JPH0424996B2 - - Google Patents
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- JPH0424996B2 JPH0424996B2 JP59087612A JP8761284A JPH0424996B2 JP H0424996 B2 JPH0424996 B2 JP H0424996B2 JP 59087612 A JP59087612 A JP 59087612A JP 8761284 A JP8761284 A JP 8761284A JP H0424996 B2 JPH0424996 B2 JP H0424996B2
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- carcinoma
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Description
本発明は、人卵巣癌に対する単一クローン抗体
及びそれを産生するハイブリドーマに関する。 更に詳しくは、本発明は、人の卵巣癌細胞で免
疫された抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合によ
つて形成されたハイブリドーマによつて産生さ
れ、次の性質を有するIgG1のクラスに属する単
一クローン抗体に関する： (1) ムチン性嚢胞腺癌細胞、類内膜癌細胞、類中
腎癌細胞と反応する； (2) 漿液性嚢胞腺癌細胞、ムチン性嚢胞腺腫細胞
とは反応しない； (3) 卵巣腫瘍以外の子宮体部癌、肺癌、乳癌、胃
癌、膵癌、腎細胞癌、大腸癌、肝癌、精上皮腫
の細胞と反応しない； (4) 卵巣、脳、心臓、肺臓、肝臓、胃、腸、膵
臓、腎臓、子宮、卵管、睾丸の正常組織細胞と
反応しない； (5) トリプシンで分解しない。 更に本発明は、人の卵巣癌細胞で免疫された抗
体産生細胞と骨髄腫細胞との融合によつて形成さ
れ、次の性質を有するIgG1のクラスに属する単
一クローン抗体を産生するハイブリドーマに関す
る： (1) ムチン性嚢胞腺癌細胞、類内膜癌細胞、類中
腎癌細胞と反応する； (2) 漿液性嚢胞腺癌細胞、ムチン性嚢胞腺腫細胞
とは反応しない； (3) 卵巣腫瘍以外の子宮体部癌、肺癌、乳癌、胃
癌、膵癌、腎細胞癌、大腸癌、肝癌、精上皮腫
の細胞と反応しない； (4) 卵巣、脳、心臓、肺臓、肝臓、胃、腸、膵
臓、腎臓、子宮、卵管、睾丸の正常組織細胞と
反応しない； (5) トリプシンで分解しない。 近年、高い特異性を有する単一クローン抗体
を、診断及び治療手段として利用しようとする試
みが精力的になされていることは周知の通りであ
る。本発明者等も、人の卵巣癌に対して特異性の
高い単一クローン抗体の確立、この単一クローン
抗体を産生するバイブリドーマの確立のために鋭
意研究を行なつた結果、本発明を完成した。 卵巣癌は婦人科癌の中にあつて、子宮癌ほど頻
度の高い疾患ではないが、腹腔内腫瘍であるため
早期診断の困難な場合が多く、予後が悪いことが
特徴である。従つて、卵巣癌の治療成績の向上に
は、早期の確実な診断法を確立して適切な治療を
おこなう必要があり、最近、Bast等および
Bhattacharya等は、細胞融合法（Ko¨hler，G.，
とMilstein，C.：Eur.J.Immunol.，６，511−
519，1976）を用いて、卵巣癌関連抗原に対する
単一クローン抗体（以下、MoAbと略す）を作成
し、免疫学的な方法で卵巣癌の診断及び治療を行
なうための基礎的な成績を発表した。まず、
Bast等はヒト漿液生嚢胞腺癌の培養細胞に対す
るMoAbOC−125を作成し、螢光抗体法で分析し
たところ、卵巣癌の大部分と反応を認めたが他臓
器とほとんど反応しなかつたため、卵巣癌関連抗
原に対するMoAbであると報告した（J.Clin.
Invest.，68，1331−1337，1981）。しかし、Bast
はKabawat等、との第２報でOC−125が漿液性
嚢胞腺癌とともに類内膜癌、類中腎癌及び良性の
漿液性嚢胞腺腫などの反応し、ムチン性嚢胞腺癌
と反応しなかつたため、OC−125は漿液性、類内
膜、類中腎の三型の卵巣腫瘍に共通した表面抗原
に対するMoAbであると報告した（Am.J.Clin.
