JPH03112496A

JPH03112496A - 物質の定量分析用標識剤

Info

Publication number: JPH03112496A
Application number: JP24926789A
Authority: JP
Inventors: Akio Tsuji; 辻　章夫; Masako Maeda; 前田　昌子; Hidetoshi Arakawa; 秀俊荒川; Morikazu Nakano; 中野　衛一; Shigeru Honma; 茂本間
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1989-09-27
Filing date: 1989-09-27
Publication date: 1991-05-14

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はポリアデニル酸からなる物質の定量分析用標識
剤及び物質の定量分析方法及びポリアデニル酸又はポリ
アデニル酸標識体の定量法に関する。

〔従来の技術〕

測定しようとする分析対象物質と類似した性質をもつ多
数の夾雑物を含む試料中の分析対象物質を、高感度に定
量しようとする場合、この分析対象物質と特異的に結合
する物質（例えば分析対象物質を抗原とする抗体、核酸
中の特異的配列を含む核酸断片等）あるいは分析対象物
質自体を、放射性物質あるいは酵素で標識し、特異的結
合体の量あるいは結合にあずからなかった標識体の量を
放射能、あるいは酵素活性を測定することにより、試料
中の分析対象物質の濃度を測定する方法が知られている
。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、分析対象物質を、放射性物質で標識する
場合には、その取り扱いに厳重な管理が必要であり、酵
素で標識する場合にも標識する操作あるいは分析対象物
質との結合反応条件により、その酵素活性が低下する場
合があり、測定に最適な酵素を使うことが不可能である
等の問題点があった。

〔課題を解決するための手段〕

そこで本発明者等は、まず、試料中のポリアデニル酸を
正確に定量する方法を新たに開発した。

そしてこの定量法によれば、ポリアデニル酸を物質の定
量分析用標識剤として極めて好適に用いることができ、
上記課題を解決し得る。

との知見を得て、本発明を完成するに至ったものである
。

すなわち本発明は、まずポリアデニル酸からなる物質の
定量分析用標識剤に特徴を有するものである。

また、本発明は、試料中のポリアデニル酸又はポリアデ
ニル酸標識体を加水分解してＡＤＰを遊離させる工程、
該ＡＤＰにリン酸を結合させてＡＴＰへ変換する工程及
びホタル由来ルシフェラーゼを用いる生物発光法を用い
て、該ＡＴＰを発光強度により測定する工程を同時もし
くは順次に行なうことにより、試料中のポリアデニル酸
又はポリアデニル酸標識体を定量することを特徴とする
ポリアデニル酸又はポリアデニル酸標識体の定量法に特
徴を有するものである。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

本発明の標識剤を用いて定量すべき物質としては如何な
るものでもよく、またこれら定量対象物質を含有する分
析試料にも特に限定されるものではない。

本発明の標識剤は、分析対象物質に直接標識せしめて分
析対象物質の定量を行っても良いが、また分析対象物質
に対し、特異的に直接あるいは間接的に結合し得る物質
に該標識剤を標識せしめ、このポリアデニル酸標識体を
用いて試料中の分析対象物質と反応させ、反応しなかっ
た標識体を除去した後、分析対象物質と結合しているポ
リアデニル酸標識体の量を求めることにより、試料中の
分析対象物質の量を算出することができる。この場合の
分析対象物質と特異的に直接結合し得る物質としては、
例えば、ｍ−ＲＮＡ、ＤＮＡプローブ、抗体等が挙げら
れ、また、ビオチンを用いればアビジン、抗体等分して
間接的に如何なる分析対象物質とも特異的に結合可能と
なる。

また、ポリアデニル酸の分子量は、如何なる分子量でも
よく、更にまた、アデニル酸の含有率は、任意な率で差
しつかえない。

更に、ポリアデニル酸標識体の調製に用いられるポリア
デニル酸も前記と同様である。

標識法は、如何なる方法でもよく、例えば、荒用等、日
本薬学会等１０９年会講演要旨集■、第１６４頁、１９
８９年記載の方法が挙げられる。

以下に、本発明の定量分析手法について、更に詳細に説
明する。

まず、試料中の、分析対象物質に対し、ポリアデニル酸
を標識せしめたポリアデニル酸標識体を加水分解してＡ
ＤＰを遊離させる。このポリアデニル酸標識体は分析対
象物質を直接標識したものでも良く、また試料中に含有
される分析対象物質と特異的に直接あるいは間接的に結
合し得る物質をポリアデニル酸で標識したポリアデニル
酸標識体を試料中の分析対象物質と反応せしめたポリア
デニル酸標識体でも良い。なお後者の場合においては未
反応のポリアデニル酸標識体は除去される。

