JPH04258763A - 細胞分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、フローサイトメトリー
を適用した細胞分析装置に関し、詳しく言えば細胞の光
情報を処理する過程での細胞光情報の選別を効果的に行
える細胞分析装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】フローサイトメトリーは、例えば蛍光色
素で標識された細胞（又はこれに準ずる粒子）を含む試
料をシース液と共に、細い液流中に流し、流体力学的焦
点合わせ効果により１列になって流れる細胞の一つ一つ
にレーザ等のビーム光を照射し、細胞より生じる散乱光
や蛍光の強度、即ち細胞光学的情報を瞬時に測定し、細
胞を分析するものである。このフローサイトメトリーは
、大量の細胞を高速度且つ高精度に分析できる特長を有
している。

【０００３】上記フローサイトメトリーを適用した細胞
分析装置としては、細い液流を形成するためのフローセ
ルと、このフローセル内を流れる細胞に光ビームを照射
する光源（例えばレーザ）と、この光ビームが照射され
た細胞よりの細胞光学的情報を検出して電気信号に変換
する光検出器と、この光検出器の信号を増幅・積分する
信号処理回路と、この信号処理回路より出力される細胞
光学的情報の信号の演算処理等を行うコンピュータとを
備えているものが知られている。

【０００４】例えば、血液中のリンパ球サブセット分析
の場合には、ヒト血液に蛍光色素で標識したモノクロー
ナル抗体を反応させ、その後に溶血処理したものが試料
として用いられる。フローセル中を流れる試料細胞には
レーザビームが照射され、４つのパラメータ、即ち前方
散乱光強度Ｉ０　、９０°散乱光強度Ｉ９０、緑色蛍光
強度Ｉｇ　、赤色蛍光強度Ｉｒ　がそれぞれ検出器で検
出され、細胞光学的情報（以下、単にデータという場合
がある）が得られる。この試料中には、リンパ球の他に
単球、顆粒球等が含まれているので、リンパ球について
のデータを他の細胞データより選別する必要がある。

【０００５】そこで、細胞の大きさと内部構造を表すと
される前方散乱光強度Ｉ０　、９０°散乱光強度Ｉ９０
を直交座標軸とするサイトグラムを作成する（図３参照
）。 図３において、ｂはリンパ球の分布、ｃは単球の分布、
ｄは顆粒球の分布をそれぞれ示している。このサイトグ
ラム上で、例えばリンパ球の分布ｂを含む分析領域Ｂ０
　（多角形又は楕円形）を設定して、リンパ球のデータ
を測定されたデータより選別する（特開昭６２−１３４
５５９号公報参照）。こうして選別されたリンパ球のデ
ータについて、緑色蛍光強度Ｉｇ　、赤色蛍光強度Ｉｒ
　の演算処理が行われ、陽性率の算出等が行われる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ところで、試料はヒト
血液より調製することが多いが、血液はヒトの病態を多
様に反映し、フローサイトメータの散乱光サイトグラム
や蛍光サイトグラムの細胞群のパターンに変化が見られ
ることも少なくない。特に、リンパ球サブセット検査で
は、リンパ球に分析領域を設定して次の検査のステップ
に進むが、リンパ球に正確に分析領域を設定できるかど
うかが検査の精度に大きく関与してくる。又、リンパ球
サブセット検査では、分析の自動化・効率化を図ること
が求められており、この点からも迅速な演算が可能な方
法が望ましい。

【０００７】かかる要求に則り、本願出願人は、例えば
特願昭６３−１７２０９６号、同６３−１９３０３３号
、同６３−１９３０７２号等公報に開示の細胞分析装置
を既に出願した。しかしながら、いずれの装置において
も複雑な演算式を用いる演算により求めるので、分析領
域の形状が必ずしもオペレータの意に沿うという訳では
ない。又、図３に示す如き二次元散布図において細胞集
団が均一に分布しない場合、例えば細胞集団が密な場合
には外れ値、或いは逆に集団が疎な場合には歯抜け現象
の影響を受け、十分に対処できず、精度が低下すること
がある。

