JPH04252181A - メタノールオキシダーゼの製造法 - Google Patents

メタノールオキシダーゼの製造法

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JPH04252181A
JPH04252181A JP3062600A JP6260091A JPH04252181A JP H04252181 A JPH04252181 A JP H04252181A JP 3062600 A JP3062600 A JP 3062600A JP 6260091 A JP6260091 A JP 6260091A JP H04252181 A JPH04252181 A JP H04252181A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明はオキシドリダクターゼの微生物に
よる製造法、漂白剤および／又は洗剤組成物にこれらの
酵素を使用すること、およびオキシドリダクターゼおよ
び任意にはジヒドロキシアセトンシンターゼ酵素、およ
びハンセヌラ（Ｈ．）・ポリモーフアアルコールオキシ
ダーゼおよび／又はジヒドロキシアセトンシンターゼ調
節配列をコードするＤＮＡ配列により形質転換された微
生物に関し、この微生物は本方法に適切に使用できる。
【０００２】電子受容体として酸素を使用するオキシド
リダクターゼは漂白組成物や洗剤組成物に使用するのに
適した酵素であり、洗浄又は漂白工程中、漂白剤例えば
Ｈ２　Ｏ２　をその場で生成するのに使用できる。例え
ば、−ＧＢ−ＰＳ第１，２２５，７１３　号（コルゲー
ト・パルモリブ社）、グルコースとグルコースオキシダ
ーゼの混合物その他の成分を乾燥粉末洗剤組成物に使用
することが記述されている。
【０００３】−ＤＥ−ＰＡ第２，５５７，６２３　号（
ヘンケル＆シイー社）、Ｃ１　〜Ｃ３　アルカノールと
アルカノールオキシダーゼ、又はガラクトースとガラク
トース・オキシダーゼ、又は尿酸とウラトキシダーゼお
よびその他の成分を漂白性を有する乾燥洗剤組成物とし
て使用することが記述されている。
【０００４】−ＧＢ−ＰＡ第２，１０１，１６７　号（
ユニリーバー社）、Ｃ１　〜Ｃ４　アルカノールとＣ１
　〜Ｃ４アルカノールオキシダーゼを液体ブリーチとし
て又は洗剤組成物として使用することが記述されている
。
【０００５】上記アルカノールと酵素は、組成物が水で
希釈するか又は十分の酸素と接触するまで、実質上の反
応は呈し得ない。
【０００６】今まで、天然のオキシダーゼ／酵素は低コ
ストで製造することができないので、洗剤等の大規模の
工業的用途に不向きであった。更に、オキシダーゼ／酵
素は洗剤や漂白剤に使用した場合、非生理的条件下で作
用させねばならない。さらには洗剤組成物に使用するの
に使われてきた天然のオキシダーゼは天然のカタラーゼ
を伴ない、生成したパーオキシサイドを殆ど直ぐに分解
するので、有効な漂白効果は得られない。したがって、
製造条件下で使用しかつ洗剤や漂白製品の使用に一層適
するオキシダーゼ／酵素の需要がある。
【０００７】これらのオキシダーゼを経済的に有利に製
造するために、細胞タンパク質の２０％まで（ファン・
デイケン等、１９７６）のＨ．ポリモーファのアルコー
ルオキシダーゼのように、発酵方法でこれらの酵素の収
率を上げる必要がある。
【０００８】高量の酵素産生新規微生物を見つけること
又は改良された性質を有する新規オキシダーゼ酵素を見
出す方法はあらゆる種類の微生物をチェックして適切な
オキシダーゼを単離すること、ついでそのパーオキサイ
ド生性能をチェックし、製造条件下および洗剤と漂白製
品の使用条件下のその安定性をチェックすることである
。いつの日か適当な酵素が見つかるであろうという望み
があったが、成功は予見できず、多分非常に低いもので
あろう。
【０００９】別の方法は、これらのオキシダーゼを生成
する天然の微生物を古典的遺伝技術により交雑する試行
錯誤方法を適用することであり、一層生産的な微生物又
は一層適切な酵素を見出すことを期待したが、成功はま
た低かった。
【００１０】高収率でおよび／又はカタラーゼの生成を
伴なわずおよび／または貯蔵や使用中例えば漂白組成物
や洗剤組成物にて改良された性質を有するオキシダーゼ
酵素の調製方法の需要が明らかに存在する。試行錯誤に
よる問題は次の方法により克服することができる。すな
わち、適当な条件下で微生物を培養し、望ましくは酵素
を濃縮し、濃縮した酵素を公知方法により集取してオキ
シダーゼ酵素を製造する方法において、組換えＤＮＡ技
術により得そしてオキシダーゼ酵素を産生し得る微生物
を使用することを特徴とする方法である。
【００１１】オキシダーゼの製造法に使用るすのに適す
る微生物は組換えＤＮＡ技術により得ることができるが
、特定の微生物又は微生物群にて構造遺伝子の発現を調
節する１種以上の他のＤＮＡ配列と共に、オキシダーゼ
をコードするＤＮＡ配列（所謂構造遺伝子）により微生
物を形質転換させ、当該配列を含むエピソームベクター
を導入するかあるいは微生物の染色体に組みこみ可能な
ＥＤＡ配列を備えた配列を含むベクターによる。
【００１２】５′−および３′−制御側面領域と共にＨ
．ポリモーファ由来のアルコールオキシダーゼ（ＥＣ　
１．１．３．１３　）をコードする構造遺伝子の決定は
、本発明の範囲を限定するものではないが、本発明の例
として記述する。本発明の精神は、グリセロールオキシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシ
ダーゼ等のその他のオキシダーゼのＤＮＡ配列を単離す
ること、ＤＮＡ配列又はその修飾を微生物のゲノムに又
は微生物を形質転換するのに使うエピソームベクターに
加えることおよびこうして得られた形質転換微生物の培
養、ならびに漂白組成にこの酵素を使用することにも適
用可能である。
【００１３】使用する微生物はバチルス属の如きバクテ
リアやカビも可能であるが、技術的かつ経済的理由から
酵母を使うのが望ましい。特に、カビ又は酵母はアスペ
ルギルス属、カンジダ属、ゲオトリカム属、ハンセヌラ
属、レンジト属、ナドソニア属、ピチア属、ポリア属、
ポリポラス属、サッカロミセス属、スポロボロミセス属
、トルロプシス属、トリコスポロン属およびゼンデラ属
から選択でき、特にアスペルギルス（Ａ）・ジャポニカ
ス、Ａ．ニガー、Ａ．オリゼー、カンジダ・ボイジニ、
Ｈ．ポリモーファ、ピチア・パストリスおよびクロッケ
ラ・ｓｐ．２２０１から選択することができる。後者の
名称は特にＣ．ボイジニの代りに使う。
【００１４】多くのＣ１　質化性酵母は過去１０年間単
離されており、ハンセヌラ・ポリモーファやカンジダ・
ボイジニについては、メタノール代謝が広く研究されて
きた（ビーンハイス等、１９８３）。
【００１５】この代謝の第１工程はメタノールがＭＯＸ
により触媒されて、ホルムアルデヒドとＨ２　Ｏ２　に
酸化される。ホルムアルデヒドは更にホルムアルデヒド
デヒドロゲナーゼおよび蟻酸デヒトロゲナーゼの作用に
より酸化される。Ｈ２　Ｏ２　はカタラーゼにより分解
されて水と酸素になる。
【００１６】別の形では、メタノールは細胞物質に同化
される。ホルムアルデヒドに転換後、この生成物はキシ
ルロースモノリン酸塩経路を介して炭水化物に固定され
る。ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ）はこ
の同化工程上重要な役割をしている。
【００１７】ＭＯＸ、蟻酸デヒドロゲナーゼ、ホルムア
ルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＤＨＡＳおよびカタラーゼ
の出現は例えば　０．５％グルコースで、グルコース抑
制を受ける。しかし、ＭＯＸの合成は、これらの条件下
でまだ十分に抑制される（ロッゲンキャンプ等、１９８
４）、ＤＨＡＳの合成とは反対に、低濃度グルコース（
　０．１％）における生育により活性化される。
【００１８】調節、すなわち当該ポリペプチドの遺伝子
をスイッチオン又はオフにする可能性が望ましい。と言
うのは、必要な時、糖蜜の如き適当な基質を選択して、
バイオマスの生産を可能にし、また必要に応じ、メタノ
ール又はメタノールと他の炭素源混合物を使って、目的
のポリペプチドを生産することができるからである。メ
タノールはやや廉価な基質であるから、ポリペプチトの
生産は非常に経済的に行なうことができる。
【００１９】メタノールで生育させてアルコールオキシ
ダーゼ（ＭＯＸ）をコードする遺伝子の活性化後、大き
なミクロボディすなわちペルオキシソームが生成される
。グルコース生育細胞はほんの僅かのペルオキシソーム
を含むが、内部容量の８０％までの細胞が活性化状態で
ペルオキシソームに置き換る。メタノールがホルムアル
デヒドとＨ２　Ｏ２　に転換しかつＨ２　Ｏ２　の分解
はこれらのペルオキシソームにおいておきることが分っ
たが、更にホルムアルデヒドの酸化又は同化は大概の場
合、細胞質にておきる。このプロセスは有毒生成物の、
いくつかの細胞プロセスの強力な同等活性化の、および
このプロセスに包含される少なくとも２つの酵素の選択
的トランスロケーションの区画分けの完全な例である。
【００２０】メタノール代謝に関与する殆どの酵素は精
製かつ特性化される（サーム，１９７７、ビストリック
等、１９８１）。特に、メタノールオキシダーゼ（ＥＣ
　１．１．３．１３　）は詳細に説明された。それは約
７４ＫｄのＭｒ値を有する同一モノマーから成るオクタ
マーでありかつ置換基としてＦＡＤをを含む。今まで、
分裂可能なトランスロケーションのシグナル配列は検出
されていない。生体内および試験管内合成物による電気
泳動研究（ロアおよびブローベル、１９８３）又はミク
ロソーム膜の存在下の試験管内合成（ロッゲンキャンプ
等、１９８４）から結論された。
【００２１】活性化条件下で、２０％までの細胞タンパ
ク質がＭＯＸから成る。
【００２２】材料および方法 ａ）微生物および培養条件 ハンセヌラ・ポリモーファＣＢＳ　４７３２　はジェイ
・ピー・ディケン博士（デルフト工業大学、オランダ）
から入手した。細胞は３００ｍｌの最小培地を含有する
１ｌ　エルレンマイヤーフラスコにて３７℃生育させ（
ビーンハイス等、１９７８）、指示通り　０．５％（ｖ
／ｖ）メタノール又は　０．５％（ｖ／ｖ）エタノール
を補充した。ファージラムダＬ４７．１およびＰ２溶原
性大腸菌Ｋ１２株Ｑ　３６４はピー・ファン・デル・エ
ルセン博士（アムステルダム大学、オランダ）から入手
し、上述通り増殖させた（ローネンおよびブラマー、１
９８０）。
【００２３】大腸菌Ｋ１２株ＢＨＢ２６００、ＢＨＢ２
６８８およびＢＨＢ２６９０（ホーン、１９７９）はエ
ム・ファン・モンタグ博士（ゲント大学、ベルギー）か
ら入手したが、大腸菌Ｋ１２株ＪＭ　１０１、７１１８
およびＭ１３誘導Ｍ１３ｍｐ８，９，１８および１９は
ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社（ゲイサーズバ
ーグ、メリーランド、米国）から入手した。
【００２４】ｂ）酵　　素 使用したすべての酵素はアマーシャム・インタナショナ
ル社、英国から入手したが、α−ヘリカーゼはファーム
・インダストリイ、フランスから入手した。酵素培養は
製造者の指示通りに行なった。ＡＴＰ：ＲＮＡアデニル
トランスフェラーゼはイーデセン等（１９８２）の記述
通りに精製した。
【００２５】ｃ）他の材料 ［３５Ｓ］メチオニン、［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ、［α
−３２Ｐ］ｄＮＴＰ′ｓ、［α−３２Ｐ］ＡＴＰおよび
［γ−３２Ｐ］ＡＴＰはアマーシャム・インタナショナ
ル社、英国から入手した。
【００２６】ニトロベンジルオキシ−メチル（ＮＢＭ）
紙はシュライアーおよびシュールから入手し、製造者の
指示通りジアゾ型（ＤＢＭ）に転換した。
【００２７】ニトロセルロースフィルター（ＨＡＴＦ型
）はミルポアから入手した。
【００２８】ＲＮＡ単離、分画化および分析Ｈ．ポリモ
ーファはメタノール又はエノタールの存在下中間対数段
階まで生育させた。この細胞は、１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ　ｐＨ８、５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　、１％ＮａＣｌ、
６％パラ−アミノサリチル酸、１％ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）および５％フェノール含有バッファーに
て、１６，０００　ｐｓｉのフレンチプレスで繰り返し
加圧して破砕した。ポリアデニール化ＲＮＡの精製は上
述通り（イーデン等、１９８２）、続いて行なった。１
ｇ細胞から４ｍｇの全ＲＮＡと０．１　ｍｇポリアデニ
ール化ＲＮＡを得た。全ＲＮＡはポリアデニール化ＲＮ
Ａの４μｇ試料はＡＴＰ：ＲＮＡアデニルトランスフェ
ラーゼおよび［α−３２Ｐ］ＡＴＰでその３′−末端を
ラベルし、ついで７Ｍ尿素含有　２．５％ポリアクリル
アミドゲルで分別した（イーデン等、１９８２）。特異
的ｍＲＮＡフラクションの分取単離については、４０μ
ｇポリアデニール化ＲＮＡをラベルしたポリアデニール
化ＲＮＡ４μｇと混合し、変性ポリアクリルアミドゲル
で分別した。放射性２．４Ｋｂ　ＲＮＡクラスをゲルス
ライスから溶離し、ついで２０℃ＳＷ６０ローターを使
ってベックマン遠心分離機にて２４，０００　ｒｅｖ／
分で１５時間、１００ｍＭ　　ＮａＣｌ、１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ　ｐＨ　７．５、１ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび
　０．１％ＳＤＳにて５〜３０％グリセロール勾配で遠
心分離して不純物を除いた。放射性フラクションを集め
、エタノールで沈澱させた。ポリアデニール化ＲＮＡは
プリカーサーとして［３５Ｓ］メチオニンを使い、ペル
ハムとジャクソン（１９７６）により、ウサギ網赤血球
リセート中試験管内にて翻訳させた。翻訳産物はバレリ
オ等（１９８３）に記述されたＭＯＸ抗血清で免疫沈降
させた。
【００２９】ｃＤＮＡ合成 ポリアクリルアミドゲルから単離したＲＮＡフラクショ
ン　１／３　は逆転写酵素で放射性ｃＤＮＡを得るため
に使用した（イーデン等、１９８２）。高放射活性（３
，０００　Ｃｉ／ｍＭ以上）の［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰ
および［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを使って、高分子量ｃＤ
ＮＡ　２００００　ｃｐｍをヒト胎盤リボヌクレアーゼ
インヒビターの存在下４２℃で１時間生成させた。
