JPH11507726A

JPH11507726A - 電気化学発光酵素イムノアッセイ

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Publication number: JPH11507726A
Application number: JP9502214A
Authority: JP
Inventors: ティー．マーチン，マーク; ソール，リチャード; リアング，パム
Original assignee: イゲン，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 1999-07-06
Anticipated expiration: 2016-06-06
Also published as: AU718767B2; EP0871887B1; ES2285713T3; US7018802B2; WO1996041175A1; ATE358276T1; JP3784072B2; DE69637001T2; US6524865B1; US20040096918A1; AU6384496A; CA2223027A1; DE69637001D1; EP0871887A1; EP0871887A4

Abstract

(57)【要約】望ましくは共役している電気化学発光性ラベルと酵素基質とがイムノアッセイに使用され、また電気化学発光は接触的に生み出される。慣用的な電気化学イムノアッセイでは、抗−分析物抗体分子が典型的には毎秒６〜８個の電気化学発光活性のルテニウム原子を生成しうるが、本発明においては、酵素でラベルした抗−分析物分子は毎秒数千個の電気化学発光活性のルテニウム原子を生成しうる。例にあげたイムノアッセイは、電気化学発光性にラベルした基質を酵素で加水分解し、これを著しく電気化学発光性にする、ラクタマーゼと共役した抗−分析物を使用する接触過程を基礎におく。各々の抗−分析物分子（すなわち各々の分析物分子）によって発生される電気化学発光の信号は慣用的方法より著しく大きい。従って、所与のイムノアッセイ分析物を低濃度で検出する際により高い感度が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】電気化学発光酵素イムノアッセイ発明の背景発明の分野本発明は、分析物（analyte）の検出および定量的測定を行うために電気化学発光（ＥＣＬ）を基礎とする酵素イムノアッセイの開発に関する。イムノアッセイは、電気化学発光性の置換された基質を酵素によって加水分解し、これを著しく電気化学発光性にする、−ラクタマーゼと共役した抗−分析物を使用する接触的方法を基礎とする。イムノアッセイは極めて感度が高く、また抗−分析物をつくることのできる任意の分析物を検出し、モニターするのに好適である。関連する技術に関する説明生物学的試料中に認めることのできるような酵素を含めて、化学的、生化学的および生物学的物質を検出しそして定量化する、迅速で、高度に特異的で、感度が高くそして正確な方法について、常に拡大する応用分野がある。典型的な生物学的試料中の酵素のような目的とする特定の分析物の量はしばしば極めて少ないので、分析生化学者は感度のようなアッセイの性能特性を改善するために継続的努力を行っている。アッセイの感度を改善する一つの方法には、目的とする分析物と結び付く検出可能なラベルによって生み出される信号を増幅することが関わる。光発光、化学発光または電気化学発光技術によって発光させることのできるこのようなラベルは既知である。「光発光」は、ある物質が光（あるいは電磁放射線あるいはｅｍｒと称される）を吸収するのに引続いて発光する過程である。蛍光および燐光は、異なる二つのタイプの光発光である。「化学発光」過程は化学反応により発光性化学種を創成することを必要とする。「電気化学発光」は、ある化学種が、それを取巻く適当な化学的環境内で電気化学的エネルギーに曝露される時に発光する過程である。これら三つの発光技術の各々での信号は、個々の光子ごとに反応することのできる既知の計測器（例えば光電子増倍管あるいはｐｍｔ）を使用することにより極めて効果的な増幅（すなわち高い利得）が可能である。しかしながら、発光性化学種が生成される仕方は光発光、化学発光および電気化学発光の過程の間で著るしく異なる。そのうえ、これらのメカニズム的な差異は、電気化学発光が光発光および化学発光に対して享有する生分析的手段としての著しい利点の根源である。電気化学発光についてありうる利点のいくつかには、(1)より簡単で、費用のより安い計測；(2)安定で、危険でないラベル；および(3)より低い検出限界、より高い信号対ノイズ比、およびより低いバックグラウンドレベルといったより良いアッセイ性能特性が含まれる。上述したように、生分析的化学の測定技術の関係からみて、電気化学発光は光発光および化学発光の双方に対して顕著な利点を享有する。そのうえ、ＥＣＬのいくつかの応用が開発されておりまた文献中に報告されている。米国特許第５，１４７，８０６号、第５，０６８，８０８号、第５，０６１，４４５号、第５，２９６，１９１号、第５，２４７，２４３号、第５，２２１，６０５号、第５，２３８，８０８号および第５，２３８，８０８号は、ＥＣＬの方法、装置、化学的部分、発明および随伴する利点のいくつかについて詳述しており、これら特許の開示は参照によって本記載に含められている。特に有用なＥＣＬシステムは、Bio/Technology（１９９４年２月）の１９３〜１９４ページのYangらの論文に記載されている。１９９２年１０月のBiomedical Products のMasseyの論文および米国特許第５，２３５，８０８号および第５，３１０，６８７号もまた参照されたい。これらの論文および特許の内容は参照によって本記載に含められている。ＥＣＬ法は異なるいくつかのメカニズムによって、多くの異なる分子に対して立証されてきた。Clin ．Chem．３７１９（１９９１年）の１５３４〜１５３９ページにおいて著者のBlackburn らはルテニウム（II）トリス（ビピリジル）のＥ容易にラベルする活性化された化学種をつくるためにビピリジル配位子の一つにある反応性の基で化学的に修飾されることのできる極めて安定な水溶性化合物である。