（以下第１工程という。）また、加水分解するには、如何なる方法でもよく、例え
ば、酵素的に加水分解する方法が挙げられる。

用いられる酵素としては、ポリアデニル酸からＡＤＰを
生成させる酵素であれば、如何なるものでもよく、例え
ば、大腸菌由来のポリヌクレオチド・フォスフォリラー
ゼ等が挙げられる。

分解条件としては、例えば、反応ｐＨは、５〜ｌＯ１好
ましくは、ｐＨ６〜９であり、反応温度は１０〜７０℃
、好ましくは２５〜４０°Ｃであり、また、反応時間は
、５分〜１０時間、好ましくは３０分〜３時間であり、
更に、緩衝液としては、１μＨ以上のマグネシウムイオ
ンを含むリン酸、Ｉ（ＥＰＥＳ。

トリス緩衝液等が挙げられ、酵素量としては、試料中の
ポリアデニル酸又はポリアデニル酸標識体量より適宜選
択すればよい。

次いで、上述の工程で得られたＡＤＰにリン酸を結合さ
せてＡＴＰへ変換する。（以下第２工程という。）ＡＤＰにリン酸を結合させてＡＴＰへ変換するには、如
何なる方法でもよく、例えば、フォスフオニノールパイ
ルベート及びパイルベート・カイネースを用いて、ＡＴ
Ｐへ変換する方法が挙げられる。

反応条件としては、例えば、ｐ旧よ、５〜ｌＯ１好まし
くは、ｐＨ６〜９であり、反応温度は、１０〜７０°Ｃ
１好ましくは、２５〜４０°Ｃであり、反応時間は、５
分〜１０時間、好ましくは３０分〜３時間であり、更に
緩衝液としては、リン酸、１１ＥＰＥＳ　、　　ｌ−リ
ス、トリエタノールアミン緩衝液等が挙げられ、フォス
フオニノールパイルベート量及び酵素量としては、試料
中のＡＤＰの含有量により適宜選択すればよい。

次いで、ホタル由来ルシフェラーゼによる生物発光法を
用いて、上述の如くして得られたＡＴＰ量に対応する発
光強度を測定し、例えば以下の実施１例２記載のような
検量線を使用してポリアデニル酸標識体において結合し
ている分析対象物質の量を算出し、定量する。（以下第
３工程という。）ホタル由来ルシフェラーゼとしては、
ルシフェリン−ルシフェラーゼ系によるＡＴＰ測定に用
いられるルシフェラーゼであれば、如何なるものでもよ
く、例えば、ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリカホ
タル等由来のルシフェラーゼが挙げられる。

上述の如くして生成したＡＴＰ含有試料に、ルシフェリ
ンを添加し、ホタル由来ルシフェラーゼを用い、反応条
件としては、ｐＨは、５〜９、好ましくは、ｐＨ６〜８
であり、反応温度は、１０〜４０°Ｃ１好ましくは、２
０〜３０℃、反応時間は、１時間以内、好ましくは、１
分以内であり、更に、緩衝液としては、ｉｎ＋Ｍ以上の
マグネシウムイオンを含むグリシルグリシン、ＨＥＰＥ
Ｓ　、　　トリシン（Ｔｒｉｃｉｎ）緩衝液等を用いて
ＡＴＰ量を測定するのである。

また、ルシフェリン及びルシフェラーゼの添加量は、Ａ
ＴＰの含有量により適宜選択すればよい。

一方、本発明においては、上述の工程を同時に、すなわ
ち、第１及び２工程を同時に行なったのち、第３工程を
行なうか、第１工程を行なったのち、第２及び３工程を
同時に行なうか、あるいは第１．２及び３工程を同時に
行なってもよい。

そして、例えば、第１及び第２工程を同時に行なう反応
条件としては、例えば、ｐＨは、５〜１０、好ましくは
ｐＨ６〜９であり、反応温度は、１０〜７０℃、好まし
くは、２５〜４０″Ｃであり、反応時間は、５分〜ｌＯ
時間、好ましくは、３０分〜３時間であり、更に、緩衝
液としては、１μ−以上のマグネシウムイオンを含むリ
ン酸、ＨＥＰＥＳ　。

トリス、トリエタノールアミン緩衝液等が挙げられ、ま
た、フォスフオニノールパイルベート量及び酵素量とし
ては、試料中のポリアデニル酸量により適宜選択すれば
よい。