【００３０】ＤＮＡ単離 １０ｇのＨ．ポリモーファ細胞を１Ｍソルビトールで洗
い、１００ｍｌ　１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭ　　
ＥＤＴＡ、および１００ｍＭクエン酸　ｐＨ　５．８に
て再懸濁させ、それに１００μｌ　β−メルカプトエタ
ノールを加えた。細胞を５００ｍｇα−ヘリカーゼで３
０℃／１時間培養してスフェロプラスト化した。スフェ
ロプラストはソルバールＧＳＡローターにて　４，００
０　ｒｅｖ／分で遠心分離して集め、４０ｍｌ２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ　ｐＨ８、５０ｍＭ　　ＥＤＴＡに再懸
濁させ、２．５％ＳＤＳを加えて分解した。不完全に分
解した細胞はソルバールＳＳ３４ローターにて２０，０
００　ｒｅｖ／分で３０分間ペレット化し、そしてＤＮ
Ａは６０Ｔｉローターを使ってベックマン遠心機中３５
，０００　ｒｅｖ／分で４８時間ＣｓＣｌ−臭化エチジ
ウム密度勾配を使って遠心分離して粘稠な上澄液から単
離した。２ｍｇのＤＮＡは平均長さ３０Ｋｂで単離した
。
【００３１】ファージラムダＬ４７．１におけるクロー
ンバンクの調製 １５０μｇ　Ｈ．ポリモーファＤＮＡを部分的にＳａｕ
３ＡＩで消化し、ＳＷ２５ローター中２３，０００　ｒ
ｅｖ／分で２２時間１Ｍ　ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−
ＨＣｌ　ｐＨ８および５ｍＭ　　ＥＤＴＡにて１０〜４
０％ショ糖勾配で沈降させた。勾配物を分画化し、フラ
クション試料はＴＢＥバッファー（８９ｍＭトリス、８
９ｍＭホウ酸、２．５　ｍＭ　　ＥＤＴＡ）中　０．６
％アガロースゲルで分別した。
【００３２】５〜２０ＫｂのＤＮＡを含むフラクション
を集め、ＤＮＡはエタノールで沈澱させた。ファージラ
ムダＬ４７．１を生育し、そのＤＮＡはリーデボアー等
（１９８４）の記述により単離した。そのＤＮＡをＢａ
ｍＨＩで消化し、アームはマニアティス等（１９８２）
の記述により酢酸カリウム勾配で遠心分離して単離した
。こうして得られた２μｇファージラムダＤＮＡアーム
と　０．５μｇＳａｕ３ＡＩ消化Ｈ．ポリモーファＤＮ
Ａを連結し、ホーン（１９７９）のプロトコールを使っ
て試験管内でパッケージした。ファージは１４ｃｍペト
リ皿当り２０，０００　ｐｆｕのプラーク密度まで大腸
菌株Ｑ３６４にブレートした。プラークはニトロセルロ
ースフィルター（ベントンとデイビス、１９７７）にブ
ロットし、そのブロットは上記のように単離した放射性
ｃＤＮＡプローブとハイブリッドさせた。ハイブリッド
条件はリーデボアー等（１９８４）に記載と同じであり
、ハイブリッドするプラークはオートラジオグラフィに
より検出した。
【００３３】アルコールオキシダーゼ（ＭＯＸ）の単離
および部分的アミノ酸配列の分析 メタノールで生育させたＨ．ポリモーファ細胞を超音波
により分解し、細胞片は遠心分離により除いた。ＭＯＸ
含有タンパク質フラクションは（ＮＨ４　）２　ＳＯ４
　沈澱により単離した（４０〜６０％飽和）。沈澱物を
透析後、ＭＯＸはイオン交換クロマトグラフィ（ＤＥＡ
Ｅ−セファロース）およびゲル濾過（セファクリンＳ−
４００）によりカタラーゼその他のタンパク質から分別
した。ＭＯＸに対する抗体は完全および不完全フロイン
ドアジュバント（デイフュ、米国）を使う常法によりウ
サギにて生成させた。過蟻酸で処理したアルコールオキ
シダーゼの配列分析はベックマンのシークエネーターで
行なった。残渣の同定はＨＰＬＣで行なった。アミノ酸
組成は標準法を使い、ニンヒドリンで染色させて、クロ
マスペックアナライザー（ランク、ヒルガー、英国）で
測定した。カルボキシ末端アミノ酸はアンブラー（１９
７２）の記述により測定した。
【００３４】デオキシオリゴヌクレオチドの化学合成デ
オキシオリゴヌクレオチドはホスファイト技術（マッチ
ュシとカルーサズ、１９８１）を使って、バイオサーチ
ＳＡＭＩジーンマシーンで合成した。それをＴＢＥ中１
６％又は２０％ポリアクリルアミドゲルで精製した。
【００３５】デオキシオリゴヌクレオチドプローブとの
ハイブリッド デオキシオリゴヌクレオチドをＴ４　−ポリヌクレオチ
ドキナーゼおよび［γ−３２Ｐ］ＡＴＰでラベルした。 得られたＭＯＸクローンのＤＮＡは各種制限酵素で消化
し、１％アガロースゲルで分別し、ＤＢＭ紙にブロット
した。ハイブリッド化はウォーレース等（１９８１）の
記述により行なった。
【００３６】ＤＮＡ配列分析 完全ＭＯＸ遺伝子を含むクローン４（例１参照）から、
いくつかのサブクローンを標準技術により、ファージＭ
１３ｍｐ−８、−９又はＭ１３ｍｐ−１８、−１９誘導
物にて作った。２つのオリエンテーションでクローンし
た小さいサブクローン（０．５　Ｋｂ未満）は両側から
直接シークエンスした。２つのオリエンテーションでク
ローンした大きなサブクローンから、エクソヌクレアー
ゼＢａｌ　３１　消化法（第１図参照）により配列デー
タを得た。両クローン化オリエンテーションの各々につ
いて、ＲＦＭ１３ＤＮＡは、望ましくはインサートの中
心でのみ分解する制限酵素で消化する。続いて、クロー
ンの両オリエンテーションをこのユニークな部位で切断
し、各種時間間隔でエクソヌクレアーゼＢａｌ　３１　
で消化した。約１００〜１５０ヌクレオチドが各間隔で
除かれるように、培養時間と条件を選んだ。ついで、配
列反応がＭ１３誘導物にてプライムする位置近くにある
制限部位を認識する制限酵素で各フラクションを消化し
た。Ｔ４　−ポリメラーゼおよびすべてのｄＮＴＰ′ｓ
で培養して平滑末端とし、全ミックスを希釈条件下で連
結して、内部ＲＦ分子を形成させる。全連結ミックスは
大腸菌株ＪＭ　１０１〜７１１８に形質転換させるのに
使った各時間間隔から、いくつかのプラークを拾い出し
、サンガーのシーケンスプロトコール（ビギン等、１９
８３）の最近記述された変法を使って配列決定した。
【００３７】栄養要求変異体の単離 ＬＥＵ−１（ＣＢＳ７１７１）はβ−イソプロピルマレ
ートデヒドロゲナーゼ活性を欠くＨ．ポリモーファ株Ｎ
ＣＹＣ　４９５の栄養要求体である。この変異株の単離
はグリースン等（１９８４）により記載された。
【００３８】ＬＲ９（ＣＢＳ７１７２）はオロチジン５
′−デカルボキシラーゼ活性を欠く、Ｈ．ポリモーファ
ＡＴＣＣ　３４４３８の栄養要求株である。
【００３９】単離のために、この酵母の最適生育温度で
ある３７℃の代りに、３０℃で全操作を行なった。酵母
細胞は３％エチルメタンスルホネートで２時間突然変異
させた（フィンク、１９７０）。反応は６％チオ硫酸ナ
トリウム（最終濃度）で止め、溶液を更に１０分培養し
た。 突然変異細胞を一度Ｈ２　Ｏで洗い、分離のためにウラ
シルを補給したＹＥＰＤ又はＹＮＢで２日培養し、ウラ
シル−栄養要求体を増やし、ついで窒素源のないＭＭで
１５時間培養を行なった。最後に、１０μｇ抗生物質／
ｍｌの濃度を含むＭＭにて１２時間ナイスタチン強化を
行なった。処理した細胞は　２００μｇウラシル／ｍｌ
および０．８ｍｇ　５−フロロオロチン酸を含むＹＮＢ
プレートで培養した（ボーク等、１９８４）。通常１０
６　細胞を単一プレートで培養した。培養３日後に耐性
コロニーを取り出し、レプリカをＹＮＢプレートで２度
培養して栄養要求株を樹立させた。栄養要求変異株から
、ｕｒａ−　細胞を単離した。別法として、　１．５×
１０６　酵母細胞は、　２００μｇウラシルと０．８ｍ
ｇ　５−フロロオロチン酸を補給したＹＮＢ液体培地１
ｍｌにて培養させた。２日間の培養後、処理細胞をウラ
シル含有ＹＮＢで平板培養し、レプリカは２度ＹＮＢで
平板培養し、上記の通り分析した。このような耐性変異
株はサッカロミセス・セレビシエのＵＲＡ３又はＵＲＡ
５座に影響を与えたウラシル要求株であることが分った
（エフ・ラクルート、私信）。試験したＨ．ポリモーフ
ァの約６００耐性コロニーの内、５２がウラシル表現型
を示した。Ｓ．セレビシエのＵＲＡ３とＵＲＡ５変異は
オロチジン５′−デカルボキシラーゼとオロチジン５′
−リン酸塩ピロホスホリラーゼをそれぞれ欠く（ジョー
ンズとフィンク、１９８２）から、Ｈ．ポリモーファの
生成ウラシル栄養要求株は両方の酵素活性について調べ
た（リーベルマン等、１９５５）。２つの酵素のいずれ
かに影響を与えた変異株が見つかった（表Ｉ）、それら
をそれぞれＯｄｃｌとＯｐｐｌ変異株と名付けた。Ｏｄ
ｃｌ変異株は低復帰頻度を示し（表　ＩＩ　）、相補に
より形質転換の目的のために適している。
【００４０】Ｈ．ポリモーファ由来の自律性複製配列（
ＨＡＲＳ）の単離 Ｈ．ポリモーファ由来の染色体ＤＮＡをＳａｌ　Ｉ又は
Ｂａｍ　ＨＩで一部消化し、組みこみプラスミドＹＩｐ
５の単一Ｓａｌ　ＩとＢａｍ　ＨＩ部位にそれぞれ連結
させた。 大腸菌　４９０をアンピシリン耐性に形質転換するため
に、この連結混合物を使用した。ＹＩｐ５は選択マーカ
ーとしてＵＲＡ３遺伝子を含む組みこみプラスミドであ
る（スチンチコーム等、１９８０）。
【００４１】Ｈ．ポリモーファＳａｌ　Ｉクローンのプ
ラスミドプールはＨ．ポリモーファ変異株ＬＲ９を形質
転換するのに使用した。全体に２７の形質転換体を得、
β−ラクタマーゼ試験で陽性であった。これらのすべて
から、大腸菌　４９０を酵母ミニリセートと共に形質転
換後プラスミドを回収した。プラスミドの制限分析によ
れば、殆どのインサートは同じパターンを示した。それ
ぞれ　０．４と０．６　Ｋｂのインサートを含む、２つ
の異なったプラスミド、ｐＨＡＲＳ　１とｐＨＡＲＳ　
２は更に研究用に使用した（第２図）。ポリエチレング
リコールで処理した完全の細胞の形質転換操作を使って
、ＤＮＡ１μｇ当り約　５００〜１，５００　の形質転
換体の頻度で、両プラスミドはＨ．ポリモーファ変異株
ＬＲ９を形質転換させる。大腸菌プラスミド処方物から
回収したｐＨＡＲＳ　１とｐＨＡＲＳ　２で再形質転換
後Ｈ．ポリモーファ形質転換体のサザーン分析は予期し
たプラスミドバンドを示し、ウラシルプロトロフィの原
因として、ＵＲＡ３遺伝子の組みこみを排除する。 したがって、ＡＲＳ１様ＨＡＲＳ配列（スチンチコーム
等、１９８２）はＨ．ポリモーファの自律的複製を行な
うと結論する。ＨＡＲＳ１もＨＡＲＳ２もＳ．セレビシ
エでは自律的複製はできなかった。ＨＡＲＳ１は第３図
に示すように、完全に配列を決定された。
【００４２】Ｈ．ポリモーファにおけるプラスミドコピ
ー数の評価 ＡＲＳ配列又はＨＡＲＳ配列によりＨ．ポリモーファに
自律的複製を与えるプラスミドのコピー数はサザンブロ
ット分析により評価した（第４図）。比較のために、５
〜１０個のコピー数／細胞（ストルール等、１９７９）
を有するＳ．セレビシエのプラスミドＹＲＰ１７（第４
図、レーン６、７）および細胞当り約３０〜５０のコピ
ーを有するＳ．セレビシエの高コピー数プラスミドｐＲ
Ｂ５８（第４図、レーン４、５）を使った。ＹＲＰ１７
はＵＲＡ３−含有酵母プラスミドであり、ＡＲＳ配列は
（スチンチコーム等、１９８２）を有するが、ｐＲＢ５
８はＵＲＡ３遺伝子を含有する２μｍ誘導体である（カ
ールソンとボトスタイン、１９８２）。ｐＢＲ３２２の
２つの組みこみコピーを有するクルイベロミセス・ラク
チス形質転換体はコントロールとして使用した（第４図
、レーン２、３）。オートラジオグラムの染色度が示す
ところでは、Ｈ．ポリモーファのプラスミドＹＲＰ１７
はＳ．セレビシエのコピー数と実質的に同じであるが、
プラスミドｐＨＡＲ−１とｐＨＡＲＳ−２はＳ．セレビ
シエのｐＢＲ５８のように細胞当り約３０〜４０のコピ
ー範囲であるコピー数を示す。このことはＨＡＲＳ配列
の自律的に複製する性質を再度証明するものである。
【００４３】形質転換操作 いくつかのプロトコールを使用した。
【００４４】ａ）　　Ｈ．ポリモーファ株ＬＥＵ−１は
ベッグズ（１９７８）の方法を使って形質転換させた。 菌株は激しく空気をおくり乍ら３７℃で、　０．５のＯ
Ｄ６００　まで５００ｍｌ　　ＹＥＰＤ液体培地に生育
させた。細胞を採り、２０ｍｌ蒸留水で洗い、２０ｍｌ
の１．２　Ｍソルビトール、２５ｍＭ　　ＥＤＴＡ　ｐ
Ｈ　８．０、１５０　ｍＭ　　ＤＴＴに再懸濁させ、室
温で１５分培養した。細胞を遠心分離により集め、２０
ｍｌ　１．２Ｍソルビトール、０．０１Ｍ　　ＥＤＴＡ
、　０．１Ｍクエン酸ナトリウム　ｐＨ　５．８および
２％ｖ／ｖ　β−グルクロンダーゼ溶液（シグマ１５０
００００　ユニット／ｍｌ）にとり、３７℃で　１０５
分培養した。１時間後、β−グルクロニダーゼの最終濃
度を４％ｖ／ｖ　にした。形質転換のために、プロトプ
ラスト３ｍｌを７ｍｌの氷冷　１．２Ｍソルビトール、
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７に添加した。プロトプ
ラストを２０００　ｒｐｍで５分間遠心分離により採取
し、氷冷ソルビトールバッファーで３度洗った。洗った
細胞を氷上　０．２ｍｌ　１．２Ｍソルビトール、１０
ｍＭ　　ＣａＣｌ２、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７
に再懸濁させた。２μｇのＹＥＰ１３　　ＤＮＡ−Ｓ．
セレビシエのＬＥＵ２遺伝子および２ミクロン−Ｏｒｉ
（ブローチ等、１９７９）から成る自律的複製Ｓ．セレ
ビシエプラスミド−を細胞１００ｍｌに加え、室温で培
養した。２０％ＰＥＧ４００、１０ｍＭ　　ＣａＣｌ２
　、１０ｍＭトリス−塩酸　ｐＨ　７．５の溶液　０．
５ｍｌを加え、全体の混合物を室温で２分間培養した。 細胞を短時間（５秒）遠心分離で高速度にセットしたＭ
ＳＧマイクロフェージに集め、　０．１　ｍｌ　ＹＥＰ
Ｄ　１．２ＭソルビトールｐＨ７．０　に再懸濁させ、
室温で１５分培養した。細胞は、２％ディフコ寒天、２
％グルコース、０．６７％ディフコ酵母窒素塩基および
Ｌ−アデニンヘミサルフェート、メチオニン、ウラシル
、ヒスチジン、トリプトファン、リジンおよび　１．２
Ｍソルビトールの各々を２０ｍｇ／ｌ含有するプレート
に拡げて表面に直接培養した。Ｌｅｖ＋　形質転換体は
３７℃で５日培養した後、５０コロニー／μｇ　　ＤＮ
Ａの頻度で生じたが、ＤＮＡを添加しない場合は形質転
換体は生じない。
【００４５】ｂ）　　別法として、Ｈ．ポリモーファＬ
ＥＵ−１をダス等（１９８４）の方法を使って、ＹＥＰ
１３で形質転換させた。指数的に生育する細胞を０．４
　のＯＤ６００　まで生育させ、ＴＥバッファー（５０
ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ　８．０、１ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ）にて洗い、２０ｍｌＴＥバッファーに再懸濁させた
。０．５　ｍｌ細胞を３０℃で１時間０．５　ｍｌ　０
．２Ｍ　　ＬｉＣｌで培養した。これらの細胞１００ｍ
