱水閉環せしめるこ
とにより得られる。該脱水閉鎖させるには、脱水
剤たとえば無水酢酸又は無水酢酸と酢酸ナトリウ
ム（無水物）を用い、温和に加熱することにより
反応させることができる。 さらに別法として、ヘルベテイカ・キミカ・ア
クタ（Helvetica Chimica Acta）第58巻（1975
年）531頁に記載されている方法あるいはこれに
準じて製造することができる。たとえば、一般式 〔式中、Ｚはアルキル基を示す〕で表わされる
Ｎ−アルコキシカルボニルマレイミド〔〕と、
一般式 NH2（CH2）oRCOOH 〔〕 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕 で表わされるアミノ酸〔〕と反応させて、一般
式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕 で表わされるマレイミド化合物〔〕を得る。次
に一般式〔〕で表わされるサクシンイミド化合
物〔〕を加え先に述べたと同様の脱水剤もしく
は脱酸剤の存在下で反応させることにより製造す
ることができる。 上記一般式〔〕で表わされる化合物において
ｚで表わされるアルキルとしては、たとえばメチ
ル，エチルが挙げられる。 ペルオキシターゼに化合物〔〕を反応させる
には、両者をΩ約６ないし８の緩衝液中で約10な
いし50℃の温度で約10分ないし24時間反応させる
ことによつて行なわれる。該緩衝液としては、た
とえばΩ7.0の0.1Mリン酸緩衝液，Ω6.3の0.05M
リン酸緩衝液などが挙げられる。 このようにして得られたマレイミド化ペルオキ
シダーゼの精製は、たとえばゲルクロマトグラフ
イーなどにより行なうことができる。該ゲルクロ
マトグラフイーを行なう際に用いられる担体とし
てはたとえばセフアデツクスＧ−25〔フアルマシ
ア・フアインケミカル社（スエーデン）製〕，バ
イオゲルＰ−２〔バイオ・ラツド・ラボラトリー
ズ社（米国）製〕などが挙げられる。 マレイミド化ペルオキシダーゼを抗hCG抗体と
反応させる場合、抗hCG抗体IgGあるいはペプシ
ン分解して得られたＦ（ab′）2画分を、メルカプト
エチルアミン類の存在下で還元し、ゲルクロマト
グラフイーによつて精製された抗hCG抗体IgGも
しくはFab′とマレイミド化ペルオキシダーゼと
を反応させる。 該反応は、両者を緩衝液中で約０℃ないし40℃
の温度で、約１ないし48時間反応させることによ
り行なうこができる。該緩衝液としては、たとえ
ばΩ6.0の5mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウ
ム塩を含む0.1Mリン酸緩衝液などが挙げられる。 このようにして得られたペルオキシダーゼ標識
抗体は、たとえばゲルクロマトグラフイーなどに
より精製することができる。該ゲルクロマトグラ
フイーに用いられる担体としては、たとえばウル
トロゲルAcA44〔LKB社（スエーデン）製〕，セ
フアクリルＳ−200〔フアルマシア・フアインケミ
カル社（スエーデン）製〕などが挙げられる。 本発明の測定方法を以下に具体的に説明する。 まず、 ：担体に保持された抗体に、測定すべきhCG含
有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行つた
後これに前記で得られたペルオキシダーゼと抗
hCG抗体IgGもしくはFab′との結合物を加えて
反応させる。 本発明の酵素免疫測定法において測定対象と
なるhCGを含む被検試料としては、尿，血清，
血漿，髄液あるいは各種臓器抽出物等が挙げら
れ、とりわけ尿，血清および血漿が繁用され
る。 ：で得られた反応生成物にペルオキシダーゼ
の基質を加え、生じた物質の吸光度もしくは螢
光強度を測定することにより上記の反応生成物
の酵素活性を知る。 ：上記−の操作を既知量のhCGの標準溶液
に対して予め行ない、hCGと吸光度もしくは螢
光強度との関係を標準曲線として作成してお
く。 ：未知量のhCGを含む分析対象物について得ら
れた吸光度もしくは螢光強度を標準曲線にあて
はめ、分析対象物中のhCG含量を測定する。 本発明のサンドイツチ法によるhCGの免疫化学
的測定法に用いられる定量用キツトとしては、主
として、 (1) 担体上に保持された抗体、 (2) 本発明方法により得られたペルオキシダーゼ
で標識化された抗体フラグメント（Fab′）， (3) 標準hCG， (4) 上記(2)〜(3)の試薬および被試験料の希釈に用
いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめ
た約10％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブ
ミン（以下、BSAと略称することもある。）を
含むΩ約６ないし９のリン酸緩衝液またはグリ
シン緩衝液が挙げられる。）， (5) ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。そ
の一例として螢光法の場合、酵素基質としてｐ
−ハイドロキシフエニル酢酸と過酸化水素、比
色法の場合、ｏ−フエニレンジアミンと過酸化
水素。酵素基質の溶解に用いる緩衝液（好まし
くはリン酸緩衝液）および酵素反応停止液が挙
げられる。 上記のキツトは例えば下記の方法により使用す
ることができる。 標準hCGもしくは被検液約10ないし200μに
試薬(4)を加えて希釈し、一定量の試薬(1)を加えて
約０ないし40℃で約１ないし48時間反応させる。
担体を水洗後、試薬(2)の約10ないし300μを加
えたのち、約０ないし40℃で反応させる。約１な
いし48時間反応後、担体を洗浄し担体上に結合し
ているペルオキシダーゼ活性を測定する。即ちペ
ルオキシダーゼの基質液約10〜1000μを加えて
約20〜40℃で約0.2〜24時間反応させたのち、酵
素反応を停止させ、反応液中の吸光度もしくは螢
光強度を測定する。 本発明の免疫化学的分析法用試薬を用いれば、
通常の臨床検査室において簡単な操作でhCGの高
感度測定が可能となる。 本発明の試薬を用いると、他の類似したホルモ
ン（たとえばhLH：黄体形成ホルモン）からの
妨害を受けることなく極めて高感度かつ正確に
hCGを測定できるので、絨毛性腫瘍やその他の
hCG産生腫瘍などの診断，予後管理などにも極め
て有用な手段を提供するものである。 以下に、参考例および実施例を挙げて、本発明
をさらに具体的に説明する。 参考例 １ 抗体の製造 人尿より公知の方法で精製した約10000IU／mg
のhCG1mgを生理食塩水１mlに溶解し、これにフ
ロインドの完全アジユバンド〔Freund′s
complete ajuvant，“免疫の生化学”，橘ら著，
共立出版株式会社（1967年）〕１mlを加えてよく
混和し乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋肉
内および背部皮下数箇所に注射した。以上の操作
を３週毎に５回行ない最終免疫後１週間で採血し
パイロツトアツセイを実施した。その結果、hCG
−βの末端ペプチド〔〕にも親和性をもつ抗血
清N305Bを得た。 参考例 ２ 特異抗hCG抗体の製造 hCG−βの末端ペプチド〔〕５mgを0.5M
NaClを含む0.1MNaHCO38mlに溶解し、予め
Ｎ／1000HClで洗浄したブロムシアン活性化セフ
アロース4B（フアルマシア・フアイン・ケミカル
ズ社製）１ｇに加え、５℃で一夜撹拌した。反応
終了後同じ0.5MNaClを含む0.1MNaHCO3で十
分に撹拌し、次いでHClでΩ８に調整した0.5M
エタノールアミン10mlを添加して室温で１時間反
応させた後、(1)1MNaClを含む0.1M酢酸緩衝液
（Ω4.0），(2)1MNaClを含む0.1Mホウ酸緩衝液
（Ω3.0）および(3)0.15MNaClを含む0.02Mホウ酸
緩衝液（Ω8.0）で順次洗浄しカラムに充填した。 参考例１で得られた抗血清N305B8mlを1.5ｇの
無水硫酸ナトリウムを用いて塩析沈殿させ、得ら
れたγ−グロブリン画分を上記のペプチド〔〕
結合セフアロース4Bカラム（0.9×４cm）に付し
た。 0.15MNaClを含む0.02Mホウ酸緩衝液（Ω8.0）