Pathol.，79，98−104，1983）。一方、
Bhattacharya等は漿液性又はムチン性と判別出
来ない低分化の嚢胞腺癌の抽出液を免疫原とし
て、MoAbID3及びID5を作成した。これらは、
Solidphase RIAによる吸収実験で、ムチン性嚢
胞腺癌とのみ反応して他臓器癌と全く反応しなか
つたため、ムチン性嚢胞腺癌関連抗原に対する
MoAbであると報告した（Cancer Research，
42，1650−1654，1982）。しかし、これらの
MoAbは、いずれも正常組織、卵巣癌以外の悪性
腫瘍、卵巣の良性腫瘍にも反応し、類中腎癌には
反応しないという欠点がある。 本発明者らは種々検討の結果、卵巣癌の中でも
最も頻度の高いムチン性嚢胞腺癌に対して特異性
の高い新規なMoAb、及びこのMoAbを産性する
ハイブリドーマを創製することに成功し、本発明
を完成するに至つた。 以下に本発明のハイブリドーマおよびMoAbの
調製法について詳述する。 なお、以下の説明において、抗体産生ハイブリ
ドーマの製造のために免疫原として使用する癌細
胞及び、本発明のMoAbの各細胞との反応性を調
べる為に用いる各種細胞は、全て人の細胞であ
る。 まず、適当な動物を癌細胞で免疫する。免疫原
としては、ムチン性嚢胞腺癌細胞、または類内膜
癌細胞、類中腎癌細胞等の卵巣癌細胞が使用出来
る。これらの癌細胞は、特定の株のものに限定さ
れない。免疫する動物はマウス、ラツト等のネズ
ミ科の動物又はその他の動物であつてよいが、通
常はマウスが好ましい。具体的には、例えば
BALB／Ｃマウスにムチン性嚢胞腺癌の細胞又
はそのホモジネート又はそれから採取された抗原
を数日〜数週間おきに数回接種する。接種量は１
匹あたり１回につき105〜107個の細胞を使うのが
好ましい。 その後マウスより脾臓を摘出し、遠心分離によ
り抗体産生細胞（脾臓細胞）を得る。この細胞は
増殖していく能力を持たないので、自己増殖能力
を有する細胞と融合させる。自己増殖能力を有す
る細胞としては骨髄腫細胞が特に好ましい。骨髄
腫細胞としては、抗体産生細胞を得た動物と同種
の動物のものを用いるのが好ましく、また、抗体
を産生しないものを選択するのが好ましい。 抗体産生細胞と骨髄腫細胞をポリエチレングリ
コール等の細胞融合剤を含む溶液（又は懸濁液）
に加え、細胞融合を行なう。抗体産生細胞と骨髄
腫細胞の使用割合は細胞数比で約５：１とするの
が好ましい。 得られた融合細胞を限界稀釈法により分離し、
分離した融合細胞を増殖させ、各ウエルにおいて
産生される抗体を公知の方法、例えば螢光光体法
又は酵素抗体法等により各種細胞組織等と反応さ
せ、その結果から所望の抗体を産生するハイブリ
ドーマを選択することができる。 選択されたハイブリドーマを培養基中で培養
し、その上清液から常法により所望のMoAbを採
取することができるが、生体内、例えばヌードマ
ウス腹腔内にハイブリドーマを注入し、これをヌ
ードマウス体内で腫瘍として生育させ、そのヌー
ドマウスの血清あるいは腹水からMoAbを回収す
ることも出来る。 この様にして得られたMoAbはIgG1のクラス
に属するものであり、分子量は約15万である。こ
のMoAbはトリプシンで分解されない。本発明者
らはこのMoAbを、MoAb4C7と命名した。 後述する実施例に示したように、本発明の
MoAb4C7はムチン性嚢胞腺癌の76.9％、類内膜
癌の85.7％及び類中腎癌の81.8％に陽性反応を認
めたが、漿液性嚢胞腺癌及びムチン性嚢胞腺癌と
共に、非上皮性卵巣腫瘍、他の臓器癌組織や正常
組織等とは全く反応を認めなかつた。従つて、本
発明のMoAb4C7産生ハイブリドーマは、ムチン
性嚢胞腺癌に存在する抗原に対するMoAb産生ハ
イブリドーマである。 MoAb4C7が類内膜癌と反応したことは、ムチ
ン性嚢胞腺癌に特有の癌関連抗原が類内膜癌にも
存在していることを示しているおり、又、
MoAb4C7が類中腎癌と反応したことは、ムチン
性嚢胞腺癌に特有な癌関連抗原が類中腎癌にも分
布していることを示している。即ち、本発明の
MoAb4C7が認識する抗原は、ムチン性嚢胞腺癌
の癌細胞の表面、腺腔を形成する類内膜癌癌細胞
の表面、類中腎癌の癌細胞の表面に存在する表面
抗原である。 本発明のMoAbは、一種類で数種類の卵巣癌を
証明出来るから、臨床応用を考える場合、極めて
有用な抗体であると言える。即ち、本発明の