ｌに、２０ｍｌＴＥバッファー中４μｇＹＥＰ１３を加
え、その試料を更に３０分間３０℃で培養した。等容量
の７０％ｖ／ｖ　ＰＥＧ　４０００　を加え、混合物３
０℃で１時間培養し、続いて４２℃で５分間培養した。 １ｍｌの水を加えた後、細胞を上記ａ）のように短時間
遠心分離で集め、２度水で洗い、０．１ｍｌ　ＹＥＰＤ
　１．２Ｍソルビトールに再懸濁させ、室温で１５分培
養した。細胞は上記の通り平板培養した。Ｌｅｕ＋　形
質転換体は３０／μｇ　　ＤＮＡの頻度で生じる。
【００４６】ｃ）　　Ｈ．ポリモーファＵＲＡ変異株Ｌ
Ｒ９は選択マーカーとしてＳ．セルビシエのＵＲＡ３遺
伝子およびＳ．セレビシエの自律的複製配列（ＡＲＳ）
を含むブラスミド、ＹＲＰ１７で形質転換させた（スチ
ンチコーム等、１９８２）。ベッグズ（１９７８）のプ
ロトプラスト方法を使って、２〜５形質転換体／μｇ　
　ＤＮＡを得た。イトー等（１９８３）のＬｉＳＯ４を
使って、この数を１５〜２０形質転換体／μｇ　　ＤＮ
Ａまで拡げた。しかし、最良の方法は、ＰＥＧ４０００
で処理した完全細胞を使う、クレベ等（１９８３）の方
法であった。３００までの形質転換体がＤＮＡμｇ当り
得られた。ＬｉＳＯ４　法ならびにクレベ法は３７℃で
行なった。
【００４７】ベクターの自律的複製によるＨ．ポリモー
ファの形質転換には２つの特徴がある：（１）ウラシル
＋　表現型の不安定性。形質転換体をＹＥＰＤで１０世
代生育させた後、９９％以上が選択培地で生育する能力
を失った（表　ＩＩ　）。（２）自律的複製は大腸菌を
酵母ミニリセート形質転換しかつＨ．ポリモーファの再
形質転換により更に確かめられた。続くサザン分析によ
り、期待したプラスミドの存在を示した。
【００４８】Ｈ．ポリモーファＬＲ９はｐＲＢ５８で又
はｐＨＨ８５で形質転換することができず、全２ミクロ
ン環状ＤＮＡ（ホレンバーグ、１９８２）をプラスミド
ＹＩＰ５のアンピシリン遺伝子のＰｓｔＩ部位に挿入し
て構築される。ＨＡＲＳ１又はＨＡＲＳ２のＤＮＡ配列
を含むＹＩＰ５はクレベのプロトコールを使って、ＤＮ
Ａμｇ当り　５００〜１５００の形質転換体の頻度でＨ
．ポリモーファＬＲ９に移した。したがって、形質転換
頻度は、Ｓ．セレビシエのＹＲＰ１７における異種構造
ＡＲＳ１を使う、上記よりも２〜５倍高い。同様に、形
質転換体中のＨＡＲＳプラスミドの安定性はＡＲＳ１プ
ラスミドより僅かに高い（表　ＩＩ　）。
【００４９】Ｓ．セレビシエ由来のＵＲＡ３遺伝子を組
みこむことによるＨ．ポリモーファの形質転換Ｓ．セレ
ビシエのＵＲＡ３遺伝子は、Ｈ．ポリモーファの染色体
ＤＮＡに対しニック翻訳したＹＩｐ５プラスミドＤＮＡ
のサザンハイブリッドにより示されるように、Ｈ．ポリ
モーファのＯＤＣ遺伝子に対し類似性を示さない。した
がって、Ｈ．ポリモーファゲノムのランダム部位へのＵ
ＲＡ３遺伝子の低頻度組み込みを予期しなければならな
かった。変異体ＬＲ９を組みこみベクターＹＩｐ５で形
質転換すると、ポリエチレングリコール法を使うＹＮＢ
プレートでは３０〜４０コロニー／μｇ　　ＤＮＡとな
ったが、Ｓ．セレビシエ変異体ＹＮＮ２７の形質転換の
ためにＹＩｐ５を使う対照実験では形質転換体は得られ
なかった。３８個の形質転換体の分析では、非選択的培
地で生育させた後、４つの安定な組み込み体を示した。 組みこみについては更にサザン分析（第５図）により証
明した。
【００５０】ＵＲＡ３遺伝子をＨ．ポリモーファの染色
体ＤＮＡに組みこむ第２の操作は、プラスミドｐＨＡＲ
Ｓ　１を有する形質転換体から安定なＵｒａ＋　形質転
換体を増やして行った。形質転換体はｍｌ当り１０９　
細胞密度まで液体ＹＥＰＤ中で生育させた。５×１０６
　細胞を含む試料を使って、新しい培地１００ｍｌに接
種し、そしてｍｌ当り１０９　の細胞密度まで生育させ
た。約１００世代になるまでこの操作を繰り返した。変
異株ＬＲ９の復帰率（ｒｅｎｅｒｓｉｏｎ　ｒａｔｅ）
は２×１０−９でありかつ１０世代当りのプラスミドロ
ス頻度はｐＨＡＲＳ　１形質転換体で９７％であるから
、１００世代後のＵｒａ＋　細胞の主部分は組みこみ体
であるべきである。試験したＵｒａ＋　コロニーは、Ｕ
ＲＡ３遺伝子の組みこみを示す安定なＵｒａ＋　表現型
を維持することを示した。このことは更にサザンブロッ
ト分析により確認された。更に、組みこみ頻度は５×１
０−６であることをこれらのデータは示している。
【００５１】例　　１ ハンセヌラ、ポリモーファ由来のアルコールオキシダー
ゼ（ＭＯＸ）の遺伝子のクローニング ポリアデニール化ＲＮＡの特性 メタノールで生育させた細胞から単離した、全体のＲＮ
Ａとポリアデニール化ＲＮＡはその３′−末端で、ＡＴ
Ｐ：ＲＮＡアデニルトランスフェラーゼでラベルし、変
性ポリアクリルアミドゲルで分別した（第６図）。ｒＲ
ＮＡは別にして、２群のＲＮＡはそれぞれ長さ１Ｋｂと
２．３Ｋｂで、ポリアデニール化ＲＮＡレーンにみられ
る。これらのＲＮＡ群はエタノール生育細胞のポリアデ
ニール化ＲＮＡにみられない（結果は示してない）から
、メタノールで生育させて活性化した遺伝子の転写であ
ることは明らかである。２．３　Ｋｂ群は非翻訳配列の
長さにより、７００　から８００　のアミノ酸のタンパ
ク質をコードしうる。同様に、１Ｋｂ群は　２５０〜３
００　アミノ酸のタンパク質をコードする。メタノール
で生育させて活性化されかつ　７００〜８００　のアミ
ノ酸鎖を有する酵素は大概ＭＯＸ（カトー等、１９７６
；ロアとブローベル、１９８３）とＤＨＡＳ（ビストリ
ック等、１９８１）である。　２５０〜３００　アミノ
酸範囲における活性化酵素は多分ホルムアルデヒドと蟻
酸デヒドロゲナーセゼ（シュッテ等、１９７６）である
。ポリアデニール化ＲＮＡは網赤血球細胞のない翻訳系
における試験管内翻訳により更に特徴づけられた。２μ
ｌ　のポリアデニール化ＲＮＡ指向タンパク混合物を１
０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで直接分別し、一方
残りの１８μｌはＭＯＸに対する抗血清で免疫沈降させ
た（第７図）。夫々７８Ｋｄ、７４Ｋｄ、５８Ｋｄ、４
２Ｋｄ、３９Ｋｄおよび３６Ｋｄの分子量を有する６つ
の強いバンドが全体のタンパク混合物で優位を占めてい
る。本質的に、同一分子量はメタノール生育Ｍ、ポリモ
ーファ細胞由来の全体の細胞抽出物において、ロアとブ
ローペル（１９８３）により見出された。
【００５２】７４Ｋｄタンパク質は取敢えずＭＯＸのモ
ノマーに、５８Ｋｄタンパク質はカタラーゼのモノマー
に、そして３９Ｋｄと３６Ｋｄのタンパク質は夫々ホル
ムアルデヒドデヒドロゲナーゼと蟻酸デヒドロゲナーゼ
のモノマーに当てることができる。７８Ｋｄポリペプチ
ドは多分ＤＨＡＳであり、４２Ｋｄポリペプチドは未同
定のままである。免疫−沈降後、両方の高分子量タンパ
ク質はＭＯＸ抗血清と反応する。
【００５３】ＭＯＸ遺伝子のクローニングメタノールで
生育させて誘導した２．３Ｋｂ　　ｍＲＮＡ群は明らか
に少なくとも２つのポリペプチドをコードするが、ハイ
ブリッド化によるＨ．ポリモーファクローンバンクをス
クリーニングするのに良好な候補と思えた。部分的にＳ
ａｎ３ＡＩ消化Ｈ．ポリモーファＤＮＡの５〜２０Ｋｂ
フラクションはファージラムダＬ４７．１でクローンし
た。
【００５４】インサートＤＮＡμｇ当り、３００，００
０　プラークが得られたが、背景は１：１０００未満で
あった。約２０，０００のプラークを含む２つのベント
ンデイビスブロットはｍＲＮＡ誘導ｃＤＮＡブローブの
１５，０００　ｃｐｍとハイブリッドした。オートラジ
オグラフ３週間後、約４０〜５０のハイブリッド性プラ
ークが検出できた。すべてのプラークを取り出し、５つ
を低密度で平板培養しそしてｃＤＮＡプローブで第２の
ハイブリッド化により精製した。４つから、単一ハイブ
リッドプラーク（１，３，４，５）ＤＮＡを単離した。 インサートの長さは８〜１３Ｋｂであった。
【００５５】有機合成ＤＮＡプローブを使うハイブリッ
ド選択 精製ＭＯＸのアミノ末端の３０アミノ酸の配列を測定し
た（第８図）。Ｓ．セレビシエの最も豊富なコドンを使
って、１４塩基の配列をこのタンパク質配列の部分から
誘導できた。不明確は唯一である。第４図に示した両プ
ローブを合成した。両プローブには、ＥｃｏＲＩ部位が
存在する。ＤＢＭブロットは制限酵素ＢａｎＨＩ、Ｅｃ
ｏＲＩ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ、Ｍｉｎｄ　ＩＩＩ／Ｓａｌ
ＩおよびＰｓｔＩ／ＳａｌＩで消化したＭＯＸクローン
のＤＮＡから作り、　１．５％アガロースゲルで分別し
た。このブロットを放射線ラベルしたプローブの混合物
とハイブリッドした後、クローン１、４および５はハイ
ブリッドしたが、クローン３はしなかった。第９図のＨ
ｉｎｄ　ＩＩＩ／ＳａｌＩブロットに示す。しかし、こ
のプローブはこれらのクローンのＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ　消化ＤＮＡとハイブリッドしなかった（結果示
さず）。ＥｃｏＲＩ部位はプローブに存在するから、ク
ローン中のハイブリッド性ＤＮＡはこの酵素によっても
切断されよう。結局、ハイブリッド化オーバラップは非
常に小さくなったので、安定なハイブリッドを生成しな
い。 制限地図と配列分析 制限酵素消化物を比較しかつ交差ハイブリッド化実験に
より、クローン１、４および５は同一のＤＮＡストレッ
チをカバーした。
【００５６】このクローン化ＤＮＡのストレッチの性質
を明確に樹立するために、クローン４のインサートを詳
細に分析した。アミノ末端プローブとのハイブリッド化
によれば、完全ＭＯＸ遺伝子（約２Ｋｂ）が存在し、２
Ｋｂ配列上流と３．５Ｋｂ下流を含む（第１０図）こと
を示した。
【００５７】最終のＥｃｏＲＩ断片のＤＮＡ配列分析は
、アミノ酸配列分析により測定した様に、ＭＯＸのアミ
ノ末端に相当するヌクレオチド配列を明らかにした。
【００５８】配列分析について、いくつかの断片を第１
０図に示すように、２つのオリエンテーションで夫々Ｍ
１３ｍｐ８／Ｍ１３ｍｐ９又は１３ｍｐ１８／Ｍ１３ｍ
ｐ１９にてサブクローンした。０．５Ｋｂより小さいク
ローンは両側から直接シーケンスした。より大きいクロ
ーンはクローン化断片の中央に位置するユニークな制限
部位で切断し、「材料と方法」に記述したエクソヌクレ
アーゼＢａｌ３１消化サブクローンを生成した。特異的
オリゴヌクレオチドプライマーを使って、サブクローン
化に使う制限部位周囲の配列および明白な配列測定ので
きない配列は、全配列をカバーする５．５Ｋｂ　　Ｂａ
ｍＨＩ／ＳａｃＩサブクローンを使って、もう一度シー
ケンスした。完全なヌクレオチド配列は第１１Ａと１１
Ｂ図に示す。
【００５９】この配列は６６４アミノ酸のタンパク質を
コードしうる２０４６ヌクレオチドの開放読み取り枠を
含む。開放読み取り枠の最後のコドンはＰｈｅをコード
し、精製ＭＯＸのカルボキシ末端と一致している。この
タンパク質をコードするＤＮＡ配列由来のアミノ酸組成
および精製ＭＯＸのアミノ酸組成は事実上同一である（
表ＩＩＩ　）。唯一の重要な差異はセリンとスレオニン
残基を含むことであり、それらは周知通り測定するのが
難しい。
【００６０】タンパク質の計算分子量は７４，０５０ド
ルトンであり、ＭＯＸの７４Ｋｄの分子量とよく一致す
る（ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲルで測定）。
【００６１】コドンの使用頻度 表ＩＶには、ＭＯＸのコドン使用頻度が示されている。 選択的数のコドンを使う傾向が明らかである。
【００６２】例　　２ プラスミド、ｐＵＲ　３１０５　の構築、それにより抗
生物質Ｇ４１８　に耐性を示すネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼをコードする遺伝子がＭＯＸレギュロン
の管理下で染色体ＭＯＸ遺伝子に組みこむ。
【００６３】プラスミドＹＥＰ１３、ＹＲＰ１７、ｐＨ
ＡＲＳ　１又はｐＨＡＲＳ　２で形質転換したＨ．ポリ
モーファ細胞は不安定でかつ非選択的条件下生育１０世
代後既にその　ｌｅｕ＋　又はｕｒａ＋　表現型を失っ
た。安定な形質転換体を得るためかつＭＯＸプロモータ
ーを試験するために、プラスミドｐＵＲ　３１０５　が
構築するが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺
伝子（ＮＥＯＲ　）はＭＯＸレギュロンの直接管理下に
なる。ＮＥＯＲ　遺伝子の最初のＡＴＧがＭＯＸレギュ
ロンの１．５Ｋｂに結合するように、構築される。この
ような大きなレギュロン断片のクローニングは必要であ
り、レギュロンの−１０００領域を含まない短い断片は
余り有効でないからである。
【００６４】ＮＥＯＲ　遺伝子は、最初のＡＴＧの下流
３５ｂｐからＴＧＡ翻訳停止コドン下流２４０　ｂｐま
でに位置するトランスポソンＴｎ５由来の１．１Ｋｂ　
　Ｘｍａ　ＩＩＩ−ＳａｌＩ断片として単離した。複雑
な連結混合物を避けるために、最初のｐＵＲ３１０１を
構築し（第１２Ａ図）、これはＭＯＸレギュロンのはる
か上流ＳａｌＩ−ＸｍａＩＩＩ　（−１５１０から−１
１２８）断片とＭ１３ｍｐ９にサブクローンしたＮＥＯ
Ｒ　遺伝子の融合である。他のプラスミドｐＵＲ　３１
０２　が構築され、全ＭＯＸレギュロンを殆どカバーす
るＭＯＸ遺伝子の１．５Ｋｂ　　ＳａｌＩ−ＨｇｉＡＩ
断片はＭＯＸ−ＮＥＯＲ　アダプター（第１２Ｂ図）配
列に連結されかつＭ１３−ｍｐ９にてクローンされる。 このプラスミドの１．２Ｋｂ　　ＸｍａＩＩＩ　断片は
ｐＵＲ　３１０１　のＸｍａＩＩＩ　部位にクローンさ
れ、ｐＵＲ　３１０３　となり、これはＭＯＸレギュロ
ンとＮＥＯＲ　遺伝子（第１２ｃ図）の正確な融合であ
る。オリエンテーションはＨｇｉＡＩとＳａｌＩの切断
によりチェックする。ラムダ−ＭＯＸ−４クローンから
、ＳａｌＩ−ＳａｃＩ断片をサブクローンし、構造ＭＯ
Ｘ遺伝子（８９４　位）のＳａｌＩ部位から、構造ＭＯ
Ｘ遺伝子（３２５９位）のはるか下流のＳａｃＩ部位ま
で達する（第１０図）。このＭ１３ｍｐ１９サブクロー
ンはｐＵＲ　３１０４　と呼ぶ。プラスミドｐＵＲ　３
１０５　はｐＵＲ　３１０３　由来の２．７Ｋｂ　　Ｓ
ａｌＩ断片をｐＵＲ　３１０４　のＳａｌＩ部位に直接
連結して得る。オリエンテーションはＳｍａＩとＳａｃ
Ｉの切断により試験した。
【００６５】このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ　とＳａ
ｃＩで切断しかつこの切断プラスミドをＨ．ポリモーフ
ァに形質転換させた後、Ｇ４１８　耐性コロニーが見つ
かり、多くの世代の間非選択的条件下で生育させてその
耐性を失わなかった。
【００６６】例　　３ ｐＵＲ　３００４　の構築、それによりＤ−アミノ酸オ
キシダーゼをコードする遺伝子はＭＯＸ−レギュロンの
管理下Ｈ．ポリモーファの染色体に移動する。