【０００８】従って、本発明の目的は、上記に鑑み、オ
ペレータの希望する任意の形で分析領域を設定でき、精
度も従来と同等か又はそれ以上を期待でき、しかも検査
・分析の自動化・効率化の可能な細胞分析装置を提供す
ることにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明の細胞分析装置は以下の構成（１）〜（８）
を備えることを特徴とする。即ち、（１）細胞浮遊液等
が流されるフローセルと、（２）このフローセル内を流
れる細胞等に光ビームを照射する光源と、（３）この光
ビームが照射された各々の細胞等について１又は２以上
のパラメータよりなる細胞光情報を検出する細胞光情報
検出手段と、（４）この細胞光情報検出手段で検出され
た細胞光情報より目的細胞集団の細胞光情報を選別する
細胞光情報選別手段と、（５）前記細胞光情報検出手段
で検出された細胞光情報及び前記細胞光情報選別手段で
選別された細胞光情報を演算処理する細胞光情報処理手
段と、（６）この細胞光情報処理手段での処理結果を出
力する出力手段とを備えてなる細胞分析装置において、
（７）前記細胞光情報選別手段は、予め入力しておいた
分析領域を記憶する分析領域記憶手段を有し、（８）前
記細胞光情報処理手段は、前記細胞光情報検出手段で検
出された細胞光情報を演算処理し、この演算処理結果に
応じて前記分析領域を移動させ、細胞光情報処理を行う
分析領域移動手段を有する。

【００１０】

【作用】本発明の細胞分析装置では、細胞光情報の選別
を行う際に、予め入力しておいた分析領域を用いて細胞
光情報の選別を行うことで、検査及び分析の自動化・効
率化を推進すると共に、検査・分析の精度の向上も可能
とするものである。

【００１１】

【実施例】以下、本発明の細胞分析装置を実施例に基づ
いて説明する。図１はその一実施例として細胞分析装置
の構成を示す図である。オートサンプラ２の試料ラック
２ａには複数の試料容器３，・・・，３が装填されてい
る。この試料ラック２ａは駆動機構（図示せず）により
駆動され、指定の試料を試料吸引チューブ４の直下に位
置させる。更に、オートサンプラ２は振とう機構、冷却
機構（いずれも図示せず）を備えており、定時的に試料
を振とうすると共に、装填された試料容器３，・・・，
３内の試料を低温（例えば４〜１０℃）に保持する。

【００１２】前記試料吸引チューブ４は、三方弁５の１
つのポートに接続されている。三方弁５の他の２つのポ
ートには、試料送液チューブ６ａ、６ｂがそれぞれ接続
されており、試料送液チューブ６ａと試料吸引チューブ
４、或いは試料送液チューブ６ａと６ｂとを連通させる
ことができる。試料送液チューブ６ａの他端には、試料
ポンプ７が設けられている。一方、試料送液チューブ６
ｂの他端は、シース液送液チューブ８内に開口している
。

【００１３】このシース液送液チューブ８は、一端が送
液ポンプ９に接続され、他端がフローセル１０に接続さ
れている。フローセル１０は、石英ガラス等により構成
され、内部のフローチャネル１０ａ内にシースフローが
形成され、流体力学的焦点合わせ効果により、試料中の
細胞又は粒子がフローチャネル１０ａ中心軸上を一列に
なって流される。

【００１４】フローセル１０より流出した液は、廃液チ
ューブ１１に導かれて、廃液タンク１２に収容される。 なお、この細胞分析装置は、シース液タンク（図示せず
）を備えており、前記試料ポンプ７、送液ポンプ９にシ
ース液が補充される。又、オートサンプラ２、ポンプ７
、９等を含む送液系は密閉可能で、バイオハザードを防
止できる。

【００１５】フローセル１０の周囲には、レーザ（光源
）１４、光検出器（細胞光情報検出手段）１５ａ、１５
ｂ、１５ｃ、１５ｄが配設される。レーザ１４よりのレ
ーザビームＬは、フローチャネル１０ａを流れる細胞（
又は粒子）に照射される。この細胞（又は粒子）よりは
、信号光が発生するが、その内前方方向のものは、前方
散乱光として、レンズ１６ａに集光されて、光検出器１
５ａに入射する。１７は、レーザビームＬが直接光検出
器１５ａに入射するのを防止するビームブロッカである
。