MoAb4C7は、ラジオイミユノアツセイ等の方法
で体液中の抗原濃度を測定したり、放射性同位元
素で標識したMoAbの放射活性をイメージングす
るなどして、診断の目的に用いることも出来る。
このMoAb4C7を用いると、ムチン性嚢胞腺癌に
対して、非常に精度の高い診断を行なうことが出
来る。又、本発明のMoAbは対応する抗原を保有
する癌組織を標的としたMoAb単独使用による治
療又は、MoAbを抗癌剤の癌組織への特異的な運
搬手段として用いるMoAb−抗癌剤複合体による
ミサイル療法に用いることも出来る。 なお、本発明における実施例及び実験例で用い
た間接酵素抗対法は、辻の方法（免疫実験操作
法、Ｘ，3161−3164，1981）に準じ以下のように
行なつた。癌細胞を細切した後、0.1％のトリプ
シン（Sigma）と0.1％コラゲナーゼ（Sigma）
を加えた溶液中、37℃で２時間反応させステンレ
スメツシユ（Ｓ−200永田理化）を用いて単細胞
化したものをPBSで洗浄浮遊し、試料細胞とす
る。0.25％グルタールアルデハイド（和光純薬工
業）で前処理したMicro ELISA plate Ｕ 2001
（Dynateck Lab.）の各ウエルに104個の試料細胞
を加え、160Gで10分間遠沈したのち99％エタノ
ールを加えて固定乾燥する。次に、ハイブリドー
マの培養上清50μを加えて室温で30分間反応さ
せ、PBSで洗浄したのち、第二抗体として、
biotinyl antimouse IgG（Vector Lab.12.5μｇ／
ml）50μを摘下し、室温で30分間反応させたの
ちPBSで洗浄する。続いて、horseradish
peroxidase Avidin Ｄ（Vector Lab.2μｇ／ml）
の50μを加え、室温で５分間反応させたのち
PBSで洗浄し、0.05％H2O2を含むオルソフエニ
レンジアミン（0.2）ｇ／ml，0.15Mクエン酸緩
衝液、PH4.0）50μを用いて室温で５分間呈色反
応を行ない、10％H2SO450μを加えて、
Automatic microphotometer（Corona MTP12）
で測定する。 また、間接螢光抗体法は、高田の方法（兵医大
学会誌７，91−99，1982）に準じ、以下のように
行なつた。 マイクロスライドガラス（松波硝子）上に載せ
た培養細胞や組織切片などを99％エタノールで５
分間固定し、PBS（生理的リン酸緩衝液）で５分
間洗浄する。培養癌細胞や組織切片の上にMoAb
（200μ／ml）の50μを摘下し、室温で乾燥しな
いように注意しながら30分間反応させる。PBS
で洗浄後、第二抗体としてのbiotinyl antimouse
IgG（Vector Lab.12.5μｇ／ml）50μと室温で30
分間反応させ、PBSで洗浄する。最後に、FITC
conjugated Avidin Ｄ（Vector Lab.10μｇ／ml）
の50μと室温で５分間反応させ、PBSで十分洗
浄したのち、90％グリセロール10％PBSで封入
し、螢光顕微鏡（Nikon VFD−Ｒ）で観察す
る。 実施例 ムチン性嚢胞腺癌に対するモノクローナル抗体
の作成 免疫原には、ムチン性嚢胞腺癌から確立したヌ
ードマウス移植株から採取したムチン性嚢胞腺癌
細胞（以下HOVA−１という）を細切したのち
１×106個相当量に２倍量のRPMI−1640に加え
てホモジネートし、その総量を用いた。 ６週令の雄BALB／Ｃマウス（チヤールズリ
バー）の腹腔内に前述した量のOVA−１ホモジ
ネートを１週間毎に４回注入し、３月後にマウス
から脾臓を摘出した。 細胞融合の方法は、渡辺等の方法（免疫実験操
作法，2963−2967，1978）及び高田の方法（兵
医大学会誌，７，91−99，1982）に準じて行なつ
た。即ち、摘出した脾臓を細切したのち、ステン
レスメツシユ（S200永田理化）を通し、
1500rpm、200Gで遠沈して得た沈渣に0.7％
NH4Cl10mlを加えて赤血球を除き、RPMI−1640
で２回洗浄して得た生細胞浮遊液3.9×107個／22
mlにマウス骨髄腫細胞株P3×63−Ag8−U1（以下
P3U1という）をRPMI−1640で２回洗浄して得
たP3U1、7.8×106個／2.5ml（５：１）を混合し、
2000rpm、200Gで10分間遠沈した。沈澱細胞を
よくときほぐした後、42.5％（ｗ／ｖ）のポリエ