【００６７】Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＡＡＯ）はメ
チル栄養性（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｅｐｈｉｃ）Ｈ．ポリ
モーファが非常に適している製造のためのオキシドリダ
クターゼの一例である。ＭＯＸ様オキシダーゼである酵
素は、メタノール又はメタノールと炭素源としての発酵
糖および単一窒素源としてのＤ−アミノ酸の混合物に生
育中誘導される酵母のペルオキシソームに転座される。 これらの条件下で、細胞は生成するＨ２　Ｏ２　から保
護される。別法として、ＡＡＯがＭＯＸ−又はＤＡＳ−
レギュロンの管理下にある場合、Ｈ２　Ｏ２　を生成す
ることなく、ＡＡＯを製造することができる。ＡＡＯの
製造は培地中メタノールの存在により誘導される。
【００６８】ＡＡＯ酵素のアミノ酸配列は公表され（ロ
ンチ等、１９８１）、完全な遺伝子はホスファイト技術
（マチュチとカルサーズ、１９８１）を使って合成され
る。この遺伝子は、ＭＯＸ遺伝子の配列から誘導される
ように、Ｈ．ポリモーファの最適コドンが使われる様に
構築される。更に、いくつかのユニークな制限部位はア
ミノ酸配列を変えずに導入され、合成中のサブクローン
化を容易にする。ＤＮＡ配列に第１３図に示す。この遺
伝子は長さ約５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドで
合成される。オリゴヌクレオチドは１６％ポリアクリル
アミドゲルで精製する。サブクローンを生成するオリゴ
ヌクレオチドはリガーゼバッファー（マニアティス等、
１９８２）に一緒に添加され、湯煎中７０℃に加熱する
。湯煎をゆっくり１６℃に冷却し、Ｔ４　−リガーゼを
加える。連結２時間後、ＤＮＡを１．５％アガロースゲ
ルで分別し、予期された長さを有する断片をゲルから単
離する。断片の末端に位置する各制限部位で切断したＭ
１３ｍｐ１８ベクターにてサブクローンする。この遺伝
子を夫々ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ　（３９〜３４６位
）、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｍａＩ（３４６〜５８９位）、
ＸｍａＩ−ＫｐｎＩ（５８９〜７２１位）およびＫｐｎ
Ｉ−ＳａｌＩ（７２１〜１０４４位）の４サブクローン
にてこのようにサブクローンする。ＳａｌＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ　およびＨｉｎｄＩＩＩ　−ＸｍａＩサブクロー
ン、およびＸｍａＩ−ＫｐｎＩとＫｐｎＩ−ＳａｌＩサ
ブクローンをＳａｌＩ−ＸｍａＩ切断Ｍ１３ｍｐ１８に
おける２つのＳａｌＩ−ＸｍａＩサブクローンと連結す
る。これらの２つのサブクローンをＳａｌＩ切断Ｍ１３
ｍｐ８に連結して、ｐＵＲ　３００１　（第１３、１４
Ａ図）を得る。全配列は改良サンガージデオキシシーケ
ンス技術（ビギン等、１９８３）を使って、ヌクレオチ
ド配列の測定により確認する。
【００６９】ＡＡＯ遺伝子を含有する組みこみプラスミ
ドの構築は第１４Ａ、Ｂ図に示す。殆ど完全なＡＡＯ遺
伝子は、ユニークなｐＵＲ　３１０４　のＳａｌＩ部位
（第１４Ａ図）において、ｐＵＲ　３００１　のＡＡＯ
遺伝子−含有ＳａｌＩ断片を挿入して、ＭＯＸ末端領域
の上流において、ｐＵＲ　３００２　を得る。オリエン
テーションはＨｉｎｄＩＩＩ　で切断してチェックする
。ＭＯＸプロモーター領域はｐＵＲ　３１０２　由来の
１．４Ｋｂ　　ＳａｌＩ−ＨｇｉＡＩ断片（第１４Ａ図
）として単離する。ついでこの断片を、ＨｇｉＡＩ−Ｓ
ａｌＩ　　ＭＯＸ−ＡＡＯアダプターの存在下部分的Ｓ
ａｌＩ−消化ｐＵＲ　３００２　（第１４Ａ図）に連結
して、ｐＵＲ　３００２のＡＡＯ遺伝子上流におく。生
成したプラスミドｐＵＲ　３００３　ののオリエンテー
ションはＨｉｎｄＩＩＩ　で切断して再度チェックする
。このプラスミドは、ＳａｃＩで切断しかつＨ．ポリモ
ーファ細胞に形質転換した後、ＭＯＸ遺伝子に組みこむ
。形質転換体は、インジューサーとしてメタノールの存
在下窒素源としてｏ−アミノ酸に生育する能力により選
択する。
【００７０】ＡＡＯ遺伝子含有細胞の選択は単純でない
ので、別の選択マーカーを導入する。結局、Ｓ．セレビ
シェＬＥＵ２遺伝子は構造ＡＡＯ遺伝子とＭＯＸターミ
ネーター間に組みこむ。この構築のために、プラスミド
ｐＵＲＳ５２８−０３を使う。このプラスミドはヨーロ
ッパ特許出願第９６９１０　号に記載のｐＵＲＹ５２８
−０３から誘導する。構築は第１４ｃ図に示す。ｐＵＲ
Ｙ５２８−０３の欠損カルボキシ末端ＬＥＵ２遺伝子配
列はｐＹｅｌｅｕ　１０　由来の完全カルボキシ末端Ｌ
ＥＵ２遺伝子配列（ラトキンとカーボン、１９７７）と
置換し、大腸菌ｌａｃ−ｌａｃレギュロンを除いた。続
いて、ＬＥＵ２遺伝子を含有するｐＵＲＳ５２８−０３
のＨｐａＩ−ＳａｌＩ断片を、ＡＡＯ構造遺伝子とＭＯ
Ｘターミネーター間にあるｐＵＲ　３００３　のＳａｌ
Ｉ部位に挿入平滑末端とする。生成プラスミドｐＵＲ　
３００４　のオリエンテーションはＳａｌＩとＳａｃＩ
で切断してチェックすることができる。ＳａｃＩ−切断
プラスミドをＨ．ポリモーファｌｅｕ−　変異体に形質
転換した後、ｐＵＲ　３００４　はＨ．ポリモーファの
染色体ＭＯＸ遺伝子に組みこむ。選択したｌｅｕ＋　形
質転換体はＡＡＯ遺伝子と共に、染色体ＭＯＸ遺伝子に
組みこむ。
【００７１】例　　４ ｐＵＲ　３２０４　、ｐＵＲ　３２０５　、ｐＵＲ　３
２１０　およびｐＵＲ　３２１１　の構築、それにより
小ペプチドホルモン、ヒト成長放出因子を、染色体ＭＯ
Ｘ遺伝子（ｐＵＲ３２０３　、ｐＵＲ　３２０４）に組
みこむか、又はＨＡＲＳ１−含有プラスミド（ｐＵＲ　
３２０５　）に組みこむか、又はＭＯＸ構造遺伝子（ｐ
ＵＲ　３２０９　、ｐＵＲ　３２１０およびｐＵＲ　３
２１１　）に融合して、ＭＯＸ−レギュロンの管理下発
現させる。
【００７２】ヒト成長ホルモン放出因子（ＨＧＲＦ）は
脳下垂体由来のヒト成長ホルモンの分泌を活性化する、
小さい４４アミノ酸ペプチドである。ＨＧＲＦは男子の
垂体小人症の診断や治療に使用可能である。ＨＧＲＦは
多くの種の成長ホルモン刺激を誘発することが分ってい
るから、動物の成長を刺激しかつミルクの生産を増大す
ることにより、ＨＧＲＦは獣医方面にも使用できる（ク
ーデ等、１９８４）。ヒト由来のＨＧＲＦを得るのは難
しいが、遺伝子をクローンしかつ適当な宿主体に移すバ
イオテクノロジィの方法により非常によく製造できた。 Ｈ．ポリモーファによるペプチドホルモンの一般的生産
例として、ＨＧＲＦの遺伝子がＨ．ポリモーファの最適
コドンに合成され、いくつかの方法で発現される。
【００７３】ｐＵＲ　３２０４　とｐＵＲ　３２０５　
の構築のために、タンパク質のカルボキシ末端部分をコ
ードする遺伝子断片は長さ約５０ヌクレオチドのＤＮＡ
オリゴマーで合成され、ＨｉｎｄＩＩＩ　−ＳａｌＩ切
断Ｍ１３ｍｐ１８のＨｉｎｄＩＩＩ　−ＳａｌＩ断片と
してサブクローンし、ｐＵＲ　３２０１　（第１５、１
６Ａ図）を得る。このＨｉｎｄＩＩＩ　−ＳａｌＩ断片
断片はついでＨｉｎｄＩＩＩ　−ＳａｌＩ切断ｐＵＲ３
１０４　（第１６Ａ図）のＭＯＸターミネーター上流に
挿入され、ｐＵＲ３２０２　を得る。ＭＯＸプロモータ
ーは、ＭＯＸ−プロモーターとＨＧＲＦ遺伝子（第１５
、１６Ａ図）間にＨｇｉＡＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ　アダプ
ターを使って、ＨｉｎｄＩＩＩ　切断ｐＵＲ　３２０２
　にｐＵＲ　３１０２　（第１６Ａ図）由来のＳａｌＩ
−ＨｇｉＡＩ　　ＭＯＸ−プロモーター断片を挿入して
、ＨＧＲＦ遺伝子の前に挿入する。生成プラスミドｐＵ
Ｒ　３２０３　のオリエンテーションはＳａｌＩとＨｇ
ｉＡＩで切断してチェックする。ＳａｃＩ切断プスラミ
ドの形質転換後、ｐＵＲ　３２０３　はＨ．ポリモーフ
ァの染色体ＭＯＸ遺伝子に組みこむ。形質転換体は免疫
活性について選択する。ｐＵＲ　３２０３　はＳａｌＩ
で切断して、ＬＥＵ２遺伝子を含むｐＵＲ５２８−０３
（第１６Ｂ図）のＳａｌＩ−ＨｐａＩ断片を挿入する。 この遺伝子のｐＵＲ　３２０４におけるオリエンテーシ
ョンはＨｉｎｄＩＩＩ　とＥｃｏＲＩで切断してチェッ
クする。ＳａｃＩ切断プラスミド（第１６Ｂ図）をｌｅ
ｕ−　Ｈ．ポリモーファ変異体に形質転換した後、ｐＵ
Ｒ　３２０４　は染色体Ｈ．ポリモーファＭＯＸ遺伝子
に組みこむ。ｌｅｕ−　形質転換体について選択する。 Ｈ．ポリモーファにて自律的に複製しかつＨＧＲＦ遺伝
子を含むｐＵＲ　３２０５　と呼ぶプラスミドは、ＭＯ
Ｘ−プロモーターとターミネーター間に挿入したＨＧＲ
Ｆ遺伝子を含有する、ｐＵＲ　３２０３　のＥｃｏＲＩ
、部分的ＨｉｎｄＩＩＩ　切断４Ｋｂ断片を部分的Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ　−ＥｃｏＲＩ切断　ｐＨＡＲＳ１（第２、
１６ｃ図）に挿入して得る。ｐＵＲ　３２０５　の構築
はＨｉｎｄＩＩＩで切断してチェックする。
【００７４】微生物によりＨＧＲＦとして小ペプチドの
生産は酵素分解（板倉等、１９７７）の結果、しばしば
不安定である。タンパク様ＭＯＸに対する融合、および
その後のペルオキシソームへの移行により分解を防ぐこ
とができた。したがって、ＭＯＸ構造遺伝子の１７７５
位（アミノ酸　５９１、第１０図、第１１図）のユニー
クＫｐｎＩ部位にＨＧＲＦ遺伝子を挿入することを決定
した。ＨＧＲＦ遺伝子は長さ５０ヌクレオチドのＤＮＡ
オリゴマーに再度合成されるが、Ｍ１３ｍｐ１９の完全
ＨＧＲＦ構造遺伝子としてクローンされる２つのＫｐｎ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ　サブクローンはＫｐｎＩ（プラス
ミドｐＵＲ　３２０６　、第１７図、第１６Ｄ図）で切
断した。更に、２７位のＨＧＲＦの内部メチオニンをコ
ードするＡＴＧトリプレット（（クーデ等、１９８４）
（ＤＮＡ配列の８２位）はシステインをコードするＴＧ
Ｔトリプレットに転換される。 このことはＨＧＲＦ活性を本質的に変えず、ＣＮＢｒ切
断（板倉等、１９７７）により融合タンパク質由来のＨ
ＧＲＦの切断を容易にする。ファージラムダＭＯＸ−４
（第１０図）から、ＳｐｈＩ（−４９１位）−ＫｐｎＩ
断片を単離し、ＳｐｈＩ−ＫｐｎＩ切断Ｍ１３ｍｐ１９
に挿入され、ｐＵＲ　３２０７を得る。ｐＵＲ　３２０
６　をＫｐｎＩで切断し、ＨＧＲＦ遺伝子をｐＵＲ　３
２０７　のＫｐｎＩ部位に挿入し、ｐＵＲ　３２０８　
を得る。オリエンテーションはｐＵＲ　３２０８の単一
ストランドＤＮＡで直接配列分析によりチェックする。 続いて、ユニークＫｐｎＩ部位からＳａｃＩ部位まで、
ＭＯＸ遺伝子の下流部分はファージラムダＭＯＸ−４由
来の１．５Ｋｂ断片として単離し、ＳａｃＩ−部分的Ｋ
ｐｎＩ切断ｐＵＲ　３２０８　に挿入する。 生成プラスミドｐＵＲ　３２０９　のオリエンテーショ
ンはＫｐｎＩで消化してチェックする。ＳａｃＩ、Ｓｐ
ｈＩ切断プラスミドの形質転換後、ｐＵＲ　３２０９　
はＨ．ポリモーファの染色体ＭＯＸ遺伝子に組みこむ。 免疫活性に関する選択をする。
【００７５】このＭＯＸ−ＨＧＲＦ融合遺伝子は、部分
的ＨｉｎｄＩＩＩ　、部分的ＥｃｏＲＩ切断ｐＵＲ　３
２０９　由来の全融合遺伝子を単離してｐＨＡＲＳＩに
、ＥｃｏＲＩ部分的ＨｉｎｄＩＩＩ　切断ｐＨＡＲＳＩ
に挿入される。 この結果がｐＵＲ　３２１０　が得られ、形質転換後Ｈ
．ポリモーファにて複製する（第１６Ｅ図）。別法とし
て、ｐＵＲＳ５２８−０３のＬＥＵ２−含有ＳａｌＩ−
ＨｐａＩ断片を、ｐＵＲ３２０９の部分的ＫｐｎＩ切断
後、コードしたタンパク質のカルボキシ末端にある、Ｈ
ＧＲＦ遺伝子の平滑末端ＫｐｎＩ部位に挿入する。生成
プラスミドｐＵＲ　３２１１　は、ＳａｃＩ、ＳｐｄＩ
切断プラスミドの形質転換後（第１６Ｆ図）、Ｈ．ポリ
モーファの染色体ＭＯＸ遺伝子に組みこむ。
【００７６】考　　察 開放読み取り枠の長さから、精製ＭＯＸとＤＮＡ由来タ
ンパク質配列のアミノ酸組成の類似性から、および同一
の３０Ｎ−末端アミノ酸から、Ｈ．ポリモーファ由来の
ＭＯＸの完全遺伝子をクローンした。その計算分子量は
ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで測定した分子量とよく
一致する。コード配列とは別に、１２００ｂｐ以上は５
′−と３′−非コード領域からシーケンスし、コード配
列の上流ＳａｌＩ部位からＳａｃＩ部位下流まで達する
。遺伝子は介在配列で妨害されないようである。
【００７７】タンパク質はプリカーサーの形で転写され
ない。分子量の測定により、Ｎ−末端シグナル配列はロ
アとブローベル（１９８３）又はロッゲンカンプ等（１
９８４）の初期研究では検出出来なかった。類似の実験
では、ラット肝臓のパーオキシソマール酵素ウリカーゼ
（ゴールドマンとブローベル、１９７８）およびカタラ
ーゼ（ゴールドマンとブローベル、１９７８；ロビーと
ラザロウ、１９７８）は切断可能なＮ−末端シグナルペ
プチドを含まないことが示唆された。しかし、これらの
著者により論究されている様に、タンパク分解的劣化は
このようなシグナル配列の検出の欠如を説明するもので
ある。
【００７８】本発明者の配列結果がはっきり証明するこ
とは、このタンパク質をパーオキシソームに転座するた
めに、切断可能なＮ−末端シグナル配列は必要でない。 このような転座シグナルは、オボアルブミンの場合のよ
うに（リンガッパ等、１９７９）、成熟タンパク質の内
部配列に十分位置しうる。タンパク質配列の検査はアミ
ノ酸配列　ＧｌｙＸＧｌｙＹＺＧｌｙ　（アミノ酸１３
−１８）を示し、ＦＡＤ−（フラビンアデニンジヌクレ
オチド）−含有酵素（ロンチ等、１９８１）に特長的で
ある。
【００７９】上記のＭＯＸ遺伝子の単離はＭＯＸをコー
ドするＤＮＡ配列およびＭＯＸ酵素のアミノ酸配列の測
定方法を示すものである。
【００８０】同様に、他のオキシダーゼ酵素に属するＤ
ＮＡ配列とアミノ酸配列を単離しかつ測定することがで
きる。ＭＯＸ遺伝子配列知識を利用して、アルコールオ
キシダーゼをコードする遺伝子又は他のオキシダーゼを
もコードする遺伝子の単離を容易にする。酵素の性質と
構造を比較することにより、構造の働きと活性の関係を
多分確立することができる。部位指向突然変異生成とし
て、タンパクコード配列の短縮化又は伸長化、相当する
ポリペプチドを修飾して、改良された性質、例えばアル
カリ安定性の増大を有するオキシダーゼ、又は洗剤製品
と一層相容性の基質を必要とするオキシダーゼを選択す
る方法も適用しうる。Ｈ．ポリモーファ由来のＭＯＸの
構造遺伝子の単離と特性化以外に、Ｈ．ポリモーファ由
来のＤＨＡＳの構造遺伝子の単離と特性化を同じように