【００１６】一方、細胞よりの９０°方向の信号光は、
レンズ１６ｂで集光される。この信号光はその一部がダ
イクロイックミラー１８ａで反射されて、９０°散乱光
検出用の光検出器１５ｂに入射する。ダイクロイックミ
ラー１８ａを透過した信号光は、更にその一部がもう一
つのダイクロイックミラー１８ｂにより反射されて、フ
ィルタ１９ａを透過して、緑色蛍光用の光検出器１５ｃ
に受光される。ダイクロイックミラー１８ｂを透過した
光は、フィルタ１９ｂを透過して赤色蛍光用の光検出器
１５ｄに受光される。なお、例えばレーザ１４には、ア
ルゴンレーザやヘリウムネオンレーザ、前方散乱光用の
光検出器１５ａにはホトダイオード、その他の検出器１
５ｂ、１５ｃ、１５ｄには光電子増倍管が適用される。

【００１７】光検出器１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、１５ｄ
の受光信号は、信号処理回路部２０で増幅されノイズを
取除かれた後、アナログ／デジタル（Ａ／Ｄ）変換器２
１によりデジタル信号に変換されて、ＭＰＵ２２に取り
込まれる。ＭＰＵ２２は、大きく分けてオートトリガに
関する機能、細胞数カウント・統一に関する機能及びそ
の他の機能を有している。その他の機能としては、細胞
数が揃えられた目的細胞集団の光情報について蛍光解析
を行う機能、前記試料ポンプ７、送液ポンプ９及びオー
トサンプラ２を制御する機能等を有している。

【００１８】ＭＰＵ２２には、フロッピディスクドライ
ブ２３、キーボード２４、ＣＲＴ２５及びプリンタ２６
が接続されている。フロッピディスクドライブ２３は、
測定条件（プロトコル）や測定データ等を、フロッピデ
ィスクに保存させるためのものである。キーボード２４
は、プロトコルの選択・設定或いはその他の指令をＭＰ
Ｕ２２に入力するためのものである。ＣＲＴ２５は、測
定をモニタするためのものであり、プリンタ（出力手段
）２６は、ＭＰＵ２２の処理結果、例えばサイトグラム
やヒストグラム等をプリントアウトするためのものであ
る。

【００１９】次に、実施例の細胞分析装置の動作を図２
に示すフローチャートを参照しながら説明する。まず、
分析目的に応じた処理が施された試料が、それぞれ試料
容器３に入れられて、試料ラック２ａに装填される。例
えば、リンパ球サブセットの解析を行う試料は、患者の
血液にフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）
で標識したＯＫＴ４モノクローナル抗体及びファイコエ
リスリン（ＰＥ）で標識したＯＫＴ８モノクローナル抗
体を反応させた後、溶血処理して得られる。

【００２０】細胞分析装置の電源がオンされると、ＲＯ
Ｍ（図示せず）よりＭＰＵ２２にプログラムが読込まれ
、システムが立上がる〔ステップ（　以下ＳＴという）
１、図２参照〕。次に、測定する試料に適合するプロト
コルが選択・設定される。このプロトコルには、光検出
器１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、１５ｄの検出ゲインや補正
演算等の測定条件を内容とするものである。これは、試
料の処理方法が測定目的に応じて異なるためであり、例
えば各処理に用いられるモノクローナル抗体の細胞との
反応性はそれぞれ異るため、光検出器１５ａ、１５ｂ、
１５ｃ、１５ｄの検出ゲインを変更する必要があり、又
各モノクローナル抗体と蛍光色素の結合様式がそれぞれ
異なるため補正演算もそれに応じて変更する必要がある
。

【００２１】次にＳＴ２では、キーボード２４よりオー
トトリガを行う旨の指令が入力されているか否かが判定
される。この判定がＹＥＳの場合にはＳＴ３へ分岐し、
ＮＯの場合にはＳＴ４へ分岐する。又、ＳＴ３では、今
回の測定が前回の測定とは異なる新たなプロトコルに従
ってなされる旨の指令が入力されているか否かをＭＰＵ
２２が判定する。この判定がＹＥＳの場合にはＳＴ８へ
分岐し、ＮＯの場合にはＳＴ４へ分岐する。

【００２２】今、ＳＴ２又はＳＴ３からＳＴ４へ分岐し
たものとして説明を進める。ＳＴ４では、操作者がキー
ボード２４より、ウィンドウＢ０　をＩ９０−Ｉ０　サ
イトグラム上に設定する（図３参照）。ウィンドウＢ０
　が設定されると、測定が開始される（ＳＴ５）。ＳＴ
５では、試料ラック２ａが駆動され、最初に測定を行う
試料が入れられた試料容器３を試料吸引チューブ４の直
下に位置させる。そして、三方弁５が試料吸引チューブ
４と試料送液チューブ６ａとを連通するように切換えら
れ、試料吸引チューブ４が試料容器３内に降下し、試料
ポンプ７が吸引側に駆動されて、試料が試料送液チュー
ブ６ａに吸引される。