でカラムを洗浄し、hLH（黄体形成ホルモン），
hFSH（卵胞刺激ホルモン）およびhTSH（甲状腺
刺激ホルモン）と交差反応する抗hCG抗体を除去
した。次いで0.17Mグリシン−塩酸緩衝液（Ω
2.3）で溶出することによつてhCG−βのＣ末端
ペプチド〔〕と強い親和性をもつ特異抗体
N305BSを得た（蛋白量1.2mg）。 参考例 ３ 抗hCG−βのＣ末端ペプチド〔〕抗体の製造 hCG−βのＣ末端ペプチド〔〕25mgおよび牛
チログロブリン（BTGと略称する）50mgを0.2M
リン酸緩衝液（Ω7.3）４mlに溶解し、５％GLA
水溶液４mlを加えて室温で３時間撹拌後、４℃で
透析（水２×４）し凍結乾燥して免疫源を得
た。このhCG−βのＣ末端ペプチド〔〕−BTG
縮合物1.5mgを生理食塩水0.75mlに溶解し、これ
にフロインドの完全アジユバンド（Freund′s
complete adjuvant）0.75mlを加えてよく混和
し、乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋肉内
および背部皮下数ケ所に注射した。以上の操作を
４週おきに４回行ない最終免疫後１週間で採血
し、遠心分離して抗血清を採取し抗hCG−βのＣ
末端ペプチド〔〕に対する抗血清N313Bを得
た。 次いで抗血清N313Bを常法により硫酸アンモ
ニウムで塩析させて得たγ−グロブリン画分を２
mgのhCGを結合させたセフアロース4Bカラム
（直径0.9cm，長さ４cm）に付した。 0.15MNaClを含む0.02Mホウ酸緩衝液（Ω8.0）
でカラムを洗浄し、次いで0.17Mグリシン−塩酸
緩衝液（Ω2.3）で溶出することによつて、hCG
に親和性の高い特異抗体N313BSを調製した。 参考例 ４ 非特異抗hCG抗体の製造 参考例１で得られた抗血清N305Bについて硫
酸アンモニウム塩析し、５mgのhCG−βのＣ末端
ペプチド〔〕を結合させたセフアロース4Bカ
ラム（直径0.9cm、長さ４cm）のアフイニテイ−
クロマトグラフイーで素通りする抗体画分を調製
した。次いでこの抗体画分を２mgのhCGを結合さ
せたセフアロース4Bカラム（直径0.9cm，長さ４
cm）に付した。0.15MNaClを含む0.02Mホウ酸緩
衝液（Ω8.0）でカラムを洗浄し、次いで
5MMgCl2で溶出することによつてhCGに親和性
の高い非特異抗体N305BGを調製した。 実施例 １ (1) マレイミド基の導入 ６mgの西洋わさびペルオキシダーゼ〔ベーリン
ガーマンハイム社（西ドイツ）製〕を１mlの
0.1Mリン酸緩衝液（Ω7.0）に溶解し、50μの
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドにとかした結合試
薬MMC（一般式〔〕において、ｎ＝１，Ｒ＝
シクロヘキシレンである化合物）4.8mgを加えて
30℃で60分間撹拌しながら反応させた。生成した
沈澱を遠心分離して除去し、上清をセフアデツク
スＧ−25のカラム（1.0×45cm）に通し、0.1Mリ
ン酸緩衝液で溶出させた。タンパクを含む画分を
分取し、コロジオン膜を用いて濃縮した。このよ
うにして調製したマレイミド化ペルオキシダーゼ
においてペルオキシダーゼ１分子あたり導入され
たマレイミド基の数は1.0〜1.2個であつた（ペル
オキシダーゼの分子量を40000，E280nm 1%＝22.75と
して計算）。 (2) マレイミド化ペルオキシダーゼと抗hCG抗体
（Fab′フラグメント）との複合体の製造 参考例４で得られた抗体N305BG5mgに0.1mgの
ペプシンを加え30℃で一夜反応後、セフアデツク
スＧ−150カラム（直径2.5cm，長さ55cm）で精製
した。得られた抗体Ｆ（ab′）2画分を２−メルカプ
トエチルアミンで還元し、セフアデツクスＧ−25
のカラによるゲルクロマトグラフイーで精製して
ウサギ抗hCG抗体（Fab′フラグメント）を得た。 上記(1)で調製したマレイミド化ペルオキシダー
ゼ1.5mgを0.1Mリン酸緩衝液（Ω6.0）0.15mlに溶
解し、先に得た抗hCG抗体（Fab′フラグメント）
1.8mgをとかした5nMエチレンジアミン四酢酸ナ
トリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（Ω6.0）0.15
mlを加えて４℃で20時間反応させた。反応後、ウ
ルトロゲルAcA44を充てんしたカラム（1.5×45
cm）を用いるゲルクロマトグラフイーにかけ、
0.1Mリン酸緩衝液（Ω6.5）で溶出させた。溶出
液の280の吸光度ならびに酵素活性を測定した。
ペルオキシダーゼとウサギ抗hCG抗体（Fab′フ
ラグメント）との複合体が生成していることを、
以下の方法で確認した。 まず、酵素活性の測定はギルバルトらの方法
〔アナリテイカル・ケミストリー（Analytical
Chemistry），第40巻（1986年），1256頁〕で行な
つた。即ち、溶出液の各フラクシヨンを0.1％ウ
シ血清アルブミンを含む0.1Mリン酸緩衝液（Ω
7.0）で1800倍に希釈した。この10μに0.1％ウ
シ血清アルブミンを含む0.05M酢酸ナトリウム緩
衝液（Ω5.0）に溶解した0.5％ｐ−ハイドロキシ
フエニル酢酸0.25mlを加えて混合し30℃で５分間
インキユベートした。次に0.01％過酸化水素0.05
mlを加えて30℃で20分反応させた。0.1Mグリシ
ン緩衝液（Ω10.3）2.5mlを加えて酵素反応を停
止させ、1μｇ／mlのキニンの螢光強度を100とし
励起光320nmにおける405nmの螢光強度を測定し
た。結果を第１図に示す。第１図において、―●
―は280nmにおける吸光度を、―○―はペルオキ
シダーゼ活性（螢光強度として）をそれぞれ示
す。フラクシヨン38付近においてペルオキシダー
ゼと抗hCG抗体（Fab′フラグメント）との複合
体の生成が極めて良好であることが分つた。 (3) 抗体結合固相の調製 ポリスチレン球（直径4.8mm，Precision
Plastics Ball Co.，Chicago，U.S.A）1500個
に、参考例２あるいは３に記載の特異抗hCG抗体
N308BSあるいはN313BSの15μｇ／ml
0.01MNaCl−0.1Mリン酸緩衝液（Ω8.0）100ml
を加え５℃で一夜インキユベートした。0.1％
BSAを含む0.05Mリン酸緩衝液（Ω77.0）で洗浄
したのち、用時まで冷所保存した。 (4) EIA EIA用の試薬として以下のものを用いた。 実施例１(2)で得られたペルオキシダーゼとウ
サギ抗hCG抗体（Fab′フラグメント）との複
合体 実施例１(3)で得られた抗hCG抗体感作ポリス
チレン球 標準hCG，標準hLH 緩衝液Ｂ；10％正常ヒツジ血清，１％ウシ血
清アルブミン，0.1％NaN3，0.15MNaClを含
むΩ7.0の0.02Mリン酸緩衝液 ペルオキシダーゼ活性特性に必要な試薬0.02
％過酸化水素と0.15％ｏ−フエニレンジアミン
を含むΩ4.8の0.1Mクエン酸−リン酸二ナトリ
ウム緩衝液および反応停止液（1N−塩酸） 測 定 緩衝液B200μ中でhCGもしくはhLHとウサギ
抗hCG感作ポリスチレン球とを室温で１日間反応
させた。ポリスチレン球を洗浄後、ペルオキシダ
ーゼ−ウサギ抗hCG抗体（Fab′フラグメント）
複合体300μを加えて４℃で１日間反応させた
のち、ポリスチレン球を洗浄し、これに0.02％過
酸化水素と0.15％ｏ−フエニレンジアミンを含む
0.1Mクエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液（Ω
4.8）500μを加えて室温で40分間放置し、1N塩
酸２mlを添加して反応を停止させ、492nmにおけ
る吸光度を測定し標準曲線を得た。それぞれの標
準曲線を第２図に示した。第２図中、―●―は
N305BS結合ポリスチレン球でのhCGの標準曲線
を、―○―はN305BS結合ポリスチレン球での
hCGの標準曲線を、―■―はN313BS結合ポリス
チレン球でのhCGの、―□―はN313BS結合ポリ
スチレン球でのhLHの標準曲線をそれぞれ示す。 このように、本発明の測定方法はhCGに得異的