行なった。
【００８１】ＤＡＳのＤＮＡ配列は第１８Ａ−１８Ｃ図
に示す。制限地図は第１９図に示す。ＤＡＳのＤＮＡ配
列から計算したアミノ酸組成は精製ＤＨＡＳの加水分解
後に測定したアミノ酸組成と一致している様であった。 ＤＨＡＳ酵素はホルムアルデヒドとキシルロースモノホ
スフェートからのジヒドロキシアセトンの合成を触媒す
る。この反応はメタノール−同化反応（ビーンハイス等
、１９８３）において重要な役割を演じている。
【００８２】前に記述した様に、ＭＯＸとＤＨＡＳの合
成はグルコールリプレッションに供する。　０．５％（
ｖ／ｖ）　メタノールの代りに基質としてグルコール／
メタノール混合物を用いる場合、高レベルのＭＯＸが得
られることが分った。前に条件下では、後者の条件の２
０％と比較して、３０％までの細胞タンパク質はＭＯＸ
から成る。
【００８３】ＭＯＸとＤＡＳのレギュロンには、グルコ
ースによるリプレッション／活性又はメタノールによる
誘導の調節に決定的役割を演じる配列が存在せねばなら
ないと考えられた。したがって、ある相同関係が予期さ
れる。
【００８４】双方共配列　ＣＴＡＴＡＡＡＴＡを有する
、「ＴＡＴＡ−ボックス」の著しい相同性が見出された
。ＭＯＸとＤＡＳレギュロンの上流に近い領域には他の
相同性は見出されなかった。期待に反して、両レギュロ
ンの詳細な研究は、翻訳開始コドンの約１０００　ｂｐ
　上流領域にＭＯＸとＤＡＳのレギュロンの顕著な相同
性を示した。ＭＯＸのレギュロンにおいて６５ｂｐの実
際上完全な連続領域は、いくつかの非相同性領域（第２
０図）により散在されている。ＤＡＳレギュロンの１３
９　ｂｐ　領域に相同している。類似の相同性は両遺伝
子の任意の他の領域にみられない。すなわち、その上流
と下流の配列を含めて長さ４Ｋｂにわたってみられない
。これらの相同配列はグルコースやメタノールにより両
遺伝子の調節の役割を有することが示唆されている。Ｍ
ＯＸの構造遺伝子のＡＴＧの上流の最初の５００　ｂｐ
　をレギュロンとして含有するベクターによる形質転換
の研究は次の点を示した。即ち、この短くなったＭＯＸ
−レギュロンはインディケーター遺伝子β−ラクタマー
ゼの比較的低発現をおこした。インディケーター遺伝子
は容易にスコアできる性質をもった酵母を供する遺伝子
であり、例えば抗生物質Ｇ４１８　に耐性を示すネオマ
イシンホスホトランスフェラーゼの遺伝子又はロイシン
ノ如き栄養要求マーカーである。
【００８５】ＭＯＸとＤＡＳ遺伝子のはるか上流の相同
領域が各種妨害を有するという事実、およびＤＡＳが　
０．１グルコースで抑制されかつＭＯＸが抑制されない
という事実は、これらの相同領域がグルコースによるリ
プレッション／活性化にとっておよび／又はメタノール
の存在下発現の誘導にとって重要であることを示唆して
いる。この仮定は実際正しいことが分った。したがって
、これらの相同領域の有無は特定の用途に重要である。 例えば、若しＭＯＸ遺伝子の−１０５２から−９８７　
領域又はＤＡＳ遺伝子の−１０７６から−９３７　領域
がメタノールによるＭＯＸ又はＤＡＳの誘導に重要であ
るならば、これらの領域の存在はＭＯＸ又はＤＡＳの発
現にとっておよび／又はメタノールによる他の酵素の誘
導にとって重要である。他の例はグルコースによるリプ
レッションを避けるためにその領域を除くことであり、
炭素源としてグルコースを有するＭＯＸおよび／又はＤ
ＡＳ調節領域の影響下ＭＯＸやＤＨＡＳ以外のタンパク
質をコードする遺伝子の発現に必要である。
【００８６】本発明の一特徴は、Ｈ．ポリモーファ由来
のＭＯＸおよびＤＨＡＳをコードする構造遺伝子の単離
および完全な特性化に関する。更に、Ｈ．ポリモーファ
におけるＭＯＸやＤＨＡＳの生合成を調節するＤＮＡ配
列、特にレギュロンやターミネーターの単離と特性化に
関する。
【００８７】更に、Ｈ．ポリモーファＣＢＳ　４７３２
　以外のＨ．ポリモーファ菌株、又はＨ．ポリモーファ
以外のハンセヌラ種、又はハンセヌラ以外の酵母、又は
カビ又はＨ．ポリモーファＣＢＳ　４７３２　由来のＭ
ＯＸ遺伝子の強力なレギュロンおよびターミネーターを
もつ高級ユーカリオートから派生するアルコールオキシ
ダーゼその他のオキシダーゼをコードする遺伝子の組み
合わせに関する。これらの組み合わせはとりわけＨ．ポ
リモーファ又は関連種由来の自律的複製配列又はセント
ロマーを含むミニクロモソーム、および任意には選択マ
ーカーとテロマーを有するベクターにおくことができる
。これらの組み合わせはＨ．ポリモーファの染色体ＤＮ
Ａに組みこむこともできる。
【００８８】更に、強力なレギュロン又はその一部およ
びＭＯＸおよび／又はＤＡＳのターミネーターおよび部
位方向突然変異生成又は他の方法により、アルコールオ
キシダーゼその他のオキシダーゼをコードする変化した
構造遺伝子の組み合わせに関する。これらの変化した構
造遺伝子はミニクロモソーム中エピソームベクターに組
み入れ、又はＨ．ポリモーファ、Ｈ．ウィンゲイ、Ｈ．
アノマラおよびＳ．セレビシエその他の酵母の染色体に
組みこむことができる。
【００８９】これ以外に、本発明はオキシダーゼ以外の
タンパク質をコードする構造遺伝子とＨ．ポリモーファ
のＭＯＸおよび／又はＤＡＳ遺伝子のレギュロンおよび
ターミネーターとの組み合わせに関する。
【００９０】本発明の非常に重要でかつ望ましい態様は
、微生物を適当な条件下で培養して、任意にはポリペプ
チドを濃縮しそして公知方法で集取する。タンパク質又
は酵素の如きポリペプチドの製造法において、組み換え
ＤＮＡ技術により得られかつこのポリペプチドをコード
する構造遺伝子を含む微生物を使い、プロモーターおよ
びＨ．ポリモーファＣＢＳ　４７３２　のＭＯＸ遺伝子
の−１０５２から−９８７　領域、又はＨ．ポリモーフ
ァＣＢＳ　４７３２のＤＡＳ遺伝子の−１０７６から−
９３７　領域、又は他のメチロトローフ型カビ又は酵母
の相当する領域、又はこれらの任意の領域の有効的修飾
を含むレギュロンのコントロール下にこの発現を行なう
、上記方法である。
【００９１】驚くべきことは、第２０図に示されかつこ
こにＭＯＸとＤＡＳ遺伝子の−１０００領域として言及
されている当該領域は構造遺伝子の発現に非常に重要で
あるということが本発明により見出された。この領域を
除いたＭＯＸレギュロンを含む組み換え体で行なった実
験は低レベルの発現を示した。したがって、このような
−１０００領域又はその有効な修飾（即ちこの領域機能
の有為な欠損をおこさない任意の修飾）を含むレギュロ
ンを使うと、比較的高量の目的ポリペプチドを製造する
ことができる。
【００９２】本発明方法の望ましい態様は、当該構造遺
伝子が遺伝子産物を微生物宿主のパーオキシソームすな
わち均等のミクロボディに転座させるのに包含されるア
ミノ酸配列をコードする１種以上のＤＮＡ配列を供した
点で特徴がある。生成したポリペプチドをパーオキシソ
ームすなわち均等のミクロボディに転座させると、その
安定性を改善し、高収率を得る。ある種のポリペプチド
特にオキシダーゼでは、このような転座は微生物宿主の
生存のためには肝要である。即ち、微生物宿主細胞がオ
キシダーゼの基質で生育する場合に生成する過酸化水素
の毒性効果から宿主を守ることである。もしこのオキシ
ダーゼが製造法に使用する微生物の宿主において機能的
であるアドレスシグナルを含まないならば、宿主特異的
アドレスシグナルをコードする配列を有する構造遺伝子
を供すべきであって、例えばこの様な配列を加えるか又
はこれらと遺伝子の最初のアドレス配列と置換する。融
合パートナーが適切なアドレスシグナルを有する融合ポ
リペプチドの生産は別の可能性である。メチロトローフ
型酵母をこの製造に使う場合には、ＤＮＡ配列はパーオ
キシソームまたはミクロボディにＭＯＸ転座させるＭＯ
Ｘ遺伝子又はその一部から成ることが望ましい。
【００９３】最後に、本発明の特徴はＨ．ポリモーファ
由来のＭＯＸを他の酵母において合成することに関する
。
【００９４】アルコールオキシダーゼ産生能を有する若
干の微生物を以下に挙げる。
【００９５】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　アルコールオキ
シダーゼを産生する酵母　　　　　　　　　　　　　　
　　　　（リーおよびコマガタによる分類、１９８０）
　　　　　　グループ１　　　　　　カンジダ・ボイジ
ニ　　　　　　グループ２ａ　　　　ハンセヌラ・フィ
ロデンドラ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　ピチア・リンドネリ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　トルロプシス・ネモデンドラ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　〃　　
　　　　・ピナス　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　〃　　　　　　・ソノレンシス　　
　　　　グループ２ｂ　　　　カンジダ・カリオシリグ
ニコラ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
ハンセヌラ・グルコチマ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　〃　　　　・ヘンリチ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　〃　
　　　・ミヌタ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　〃　　　　・ノンフェルメンタス　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　〃
　　　　・ポリモーファ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　〃　　　　・ウイッケルハミ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ピチア
・ピナス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　〃　　・トレハロフィラ　　　　　　グループ２
ｃ　　　　カンジダ・サクシフィラ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　トルロプシス・ニトラトフ
ィア　　　　　　グループ３　　　　　　ピチア・セロ
ビオサ　　　　　　グループ４　　　　　　ハンセヌラ
・カプスラタ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　ピチア・パストリス　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　トルロプシス・モリシアナ　　　　
　　アルコールオキシダーゼを産生するカビ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　レンジト・トラベ
ア　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ポリ
ポラス・ベルシカラー　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　〃　　　　・オブツサス　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ポリア・コン
チグアアルコールオキシダーゼ以外のオキシダーゼの中
で最も興味のあるものは： −グリセロールオキシダーゼ −アルデヒドオキシダーゼ −アミンオキシダーゼ −アリールアルコールオキシダーゼ −アミノ酸オキシダーゼ −グルコースオキシダーゼ −ガラクトースオキシダーゼ −ソルボースオキシダーゼ −尿酸オキシダーゼ −クロロパーオキシダーゼ；および −キサンチンオキシダーゼ。
【００９６】Ｈ．ポリモーファ由来のＭＯＸおよびＤＡ
Ｓ遺伝子の強力なレギュロンやターミネーターとオキシ
ダーゼの構造遺伝子との組み合わせは、特定の宿主又は
宿主群に構造遺伝子を複製できる、例えばＨ．ポリモー
フヌァ由来の配列又はセントロマー（およびテロマー）
を、Ｈ．ポリモーファおよび関連の酵母又はその他の微
生物に移行しうる適切なベクターに自律的複製する。
【００９７】既述したＨ．ポリモーファ変異株ＬＥＵ−
１とＬＲ９は夫々ＣＢＳに　７１７１　と７１７２の番
号で寄託されている。
【００９８】以下に文献、表、図面を説明する。
【００９９】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　表　　　　　　Ｉ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　￣￣￣￣￣　　
　　　　　　生育にウラシルを必要とするＨ．ポリモー
ファ中のオロチジン　　　　　　　　５′−リン酸塩デ
カルボキシラーゼおよびオロチジン５′−　　　　　　
　　リン酸塩ピロホスホリラーゼの活性　　　　＿＿＿
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＿＿＿＿＿　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　活
　　性　　（％）ａ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　オロチジン５′−　　　　オロチジン５′−　
　　　菌株／表現型　　　　　　転換率　　　　　　リ
ン酸塩デカルボ　　　　リン酸塩ピロホス　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　キシラーゼ　　　　　　　　　　ホリラーゼ　　
　　　　　　　　￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣　　　　野　　生　
　型　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　
　１００　　　　　　　　　　　　　　　　　１００　
　　　ＬＲ　９／ｏｄｃｌ　　　　＜　２×１０９　　
　　　　　　　＜　１　　　　　　　　　　　　　　　
　　１０６　　　　ＭＲ　７／ｏｄｃｌ　　　　　　　
６×１０７　　　　　　　　　＜　１　　　　　　　　
　　　　　　　　　　７１　　　　ＮＭ　８／ｏｄｃｌ
　　　　　　　３×１０８　　　　　　　　　＜　１　
　　　　　　　　　　　　　　　　１０５　　　　ＣＬ
Ｋ　５５／ｏｐｐｌ　　　　　　測定せず　　　　　　
　　　　９０　　　　　　　　　　　　　　　　＜　１
　　　　ＣＬＫ　６８／ｏｐｐｌ　　　　　　　　〃　
　　　　　　　　　　　　　８２　　　　　　　　　　