【００２３】次に、三方弁５が試料送液チューブ６ａと
６ｂを連通するように切換えられ、試料ポンプ７が送液
側に駆動され、試料が送液チューブ８に送られる。一方
、送液ポンプ９が送液側に駆動され、シース液がフロー
セル１０に送られる。フローチャネル１０ａ内では、シ
ースフローが形成され、流体力学的焦点合わせ効果によ
り、細胞はフローチャネル１０ａ中心軸上を一列になっ
て流れていく。この細胞の一つ一つについてレーザビー
ムＬが照射され、前方散乱光強度Ｉ０　、９０°散乱光
強度Ｉ９０、緑色蛍光強度Ｉｇ　、赤色蛍光強度Ｉｒ　
がそれぞれ測定されていく。これら細胞光情報は、必要
に応じてフロッピディスク等に順次記憶される。

【００２４】測定中は、上記ウィンドウＢ０　に属する
細胞の数がカウントされる。ＳＴ６では、この細胞数ｎ
が所定のｎａ　に達したか否かを判定し、ＹＥＳの場合
にはＳＴ７へ、ＮＯの場合にはＳＴ６を繰り返す。所定
の値ｎａ　は、規制の細胞数ｎａ０に対し大きめのｎａ
０＋αとされる。この時、最終画分Ｂ０　’内の細胞数
ｎ’は、前記所定の細胞数ｎａ　よりも少なくなる可能
性があるが、初めからα分だけ余裕をもってカウントす
れば、ｎａ０を下回ることはないであろう。

【００２５】ＳＴ１２では、細胞数統一処理を行う。こ
れは、最終画分Ｂ０’内の細胞光情報（細胞数ｎ’個）
の内、ｎａ０を超える部分を切り捨てることにより行わ
れる（図４参照）。ＳＴ１２で細胞数が統一されたデー
タについては、更に蛍光特性解析が行われる（ＳＴ１３
）。この蛍光特性解析では、例えば緑色蛍光強度Ｉｇ　
、赤色蛍光強度Ｉｒ　についてそれぞれヒストグラムを
作成し、陽性率の算出等が行われる。この蛍光特性解析
の結果は、ＣＲＴ２５に表示され（ＳＴ１４）、プリン
タ２６よりプリントアウトされる（ＳＴ１５）。

【００２６】ＳＴ１６では、更に測定すべき試料がある
か否かが判定される。この判定がＹＥＳの場合にはＳＴ
１へ戻り、ＮＯの場合には分析を終了する。さて、ＳＴ
１へ戻り、前回の測定と同じプロトコルで、且つオート
トリガを行う場合には、ＳＴ２、ＳＴ３を経て、ＳＴ８
の処理へ進む。ＳＴ８では、直前の測定で得られた最終
画分Ｂ０　’を再びＩ９０−Ｉ０　サイトグラム上にウ
ィンドウとして設定する（図３参照）。そして、ＳＴ５
と全く同様に測定を開始し、最終画分Ｂ０　’に入る細
胞をカウントし、これが所定数ｎａ　に達したか否かを
判定する（ＳＴ１０）。

【００２７】ＳＴ１０の判定がＹＥＳになると、ＳＴ１
１へ進み測定を終了すると共に、オートトリガ演算を行
う。このオートトリガ演算は、サイトグラムＩ０　−Ｉ
９０において所定範囲で細胞が出現する最高頻度のポジ
ションを探求し、直前ウィンドウの重心を最高出現頻度
のポジションに平行移動させるものである。即ち、この
画分Ｂ１　内で細胞等の試料の最高出現頻度のポジショ
ンを（ｘ１　，ｙ１　）とし、予め入力しておいた分析
領域Ｂ０　’の重心を（ｘ０　，ｙ０　）とすると、多
角形の分析領域の場合、各頂点（Ｘ１　，Ｙ１　），・
・・，（Ｘｕ　，Ｙｕ　）の最終画分Ｂ１　’〔図４（
ｂ）参照〕における各頂点は、 〔Ｘ１　＋（ｘ１　−ｘ０　），Ｙ１　＋（ｙ１　−ｙ
０　）〕，・・・， 〔Ｘｕ　＋（ｘ１　−ｘ０　），Ｙｕ　＋（ｙ１　−ｙ
０　）〕となる。一方、楕円の場合は、楕円の一般式（
ｘ２　／ａ２　）＋（ｙ２　／ｂ２　）＝１を反時計回
りでθだけ回転させた時、新座標（Ｘ，Ｙ）との間には
、ｘ＝Ｘｃｏｓθ＋Ｙｓｉｎθ ｙ＝−Ｘｓｉｎθ＋Ｙｃｏｓθ の関係がある。従って、楕円は一般的には、