チレングリコール（PEG1000、Sigma）を含有
した37℃、PH7.4のRPMI−1640、１mlを回転し
ながら１分間かけて徐々に加え、細胞融合を行な
つた。 反応１分後からRPMI−1640を徐々に加え、総
量30mlとした細胞融合を終了した。2000rpm、
200Gで遠沈後、10％牛胎児血清を含んだRPMI
−1640、100mlを加えて細胞浮遊液を作り、
Falcon micro culture plate（3042）の１ウエル
あたり0.2mlずつ分注し、37℃、５％CO2培養器
中で培養した。24時間後から２日毎に上清の半量
をHAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン10％、牛胎児血清）と入れ換えた。
10日目に上清を取り出して後述する酵素抗体法で
抗体産生の有無を確かめ、限界稀釈法により、抗
体産生が陽性を示したウエルの中のハイブリドー
マを１ウエルあたり0.3〜0.6個となるように調節
した。培地は最初HT（ヒポキサンチン、チミジ
ン、10％牛胎児血清）を用い、feeder layerとし
てBALB／Ｃマウスの胸腺細胞５×105／ウエル
を加えた。次に10％牛胎児血清を加えたRPMI−
1640倍地に置換した。 このような限界稀釈法によるクローニングを２
回ずつ行ない、約500種の抗体産生細胞を作成し
た。これらの中から間接螢光抗体法によりムチン
性嚢胞腺癌のヌードマウス継代移植株（OVA−
１）に反応するMoAb4C7産生ハイブリドーマ１
種を得た。 得られたハイブリドーマの大量培養は、１ウエ
ルのハイブリドーマを５ウエル、24ウエル
（Falcon3008）と増量しながら、最終的には
Falcon組織培養フラスコ（3013，3024）を用い
て培養した。 培養上清を50％飽和硫安で塩析して採取したγ
−グロブリン分画を凍結乾燥し、目的の
MoAb4C7を得た。MoAb産生ハイブリドーマ及
び乾燥したMoAbは共に−80℃で凍結保存した。 実験例 上記実施例で得られたモノクローナル抗体の各
種細胞に対する反応性を検討した。 (1) 各種ヒト卵巣癌等に対する反応性 実施例で得たMoAb4C7を200μｇ／mlの濃度
でPBSに溶かし、卵巣癌を主とした卵巣腫瘍
等に対する反応性を間接螢光抗体法により調べ
たところ、表−１に示すような結果であつた。 すなわち、本発明のモノクローナル抗体
MoAb4C7はムチン性嚢胞腺癌の13例中10例
（76.9％）、類内膜癌７例中６例（85.7％）、腹
水中の癌細胞を含めた類中腎癌の11例中９例
81.8％）に陽性反応を示した。一方漿液性嚢胞
腺癌12例、ムチン性嚢胞腺腫６例全てに反応を
示さなかつた。 前述した４種の上皮性卵巣癌以外の分類不能
癌、類皮嚢胞癌、胎児性癌、Krukenberg腫
瘍、充実性奇形腫、身分化胚細胞腫、顆粒膜細
胞腫等に対してはMoAb4C7は全く反応を示さ
なかつた。
及びそれを産生するハイブリドーマに関する。 更に詳しくは、本発明は、人の卵巣癌細胞で免
疫された抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合によ
つて形成されたハイブリドーマによつて産生さ
れ、次の性質を有するIgG1のクラスに属する単
一クローン抗体に関する： (1) ムチン性嚢胞腺癌細胞、類内膜癌細胞、類中
腎癌細胞と反応する； (2) 漿液性嚢胞腺癌細胞、ムチン性嚢胞腺腫細胞
とは反応しない； (3) 卵巣腫瘍以外の子宮体部癌、肺癌、乳癌、胃
癌、膵癌、腎細胞癌、大腸癌、肝癌、精上皮腫
の細胞と反応しない； (4) 卵巣、脳、心臓、肺臓、肝臓、胃、腸、膵
臓、腎臓、子宮、卵管、睾丸の正常組織細胞と
反応しない； (5) トリプシンで分解しない。 更に本発明は、人の卵巣癌細胞で免疫された抗
体産生細胞と骨髄腫細胞との融合によつて形成さ
れ、次の性質を有するIgG1のクラスに属する単
一クローン抗体を産生するハイブリドーマに関す
る： (1) ムチン性嚢胞腺癌細胞、類内膜癌細胞、類中
腎癌細胞と反応する； (2) 漿液性嚢胞腺癌細胞、ムチン性嚢胞腺腫細胞
とは反応しない； (3) 卵巣腫瘍以外の子宮体部癌、肺癌、乳癌、胃
癌、膵癌、腎細胞癌、大腸癌、肝癌、精上皮腫
の細胞と反応しない； (4) 卵巣、脳、心臓、肺臓、肝臓、胃、腸、膵
臓、腎臓、子宮、卵管、睾丸の正常組織細胞と