　　　　　　＜　１　　　　ＹＮＮ　２７／ｕｒａ　３
　　　　　　　〃　　　　　　　　　　　　　　　０　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣後期対数期まで菌株をＹ
ＥＰＤで生育させた。細胞の抽出はブラウンホモジナイ
ザーを使って、ガラスビーズで行なった。タンパク質は
２８０ｎｍで光学密度により評価した。
【０１００】ａ）野生型活性率として表わした。
【０１０１】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　表　　　　ＩＩ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　￣￣￣￣
￣　　　　　　　　　　　　　　　　Ｈ．ポリモーファ
のウラシル要求株の形質転換　　　　　　＿＿＿＿＿＿
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＿　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　形質転換　　　　　　　　株　
　　　　　　　　　プラスミド　　　　　　形質転換　
　　　安定性ｂ　　　　　ＤＮＡの　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　頻　　度ａ　　　　　（％）　　　　　　状態　　
　　　　￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣　　　　　　ＬＲ９　　　　　
　　　ＹＲＰ１７　　　　　２．２×１０２　　　　　
＜１　　　　　　　　　自律的複製　　　　　　ＬＲ９
　　　　　　　　ｐＨＡＲＳ１　　　１．５×１０３　
　　　　　　２　　　　　　　　　自律的複製　　　　
　　ＬＲ９　　　　　　　　ｐＨＡＲＳ２　　　４．６
×１０２　　　　　　　１．５　　　　　　　自律的複
製　　　　　　ＬＲ９　　　　　　　　ＹＩＰ５　　　
　　　　３（３８）ｃ　　　　　１０５　　　　　　　
　　組みこみ　　　　　　ＬＲ９　　　　　　　　ｐＲ
Ｂ５８　　　　　　　　０　　　　　　　　−　　　　
　　　　　　−　　　　　　ＬＲ９　　　　　　　　ｐ
ＨＨ８５　　　　　　　　０　　　　　　　　−　　　
　　　　　　　−　　　　　　ＹＮＮ２７　　　　Ｙ１
Ｐ５　　　　　　　　　　０　　　　　　　　−　　　
　　　　　　　−　　　　　　￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣ａ）ＤＮ
Ａμｇ当りの全数として表わす。ポリエチレングリコー
ルで処理した完全細胞は「材料と方法」で記述したよう
に形質転換用に使用した。 ｂ）１０世代間ＹＥＰＤで生育させた後、残存ウラシル
原栄養体率として表わす。
【０１０２】ｃ）（）内の数字は遊離プラスミドＹＩＰ
５含有ミニコロニーの量を示す。
【０１０３】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　表　　　　ＩＩＩ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　￣￣￣￣￣　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｍ
ＯＸのアミノ酸組成　　　　　　　　　　　　　　アミ
ノ酸　　　　　　ＤＮＡ配列　　　　　　　　加水分解
物　ａ）　　　　　　　　　　　　　　　ＰＨＥ　　　
　　　　　　　３１　　　　　　　　　　　　　　　　
３２　　　　　　　　　　　　　　ＬＥＵ　　　　　　
　　　　４７　　　　　　　　　　　　　　　　４９　
　　　　　　　　　　　　　ＩＬＥ　　　　　　　　　
　３４　　　　　　　　　　　　　　　　３４　　　　
　　　　　　　　　　ＭＥＴ　　　　　　　　　　１２
　　　　　　　　　　　　　　　　１１　　　　　　　
　　　　　　　ＶＡＬ　　　　　　　　　　４２　　　
　　　　　　　　　　　　　４３　　　　　　　　　　
　　　　ＳＥＲ　　　　　　　　　　４３　　　　　　
　　　　　　　　　　３３　ａ）　　　　　　　　　　
　　　　　ＰＲＯ　　　　　　　　　　４３　　　　　
　　　　　　　　　　　４２　　　　　　　　　　　　
　　ＴＨＲ　　　　　　　　　　４４　　　　　　　　
　　　　　　　　３８　　　　　　　　　　　　　　Ａ
ＬＡ　　　　　　　　　　４７　　　　　　　　　　　
　　　　　５０　　　　　　　　　　　　　　ＴＹＲ　
　　　　　　　　　２７　　　　　　　　　　　　　　
　　２７　　　　　　　　　　　　　　ＨＩＳ　　　　
　　　　　　１９　　　　　　　　　　　　　　　　２
１　　　　　　　　　　　　　　ＧＬＮ　　　　　　　
　　　１３　　　　　　　　　　　　　　ＧＬＵ　　　
　　　　　　　３６　　　　　　　　　　　　　　］５
１　　　　　　　　　　　　　　ＡＳＮ　　　　　　　
　　　３２　　　　　　　　　　　　　　ＡＳＰ　　　
　　　　　　　５０　　　　　　　　　　　　　　］８
４　　　　　　　　　　　　　　ＬＹＳ　　　　　　　
　　　３５　　　　　　　　　　　　　　　　３８　　
　　　　　　　　　　　　ＣＹＳ　　　　　　　　　　
１３　　　　　　　　　　　　　　　　１２　　　　　
　　　　　　　　　ＴＲＰ　　　　　　　　　　１０　
　　　　　　　　　　　　　　　−ｂ）　　　　　　　
　　　　　　　ＡＲＧ　　　　　　　　　　３６　　　
　　　　　　　　　　　　　３６　　　　　　　　　　
　　　　ＧＬＹ　　　　　　　　　　５０　　　　　　
　　　　　　　　　　５３　　　　　　　　ａ）加水分
解は２４時間行なった　　　　　　　　ｂ）測定せず 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　表　　　　　　ＩＶ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　￣￣
￣￣￣　　　　　　　　　　Ｓ．セレビシエ、Ｈ．ポリ
モーファおよび大腸菌の望ましい　　　　　　　　　　
コドン使用頻度の比較　　　　　　サッカロミセス　　
　　　　　　　　　　　　ハンセヌラ　　　　　　　　
　　大腸菌　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ＭＯＸ　　　　ＡＬ
Ａ　　ＧＣＵ，ＧＣＣ　　　　　　ＧＣＣ　　　　　　
　　　　　　　　ＧＣＣ使用せず　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　不明　　　　ＳＥ
Ｒ　　ＵＣＵ，ＵＣＣ　　　　　　ＵＣＣ，ＵＣＧ　　
　　　　ＵＣＵ，ＵＣＣ　　　　ＴＨＲ　　ＡＣＵ，Ａ
ＣＣ　　　　　　ＡＣＣ　　　　　　　　　　　　　　
ＡＣＵ，ＡＣＣ　　　　ＶＡＬ　　ＧＵＵ，ＧＵＣ　　
　　　　ＧＵＡ使用せず　　　　　　ＧＵＵ，ＧＵＡ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　不明　　　　ＩＬＥ　　ＡＵＵ，ＡＵＣ　
　　　　　ＡＵＣ，ＡＵＵ　　　　　　ＡＵＣ　　　　
ＡＳＰ　　ＧＡＣ　　　　　　　　　　　　　　ＧＡＣ
　　　　　　　　　　　　　　ＧＡＣ　　　　ＰＨＥ　
　ＵＵＣ　　　　　　　　　　　　　　ＵＵＣ　　　　
　　　　　　　　　　ＵＵＣ　　　　ＴＹＲ　　ＵＡＣ
　　　　　　　　　　　　　　ＵＡＣ　　　　　　　　
　　　　　　ＵＡＣ　　　　ＣＹＳ　　ＵＧＵ　　　　
　　　　　　　　　　不明　　　　　　　　　　　　　
　　　不明　　　　ＡＳＮ　　ＡＡＣ　　　　　　　　
　　　　　　ＡＡＣ　　　　　　　　　　　　　　ＡＡ
Ｃ　　　　ＨＩＳ　　ＣＡＣ　　　　　　　　　　　　
　　ＣＡＣ　　　　　　　　　　　　　　ＣＡＣ　　　
　ＧＬＵ　　ＧＡＡ　　　　　　　　　　　　　　ＧＡ
Ｇ　　　　　　　　　　　　　　ＧＡＡ　　　　ＧＬＹ
　　ＧＧＵ　　　　　　　　　　　　　　ＧＧＣは実際
上　　　　　　ＧＧＵ，ＧＧＣ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　使用せず
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　不明　　　　ＧＬＮ　　ＣＡＡ　　　　
　　　　　　　　　　ＣＡＧ　　　　　　　　　　　　
　　ＣＡＧ　　　　ＬＹＳ　　ＡＡＧ　　　　　　　　
　　　　　　ＡＡＧ　　　　　　　　　　　　　　ＡＡ
Ａ　　　　ＰＲＯ　　ＣＣＡ　　　　　　　　　　　　
　　ＣＣＵ，ＣＣＡ　　　　　　ＣＣＧ　　　　ＬＥＵ
　　ＵＵＧ　　　　　　　　　　　　　　ＣＵＧ，ＣＵ
Ｃ　　　　　　ＣＵＧ　　　　ＡＲＧ　　ＡＧＡ　　　
　　　　　　　　　　　ＡＧＡ　　　　　　　　　　　
　　　ＣＧＵ引用例 １．　　ＧＢ−ＰＳ１，２２５，７１３　号（コルゲー
ト・パルモリブ・カンパニィ、１９７１年３月２４日公
告、優先日１９６８年４月１９日）。
【０１０４】２．　　ＤＥ−ＰＡ２，５５７，６２３　
号（ヘンケル＆シー社、１９７７年６月３０日公開、優
先日１９７５年１２月２０日）。
【０１０５】３．　　ＧＢ−ＰＡ２，１０１，１６７　
号（ユニリーバー・ビー・エル・シー、１９８３年１月
１２日公開、優先日１９８１年７月７日）。
【０１０６】４．　　ファン・ディケン・ジェイ・ビー
、オットー・アールおよびハーダー・ダブリュー（１９
７６）、アーカイブス・オブ・マイクロバイオロジィ　
　１１１、１３７〜１４４。
【０１０７】５．　　ビーンハイス・エム、ファン・デ
ィケン・ジェイ・ピーおよびハーダー・ダブリュー（１
９８３）、アドバンシズ・イン・マイクロバイアル・フ
ィジオロジィ、ローズ・エイチ、ガレス・モリス・ジェ
イおよびテンペスト・ディー・ダブリュー著、第２４巻
、１〜８２、アカデミック・ブレス、ニューヨーク。
【０１０８】６．　　ロッゲンカンプ・アール、ヤノヴ
ィッツ・ゼット、スタニコフスキィ・ビーおよびホレン
バーグ・シー・ビー（１９８４）、モレキュラー・ジー
ン・ジェネティックス　　１９４、４８９〜４９３。
【０１０９】７．　　サーム、エイチ（１９７７）、ア
ドバンシズ・イン・マイクロバイオロジック・エンジニ
アリング、ゴース・ティー・ケイ、フィーヒター・エイ
およびブレイクブラウ・エヌ著、第６巻、７７〜１０３
、スプリンガー・フェルラーグ、ベルリン。
【０１１０】８．　　ビストリック・エル・ブイ、ソコ
ロフ・エイ・ピーおよびトロチエンコ・ワイ・エイ（１
９８１）、ＦＥＢＳレターズ、１３２、３２４〜３２８
。
【０１１１】９．　　ロア・エムおよびブローベル・ジ
ィー（１９８３）、プロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミイ・サイエンス、ＵＳＡ、８０、６８７
２〜６８７６。
【０１１２】１０．　　ビーハイス・エム、ファン・デ
ィケン・ジェイ・ピー、ピロン、エス・エイ・エフおよ
びハーダー・ダブリュー（１９７８）、アーカイブス・
オブ・マイクロバイオロジィ、１１７、１９５３〜１６
３。
【０１１３】１１．　　ローネン・ダブリュ・エイ・エ
ムおよびブラマー、ダブリュー・ジィー（１９８０）、
ジーン、２０、２４９〜２５９。
【０１１４】１２．　　ホーン・ビー（１９７９）、メ
ソッズ・イン・エンザイモロジィ、ウー・アール著、第
６８巻、２９９〜３０９、アカデミックプレス、ニュー
ヨーク。
【０１１５】１３．　　イーデンス・エル、ヘスリンガ
・エル、クロック・エル、リーデボアー・エイ・エム、
マート・ジェイ、トーネン・エム・ワイ、ビッサー・シ
ィーおよびベリップス・シィー・ティー（１９８２）、
ジーン、１８、１〜１２。 １４．　　ペルハム・エイチ・アール・ビーおよびジャ
クソン・アール・ジェイ（１９７６）、エアロープ・ジ
ャーナル・オブ・バイオケミストリィ、６７、２４７〜
２５７。
【０１１６】１５．　　バレリオ・ディー、ダイベンス
タイン・エム・ジェイ・シー、メーラ・カン・ピー、ギ
ューツ・ファン・ケッセル・エイ、ドロールド・エイお
よびファン・デル・エブ・エイ・ジェイ（１９８３）、
ジーン、２５、　　２３１〜２４０。
【０１１７】１６．　　リーデボアー・エイ・エム、ベ
リップス・シィー・ティー、およびデッカー・ピー・エ
ム・エム（１９８４）、ジーン、３０、２３〜３２。
【０１１８】１７．　　マニアティス・ティー、フリッ
チ・イー・エフおよびサムブルック・ジェイ（１９８２
）、モレキュラー・クローニング、２７８頁、コールド
−スプリング・ハーバー・ラボラトリイ版、ニューヨー
ク。
【０１１９】１８．　　ベントン・ダブリュー・ディー
およびディビス・アール・ダブリュー（１９７７）、サ
イエンス　　１９６、１８０〜１８２。
【０１２０】１９．　　アンブラー・アール・ビー（１
９７２）、メソッズ・イン・エンザイモロジィ、第２５
巻、２６２〜２７２、アカデミック・プレス、ニューヨ
ーク。 ２０．　　マッチュシ・エム・ディーおよびカルサーズ
・エム・エイチ（１９８１）、ジャーナル・オブ・アメ
リカン・ケミカル・ソサイエティ　　１０３、３１８５
〜３１９１。
【０１２１】２１．　　ウォレス・アール・ビー、ジョ
ンソン・エム・ジェイ、ヒロセ・ティー、ミヤケ・ティ
ー、カワシマ・イー・エイチおよびイタクラ・ケイ（１
９８１）、ニュクレイック・アシッズ・リサーチ　　９
、８７９〜８９４。
【０１２２】２２．　　ビギン・エム・ディー、ギブソ
ン・ティー・ジェイおよびホン・ジー・エフ（１９８３
）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミィ
・サイエンス、ＵＳＡ　　８０、３９６３〜３９６５。
【０１２３】２３．　　グリーソン・エム・エイ、ウェ
イツ・エム・ジェイおよびサドベリー・ピー・イー（１
９８４）、Ｃ１　化合物に対する微生物の生育、クロー
フォード・アール・エルおよびハンソン・アール・エス
、エイ・エス・エム出版、ワシントン、２２８〜２３５
。
【０１２４】２４．　　フィング・ジー・ディー（１９
７０）、メソッズ・イン・エンザイモロジィ、テイバー
・エイチおよびテイバー・シー・ダブリュー著、第１７
巻、５９〜７８、アカデミック・プレス、ニューヨーク
。
【０１２５】２５．　　ボーク・ジェイ・ディー、ラッ
クラウト・エフおよびフィンク・ジー・ディー（１９８
４）、モレキュラー・ジーン・ジェネティック１９７、
３４５〜３４６。
【０１２６】２６．　　ジョーンズ・イー・ダブリュー
およびフィンク・ジー・ディー（１９８２）、コールド
・スプリング・ハーバー・モノグル・シリーズ、　　１
１Ｂ、１８１〜２９９。
【０１２７】２７．　　リーベルマン・アイ、コーンバ
ーグ・エイおよびシムス・イー・エス（１９５５）、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ　　２
１５、４０３〜４１５。