【００２８
】

【数１】

【００２９】で表される。更に、これが分析領域Ｂ０　
’の重心（ｘ０　，ｙ０　）より分析領域Ｂ１　の重心
（ｘ１　，ｙ１　）に移動した場合、

【００３０】

【数２】

【００３１】という式で楕円の分析領域が表示される。

【００３２】この場合、細胞数は、直前の最終画分Ｂ０
　’によりカウントされるので、最終画分Ｂ１　’内の
細胞数ｎ１　’は、ｎａ　とは異なるが、ｎａ０を下回
ることはない。よって、この場合も先と同様に細胞数統
一処理を行う（ＳＴ１２）。そして、ＳＴ１３〜１５の
処理が行われる。なお、最高出現頻度を探求する方法は
上記方式によるものばかりでなく、前方散乱光強度Ｉ０
　或いは９０°散乱光強度Ｉ９０のヒストグラムの所定
領域におけるピークを探求する方式も可能である。

【００３３】又、上記実施例では、リンパ球について説
明しているが、単球、顆粒球等の白血球、赤血球、或い
は培養細胞等の広範囲な試料分析についても適用可能で
ある。

【００３４】

【発明の効果】本発明の細胞分析装置は、以上説明した
ように予め入力しておいた分析領域を用いて、分析領域
の形状は変化させずにそのままＩ０　−Ｉ９０サイトグ
ラム上で平行移動させるため、簡易且つ迅速に演算でき
ると共に、オペレータの意向が形状にも反映される。従
って、測定の自動化・効率化が促進されるという格別な
効果が得られる。

【００３５】又、本発明の装置は、主としてリンパ球へ
の適用は勿論のこと、単球、顆粒球等の白血球、赤血球
、或いは培養細胞等の広範な種類のサンプルにも適用可
能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例に係る細胞分析装置の構成模
式図である。

【図２】本発明による細胞分析装置の全体動作を説明す
る流れ図である。

【図３】サイトグラムＩ０　−Ｉ９０及びその上で表示
される細胞群の説明図である。

【図４】分析領域内の細胞数の統一方法を説明する模式
図である。

【符号の説明】

１０　　フローセル １４　　レーザ １５ａ・１５ｂ・１５ｃ・１５ｄ　　光検出器２２　　
ＭＰＵ ２５　　ＣＲＴ ２６　　プリンタ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】細胞浮遊液等が流されるフローセルと、こ
   のフローセル内を流れる細胞等に光ビームを照射する光
   源と、この光ビームが照射された各々の細胞等について
   １又は２以上のパラメータよりなる細胞光情報を検出す
   る細胞光情報検出手段と、この細胞光情報検出手段で検
   出された細胞光情報より目的細胞集団の細胞光情報を選
   別する細胞光情報選別手段と、前記細胞光情報検出手段
   で検出された細胞光情報及び前記細胞光情報選別手段で
   選別された細胞光情報を演算処理する細胞光情報処理手
   段と、この細胞光情報処理手段での処理結果を出力する
   出力手段とを備えてなる細胞分析装置において、前記細
   胞光情報選別手段は、予め入力しておいた分析領域を記
   憶する分析領域記憶手段を有し、前記細胞光情報処理手
   段は、前記細胞光情報検出手段で検出された細胞光情報
   を演算処理し、この演算処理結果に応じて前記分析領域
   を移動させ、細胞光情報処理を行う分析領域移動手段を
   有することを特徴とする細胞分析装置。
2. 【請求項２】前記分析領域移動手段は、分析領域の重心
   を細胞光情報で選別された細胞群の最高出現頻度に合致
   させる機能を有することを特徴とする請求項１記載の細
   胞分析装置。