反応しない； (5) トリプシンで分解しない。 近年、高い特異性を有する単一クローン抗体
を、診断及び治療手段として利用しようとする試
みが精力的になされていることは周知の通りであ
る。本発明者等も、人の卵巣癌に対して特異性の
高い単一クローン抗体の確立、この単一クローン
抗体を産生するバイブリドーマの確立のために鋭
意研究を行なつた結果、本発明を完成した。 卵巣癌は婦人科癌の中にあつて、子宮癌ほど頻
度の高い疾患ではないが、腹腔内腫瘍であるため
早期診断の困難な場合が多く、予後が悪いことが
特徴である。従つて、卵巣癌の治療成績の向上に
は、早期の確実な診断法を確立して適切な治療を
おこなう必要があり、最近、Bast等および
Bhattacharya等は、細胞融合法（Ko¨hler，G.，
とMilstein，C.：Eur.J.Immunol.，６，511−
519，1976）を用いて、卵巣癌関連抗原に対する
単一クローン抗体（以下、MoAbと略す）を作成
し、免疫学的な方法で卵巣癌の診断及び治療を行
なうための基礎的な成績を発表した。まず、
Bast等はヒト漿液生嚢胞腺癌の培養細胞に対す
るMoAbOC−125を作成し、螢光抗体法で分析し
たところ、卵巣癌の大部分と反応を認めたが他臓
器とほとんど反応しなかつたため、卵巣癌関連抗
原に対するMoAbであると報告した（J.Clin.
Invest.，68，1331−1337，1981）。しかし、Bast
はKabawat等、との第２報でOC−125が漿液性
嚢胞腺癌とともに類内膜癌、類中腎癌及び良性の
漿液性嚢胞腺腫などの反応し、ムチン性嚢胞腺癌
と反応しなかつたため、OC−125は漿液性、類内
膜、類中腎の三型の卵巣腫瘍に共通した表面抗原
に対するMoAbであると報告した（Am.J.Clin.
Pathol.，79，98−104，1983）。一方、
Bhattacharya等は漿液性又はムチン性と判別出
来ない低分化の嚢胞腺癌の抽出液を免疫原とし
て、MoAbID3及びID5を作成した。これらは、
Solidphase RIAによる吸収実験で、ムチン性嚢
胞腺癌とのみ反応して他臓器癌と全く反応しなか
つたため、ムチン性嚢胞腺癌関連抗原に対する
MoAbであると報告した（Cancer Research，
42，1650−1654，1982）。しかし、これらの
MoAbは、いずれも正常組織、卵巣癌以外の悪性
腫瘍、卵巣の良性腫瘍にも反応し、類中腎癌には
反応しないという欠点がある。 本発明者らは種々検討の結果、卵巣癌の中でも
最も頻度の高いムチン性嚢胞腺癌に対して特異性
の高い新規なMoAb、及びこのMoAbを産性する
ハイブリドーマを創製することに成功し、本発明
を完成するに至つた。 以下に本発明のハイブリドーマおよびMoAbの
調製法について詳述する。 なお、以下の説明において、抗体産生ハイブリ
ドーマの製造のために免疫原として使用する癌細
胞及び、本発明のMoAbの各細胞との反応性を調
べる為に用いる各種細胞は、全て人の細胞であ
る。 まず、適当な動物を癌細胞で免疫する。免疫原
としては、ムチン性嚢胞腺癌細胞、または類内膜
癌細胞、類中腎癌細胞等の卵巣癌細胞が使用出来
る。これらの癌細胞は、特定の株のものに限定さ
れない。免疫する動物はマウス、ラツト等のネズ
ミ科の動物又はその他の動物であつてよいが、通
常はマウスが好ましい。具体的には、例えば
BALB／Ｃマウスにムチン性嚢胞腺癌の細胞又
はそのホモジネート又はそれから採取された抗原
を数日〜数週間おきに数回接種する。接種量は１
匹あたり１回につき105〜107個の細胞を使うのが
好ましい。 その後マウスより脾臓を摘出し、遠心分離によ
り抗体産生細胞（脾臓細胞）を得る。この細胞は
増殖していく能力を持たないので、自己増殖能力
を有する細胞と融合させる。自己増殖能力を有す
る細胞としては骨髄腫細胞が特に好ましい。骨髄
腫細胞としては、抗体産生細胞を得た動物と同種
の動物のものを用いるのが好ましく、また、抗体
を産生しないものを選択するのが好ましい。 抗体産生細胞と骨髄腫細胞をポリエチレングリ
コール等の細胞融合剤を含む溶液（又は懸濁液）
に加え、細胞融合を行なう。抗体産生細胞と骨髄
腫細胞の使用割合は細胞数比で約５：１とするの
が好ましい。 得られた融合細胞を限界稀釈法により分離し、
分離した融合細胞を増殖させ、各ウエルにおいて
産生される抗体を公知の方法、例えば螢光光体法