かつ高感度であり、hLHとは交差反応を示さな
かつた。 実施例２ 短時間法 標準hCG，実施例１(2)で得られたペルオキシダ
ーゼ−抗hCG抗体（Fab′フラグメント）複合体、
および実施例１(3)で得られた抗hCG抗体N305BS
結合ポリスチレン球１個を25％正常ヒツジ血清，
１％ウシ血清アルブミン，0.002％メルチオレー
ト，0.15MNaClを含む0.02Mリン酸緩衝液（Ω
7.0）300μ中で同時に混合して４℃１日間反応
させたのち、ポリスチレンボールを洗浄し、実施
例１(4)に示した方法でペルオキシダーゼ活性を測
定した。第３図に示したように、良好なhCGの標
準曲線を与えた。 実施例 ３ ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ハイドロキシ
サクシンイミド（MBS）による結合法 西洋わさびペルオキシダーゼ〔ベーリンガーマ
ンハイム社（西ドイツ）製〕６mgを0.1Mリン酸
緩衝液（Ω7.0）に溶解し、50μのＮ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミドにとかした結合試薬MBS（一般
式〔〕において、ｎ＝０，Ｒ＝フエニレンであ
る化合物）4.8mgを加えて25℃で30分間撹拌しな
がら反応させた。次に反応生成物をセフアデツク
スＧ−25のカラム（1.0×45cm）に通し、0.05M
酢酸緩衝液（Ω5.0）で溶出した。タンパクを含
む画分を分取し、コロジオン膜を用いて濃縮し
た。このようにして得たマレイミド化ペルオキシ
ダーゼにおいてペルオキシダーゼ１分子あたり導
入されたマレイミド基の数は0.68〜0.78であつ
た。 参考例４で得られた抗体N305BG5mgに0.1mgの
ペプシンを加え30℃で１夜反応後、セフアデツク
スＧ−150カラム（直径2.5cm、長さ55cm）で調製
した。得られた抗体Ｆ（ab′）2画分を２−メルカプ
トエチルアミンで還元し、セフアデツクスＧ−25
のカラムによるゲルクロマトグラフイーで精製し
てウサギ抗hCG抗体（Fab′フラグメント）を調
製した。抗hCG抗体（Fab′フラグメント）1.7mg
をとかした5mMエチレンジアミン四酢酸ナトリ
ウム塩を含む0.1Mリン酸緩衝液（Ω6.0）0.15ml
を、先に調製したマレイミド化ペルオキシダーゼ
1.5mgの0.1Mリン酸緩衝液（Ω6.0）0.15mlに加え
て４℃で20時間反応させた。反応後、ウルトロゲ
ルAcA44を充てんしたカラム（1.5×45cm）を用
いるゲルクロマトグラフイーにかけ、0.1Mリン
酸緩衝液（Ω6.5）で溶出させ、ペルオキシダー
ゼ−ウサギ抗hCG抗体（Fab′フラグメント）複
合体を得た。 本複合体を実施例１(2)，(4)に示した方法に従つ
て検定したところ、固相への非特異的吸着が極め
て小さく、高感度を与えることが分つた。 EIAにおける試薬としては、以下のものを用い
た。 実施例１(3)で得られた抗hCG抗体N305BS結
合ポリスチレン球 実施例３で得られたペルオキシダーゼとウサ
ギ抗hCG抗体（Fab′フラグメント）との複合
体 標準hCG 緩衝液Ｂ〔実施例１(4)参照〕 ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬 0.5％ｐ−ハイドロキシフエニル酢酸を含む
Ω5.0の酢酸緩衝液，0.01％過酸化水素水およ
び反応停止液（Ω10.3の0.1Mグリシン緩衝液） 実施例 ４ hCGの特異免疫化学的測定用キツトおよびhCG
の測定 下記のhCG免疫化学的測定用キツトを用い、下
記の操作法に従つて正常人，卵巣摘出患者，排卵
期婦人，妊婦および絨毛摘出患者の血漿中のhCG
濃度を測定した。 hCGの免疫化学的測定キツト (1) 実施例１(3)で得られる１個あたり約1μｇの
hCG特異抗体で感作した直径4.8mmのポリスチ
レン球 (2) 実施例１(2)で得られるペルオキシダーゼ標識
抗hCG抗体複合体 (3) ０〜100mIUの標準hCG (4) 上記(1)，(3)の試薬および被検試料の希釈に用
いる緩衝液Ｂ〔実施例１(4)参照〕 (5) ｏ−フエニレンジアミン (6) 上記(2)の試薬の希釈に用いる緩衝液Ｃ；0.1
％ウシ血清アルブミン，0.002％メルチオレー
トを含むΩ7.5の0.1Mリン酸緩衝液 (7) 上記(5)の溶解に用いる緩衝液Ｄ；0.02％過酸
化水素0.002％メルチオレートを含むΩ4.8の
0.1Mクエン酸緩衝液 (8) 停止液；1N塩酸 (9) コントロール血清（正常ヒツジ血清） 操作法 被検試料50μに試薬(4)250μおよび試薬(1)１
個を添加し、室温で１日間反応させた。ポリスチ
レン球を水洗後、試薬(6)で希釈した試薬(2)300μ
（複合体として約30ng）を添加し、４℃で１
日間反応させた。ポリスチレン球を水洗し、試薬
(7)で溶解した0.15％の試薬(5)500μを加えて室温
で40分間反応させたのち、1N塩酸1.5mlを添加し
て反応を停止させ、492nmの吸光度を測定した。
別に標準hCG溶液については、試薬(4)200μ，
コントロール血清50μおよび試薬(1)１個を加え
て上記と同一操作を行ない標準曲線を作成した。 上記方法により、正常人，卵巣摘出患者，排卵
期婦人，妊婦および絨毛癌摘出患者の血漿中の
hCG濃度を測定した。結果は第１表に示される。
「hCG」と略称することもある。）の酵素免疫測定
法（以下、「EIA」と略称することもある。）に関
するものである。 従来、hCGのEIAについては次の２法が提案さ
れている。 (1) 競合法：酵素で標識した一定量のhCGを含有
する物質と、未知量のhCGを含有する物質とを
抗hCG抗体に対して競合的に結合させ、抗体と
結合した酵素の酵素活性もしくは抗体と結合し
なかつた酵素の酵素活性を測定し、その測定結
果を、予め既知量のhCGにおいて同様にして得
られた結果と対比することにより定量を行う方
法。 (2) サンドイツチ法：未知量のhCGを含有する物
質を、抗hCG抗体を用いて固定し、これに酵素
で標識した抗体を結合させて、その酵素活性を
測定し定量する方法。 本発明者は、上記(1)の競合法においては特定の
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識体と特定の抗体と
を用いると高感度で高特異性の微量定量が可能で
あることを見出した（特開昭56−138248号公報参
照）。また上記(2)のサンドイツチ法においては、
担体上に保持された抗体，抗原および標識剤を結
合させた抗体を用いるEIAにおいて、担体上に保
持される抗体と標識剤を結合する抗体とが互いに
抗原決定部位を重複しない２種の抗体であり、該
抗体のうち一方がhCGに特異的に反応する抗体で
あることを特徴とするhCGのEIAが高感度，高精
度，高特異性であることを見出した（特開昭57−
67858号公報参照）。 しかしながらこれらの方法においてもなお、約
0.1−2mIU以下の微量hCGを精度よく測定するこ
とは難しく、悪性腫瘍のより確かな診断と経過観
察あるいは正常人におけるその生理学的意義を決
定する上では、更に感度の高い測定法が必要とさ
れた。 本発明者は上記の事情に鑑み、更に検討を重ね
たところ、上記特異抗体を用いるサンドイツチ法
によるEIAにおいて、抗hCG抗体を用いてペルオ
キシターゼと結合させることにより得られる抗体
−酵素標識体が高感度，高精度の微量定量を可能
にすることを見出した。これに基づいてさらに研
究をした結果、本発明を完成した。 本発明は、(1)担体上に保持された抗体，抗原お
よび標識剤を結合させた抗体を用いる免疫化学的
測定法において、担体上に保持される抗体と標識
剤を結合させる抗体とが互いに抗原決定部位を重
複しない２種の抗体であり、担体上に保持される
抗体がヒト絨毛性ゴナドトロピンに特異的に反応
する抗体であり、標識剤としてペルオキシターゼ
を用いこれと抗体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結
合または２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ
示す。〕で表わされる化合物〔〕で結合させた
ものを用いることを特徴とするヒト絨毛性ゴナド
トロピンの免疫化学的測定法および(2)ペルオキ
シターゼと抗体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結
合または２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ
示す。〕で表わされる化合物〔〕で結合させた
もの、およびペルオキシターゼに結合させる抗
体と互いに抗原決定部位を重複せずかつヒト絨毛
性ゴナドトロピンに特異的に反応する抗体を担体
上に保持したものを含有するヒト絨毛性ゴナドト
ロピンの免疫化学的測定用試薬である。 本発明において用いられる担体上に保持された
抗体における担体としては、たとえば、ゲル粒子
（例、アガロースゲル〔例、セフアロース4B，セ
フアロース6B（フアルマシア・フアインケミカル
社（スエーデン）製〕，デキストランゲル〔例、
セフアデツクスＧ−75，セフアデツクスＧ−100，
セフアデツクスＧ−200（フアルマシア・フアイン
ケミカル社製）〕，ポリアクリルアミドゲル〔例、
バイオゲルＰ−30，バイオゲルＰ−60，バイオゲ
ルＰ−100（バイオラツド・ラボラトリーズ社（米
国））〕，セルロース粒子〔例、アビセル（旭化成
製），イオン交換セルロース（例、ジエチルアミ
ノエチルセルロース，カルボキシメチルセルロー
ス）〕，物理的吸着剤〔例、ガラス（例、ガラス
球，ガラスロツド，アミノアルキルガラス球，ア
ミノアルキルガラスロツド），シリコン片，スチ
レン系樹脂（例、ポリスチレン球，ポリスチレン
粒子）〕，イオン交換樹脂｛例、弱酸性陽イオン交
換樹脂〔例、アンバーライトIRC−50（ローム・
ハース社（米国）製），ゼオカープ226（パームチ
ツト社（西ドイツ）製）〕，弱塩基性陰イオン交換
樹脂〔例、アンバーライトIR−4B，ダウエツク
ス３（ダウケミカル社（米国）製）〕｝などが挙げ
られる。 本発明における担体上に保持された抗体におけ
る抗体は、標識剤を結合させた抗体における抗体
と互いに抗原決定部位を重複しない２種の抗体で
あり、hCGに特異的に反応する抗体であればよ
い。 該hCGに特異的に反応する抗体としては、たと
えばエンドクリノロジー（Endocrinology），
第104巻（1979年），第396頁に記載されているよ
うな抗体が挙げられる。即ち、hCG−β鎖のＣ末
端側のhCGに特異的なペプチドと牛アルブミンや
牛チログロブリンなどキヤリアー用タンパクとを
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミドなど水溶性カルボジイミドを用い
て得た縮合物をフロインドの完全アジユバンドも
しくは不完全アジユバンドと共に人以外の温血動
物たとえばウサギに頻回接種して抗体を形成せし
め、これを採取することによりhCGに特異的に反
応する抗血清を得ることができる。 特開昭56−138248に記載されたhCGに特異的に
反応する抗hCG抗体、すなわち担体上に不溶化し
た一般式〔〕 Ｈ−R1−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−
Leu−Pro−Gln−OH 〔XI〕 〔式中、R1は で示されるペプチドの14位のGlyを含む１〜14個
の部分ペプチド鎖を表わす。〕で示されるペプチ
ドに抗hCG抗体を含有する体液を接触させ、つい
で特異的に吸収された抗hCG抗体を溶出すること
により得られた抗hCG抗体が挙げられる。 該hCGに特異的に反応する抗体としては、さら
に、前記一般式〔〕で表わされるペプチドと
キヤリア用タンパクとをグルタルアルデヒド
（「GLA」と略称することもある。）の存在下に縮
合せしめた縮合生成物を人以外の温血動物に接種
して抗体を形成せしめ、これを採取することによ
り得られた抗体が挙げられる。 ここにおいてキヤリア用タンパクとは、単独で
は抗体産性を誘導することができないペプタイド
などハプテン（低分子量物質）に対する抗体を産
生させるためにハプテンと結合させて用いられる
ものをいい、その例としてはたとえば牛血清アル
ブミン，牛ガンマグロブリン，牛チログロブリ
ン，破傷風トキソイド，ヘモシアニンおよびポリ
アミノ酸などが挙げられる。 一般式〔〕で表わされるペプチドとキヤリア
用タンパクとをGLAの存在下に結合させるには、
公知の方法〔例、ホルモン・アンド・メタボリツ
ク・リサーチ（Hormone and Metabolic
Research），第８巻（1976年），第241頁〕によつ
て実施し得る。一般式〔〕で表わされるペプチ
ドとキヤリア用タンパクの使用量比は１対１ない
し２対１が適当であり、反応Ωは7.3前後が良好
な結果を与える場合が多い。また反応に要する時
間は２〜６時間がよい場合が多いが、特に３時間
が適当である。この様にして調製した縮合生成物
は常套手段で４℃前後で水に対して透析し、凍結
乾燥して保存することができる。 以上の様にして製造した縮合生成物は人以外の
温血動物に接種される。上記hCGに特異的に反応
する抗体の製造に用いられる人以外の温血動物と
しては、たとえば哺乳温血動物（例、ウサギ、ヒ
ツジ、ラツト、マウス、モルモツト、ウシ、ウ
マ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、ハト、アヒル、
ガチヨウ、ウズラ）などが挙げられる。該縮合生
成物を人以外の温血動物に接種する方法として
は、動物に接種する縮合生成物は抗体産生するに
有効な量でよく、たとえばウサギに１回２mgを等
容量（１ml）の生理食塩水およびフロインドの完
全アジユバンドで乳化して、背部ならびに後肢掌
皮下に４週間おきに５回接種すると抗体を産生さ
せ得る場合が多い。 このようにして、温血動物中に形成された抗体
を採取する方法としては、たとえばウサギでは、
通常最終接種後７日から12日の間に耳静脈から採
血し、遠心分離して血清として得られる。 hCGの特異抗体の製造に用いられる担体上に保
持された抗原における担体としては、前記した担
体と同様のものが挙げられる。 担体に抗原もしくは抗体を保持させるには、公
知の常套手段を応用し得るが、たとえば“代謝”，
第８巻（1971年），第696頁に記載されているプロ
ムシアン法，GLA法などが挙げられる。また、
より簡易な方法として物理的に担体表面に吸着さ
せてもよい。 前記一般式〔〕で表わされるペプチドの具体
例としてはたとえばhCG−βのＣ末端ペプチド
〔XI〕（123−145）〔Ｈ−Ala−Pro−Pro−Pro−
Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−
Pro−Gly−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Iie−
Leu−Pro−Gln−OH〕が挙げられ、これはたと
えば特開昭56−138248号公報に記載の方法により
製造することができる。 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、その他に関し略号で表示する場合、
それらはIUPAC−IUB Commission on
Biological Nomenclature による略号あるいは
当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を次に挙げる。また、アミノ酸などに関し
光学異性体がありうる場合は、特に明示しなけれ
ばＬ体を示すものとする。 Ala：アラニン Pro：プロリン Ser：セリン Leu：ロイシン Arg：アルギニン Gly：グリシン Asp：アスパラギン酸 Thr：スレオニン Ile：イソロイシン Gln：グルタミン 本発明で用いられる種々のペプチドは、ペプチ
ド合成の公知の常套手段で製造しうる。固相合成
法、液相合成法のいずれによつてもよいが、液相
合成法が有利な場合が多い。そのようなペプチド
合成の手段としては、たとえば“The
Peptides”、第１巻（1966）、Schroder and
Lubke著、Academic press，New York，U.S.