なお、上記においては、ポリアデニル酸標識体に結合し
ている分析対象物質の定量分析方法を中心に説明したが
、上記方法は、試料中のポリアデニル酸またはポリアデ
ニル酸標識体を定量する場合にも当然に適用できること
はいうまでもない。

〔発明の効果〕

本発明のポリアデニル酸からなる物質定量分析用標識剤
を使用すれば従来の標識剤としてラジオアイソトープを
使用する場合のような厳重な管理を不要であり、又、酵
素を使用する場合のように標識操作において酵素活性が
低下するという問題点もな（、正確にかつ高感度に分析
対象物質を定量分析することが可能であり、薬剤、生体
内有用物質等の分析試験において大いに寄与するもので
ある。

実施例１（１）試薬の調製以下の試薬（イ）〜（ニ）を調製した。

試薬（イ）：ポリアデニル酸溶液再蒸留水に、ポリアデニル酸（ベーリンガー・マンハイ
ム社製、ＡＤＰが約１５００個重合したものである。）
を、１Ｉｎ１当り夫々１　ｎｇ−１０ｐｇとなる如く溶
解してポリアデニル酸溶液を夫々調製した。

試薬（Ｏ）：ポリヌクレオチドフォスフォリラーゼとパ
イルベート・カイネースの混合溶液０、１　Ｍ　Ｉ−リ
ス緩衝液（ｐｌ（８，０）に、ポリヌクレオチドフォス
フォリラーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）、パイ
ルベート・カイネース（ベーリンガー・マンハイム社製
）、硫酸マグネシウム、フォスフオニノールパイルベー
ト及びリン酸水素２ナトリウムを夫々１ｏｌｌ／ｄ、１
００υ／ｄ、ＩＩＩＩＭ、３０ｍＭ及び１０ｍＭの濃度
となる如く溶解してポリヌクレオチドフォスフォリラー
ゼとパイルベート・カイネースの混合溶液を調製した。

試薬（ハ）：ルシフェリン溶液２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，７５）に、Ｄ−
ルシフェリン及び硫酸マグネシウムを夫々８６μＨ及び
５．４ｍＭの濃度となるように溶解してルシフェリン溶
液を調製した。

試！（ニ）：ルシフエラーゼ溶液５０　ｍＭ　ＩＩＥＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７，５）に、ホ
タルルシフェラーゼ（シグマ社製）を０．０２　ｍｇ／
　ｒｔｔｌの濃度となるように溶解してルシフェラーゼ
溶液を調製した。

（２）測定上記試薬（イ）〜（ニ）を使用してポリアデニル酸量と
発光強度との関係を調べた。

試薬（イ）ｌＯｕ７！に、試薬（ＩＩ）２０ｕ／！を添
加し、温度３６℃で２時間反応させたものに、試薬（ｎ
）４００μ！及び試薬（ニ）１μｌを添加し、生じてく
る発光を発光検出器（アロカ社製、アロカルミネッセン
スリーダー）により１５秒間積算した。

このようにして得られた発光強度とポリアデニル酸との
相関を第１図に示した。

第１図より明らかなように、ポリアデニル酸量５と発光
強度との間には直線的相関があり、ポリアデニル酸の検
出域は１０　ｐｇ〜Ｉ　Ｑ　ｎｇ／　ａｓｓａｙであり
、５回繰り返しの精度（Ｃｖ％）は、平均５．７％と良
好であった。

さらに、上記検量環上のポリアデニル酸を含む試料（５
Ｘ１０’及び２Ｘ１０”ｐｇ／ｌ０ｍ１りを、上記と同
様な方法で測定したところ、検量線の値とよく一致する
発光強度が得られた。

実施例２（１）　　試薬の調製以下の試薬（イ）〜（本）を調製した。

試薬（イ）：ＴＳＨ溶液５０ａＭリン酸緩衝液（０，１％牛血清アルブミン及び
０．９％塩化ナトリウム含有、ｐＨ７，０）に、ＴＳＨ
を０〜２００μＵ／Ｉ１１の濃度となるように溶解して
ＴＳＨ溶液を調製した。

試薬（Ｉｌ＋）　　：ビオチン標識抗ＴＳＨ抗体溶液５
０ｍＭリン酸緩衝液（０，１％牛血清アルブミン及び０
．９％塩化ナトリウム含有、ｐＨ７，０）にビオチン標
識抗ＴＳＨ抗体を約１５ａ＋ｇ／ｍの濃度となるように
溶解する。