【０１２８】２８．　　スティンクコーム・ディー・テ
ィー、トマス・エム、ケリー・ジェイ、セルカー・イー
およびディビス・アール・ダブリュー（１９８０）、プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミック・
サイエンス、ＵＳＡ　　７７、４５５９〜４５６３。
【０１２９】２９．　　スティンクコーム・ディー・テ
ィー、マン・シー、およびディビス・アール・ダブリュ
ー（１９８２）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジイ　　１５８、１５７〜１７９。
【０１３０】３０．　　ストラール・ケイ、スティンク
コーム・ディー・ティー、シェラー・エスおよびディビ
ス・アール・ダブリュー（１９７９）、プロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス、
ＵＳＡ　　７６、１０３５〜１０３９。
【０１３１】３１．　　カールソン・エムおよびボトス
タイン・ディー（１９８２）、セル　　２８、１４５〜
１５４。
【０１３２】３２．　　ベッグズ・ジェイ・ディー（１
９７８）、ネイチャー２７５、１０４〜１０９。
【０１３３】３３．　　ブローチ・ジェイ・アール、ス
トランサーン・ジェイ・エスおよびヒックス・ジェイ・
ビー（１９７９）、ジーン　　８、１２１〜１３３。
【０１３４】３４．　　ダス・エス、ケラーマン・イー
およびホレンバーグ・シー・ピー（１９８４）、ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジィ　　１５８、１１６５〜
１１６７。
【０１３５】３５．　　イトー・エイチ、フクダ・ワイ
、ムラタ・ケイおよびキムラ・エイ（１９８３）、ジャ
ーナル・オブ・バクテリオロジィ　　１５３、１６３〜
１６８。 ３６．　　クレーベ・アール・ジェイ、ハリス・ジェイ
・ブイ、シャープ・ゼット・ディーおよびダグラス・エ
ム、ジー（１９８３）、ジーン　　２５、３３３〜３４
１。
【０１３６】３７．　　ホレンバーグ・シー・ピー（１
９８２）、カレント・トピックス、マイクロバイオロジ
カル・イムノロジィ　　９６、１１９〜１４４。
【０１３７】３８．　　カトー・エヌ、オーモリ・ワイ
、タニ・ワイおよびオガタ・ケイ（１９７６）、ユーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリイ　　６
４、３４１〜３５０。
【０１３８】３９．　　シュッテ・エイチ、フロスドル
フ・ジェイ、サーム・エイチおよびクラ・エム・アール
（１９７６）、ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイ
オケミストリイ　　６２、１５１〜１６０。
【０１３９】４０．　　ロンチ・エス、ミンチオテイ・
エル、ガリアノ・エム、カーティ・ビー、スエンソン・
アール・ピー、ウィリアムス・シー・エイチおよびマセ
イ・ブイ（１９８１）、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリイ２５７、８８２４／８８３０。
【０１４０】４１．　　ラトキン・ピーおよびカーボン
・ジェイ（１９７７）、プロシーディング・オブ・ナシ
ョナル・アカデミック・サイエンス、ＵＳＡ　　７４、
４８７〜４９１。
【０１４１】４２．　　クーデ・エフ・エックス、ジア
ズ・ジェイ、モアー・エム、ロスカム・ダブリューおよ
びロンクッチ・アール（１９８４）、トレンズ・イン・
バイオテクノロジィ　　２、８３〜８８。
【０１４２】４３．　　イタクラ・ケイ、ヒロセ・ティ
ー、クリー・アール、リッグズ・エイ・ディー、ヘイン
カー・エイチ・エル、ボリバー・エフおよびボイアー・
エイチ・ダブリュー（１９７７）、サイエンス　　１９
８、１０５６〜１０６３。
【０１４３】４４．　　ゴールドマン・ビー・エムおよ
びブローベル・ジィー（１９７８）、プロシーディング
ス・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス、Ｕ
ＳＡ７５、５０６６〜５０７０。
【０１４４】４５．　　ロビー・エムおよびラザロー・
ピー・ビー（１９７８）、プロシーディングス・オブ・
ナショナル・アカデミック・サイエンスＵＳＡ７５、４
３４４〜４３４８。
【０１４５】４６．　　リンガッパ・ブィ・アール、リ
ンガッパ・ジェイ・アールおよびブローベル・ジィー（
１９７９）、ネイチャー　　２８１、１１７〜１２１。
【０１４６】４７．　　ワトソン・ジェイ・ディー、ツ
ーズ・ジェイおよびフルツ・ディー・ティー（１９８３
）、組換えＤＮＡ、短期コース、１７８頁、フリーマン
・アンド・カンパニー発行、ニューヨーク。
【０１４７】４８．　　リー・ジェイ・ディーおよびコ
マガタ・ケイ（１９８０）、ジャーナル・オブ・ジェネ
ティック・アプライド・マイクロバイオロジィ２６、１
３３〜１５８。
【図面の簡単な説明】
【図１】特異的ＭＯＸサブクローンのシークエンス化に
使用するエクソヌクレアーゼＢａｌ　３１　消化方法。 Ｍ１３ｍｐ−８又は−９、−１８又は−１９にてサブク
ローンした断片Ｘ−Ｙをユニークな制限Ｚ部位で切断す
る。ＤＮＡ分子は時間依存性エクソヌクレアーゼＢａｌ
　３１　消化に供する。Ｍ１３シークエンスプライマー
近くに位置するＤＮＡ断片は制限酵素Ｙを使って除く。 末端はＴ４　−ＤＮＡポリメラーゼで培養して平滑末端
とし、ついで分子内的に連結させる。ファージプラーク
を形質転換後取り上げ、断片をＸ部位の方向でＺ部位か
らシーケンスする。逆転複数クローニング部位を有する
Ｍ１３誘導体を使って、断片をＸ部位の方向にＺ部位か
らシーケンスする。
【図２】同上。
【図３】ＨＡＲＳ断片をＹ１ｐ５の単一ＳａｌＩ部位に
挿入して誘導したｐＨＡＲＳプラスミドの整列。
【図４】ＨＡＲＳ−１断片の完全ヌクレオチド配列。
【図５】Ｈ．ポリモーファ形質転換体のサザーンハイブ
リッドによるコピー数の評価。各プローブ８および１８
ｍｌの試料を電気泳動にかけた。レーン１はＨｉｎｄＩ
ＩＩとＥｃｏＲＩで消化したファージラムダＤＮＡであ
る。 レーン２，３はＨｉｎｄＩＩＩ　（エム・レイネン、ケ
イ・ブロイニッヒおよびシー・ピー・ホレンバーグ、未
公表）で消化した組みこみプラスミドの２つのコピーを
含むＫ・ラクティスの形質転換体である。レーン４〜７
はＥｃｏＲＩで消化したｐＲＢ（４−５）とＹＲＰ１７
（６−７）でそれぞれ形質転換させたＹＮＮ２７；レー
ン８，９はＥｃｏＲＩで消化したＹＲＰ１７で形質転換
させたＬＲ９；レーン１０，１１はＨｉｎｄＩＩＩ　で
消化したｐＨＡＲＳ　２で形質転換したＬＲ９；レーン
１２，１３はＥｃｏＲＩで消化したｐＨＡＲＳ　１で形
質転換したＬＲ９である。
【図６】プラスミドＹＩｐ５の組みこみにより形質転換
されたＨ．ポリモーファ変異株ＬＲ９由来のＤＮＡのサ
ザーンブロットのオートラジオグラム。レーン１はＨｉ
ｎｄＩＩＩ　とＥｃｏＲＩ双方で消化したファージラム
ダＤＮＡ；レーン２は未消化の　ｐＨＡＲＳ−１；レー
ン３，５および６，７は２つの異なる形質転換体由来の
ＤＮＡを示す。レーン３は未消化；レーン４はＥｃｏＲ
Ｉで消化；レーン５はＰｖｕＩＩで消化；レーン６はＥ
ｃｏＲＩで消化；レーン７はＰｖｕＩＩで消化；レーン
８はＥｃｏＲＩで消化；レーン８はＥｃｏＲＩで消化し
たプラスミドＹＩｐ５。ニック翻訳したＹＩｐ５はハイ
ブリッドプローブとして使用した。
【図７】オリゴ（αＴ）セルロースについて一度精製（
レーンＡ）又は二度精製（レーンＢ）した、Ｈ．ポリモ
ーファ由来の３２Ｐ−ラベルしたＲＮＡの電気泳動。電
気泳動は変性７Ｍ尿素　２．５％ポリアクリルアミドゲ
ルについて行なった。酵母ｒＲＮＡ′ｓの位置およびそ
れぞれの分子量は１８ｓと２５ｓにより示されている。 レーンＢに見られる２．３　ｋｂバンドはｃＤＮＡプロ
ーブに転換し、ついでＨ．ポリモーファクローンバンク
からＭＯＸとＤＨＡＳを単離するのに使った（Ｆｉｇ．
６）。メタノール活性他Ｈ．ポリモーファｍＲＮＡをウ
サギ網赤血球リセートで試験管内翻訳した後に得た３５
Ｓ−ラベルしたタンパク質。全リセート（レーンＡ）２
μｌ又はＭＯＸ特異的抗血清（レーンＢ）を使う残存１
８μｌの免疫沈降物を１１．５％ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲルで分別した。公知の分子量を有するタンパク
混合物はマーカーとして使用した（Ｆｉｇ．７）。
【図８】ベックマン　　シーケネーターで測定した、精
製ＭＯＸのＮ−末端配列。サッカロミセス所望コドンを
使って、配列Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ
から誘導しうる２つのプローブ。
【図９】ＨｉｎｄＩＩＩ　／ＳａｌＩ切断ＭＯＸクロー
ンのＤＢＭブロットのハイブリッド化。このＤＮＡを　
１．５％アガロースゲル（第９Ａ図）で分別し、ブロッ
トをＭＯＸ−由来合成ＤＮＡプローブ混合物にハイブリ
ッドした（第８図）。クローン１，４および５の唯一の
バンドは、第９Ａ図の矢印に示すように、ハイブリッド
する（第９Ｂ図）。レーンＭ：分子量マーカー、レーン
Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ：夫々クローン１，３，４および５
。レーンＥ：ラムダＬ４７．１。
【図１０】ＭＯＸクローン４の制限地図。ＭＯＸ遺伝子
のサブクローン化およびシークエンス化に使用した適当
な制限部位のみを示してある。構造ＭＯＸ配列および作
ったＭ１３サブクローンを含む開放読み取り枠を表わす
。使用した制限部位：Ｂ＝ＢａｍＨＩ、ＥＩ　＝Ｅｃｏ
ＲＩ、ＥＶ　＝ＥｃｏＲＶ、Ｐ＝ＰｓｔＩ、Ｓｌ＝Ｓａ
ｌＩ、Ｓｃ＝ＳａｃＩ、Ｓｔ＝ＳｔｕＩ、Ｈ＝Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ　、Ｓｐ＝ＳｐｈＩ、Ｋ＝ＫｐｎＩ、Ｈｇ＝Ｈｇ
ｉＡｌおよびＸ＝ＸｍａＩ。
【図１１】ＭＯＸ構造遺伝子のヌクレオチド配列および
その５′−および３′−フランキング配列。
【図１２】同上。
【図１３】同上。
【図１４】同上。
【図１５】同上。
【図１６】同上。
【図１７】同上。
【図１８】同上。
【図１９】ネオマイシンホスホトランスフェラーゼが遺
伝子に組みこむことによるプラスミドｐＵＲ　３１０５
　の構築。
【図２０】同上。
【図２１】プロモーターＭＯＸ−ネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼアダプター断片。
【図２２】図１９と同じ。
【図２３】図１９と同じ。
【図２４】公表されたアミノ酸配列から誘導される。Ａ
ＡＯ遺伝子のＤＮＡ配列。この遺伝子は約５０ヌクレオ
チド長さのオリゴヌクレオチド中Ｈ．ポリモーファの最
適コドンに合成する。サブクローンのために使用する制
限部位を示す。ＨｇｉＡＩ−ＳａｌＩ断片は構造ＡＡＯ
遺伝子とＭＯＸプロモーター間のアダプターを形成する
。翻訳開始コドン（ｍｅｔ）と停止コドン（＊＊＊）を
示す。構造配列は１〜１０４４であり、ＭＯＸプロモー
ターは−３４〜−１である。
【図２５】同上。
【図２６】同上。
【図２７】ｐＵＲ　３００３　の構築、それによりＡＡ
Ｏ遺伝子はＨ．ポリモーファの染色体ＭＯＸ遺伝子に組
みこむ。ＡＡＯ遺伝子の活性に関する選択。
【図２８】同上。
【図２９】ｐＵＲ　３００４　の構築、それによりＡＡ
Ｏ遺伝子はＨ．ポリモーファｌｅｕ−　誘導体の染色体
ＭＯＸ遺伝子に組みこむ。ｌｅｕ＋　についての選択。
【図３０】同上。
【図３１】ｐＵＲＳ５２８−０３の構築。ｐＣＲ１配列
の除去および二重ｌａｃＵＶ５プロモーターにより、こ
のプラスミドはｐＵＲＹ５２８−０３より約２．２　ｋ
ｂ短い。
【図３２】同上。
【図３３】公表されたアミノ酸配列から誘導した、ＨＧ
ＲＦ遺伝子のＤＮＡ配列。この遺伝子は約５０ヌクレオ
チド長さのオリゴヌクレオチドにおけるＨ．ポリモーフ
ァの最適コドンに合成する。ＨｇｉＡＩ、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ　およびＳａｌＩ部位はサブクローニングのために使
用する。ＨｇｉＡＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ　断片は構造ＨＧ
ＲＦ遺伝子とＭＯＸプロモーター間のアダプターを形成
する。翻訳開始コドン（ｍｅｔ）と停止コドン（＊＊＊
）を示す。構造配列は１〜１４０であり、ＭＯＸプロモ
ーターは−３４〜−１である。
【図３４】ｐＵＲ　３２０３　の構築、それによりＨＧ
ＲＦをコードする遺伝子はＨ．ポリモーファの染色体Ｍ
ＯＸ遺伝子に組みこむ。ＨＧＲＦの免疫活性に対する選
択。
【図３５】同上。
【図３６】ｐＵＲ　３２０４　の構築、それによりＨＧ
ＲＦをコードする遺伝子はＨ．ポリモーファｌｅｕ−　
誘導体の染色体ＭＯＸ遺伝子に組みこむ。ｌｅｕ＋　に
ついて選択。
【図３７】ｐＵＲ　３２０５　の構築、それによりＨＧ
ＲＦをコードする遺伝子は、Ｈ．ポリモーファに自律的
に複製するＨＡＲＳ−１−含有プラスミドに挿入される
。ｕｒａ−　変異株の形質転換体により選択。
【図３８】ｐＵＲ　３２０９　の構築、それによりＨＧ
ＲＦをコードする遺伝子は、構造ＭＯＸ遺伝子に融合し
た、Ｈ．ポリモーファの染色体ＭＯＸ遺伝子に組みこむ
。ＨＧＲＦはＣＮＢｒ分解により融合タンパク質から切
断する。ＨＧＲＦの免疫活性に関する選択。
【図３９】同上。
【図４０】ｐＵＲ　３２１０　の構築、それによりＨＧ
ＲＦをコードする遺伝子は、構造ＭＯＸ遺伝子に融合し
たＨＡＲＳ−１−含有プラスミドに挿入される。図３７
のように選択。
【図４１】ｐＵＲ　３２１１　の構築、それによりＨＧ
ＲＦをコードする遺伝子は、構造ＭＯＸ遺伝子に融合し
た、Ｈ．ポリモーファｌｅｕ−　誘導体の染色体ＭＯＸ
遺伝子に組みこむ。ｌｅｕ＋　について選択。
【図４２】公表されたアミノ酸配列から誘導された、Ｈ
ＧＲＦ遺伝子のＤＮＡ配列。この遺伝子を図３３のよう
に合成するが、構造ＭＯＸ遺伝子のユニークなＫｐｎＩ
部位に挿入できるように構築する。したがって、遺伝子
の両側にＫｐｎＩ部位を供した。ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ　断片はサブクローニング用に用いた。合成はＭＯ
Ｘ酵素に対する融合産物としてである。８２位の内部ｍ
ｅｔ（ＡＴＧ）はｃｙｓ（ＴＧＴ）に転換する。翻訳開
始（ｍｅｔ）および停止（＊＊＊）コドンを示す。
【図４３】ＤＡＳ構造遺伝子のヌクレオチド配列とその
５′−および３′−フランキング配列。
【図４４】同上。
【図４５】同上。
【図４６】同上。
【図４７】同上。
【図４８】同上。
【図４９】同上。
【図５０】同上。
【図５１】同上。
【図５２】ＤＡＳ−ラムダクローンの制限地図。唯一の
適切な制限部位を示すが、ＭＯＸ遺伝子のサブクローン