A.あるいは“ペプチド合成”、泉屋ら著、丸善株
式会社（1975年）に記載された方法、たとえばア
ジド法、クロライド法、酸無水物法、混合無水物
法、DCC法、活性エステル法、ウツドワード試
薬Ｋを用いる方法、カルボジイミダゾール法、酸
化還元法、DCC／アデイテイプ（例、HONB，
HOBt，HOSu）法などがあげられる。 このようにして得られたhCGに特異的に反応す
る抗体を担体上に保持するには、公知の常套手段
を応用し得るが、たとえば前記した“代謝”，第
８巻（1971年），第696頁に記載されているブロム
シアン法，GLA法などが挙げられる。また、よ
り簡易な方法として物理的に担体表面に吸着させ
てもよい。 本発明の測定法でいう抗原としては、測定対象
となるhCGをいう。 本発明で用いられる標識剤を結合させた抗体に
おける抗体は、hCGに非特異的に反応するもので
あつて、前記担体上に保持された抗体と互いに抗
原決定部位を重複しないものが用いられる。 該hCGに非特異的に反応する抗体の例として
は、たとえば、人尿より公知の方法で精製した
hCGを、人以外の温血動物に接種してhCGに対す
る抗体を形成せしめ、さらに塩析により得たγ−
グロブリン画分をhCG−βのＣ末端ペプチドを結
合させた固相を充てんしたカラムを用いるアフイ
ニテイ−クロマトグラフイーにかけて素通り画分
を得、さらにhCGを結合させた固相を充てんした
カラムを用いるアフイニテイ−クロマトグラフイ
ーで精製して得られたhLHなど類似の構造を有
する蛋白ホルモンとも交差反応を示す抗体などが
挙げられる。 標識剤であるペルオキシダーゼとしては、種々
の起源のものを用いることができるが、その例と
してはたとえば西洋わさび，パイナツプル，イチ
ジク，甘藷，ソラマメおよびトウモロコシなどか
ら得られるペルオキシダーゼが挙げられ、特に西
洋わさびから抽出されたホースラデイツシユ・ペ
ルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）が好
ましい。 ペルオキシダーゼと抗体とを結合させる化合物
として、一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕
で表わされる化合物を用いるが、上記式中、Ｒで
表わされる２価の６員環状炭化水素残基として
は、飽和のもの，不飽和のもののいずれでもよ
い。飽和の２価の６員環状炭化水素の例として
は、たとえば１，２−，１，３−，１，４−シク
ロヘキシレンが挙げられ、不飽和の２価の６員環
状炭化水素残基の例としては、たとえば１，２
−，１，３−，１，４−フエニレンなどが挙げら
れる。 該化合物〔〕において、ｎとしては１ないし
５の整数が好ましく、特に１が好ましい。Ｒとし
ては２価の６員環状炭化水素残基が好ましく、特
に１，４−シクロヘキシレンが好ましい。 本発明の方法において用いられる化合物〔〕
は、たとえばザ・ジヤーナル・オブ・バイオケミ
ストリー（The Journal of Biochemistry）第
79巻233頁（1976年），ヨーロピアン・ジヤーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（European
Journal of Biochemistry）第101巻395頁（1979
年）、特開昭52−85163号公報、特開昭52−85164
号公報等に記載の方法あるいはこれらの方法に準
じて製造することができる。たとえば、一般式 〔式中、Ｘは水酸基またはハロゲン原子を示
す。ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表
わされるマレイミド化合物〔〕と一般式 〔式中、Ｙは水素原子またはアルカリ金属原子
を示す。〕で表わされるサクシンイミド化合物
〔〕とを脱水剤あるいは脱酸剤の存在下で反応
させることにより製造することができる。上記一
般式において、ハロゲン原子としては塩素，臭素
などが挙げられ、アルカリ金属原子としてはたと
えばナトリウム，カリウムなどが挙げられる。ま
た反応に用いられる脱水剤としてはたとえば、硫
酸，ジシクロヘキシルカルボジイミドなどが、脱
酸剤としてはたとえばピリジン，トリエチルアミ
ンなどが挙げられる。 前記化合物〔〕は、たとえば特開昭52−
85164号公報に記載の方法あるいはこれに準じて
製造することができる。たとえば一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕 で表わされる化合物〔〕を脱水閉環せしめるこ
とにより得られる。該脱水閉鎖させるには、脱水
剤たとえば無水酢酸又は無水酢酸と酢酸ナトリウ
ム（無水物）を用い、温和に加熱することにより
反応させることができる。 さらに別法として、ヘルベテイカ・キミカ・ア
クタ（Helvetica Chimica Acta）第58巻（1975
年）531頁に記載されている方法あるいはこれに
準じて製造することができる。たとえば、一般式 〔式中、Ｚはアルキル基を示す〕で表わされる
Ｎ−アルコキシカルボニルマレイミド〔〕と、
一般式 NH2（CH2）oRCOOH 〔〕 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕 で表わされるアミノ酸〔〕と反応させて、一般
式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕 で表わされるマレイミド化合物〔〕を得る。次
に一般式〔〕で表わされるサクシンイミド化合
物〔〕を加え先に述べたと同様の脱水剤もしく
は脱酸剤の存在下で反応させることにより製造す
ることができる。 上記一般式〔〕で表わされる化合物において
ｚで表わされるアルキルとしては、たとえばメチ
ル，エチルが挙げられる。 ペルオキシターゼに化合物〔〕を反応させる
には、両者をΩ約６ないし８の緩衝液中で約10な
いし50℃の温度で約10分ないし24時間反応させる
ことによつて行なわれる。該緩衝液としては、た
とえばΩ7.0の0.1Mリン酸緩衝液，Ω6.3の0.05M
リン酸緩衝液などが挙げられる。 このようにして得られたマレイミド化ペルオキ
シダーゼの精製は、たとえばゲルクロマトグラフ
イーなどにより行なうことができる。該ゲルクロ
マトグラフイーを行なう際に用いられる担体とし
てはたとえばセフアデツクスＧ−25〔フアルマシ
ア・フアインケミカル社（スエーデン）製〕，バ
イオゲルＰ−２〔バイオ・ラツド・ラボラトリー
ズ社（米国）製〕などが挙げられる。 マレイミド化ペルオキシダーゼを抗hCG抗体と
反応させる場合、抗hCG抗体IgGあるいはペプシ
ン分解して得られたＦ（ab′）2画分を、メルカプト
エチルアミン類の存在下で還元し、ゲルクロマト
グラフイーによつて精製された抗hCG抗体IgGも
しくはFab′とマレイミド化ペルオキシダーゼと
を反応させる。 該反応は、両者を緩衝液中で約０℃ないし40℃
の温度で、約１ないし48時間反応させることによ
り行なうこができる。該緩衝液としては、たとえ
ばΩ6.0の5mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウ
ム塩を含む0.1Mリン酸緩衝液などが挙げられる。 このようにして得られたペルオキシダーゼ標識
抗体は、たとえばゲルクロマトグラフイーなどに
より精製することができる。該ゲルクロマトグラ
フイーに用いられる担体としては、たとえばウル
トロゲルAcA44〔LKB社（スエーデン）製〕，セ
フアクリルＳ−200〔フアルマシア・フアインケミ
カル社（スエーデン）製〕などが挙げられる。 本発明の測定方法を以下に具体的に説明する。 まず、 ：担体に保持された抗体に、測定すべきhCG含
有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行つた
後これに前記で得られたペルオキシダーゼと抗
hCG抗体IgGもしくはFab′との結合物を加えて
反応させる。 本発明の酵素免疫測定法において測定対象と
なるhCGを含む被検試料としては、尿，血清，
血漿，髄液あるいは各種臓器抽出物等が挙げら
れ、とりわけ尿，血清および血漿が繁用され
る。 ：で得られた反応生成物にペルオキシダーゼ
の基質を加え、生じた物質の吸光度もしくは螢
光強度を測定することにより上記の反応生成物
の酵素活性を知る。 ：上記−の操作を既知量のhCGの標準溶液
に対して予め行ない、hCGと吸光度もしくは螢
光強度との関係を標準曲線として作成してお
く。 ：未知量のhCGを含む分析対象物について得ら
れた吸光度もしくは螢光強度を標準曲線にあて
はめ、分析対象物中のhCG含量を測定する。 本発明のサンドイツチ法によるhCGの免疫化学
的測定法に用いられる定量用キツトとしては、主
として、 (1) 担体上に保持された抗体、 (2) 本発明方法により得られたペルオキシダーゼ
で標識化された抗体フラグメント（Fab′）， (3) 標準hCG， (4) 上記(2)〜(3)の試薬および被試験料の希釈に用
いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめ
た約10％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブ
ミン（以下、BSAと略称することもある。）を
含むΩ約６ないし９のリン酸緩衝液またはグリ
シン緩衝液が挙げられる。）， (5) ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。そ
の一例として螢光法の場合、酵素基質としてｐ
−ハイドロキシフエニル酢酸と過酸化水素、比
色法の場合、ｏ−フエニレンジアミンと過酸化
水素。酵素基質の溶解に用いる緩衝液（好まし
くはリン酸緩衝液）および酵素反応停止液が挙
げられる。 上記のキツトは例えば下記の方法により使用す
ることができる。 標準hCGもしくは被検液約10ないし200μに
試薬(4)を加えて希釈し、一定量の試薬(1)を加えて
約０ないし40℃で約１ないし48時間反応させる。
担体を水洗後、試薬(2)の約10ないし300μを加
えたのち、約０ないし40℃で反応させる。約１な
いし48時間反応後、担体を洗浄し担体上に結合し
ているペルオキシダーゼ活性を測定する。即ちペ
ルオキシダーゼの基質液約10〜1000μを加えて
約20〜40℃で約0.2〜24時間反応させたのち、酵
素反応を停止させ、反応液中の吸光度もしくは螢
光強度を測定する。 本発明の免疫化学的分析法用試薬を用いれば、
通常の臨床検査室において簡単な操作でhCGの高
感度測定が可能となる。 本発明の試薬を用いると、他の類似したホルモ
ン（たとえばhLH：黄体形成ホルモン）からの
妨害を受けることなく極めて高感度かつ正確に
hCGを測定できるので、絨毛性腫瘍やその他の
hCG産生腫瘍などの診断，予後管理などにも極め
て有用な手段を提供するものである。 以下に、参考例および実施例を挙げて、本発明
をさらに具体的に説明する。 参考例 １ 抗体の製造 人尿より公知の方法で精製した約10000IU／mg
のhCG1mgを生理食塩水１mlに溶解し、これにフ
ロインドの完全アジユバンド〔Freund′s
complete ajuvant，“免疫の生化学”，橘ら著，
共立出版株式会社（1967年）〕１mlを加えてよく
混和し乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋肉
内および背部皮下数箇所に注射した。以上の操作
を３週毎に５回行ない最終免疫後１週間で採血し
パイロツトアツセイを実施した。その結果、hCG
−βの末端ペプチド〔〕にも親和性をもつ抗血
清N305Bを得た。 参考例 ２ 特異抗hCG抗体の製造 hCG−βの末端ペプチド〔〕５mgを0.5M
NaClを含む0.1MNaHCO38mlに溶解し、予め
Ｎ／1000HClで洗浄したブロムシアン活性化セフ
アロース4B（フアルマシア・フアイン・ケミカル
ズ社製）１ｇに加え、５℃で一夜撹拌した。反応
終了後同じ0.5MNaClを含む0.1MNaHCO3で十
分に撹拌し、次いでHClでΩ８に調整した0.5M
エタノールアミン10mlを添加して室温で１時間反
応させた後、(1)1MNaClを含む0.1M酢酸緩衝液
（Ω4.0），(2)1MNaClを含む0.1Mホウ酸緩衝液
（Ω3.0）および(3)0.15MNaClを含む0.02Mホウ酸
緩衝液（Ω8.0）で順次洗浄しカラムに充填した。 参考例１で得られた抗血清N305B8mlを1.5ｇの
無水硫酸ナトリウムを用いて塩析沈殿させ、得ら
れたγ−グロブリン画分を上記のペプチド〔〕
結合セフアロース4Bカラム（0.9×４cm）に付し
た。 0.15MNaClを含む0.02Mホウ酸緩衝液（Ω8.0）
でカラムを洗浄し、hLH（黄体形成ホルモン），
hFSH（卵胞刺激ホルモン）およびhTSH（甲状腺
刺激ホルモン）と交差反応する抗hCG抗体を除去
した。次いで0.17Mグリシン−塩酸緩衝液（Ω
2.3）で溶出することによつてhCG−βのＣ末端
ペプチド〔〕と強い親和性をもつ特異抗体
N305BSを得た（蛋白量1.2mg）。 参考例 ３ 抗hCG−βのＣ末端ペプチド〔〕抗体の製造 hCG−βのＣ末端ペプチド〔〕25mgおよび牛
チログロブリン（BTGと略称する）50mgを0.2M
リン酸緩衝液（Ω7.3）４mlに溶解し、５％GLA
水溶液４mlを加えて室温で３時間撹拌後、４℃で
透析（水２×４）し凍結乾燥して免疫源を得
た。このhCG−βのＣ末端ペプチド〔〕−BTG
縮合物1.5mgを生理食塩水0.75mlに溶解し、これ
にフロインドの完全アジユバンド（Freund′s
complete adjuvant）0.75mlを加えてよく混和
し、乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋肉内
および背部皮下数ケ所に注射した。以上の操作を
４週おきに４回行ない最終免疫後１週間で採血
し、遠心分離して抗血清を採取し抗hCG−βのＣ
末端ペプチド〔〕に対する抗血清N313Bを得
た。 次いで抗血清N313Bを常法により硫酸アンモ
ニウムで塩析させて得たγ−グロブリン画分を２
mgのhCGを結合させたセフアロース4Bカラム
（直径0.9cm，長さ４cm）に付した。 0.15MNaClを含む0.02Mホウ酸緩衝液（Ω8.0）
でカラムを洗浄し、次いで0.17Mグリシン−塩酸
緩衝液（Ω2.3）で溶出することによつて、hCG
に親和性の高い特異抗体N313BSを調製した。 参考例 ４ 非特異抗hCG抗体の製造 参考例１で得られた抗血清N305Bについて硫
酸アンモニウム塩析し、５mgのhCG−βのＣ末端
ペプチド〔〕を結合させたセフアロース4Bカ
ラム（直径0.9cm、長さ４cm）のアフイニテイ−
クロマトグラフイーで素通りする抗体画分を調製
した。次いでこの抗体画分を２mgのhCGを結合さ
せたセフアロース4Bカラム（直径0.9cm，長さ４
cm）に付した。0.15MNaClを含む0.02Mホウ酸緩
衝液（Ω8.0）でカラムを洗浄し、次いで
5MMgCl2で溶出することによつてhCGに親和性
の高い非特異抗体N305BGを調製した。 実施例 １ (1) マレイミド基の導入 ６mgの西洋わさびペルオキシダーゼ〔ベーリン
ガーマンハイム社（西ドイツ）製〕を１mlの
0.1Mリン酸緩衝液（Ω7.0）に溶解し、50μの
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドにとかした結合試
薬MMC（一般式〔〕において、ｎ＝１，Ｒ＝
シクロヘキシレンである化合物）4.8mgを加えて
30℃で60分間撹拌しながら反応させた。生成した
沈澱を遠心分離して除去し、上清をセフアデツク
スＧ−25のカラム（1.0×45cm）に通し、0.1Mリ
ン酸緩衝液で溶出させた。タンパクを含む画分を
分取し、コロジオン膜を用いて濃縮した。このよ
うにして調製したマレイミド化ペルオキシダーゼ
においてペルオキシダーゼ１分子あたり導入され
たマレイミド基の数は1.0〜1.2個であつた（ペル
オキシダーゼの分子量を40000，E280nm 1%＝22.75と
して計算）。 (2) マレイミド化ペルオキシダーゼと抗hCG抗体
（Fab′フラグメント）との複合体の製造 参考例４で得られた抗体N305BG5mgに0.1mgの
ペプシンを加え30℃で一夜反応後、セフアデツク
スＧ−150カラム（直径2.5cm，長さ55cm）で精製
した。得られた抗体Ｆ（ab′）2画分を２−メルカプ
トエチルアミンで還元し、セフアデツクスＧ−25
のカラによるゲルクロマトグラフイーで精製して
ウサギ抗hCG抗体（Fab′フラグメント）を得た。 上記(1)で調製したマレイミド化ペルオキシダー
ゼ1.5mgを0.1Mリン酸緩衝液（Ω6.0）0.15mlに溶
解し、先に得た抗hCG抗体（Fab′フラグメント）
1.8mgをとかした5nMエチレンジアミン四酢酸ナ
トリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（Ω6.0）0.15
mlを加えて４℃で20時間反応させた。反応後、ウ
ルトロゲルAcA44を充てんしたカラム（1.5×45
cm）を用いるゲルクロマトグラフイーにかけ、
0.1Mリン酸緩衝液（Ω6.5）で溶出させた。溶出
液の280の吸光度ならびに酵素活性を測定した。
ペルオキシダーゼとウサギ抗hCG抗体（Fab′フ
ラグメント）との複合体が生成していることを、
以下の方法で確認した。 まず、酵素活性の測定はギルバルトらの方法
〔アナリテイカル・ケミストリー（Analytical
Chemistry），第40巻（1986年），1256頁〕で行な
つた。即ち、溶出液の各フラクシヨンを0.1％ウ
シ血清アルブミンを含む0.1Mリン酸緩衝液（Ω
7.0）で1800倍に希釈した。この10μに0.1％ウ
シ血清アルブミンを含む0.05M酢酸ナトリウム緩
衝液（Ω5.0）に溶解した0.5％ｐ−ハイドロキシ
フエニル酢酸0.25mlを加えて混合し30℃で５分間
インキユベートした。次に0.01％過酸化水素0.05
mlを加えて30℃で20分反応させた。0.1Mグリシ
ン緩衝液（Ω10.3）2.5mlを加えて酵素反応を停