なお、ビオチン標識抗ＴＳＨ抗体は、次のように調製し
た。０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液１００ｕｆｆｉに
溶解した５０μｇの抗ＴＳＩ１１ｇＧ画分（ラビット）
〔免疫化学、医化学実験法講座、４、抗体の調製と精製
法、第４７〜７６頁、（１９７２年）記載の方法により
調製した。〕に、〕Ｄ−ビオチンーＮ−ハイドロキシコ
ハク酸イミドエステルのジメチルホルみアミド溶液（２
ｒａｇ／ｄ）、１０ｕｌを添加し、２５°Ｃで４時間反
応させたのち、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅに）Ｇ
−２５カラムクロマトグラフイーにより精製して得たも
のである。

試薬（ハ）　：洗浄液０．９％（Ｗ／Ｖ）食塩水試薬（ニ）：アビジン溶液５０ｍＭリン酸緩衝液（０，１％牛血清アルブミン及び
０．９％塩化ナトリウム含有、ＰＨ７，０）に、アビジ
ンを２０ｕｇ／ｍ１の濃度となるように溶解してアビジ
ン溶液を調製した。

試薬（ネ）：ビオチン標識ポリアデニル酸溶液５０ｗＭ
リン酸緩衝液（０，１％牛血清アルブミン及び０．９％
塩化ナトリウム含有、ｐＨ７，０）にビオチン標識ポリ
アデニル酸を２．５μｇ／ｄの濃度となる如く溶解して
ビオチン標識ポリアデニル酸溶液を調製した。

なお、ビオチン標識ポリアデニル酸は、Ａｒａｋａｗａ
等の方法〔ケム、ファルム、プル（Ｃｈｅａｐ、Ｐｈａ
ｒｍ。

Ｂｕｌｌ、、　３７　（７）　、第１８３１〜１８３３
　（１９８９年）〕を以下のように変更して調製したも
のである。すなわち、ポリ（ｐｏｌｙ）　Ａ　２．５　
ｍｇ水溶液にビオチン−Ｘ−ハイドラザイド（Ｂｉｏｔ
ｉｎ−Ｘ−ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）　　（カルビオケム社
製）ｌＯＩＩＩｇ／Ｉｄ水溶液１．２５ｄ及びゲルター
ルアルデヒド０．０５％水溶液１．５　ｄを添加し、３
７°Ｃで１０分間反応させたのち、常法によるエタノー
ル沈殿法により精製して得たものである。

（２）測定上記の試薬（イ）〜（ネ）を使用して以下のようにＴＳ
Ｈの定量分析試験を行った。

抗ＴＳＨ抗体をウェルの壁に固相化したマイクロタイタ
ーウェルに試薬（イ）を５０μ！、及び試薬（ＩＩ）を
５０μ！添加し、温度４°Ｃで一夜反応させたのち、試
薬（ハ）で３回洗浄し、更に、試薬（ニ）をｌＯＯμ！
添加し、温度２５℃で３０分間反応させた。

試薬（ハ）で洗浄したのち、試薬（本）を１００μｌ添
加し、２５°Ｃで３０分間反応させた０次いで、試薬（
ハ）で洗浄したのち、ウェルに結合したポリアデニル酸
量を実験例１記載の方法で測定した。

これより得られた発光強度とＴＳＨ量との相関を第２図
に示した。

この図より明らかなようにＴＳＨ量と発光強度との間に
は直線的相関があり、ＴＳＨの検量域は、３、１２　＃
Ｕ／ａｆ〜２００　／／Ｕ／１１１１！、検出限界が　
０．１５６μυ／ａｓｓａｙであり、精度は、平均１Ｏ
０７％と良好であった。

さらに、上記検量成上のＴＳＨを含む試料（２００及び
３．１２５μＵ／ｌｌ１１）を、前記と同様の方法で測
定したところ、検量線の値とよく一致する発光強度が得
られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、発光強度とポリアデニル酸との相関を示す図
であり、また、第２図は、発光強度とＴＳＨ量との相関
を示す図である。第図ゐ１ｙＡ（躇ハｕｂｅ）第図ＴＳＨＩｔＵ／ｍｌ

Claims

【特許請求の範囲】１、ポリアデニル酸からなる物質の定量分析用標識剤。２、試料中のポリアデニル酸又はポリアデニル酸標識体
を加水分解してＡＤＰを遊離させる工程、該ＡＤＰにリ
ン酸を結合させてＡＴＰへ変換する工程及びホタル由来
ルシフェラーゼを用いる生物発光法を用いて、該ＡＴＰ
を発光強度により測定する工程を同時もしくは順次に行
なうことにより、試料中のポリアデニル酸又はポリアデ
ニル酸標識体を定量することを特徴とするポリアデニル
酸又はポリアデニル酸標識体の定量法。