又は酵素抗体法等により各種細胞組織等と反応さ
せ、その結果から所望の抗体を産生するハイブリ
ドーマを選択することができる。 選択されたハイブリドーマを培養基中で培養
し、その上清液から常法により所望のMoAbを採
取することができるが、生体内、例えばヌードマ
ウス腹腔内にハイブリドーマを注入し、これをヌ
ードマウス体内で腫瘍として生育させ、そのヌー
ドマウスの血清あるいは腹水からMoAbを回収す
ることも出来る。 この様にして得られたMoAbはIgG1のクラス
に属するものであり、分子量は約15万である。こ
のMoAbはトリプシンで分解されない。本発明者
らはこのMoAbを、MoAb4C7と命名した。 後述する実施例に示したように、本発明の
MoAb4C7はムチン性嚢胞腺癌の76.9％、類内膜
癌の85.7％及び類中腎癌の81.8％に陽性反応を認
めたが、漿液性嚢胞腺癌及びムチン性嚢胞腺癌と
共に、非上皮性卵巣腫瘍、他の臓器癌組織や正常
組織等とは全く反応を認めなかつた。従つて、本
発明のMoAb4C7産生ハイブリドーマは、ムチン
性嚢胞腺癌に存在する抗原に対するMoAb産生ハ
イブリドーマである。 MoAb4C7が類内膜癌と反応したことは、ムチ
ン性嚢胞腺癌に特有の癌関連抗原が類内膜癌にも
存在していることを示しているおり、又、
MoAb4C7が類中腎癌と反応したことは、ムチン
性嚢胞腺癌に特有な癌関連抗原が類中腎癌にも分
布していることを示している。即ち、本発明の
MoAb4C7が認識する抗原は、ムチン性嚢胞腺癌
の癌細胞の表面、腺腔を形成する類内膜癌癌細胞
の表面、類中腎癌の癌細胞の表面に存在する表面
抗原である。 本発明のMoAbは、一種類で数種類の卵巣癌を
証明出来るから、臨床応用を考える場合、極めて
有用な抗体であると言える。即ち、本発明の
MoAb4C7は、ラジオイミユノアツセイ等の方法
で体液中の抗原濃度を測定したり、放射性同位元
素で標識したMoAbの放射活性をイメージングす
るなどして、診断の目的に用いることも出来る。
このMoAb4C7を用いると、ムチン性嚢胞腺癌に
対して、非常に精度の高い診断を行なうことが出
来る。又、本発明のMoAbは対応する抗原を保有
する癌組織を標的としたMoAb単独使用による治
療又は、MoAbを抗癌剤の癌組織への特異的な運
搬手段として用いるMoAb−抗癌剤複合体による
ミサイル療法に用いることも出来る。 なお、本発明における実施例及び実験例で用い
た間接酵素抗対法は、辻の方法（免疫実験操作
法、Ｘ，3161−3164，1981）に準じ以下のように
行なつた。癌細胞を細切した後、0.1％のトリプ
シン（Sigma）と0.1％コラゲナーゼ（Sigma）
を加えた溶液中、37℃で２時間反応させステンレ
スメツシユ（Ｓ−200永田理化）を用いて単細胞
化したものをPBSで洗浄浮遊し、試料細胞とす
る。0.25％グルタールアルデハイド（和光純薬工
業）で前処理したMicro ELISA plate Ｕ 2001
（Dynateck Lab.）の各ウエルに104個の試料細胞
を加え、160Gで10分間遠沈したのち99％エタノ
ールを加えて固定乾燥する。次に、ハイブリドー
マの培養上清50μを加えて室温で30分間反応さ
せ、PBSで洗浄したのち、第二抗体として、
biotinyl antimouse IgG（Vector Lab.12.5μｇ／
ml）50μを摘下し、室温で30分間反応させたの
ちPBSで洗浄する。続いて、horseradish
peroxidase Avidin Ｄ（Vector Lab.2μｇ／ml）
の50μを加え、室温で５分間反応させたのち
PBSで洗浄し、0.05％H2O2を含むオルソフエニ
レンジアミン（0.2）ｇ／ml，0.15Mクエン酸緩
衝液、PH4.0）50μを用いて室温で５分間呈色反
応を行ない、10％H2SO450μを加えて、
Automatic microphotometer（Corona MTP12）
で測定する。 また、間接螢光抗体法は、高田の方法（兵医大
学会誌７，91−99，1982）に準じ、以下のように
行なつた。 マイクロスライドガラス（松波硝子）上に載せ
た培養細胞や組織切片などを99％エタノールで５
分間固定し、PBS（生理的リン酸緩衝液）で５分
間洗浄する。培養癌細胞や組織切片の上にMoAb
（200μ／ml）の50μを摘下し、室温で乾燥しな