止させ、1μｇ／mlのキニンの螢光強度を100とし
励起光320nmにおける405nmの螢光強度を測定し
た。結果を第１図に示す。第１図において、―●
―は280nmにおける吸光度を、―○―はペルオキ
シダーゼ活性（螢光強度として）をそれぞれ示
す。フラクシヨン38付近においてペルオキシダー
ゼと抗hCG抗体（Fab′フラグメント）との複合
体の生成が極めて良好であることが分つた。 (3) 抗体結合固相の調製 ポリスチレン球（直径4.8mm，Precision
Plastics Ball Co.，Chicago，U.S.A）1500個
に、参考例２あるいは３に記載の特異抗hCG抗体
N308BSあるいはN313BSの15μｇ／ml
0.01MNaCl−0.1Mリン酸緩衝液（Ω8.0）100ml
を加え５℃で一夜インキユベートした。0.1％
BSAを含む0.05Mリン酸緩衝液（Ω77.0）で洗浄
したのち、用時まで冷所保存した。 (4) EIA EIA用の試薬として以下のものを用いた。 実施例１(2)で得られたペルオキシダーゼとウ
サギ抗hCG抗体（Fab′フラグメント）との複
合体 実施例１(3)で得られた抗hCG抗体感作ポリス
チレン球 標準hCG，標準hLH 緩衝液Ｂ；10％正常ヒツジ血清，１％ウシ血
清アルブミン，0.1％NaN3，0.15MNaClを含
むΩ7.0の0.02Mリン酸緩衝液 ペルオキシダーゼ活性特性に必要な試薬0.02
％過酸化水素と0.15％ｏ−フエニレンジアミン
を含むΩ4.8の0.1Mクエン酸−リン酸二ナトリ
ウム緩衝液および反応停止液（1N−塩酸） 測 定 緩衝液B200μ中でhCGもしくはhLHとウサギ
抗hCG感作ポリスチレン球とを室温で１日間反応
させた。ポリスチレン球を洗浄後、ペルオキシダ
ーゼ−ウサギ抗hCG抗体（Fab′フラグメント）
複合体300μを加えて４℃で１日間反応させた
のち、ポリスチレン球を洗浄し、これに0.02％過
酸化水素と0.15％ｏ−フエニレンジアミンを含む
0.1Mクエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液（Ω
4.8）500μを加えて室温で40分間放置し、1N塩
酸２mlを添加して反応を停止させ、492nmにおけ
る吸光度を測定し標準曲線を得た。それぞれの標
準曲線を第２図に示した。第２図中、―●―は
N305BS結合ポリスチレン球でのhCGの標準曲線
を、―○―はN305BS結合ポリスチレン球での
hCGの標準曲線を、―■―はN313BS結合ポリス
チレン球でのhCGの、―□―はN313BS結合ポリ
スチレン球でのhLHの標準曲線をそれぞれ示す。 このように、本発明の測定方法はhCGに得異的
かつ高感度であり、hLHとは交差反応を示さな
かつた。 実施例２ 短時間法 標準hCG，実施例１(2)で得られたペルオキシダ
ーゼ−抗hCG抗体（Fab′フラグメント）複合体、
および実施例１(3)で得られた抗hCG抗体N305BS
結合ポリスチレン球１個を25％正常ヒツジ血清，
１％ウシ血清アルブミン，0.002％メルチオレー
ト，0.15MNaClを含む0.02Mリン酸緩衝液（Ω
7.0）300μ中で同時に混合して４℃１日間反応
させたのち、ポリスチレンボールを洗浄し、実施
例１(4)に示した方法でペルオキシダーゼ活性を測
定した。第３図に示したように、良好なhCGの標
準曲線を与えた。 実施例 ３ ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ハイドロキシ
サクシンイミド（MBS）による結合法 西洋わさびペルオキシダーゼ〔ベーリンガーマ
ンハイム社（西ドイツ）製〕６mgを0.1Mリン酸
緩衝液（Ω7.0）に溶解し、50μのＮ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミドにとかした結合試薬MBS（一般
式〔〕において、ｎ＝０，Ｒ＝フエニレンであ
る化合物）4.8mgを加えて25℃で30分間撹拌しな
がら反応させた。次に反応生成物をセフアデツク
スＧ−25のカラム（1.0×45cm）に通し、0.05M
酢酸緩衝液（Ω5.0）で溶出した。タンパクを含
む画分を分取し、コロジオン膜を用いて濃縮し
た。このようにして得たマレイミド化ペルオキシ
ダーゼにおいてペルオキシダーゼ１分子あたり導
入されたマレイミド基の数は0.68〜0.78であつ
た。 参考例４で得られた抗体N305BG5mgに0.1mgの
ペプシンを加え30℃で１夜反応後、セフアデツク
スＧ−150カラム（直径2.5cm、長さ55cm）で調製
した。得られた抗体Ｆ（ab′）2画分を２−メルカプ
トエチルアミンで還元し、セフアデツクスＧ−25
のカラムによるゲルクロマトグラフイーで精製し
てウサギ抗hCG抗体（Fab′フラグメント）を調
製した。抗hCG抗体（Fab′フラグメント）1.7mg
をとかした5mMエチレンジアミン四酢酸ナトリ
ウム塩を含む0.1Mリン酸緩衝液（Ω6.0）0.15ml
を、先に調製したマレイミド化ペルオキシダーゼ
1.5mgの0.1Mリン酸緩衝液（Ω6.0）0.15mlに加え
て４℃で20時間反応させた。反応後、ウルトロゲ
ルAcA44を充てんしたカラム（1.5×45cm）を用
いるゲルクロマトグラフイーにかけ、0.1Mリン
酸緩衝液（Ω6.5）で溶出させ、ペルオキシダー
ゼ−ウサギ抗hCG抗体（Fab′フラグメント）複
合体を得た。 本複合体を実施例１(2)，(4)に示した方法に従つ
て検定したところ、固相への非特異的吸着が極め
て小さく、高感度を与えることが分つた。 EIAにおける試薬としては、以下のものを用い
た。 実施例１(3)で得られた抗hCG抗体N305BS結
合ポリスチレン球 実施例３で得られたペルオキシダーゼとウサ
ギ抗hCG抗体（Fab′フラグメント）との複合
体 標準hCG 緩衝液Ｂ〔実施例１(4)参照〕 ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬 0.5％ｐ−ハイドロキシフエニル酢酸を含む
Ω5.0の酢酸緩衝液，0.01％過酸化水素水およ
び反応停止液（Ω10.3の0.1Mグリシン緩衝液） 実施例 ４ hCGの特異免疫化学的測定用キツトおよびhCG
の測定 下記のhCG免疫化学的測定用キツトを用い、下
記の操作法に従つて正常人，卵巣摘出患者，排卵
期婦人，妊婦および絨毛摘出患者の血漿中のhCG
濃度を測定した。 hCGの免疫化学的測定キツト (1) 実施例１(3)で得られる１個あたり約1μｇの
hCG特異抗体で感作した直径4.8mmのポリスチ
レン球 (2) 実施例１(2)で得られるペルオキシダーゼ標識
抗hCG抗体複合体 (3) ０〜100mIUの標準hCG (4) 上記(1)，(3)の試薬および被検試料の希釈に用
いる緩衝液Ｂ〔実施例１(4)参照〕 (5) ｏ−フエニレンジアミン (6) 上記(2)の試薬の希釈に用いる緩衝液Ｃ；0.1
％ウシ血清アルブミン，0.002％メルチオレー
トを含むΩ7.5の0.1Mリン酸緩衝液 (7) 上記(5)の溶解に用いる緩衝液Ｄ；0.02％過酸
化水素0.002％メルチオレートを含むΩ4.8の
0.1Mクエン酸緩衝液 (8) 停止液；1N塩酸 (9) コントロール血清（正常ヒツジ血清） 操作法 被検試料50μに試薬(4)250μおよび試薬(1)１
個を添加し、室温で１日間反応させた。ポリスチ
レン球を水洗後、試薬(6)で希釈した試薬(2)300μ
（複合体として約30ng）を添加し、４℃で１
日間反応させた。ポリスチレン球を水洗し、試薬
(7)で溶解した0.15％の試薬(5)500μを加えて室温
で40分間反応させたのち、1N塩酸1.5mlを添加し
て反応を停止させ、492nmの吸光度を測定した。
別に標準hCG溶液については、試薬(4)200μ，
コントロール血清50μおよび試薬(1)１個を加え
て上記と同一操作を行ない標準曲線を作成した。 上記方法により、正常人，卵巣摘出患者，排卵
期婦人，妊婦および絨毛癌摘出患者の血漿中の
hCG濃度を測定した。結果は第１表に示される。
【表】
【表】
第１表の結果から明らかなように、正常者を含
め極微量の血清hCGがhLHなどの類似したホル
モンの交差反応を受けることなく測定できる。ま
た、絨毛癌摘出者の予後管理においても、治瘉の
判定に極めて有効である。
め極微量の血清hCGがhLHなどの類似したホル
モンの交差反応を受けることなく測定できる。ま
た、絨毛癌摘出者の予後管理においても、治瘉の
判定に極めて有効である。
第１図は実施例１で得られたペルオキシダーゼ
とウサギ抗hCG抗体（Fab′フラグメント）との
反応生成物のゲルクロマトグラフイーにおける溶
出パターンを、第２図は実施例１においてペルオ
キシダーゼ標識抗hCG抗体（Fab′フラグメント）
とhCG特異的抗体結合ポリスチレン球とを用いる
EIAのhLHの標準曲線を、第３図は実施例２で得
られた同時アツセイ法におけるhCGの標準曲線を
それぞれ表わす。
とウサギ抗hCG抗体（Fab′フラグメント）との
反応生成物のゲルクロマトグラフイーにおける溶