およびシーケンス化に用いた。構造ＤＡＳ配列および作
ったＭ１３サブクローンを含む開放読み取り枠が示され
ている。
【図５３】ＤＡＳとＭＯＸ遺伝子の−１０００領域にお
ける同一配列。

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　適当な条件下で微生物を培養し、任意
    には生成した酵素を濃縮しついでこの濃縮酵素を公知方
    法により集取してオキシドリダクターゼを製造する方法
    において、組換えＤＮＡ技術により得、そして、漂白剤
    をその場で生成するための漂白及び／又は洗剤組成物に
    使用するのに適したオキシドリダクターゼを産生しうる
    微生物を使用することを特徴とする、上記方法。
  2. 【請求項２】　　微生物は １）　　アルコールオキシダーゼ ２）　　アルキルアミンオキシダーゼおよびベンジルア
    ミンオキシダーゼを含むアミンオキシダーゼ、３）　　
    Ｄ−アラニンオキシダーゼ、リジンオキシダーゼを含む
    アミノ酸オキシダーゼ、 ４）　　コレステロールオキシダーゼ、５）　　尿酸オ
    キシダーゼ、 ６）　　キサンチンオキシダーゼ、 ７）　　クロロパーオキシダーゼ、および８）　　アル
    デヒドオキシダーゼ からなる群から選択した少なくとも１種の酵素を産生し
    うる、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】　　微生物はカビ又は酵母である、特許請
    求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】　　カビ又は酵母はアスペルギルス属、カ
    ンジダ属、ゲオトリカム属、ハンセヌラ属、レンジト属
    、ナドソニア属、ピチア属、ポリア属、ポリポラス属、
    サッカロミセス属、スポロボロミセス属、トルロプシス
    属、トリコスポラ属およびゼンデラ属から成る群から選
    択する、特許請求の範囲第３項記載の方法。
  5. 【請求項５】　　カビ又は酵母はアスペルギルス・ジャ
    ポニカス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・
    オリゼ、カンジダ・ボイジニ、ハンセヌラ・アノマラ、
    ハンセヌラ・ポリモーファ、ハンセヌラ・ウインゲイ、
    クローケラ・ｓｐ．２２０１およびピチア・パストリス
    種から選択する、特許請求の範囲第４項記載の方法。
  6. 【請求項６】　　微生物はジヒドロキシアセトンシンタ
    ーゼ酵素を産生することができ、ホルムアルデヒドから
    ジヒドロキシアセトンの生成を促進する酵素を産生する
    、特許請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項に記
    載の方法。
  7. 【請求項７】　　特許請求の範囲第１項から第５項のい
    ずれか１項に記載の方法により得たオキシドリダクター
    ゼを酸化方法に使用すること。
  8. 【請求項８】　　漂白活性を有する洗剤組成物又は硬質
    面洗浄組成物を含む漂白組成物であって、特許請求の範
    囲第１項から第５項のいずれか１項に記載の方法により
    得たオキシドリダクターゼおよびその基質を含有するこ
    とを特徴とする、上記組成物。
  9. 【請求項９】　　組換えＤＮＡ技術により製造でき、か
    つ特許請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項に記
    載の方法に使用するのに適したオキシドリダクターゼを
    産生しうる、微生物。
  10. 【請求項１０】　　組換えＤＮＡ技術により製造でき、
    かつ特許請求の範囲第６項記載の方法に使用するのに適
    したジヒドロキシアセトンシンターゼ酵素を産生し得、
    さらにオキシドリダクターゼを産生し得る、微生物。
  11. 【請求項１１】　　特許請求の範囲第９項記載の形質転
    換微生物の調製方法において、構造遺伝子の発現を調節
    する１種以上の他のＤＮＡ配列と共にオキシドリダクタ
    ーゼをコードするＤＮＡ配列をエピソームベクターを介
    して微生物に導入するか又はゲノムにて統合させて、微
    生物をオキシドリダクターゼ産生可能にさせることを特
    徴とする、上記方法。
  12. 【請求項１２】　　特許請求の範囲第１０項記載の形質
    転換微生物の調製方法において、構造遺伝子の発現を調
    節する１種以上の別のＤＮＡ配列と共にジヒドロキシア
    セトンシンターゼ酵素をコードするＤＮＡをエピソーム
    ベクター又はゲノム中の統合を介して導入し、微生物を
    ジヒドロキシアセトンシンターゼ酵素（ＤＨＡＳ酵素）
    を産生させ得ることを特徴とする、上記方法。
  13. 【請求項１３】　　天然のＤＮＡおよび／又はｃＤＮＡ
    および／又は化学的に合成したＤＮＡから組換えＤＮＡ
    技術により得ることができることを特徴とする、オキシ
    ドリダクターゼをコードするＤＮＡ配列。
  14. 【請求項１４】　　アルコールオキシダーゼをコードす
    る、特許請求の範囲第１３項記載のＤＮＡ配列。
  15. 【請求項１５】　　ポリペプチド１−６６４　（ＭＯＸ
    ）をコードする第１１Ａ＋１１Ｂ図に示したＤＮＡ配列
    １−１９９２（ＭＯＸ遺伝子）を有し、そのアミノ酸配
    列は第１１Ａ＋１１Ｂ図に示される、特許請求の範囲第
    １４項記載のＤＮＡ配列。
  16. 【請求項１６】　　漂白剤をその場で生成するための漂
    白及び／又は洗剤組成物に使用するのに適したオキシド
    リダクターゼをコードする構造遺伝子および特定の微生
    物又はある群の微生物中構造遺伝子の発現を調節する１
    種以上の別のＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡ配列の組み合わ
    せ。
  17. 【請求項１７】　　第１１Ａ図に示した上流ＤＮＡ配列
    −１から約−１５００の少なくとも一部および／又は第
    １１Ｂ図に示した下流ＤＮＡ配列１９９３から約３２６
    ０（ＭＯＸ遺伝子の制御領域）の少なくとも一部を含む
    、特許請求の範囲第１６項記載のＤＮＡ配列の組み合わ
    せ。
  18. 【請求項１８】　　第１１Ａ図に示した上流ＤＮＡ配列
    の少なくともポリヌクレオチド−１０５２から−９８７
    　を含む、特許請求の範囲第１７項記載のＤＮＡ配列の
    組み合わせ。
  19. 【請求項１９】　　第１１Ａ図に示した少なくともポリ
    ヌクレオチド−１０５２から−９８７　の欠失により得
    ることができる変性ＭＯＸプロモーター配列を含む、特
    許請求の範囲第１７項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。
  20. 【請求項２０】　　第１８Ａ図＋１８Ｂ図に示した上流
    ＤＮＡ配列−１から約−２１２５の少なくとも一部およ
    び／又は第１８Ｃ図に示した下流ＤＮＡ配列２１０７か
    ら約２３５０の少なくとも一部（ＤＡＳ遺伝子の制御領
    域）を含む、特許請求の範囲第１６項記載のＤＮＡ配列
    の組み合わせ。
  21. 【請求項２１】　　第１８Ａ図に示した上流ＤＮＡ配列
    の少なくともポリヌクレオチド−１０７６から−９３７
    　を含む、特許請求の範囲第２０項記載のＤＮＡ配列の
    組み合わせ。
  22. 【請求項２２】　　第１８Ａ図に示した少なくともポリ
    ヌクレオチド−１０７６から−９３７　の欠失により得
    ることができる変性ＤＡＳプロモーター配列を含む、特
    許請求の範囲第２０項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。
  23. 【請求項２３】　　真核生物、カビ又は酵母のオキシド
    リダクターゼをコードする構造遺伝子を含む、特許請求
    の範囲第１６項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。
  24. 【請求項２４】　　ハンセヌラ属、望ましくはＨ．ポリ
    モーファの酵母のオキシドリダクターゼをコードする構
    造遺伝子を含む、特許請求の範囲第２３項記載のＤＮＡ
    配列の組み合わせ。
  25. 【請求項２５】　　オキシドリダクターゼをコードする
    構造遺伝子はアルコールオキシダーゼをコードする、特
    許請求の範囲第１６項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。
  26. 【請求項２６】　　構造遺伝子はポリペプチド１−６６
    ４（ＭＯＸ）をコードする第１１Ａ図＋１１Ｂ図に示し
    たＤＮＡ配列　１−１９９２（ＭＯＸ遺伝子）であり、
    そのアミノ酸配列は第１１Ａ図＋１１Ｂ図に示される、
    特許請求の範囲第２５項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ
    。
  27. 【請求項２７】　　ＤＨＡＳをコードする構造遺伝子を
    含む、特許請求の範囲第１６項記載のＤＮＡ配列の組み
    合わせ。
  28. 【請求項２８】　　第１８Ｂ図＋１８Ｃ図に示すアミノ
    酸配列を有するＤＨＡＳをコードする構造遺伝子を含む
    、特許請求の範囲第２７項記載のＤＮＡ配列の組み合わ
    せ。
  29. 【請求項２９】　　組換えＤＮＡ技術により、ＤＮＡ配
    列を変性し、オキシドリダクターゼをコードする機能又
    はその制御機能を保持する、特許請求の範囲第１６項か
    ら第２８項のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列の組み合
    わせ。
  30. 【請求項３０】　　ある特定の宿主微生物の後代に上記
    組み合わせを安定的に遺伝させうる１種以上のＤＮＡ配
    列を含む、特許請求の範囲第１６項から第２９項のいず
    れか１項に記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。
  31. 【請求項３１】　　特異的酵素又はその他のタン白質を
    産生するのに微生物宿主の形質転換に適するＤＮＡ配列
    の組み合わせで、そのＤＮＡ配列の組み合わせはレギュ
    ロン、その特異的酵素又はその他のタン白質をコードす
    る構造遺伝子および任意にはターミネータを含む組み合
    わせであって、レギュロンは第１１Ａ図に示すＭＯＸ遺
    伝子のレギュロン−１から約−１５００の少なくとも一
    部又は第１８Ａ図に示すＤＡＳ遺伝子のレギュロン−１
    から約−２１２５の少なくとも一部から成る群から選ん
    で使用し、その修飾はレギュロン機能に修復を与えず、
    そして任意にはターミネータは第１１Ｂ図に示すＭＯＸ
    遺伝子のターミネータ１９９３から約３２６０の少なく
    とも一部又は第１８Ｂ図に示すＤＡＳ遺伝子のターミネ
    ータ２１１０から約２３５０の少なくとも一部から成る
    群から選択して使用し、その修飾はターミネータ機能に
    修復を与えないことを特徴とする、上記ＤＮＡ配列の組
    み合わせ。
  32. 【請求項３２】　　ハンセヌラ酵母、特にハンセヌラ・
    ポリモーファの形質転換に適する、特許請求の範囲第３
    １項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。
  33. 【請求項３３】　　サッカロミセス酵母、特にサッカロ
    ミセス・セレビシエの形質転換に適する、特許請求の範
    囲第３１項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。
  34. 【請求項３４】　　特異的酵素又は他のタン白質をコー
    ドする構造遺伝子は、その特異的酵素又はその他のタン
    白質がペルオキシソームすなわちこの微生物宿主の同一
    ミクロボディにトランスロケーションするように、その
    機能を修復せず、この特異的酵素又はその他のタン白質
    を修飾するＭＯＸ（第１１Ａ＋１１Ｂ図）をコードする
    構造遺伝子由来のＤＮＡ配列を含む、特許請求の範囲第
    ３１項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。
  35. 【請求項３５】　　ジヒドロオキシシンターゼ酵素をコ
    ードするＤＮＡ配列であって、天然のＤＮＡおよび／又
    はｃＤＮＡおよび／又は化学合成したＤＮＡから組換え
    ＤＮＡ技術により得ることができる、上記ＤＮＡ配列。
  36. 【請求項３６】　　ポリペプチド１−７０２（ＤＨＡＳ
    ）をコードする、第１８Ｂ＋１８Ｃ図に示すＤＮＡ配列
    １−２１０６（ＤＡＳ遺伝子）を有し、そのアミノ酸配
    列は第１８Ｂ＋１８Ｃ図に示す、特許請求の範囲第３５
    項記載のＤＮＡ配列。
  37. 【請求項３７】　　特定の微生物又は微生物群に構造遺
    伝子の発現を調節する１種以上のＤＮＡ配列およびジヒ
    ドロキシアセトンシンターゼ酵素をコードするＤＮＡ配
    列の組み合わせ。
  38. 【請求項３８】　　特許請求の範囲第３６項記載のＤＮ
    Ａ配列（ＤＡＳ遺伝子）および第１８Ａ＋１８Ｂ図に示
    す上流ＤＮＡ配列−１から約−２１２５の少なくとも一
    部および／又は第１８Ｃ図に示す下流ＤＮＡ配列２１０
    ７から約２３５０の少なくとも一部（ＤＡＳ遺伝子の制
    御領域）および／又は第１１Ａ図に示す上流ＤＮＡ配列
    −１から約−１５００の少なくとも一部および／又は第
    １１Ｂに示す下流ＤＮＡ配列１９９３から約３２６０の
    少なくとも一部（ＭＯＸ遺伝子の制御領域）から成る、
    特許請求の範囲第３７項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ
    。
  39. 【請求項３９】　　第１８Ａ図に示す上流ＤＮＡ配列の
    少なくともポリヌクレオチド−１０７６から−９３７　
    又は第１１Ａ図に示す上流ＤＮＡ配列の少なくともポリ
    ヌクレオチド−１０５２から−９８７　をそれぞれ含む
    、特許請求の範囲第３８項記載のＤＮＡ配列の組み合わ
    せ。
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