いように注意しながら30分間反応させる。PBS
で洗浄後、第二抗体としてのbiotinyl antimouse
IgG（Vector Lab.12.5μｇ／ml）50μと室温で30
分間反応させ、PBSで洗浄する。最後に、FITC
conjugated Avidin Ｄ（Vector Lab.10μｇ／ml）
の50μと室温で５分間反応させ、PBSで十分洗
浄したのち、90％グリセロール10％PBSで封入
し、螢光顕微鏡（Nikon VFD−Ｒ）で観察す
る。 実施例 ムチン性嚢胞腺癌に対するモノクローナル抗体
の作成 免疫原には、ムチン性嚢胞腺癌から確立したヌ
ードマウス移植株から採取したムチン性嚢胞腺癌
細胞（以下HOVA−１という）を細切したのち
１×106個相当量に２倍量のRPMI−1640に加え
てホモジネートし、その総量を用いた。 ６週令の雄BALB／Ｃマウス（チヤールズリ
バー）の腹腔内に前述した量のOVA−１ホモジ
ネートを１週間毎に４回注入し、３月後にマウス
から脾臓を摘出した。 細胞融合の方法は、渡辺等の方法（免疫実験操
作法，2963−2967，1978）及び高田の方法（兵
医大学会誌，７，91−99，1982）に準じて行なつ
た。即ち、摘出した脾臓を細切したのち、ステン
レスメツシユ（S200永田理化）を通し、
1500rpm、200Gで遠沈して得た沈渣に0.7％
NH4Cl10mlを加えて赤血球を除き、RPMI−1640
で２回洗浄して得た生細胞浮遊液3.9×107個／22
mlにマウス骨髄腫細胞株P3×63−Ag8−U1（以下
P3U1という）をRPMI−1640で２回洗浄して得
たP3U1、7.8×106個／2.5ml（５：１）を混合し、
2000rpm、200Gで10分間遠沈した。沈澱細胞を
よくときほぐした後、42.5％（ｗ／ｖ）のポリエ
チレングリコール（PEG1000、Sigma）を含有
した37℃、PH7.4のRPMI−1640、１mlを回転し
ながら１分間かけて徐々に加え、細胞融合を行な
つた。 反応１分後からRPMI−1640を徐々に加え、総
量30mlとした細胞融合を終了した。2000rpm、
200Gで遠沈後、10％牛胎児血清を含んだRPMI
−1640、100mlを加えて細胞浮遊液を作り、
Falcon micro culture plate（3042）の１ウエル
あたり0.2mlずつ分注し、37℃、５％CO2培養器
中で培養した。24時間後から２日毎に上清の半量
をHAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン10％、牛胎児血清）と入れ換えた。
10日目に上清を取り出して後述する酵素抗体法で
抗体産生の有無を確かめ、限界稀釈法により、抗
体産生が陽性を示したウエルの中のハイブリドー
マを１ウエルあたり0.3〜0.6個となるように調節
した。培地は最初HT（ヒポキサンチン、チミジ
ン、10％牛胎児血清）を用い、feeder layerとし
てBALB／Ｃマウスの胸腺細胞５×105／ウエル
を加えた。次に10％牛胎児血清を加えたRPMI−
1640倍地に置換した。 このような限界稀釈法によるクローニングを２
回ずつ行ない、約500種の抗体産生細胞を作成し
た。これらの中から間接螢光抗体法によりムチン
性嚢胞腺癌のヌードマウス継代移植株（OVA−
１）に反応するMoAb4C7産生ハイブリドーマ１
種を得た。 得られたハイブリドーマの大量培養は、１ウエ
ルのハイブリドーマを５ウエル、24ウエル
（Falcon3008）と増量しながら、最終的には
Falcon組織培養フラスコ（3013，3024）を用い
て培養した。 培養上清を50％飽和硫安で塩析して採取したγ
−グロブリン分画を凍結乾燥し、目的の
MoAb4C7を得た。MoAb産生ハイブリドーマ及
び乾燥したMoAbは共に−80℃で凍結保存した。 実験例 上記実施例で得られたモノクローナル抗体の各
種細胞に対する反応性を検討した。 (1) 各種ヒト卵巣癌等に対する反応性 実施例で得たMoAb4C7を200μｇ／mlの濃度
でPBSに溶かし、卵巣癌を主とした卵巣腫瘍
等に対する反応性を間接螢光抗体法により調べ
たところ、表−１に示すような結果であつた。 すなわち、本発明のモノクローナル抗体
MoAb4C7はムチン性嚢胞腺癌の13例中10例
（76.9％）、類内膜癌７例中６例（85.7％）、腹
水中の癌細胞を含めた類中腎癌の11例中９例