出パターンを、第２図は実施例１においてペルオ
キシダーゼ標識抗hCG抗体（Fab′フラグメント）
とhCG特異的抗体結合ポリスチレン球とを用いる
EIAのhLHの標準曲線を、第３図は実施例２で得
られた同時アツセイ法におけるhCGの標準曲線を
それぞれ表わす。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 担体上に保持された抗体，抗原および標識剤
を結合させた抗体を用いる免疫化学的測定法にお
いて、担体上に保持される抗体と標識剤を結合さ
せる抗体とが互いに抗原決定部位を重複しない２
種の抗体であり、担体上に保持される抗体がヒト
絨毛性ゴナドトロピンに特異的に反応する抗体で
あり、標識剤としてペルオキシダーゼを用いこれ
と抗体とを一般式 ［式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結
合または２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ
示す。］で表わされる化合物で結合させたものを
用い検出感度0.2mIU／mlを有することを特徴と
するヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定
法。 ２ ペルオキシダーゼと抗体とを一般式 ［式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結
合または２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ
示す。］で表わされる化合物で結合させたもの、
およびペルオキシダーゼに結合させる抗体と互
いに抗原決定部位を重複せずかつヒト絨毛性ゴナ
ドトロピンに特異的に反応する抗体を担体上に保
持したものを含有するヒト絨毛性ゴナドトロピン
の免疫化学的測定用試薬。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20089782A JPS5990054A (ja) | 1982-11-15 | 1982-11-15 | ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定法および試薬 |
| DE8383111327T DE3376508D1 (en) | 1982-11-15 | 1983-11-12 | Immunochemical assay of human chorionic gonadotropin and reagent therefor |
| EP19830111327 EP0109078B1 (en) | 1982-11-15 | 1983-11-12 | Immunochemical assay of human chorionic gonadotropin and reagent therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20089782A JPS5990054A (ja) | 1982-11-15 | 1982-11-15 | ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定法および試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5990054A JPS5990054A (ja) | 1984-05-24 |
| JPH038512B2 true JPH038512B2 (ja) | 1991-02-06 |
Family
ID=16432066
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20089782A Granted JPS5990054A (ja) | 1982-11-15 | 1982-11-15 | ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定法および試薬 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0109078B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5990054A (ja) |
| DE (1) | DE3376508D1 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59176675A (ja) * | 1983-03-26 | 1984-10-06 | Eiken Kagaku Kk | 酵素免疫測定用試薬 |
| JPS6117065A (ja) * | 1984-07-04 | 1986-01-25 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ヒト絨毛性ゴナドトロピンの測定試薬 |
| US4657853A (en) * | 1984-09-14 | 1987-04-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immunoassays utilizing covalent conjugates of polymerized enzyme and antibody |
| CN86104525A (zh) * | 1985-07-31 | 1987-02-25 | 武田药品工业株式会社 | 人类白细胞介素-2的分析方法和试剂 |
| JP2546991B2 (ja) * | 1986-06-26 | 1996-10-23 | コニカ株式会社 | パ−オキシダ−ゼ酵素反応を用いた特定成分の測定方法 |
| JPS6371654A (ja) * | 1986-09-12 | 1988-04-01 | Konica Corp | パ−オキシダ−ゼ酵素反応を用いた特定成分の測定方法 |
| CA2005511A1 (en) * | 1989-01-17 | 1990-07-17 | Harold C. Warren Iii | Enzyme-labeled receptor composition, diagnostic kit and use in method to determine a ligand |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5822036B2 (ja) * | 1975-12-11 | 1983-05-06 | 三井東圧化学株式会社 | マレインイミドユウドウタイノ セイゾウホウホウ |
| JPS5272284A (en) * | 1975-12-12 | 1977-06-16 | Dainippon Pharmaceutical Co | Enzymeeimmunoassay reagent |
| DK159276C (da) * | 1980-03-31 | 1991-02-18 | Takeda Chemical Industries Ltd | Fremgangsmaade til isolering af specifikke antistoffer og enzym-immunbestemmelsesmetode med anvendelse af det isolerede antistof |
| CH642458A5 (en) * | 1980-04-25 | 1984-04-13 | Hoffmann La Roche | Immunological method |
| DE3174064D1 (en) * | 1980-10-15 | 1986-04-17 | Takeda Chemical Industries Ltd | Method for immunochemical assay and kit therefor |
| JPS57184970A (en) * | 1981-05-08 | 1982-11-13 | Toyo Jozo Co Ltd | Measuring method for hcg |
-
1982
- 1982-11-15 JP JP20089782A patent/JPS5990054A/ja active Granted
-
1983
- 1983-11-12 DE DE8383111327T patent/DE3376508D1/de not_active Expired
- 1983-11-12 EP EP19830111327 patent/EP0109078B1/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5990054A (ja) | 1984-05-24 |
| EP0109078B1 (en) | 1988-05-04 |
| DE3376508D1 (en) | 1988-06-09 |
| EP0109078A1 (en) | 1984-05-23 |
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