81.8％）に陽性反応を示した。一方漿液性嚢胞
腺癌12例、ムチン性嚢胞腺腫６例全てに反応を
示さなかつた。 前述した４種の上皮性卵巣癌以外の分類不能
癌、類皮嚢胞癌、胎児性癌、Krukenberg腫
瘍、充実性奇形腫、身分化胚細胞腫、顆粒膜細
胞腫等に対してはMoAb4C7は全く反応を示さ
なかつた。
【表】
(2) 卵巣癌以外のヒト各種癌に対する反応性
卵巣癌以外の各種癌（子宮体部癌、肺癌、乳
癌、胃癌、膵癌、腎細胞癌、大腸癌、肝癌及び
精上皮腫）に対する反応性は表−２に示す通り
である。MoAb4C7は、上記各種癌に対し全く
反応性を示さなかつた。
癌、胃癌、膵癌、腎細胞癌、大腸癌、肝癌及び
精上皮腫）に対する反応性は表−２に示す通り
である。MoAb4C7は、上記各種癌に対し全く
反応性を示さなかつた。
【表】
(3) 各種ヒト正常組織に対する反応性
成人及び14週令と15週令の胎児正常組織に対
してMoAb4C7による間接螢光抗体法を実施し
たところ、卵巣をはじめ、脳、心臓、肺臓、肝
臓、胃、腸、膵臓、腎臓、子宮、卵管、睾丸等
全ての組織で反応を認めなかつた。結果を表−
３に示す。
してMoAb4C7による間接螢光抗体法を実施し
たところ、卵巣をはじめ、脳、心臓、肺臓、肝
臓、胃、腸、膵臓、腎臓、子宮、卵管、睾丸等
全ての組織で反応を認めなかつた。結果を表−
３に示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 人の卵巣癌細胞で免疫されたマウス脾細胞と
マウス骨髄腫細胞との融合によつて形成されたハ
イブリドーマによつて産生され、次の性質を有す
るIgG1のクラスに属する単一クローン抗体： (1) ムチン性嚢胞腺癌細胞、類内膜癌細胞、類中
腎癌細胞と反応する； (2) 漿液性嚢胞腺癌細胞、ムチン性嚢胞腺腫細胞
とは反応しない； (3) 卵巣腫瘍以外の子宮体部癌、肺癌、乳癌、胃
癌、膵癌、腎細胞癌、大腸癌、肝癌、精上皮腫
の細胞と反応しない； (4) 卵巣、脳、心臓、肺臓、肝臓、胃、腸、膵
臓、腎臓、子宮、卵管、睾丸の正常組織細胞と
反応しない； (5) トリプシンで分解しない。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59087612A JPS60231622A (ja) | 1984-04-28 | 1984-04-28 | ムチン性卵巣癌細胞モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59087612A JPS60231622A (ja) | 1984-04-28 | 1984-04-28 | ムチン性卵巣癌細胞モノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60231622A JPS60231622A (ja) | 1985-11-18 |
| JPH0424996B2 true JPH0424996B2 (ja) | 1992-04-28 |
Family
ID=13919795
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59087612A Granted JPS60231622A (ja) | 1984-04-28 | 1984-04-28 | ムチン性卵巣癌細胞モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60231622A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0377657A1 (en) * | 1987-08-19 | 1990-07-18 | Centocor, Inc. | Human ovarian tumor-associated antigen specific for monoclonal antibody ov-tl3 |
-
1984
- 1984-04-28 JP JP59087612A patent/JPS60231622A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60231622A (ja) | 1985-11-18 |
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