感受性のペニシリンおよびセファロスポリンの−ラクタム環のアミド結合を加水分解するベータ−ラクタマーゼは微生物中に広く分布しており、また−ラクタム抗生物質に対する微生物耐性に役割を果たす。ベータ−ラクタマーゼは、多数のバクテリア種によって作り出されるものの哺乳類の組織によっては作り出されない関連ある一群の酵素からなり、また基質特異性に差がありうる。一般的には、D．J., J ．Med．Micro（１９９３）３９，９３〜９９ページ；Coulton，S．およびFrancois，I.，Prog ．Med．Chem.（１９９４）３１，２９７〜３４９；Moel lering．R.C.，Jr., J ．Antimicrob．Chemother.（１９９３）３１（補遺Ａ）１〜８ページ；およびNeu，H.C，Science（１９９２）２５７，１０６４〜１０７２ページを参照されたい。微生物−ラクタマーゼを検出するためのいくつかの方法が現在存在する。いくつかの代表例は以下のとおりである。 J．Appl．Bacteriol．７３巻１号（１９９２年）の１４〜２２ページ所載のW ．L．Bakerの「Co-existence of-lactamase and penicillin acylase in bacter ia; detection and quantitative determination of enzyme activities」は、ペニシロエートおよび６−アミノペニシラニン酸が単一基質への酵素の作用によってともに生成される時の、ペニシロエートを検出するための銅−還元アッセイ、および６−アミノペニシラニン酸の濃度を検知するフルオレサミンアッセイを開示している。米国特許第５，２６４，３４６号は様々な応用を有する−ラクタマーゼのための測色アッセイを開示している。このアッセイはｐ−フェニレンジアミンのＮ− アルキレン誘導体またはベンジジンの３，３′，５，５′−テトラアルキル誘導体のいずれかの酸化により生成される発色団の脱色に基礎をおいている。この脱色はセファロスポリンまたはペニシリンの加水分解から生成する開放した−ラクタム環の存在に帰せられる。ペニシリンの開放した−ラクタム生成物による脱色は、水銀を含有する化合物のような脱色増強剤の存在を必要とする。この増強剤はセファロスポリンの開放した−ラクタム生成物での脱色に関しては必要でない。米国特許第４，４７０，４５９号は、−ラクタム基質が蛍光を発する能力を後退させる、−ラクタム基質の−ラクタマーゼ転換を基礎とする、微生物源由来のラクタマーゼの存在を検出するための迅速な方法を開示している。この特性を有すると述べられている特定の−ラクタムには、アンピシリン、セファレキシン、アモキシリン、セファドロキシル（cefadroxil）およびセファログリシンがある。蛍光を発する能力の変化は−ラクタマーゼの存在に帰せられる。ＷＯ８４／０３３０３は、−ラクタマーゼの生産者を同定するための微生物学的試験方法を開示している。このアッセイはクマリンのような指示薬の蛍光に影響を及ぼす、酸性の変化に依存する。この酸性度変化は−ラクタマーゼの存在により生成される転換生成物に帰せられる。 Eur．J．Clin．Microbiol．Infect．Dis．第８巻１１号（１９８９年）の９６２〜９６７ページ所載のA．C．Petersonらの「Evaluation of four qualitative methods for detection of-lactamase production in staphylococcus and Mic rococcus species」は、−ラクタマーゼのための定性的アッセイを評価するのに用いられたいくつかの要因を掲出している。 The Journal of Pediatrics ９７巻５号（１９８０年１１月）の７１５〜７２０ページ所載のRobert H．Yolkenらの「Rapid diagnosis of infections caused by-lactamase-producing bacteria by means of an enzymeradioisotopicassay 」は、バクテリア感染を検知するための迅速な試験として−ラクタマーゼを測定するための感度のある酵素放射性同位体アッセイを開示している。アッセイのプロトコルには、試料を使用するインキュベーション段階に引続く、溶離された画分の放射能の測定に先立つＤＥＡＥ−Sephacelのように正に荷電したカラム上での分離段階が含まれる−ラクタマーゼで転換されたペニシリン生成物は追加的なカルボキシル基を有し、この基はこの生成物が正に荷電されたカラムにペニシリンより強く結合するのを確実にする。溶離された画分の放射能ともとの値との差は−ラクタマーゼの存在に帰せられる。一般にイムノアッセイにおいては、分析物を検出するために抗体（本明細書では同様に「抗−分析物」と称される）が使用される。普通、抗−分析物は例えば吸光、蛍光、発光または電気化学発光によって検出可能な分子でラベルされる。別法としては、抗体がこれらの特徴の一つを有する化合物を創成するあるいは分解する酵素でラベルされることができる。酵素イムノアッセイには二つの主なタイプ、すなわち酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）および酵素増幅イムノアッセイ技術（ＥＭＩＴ）がある。ペンシルバニア州、PhiladelphiaのW.B.Saunders１９９３年刊のS.C.AndersonおよびS.Cockayne著のClinial Chemistry ;Concepts an d Applications。酵素イムノアッセイでは、過程は接触的であり、多数の検出可能なラベルが生成され、感度が増強される可能性が生まれる。電気化学発光（ＥＣＬ）イムノアッセイは、ラベルに共役する抗体を用いて慣用的に実施され、それは一般にトリス（ビピリジル）ルテニウム（II）１）Clin．Chem．３７、１５３４〜１５３９ページ。このアッセイでは各々の抗 −ラクタマーゼと共役する抗体を製造しそしてＥＣＬを基礎とするイムノアッセイに使用するための組成物および方法が現在見出されている。例えば酵素−ラとができる。Ｒｕ−ＡｍｐおよびＲｕ−ＡＰＡと称されるペニシリンはほんの極めて弱く電気化学発光性であるが、本発明に従って−ラクタマーゼによって加水分解される時、著しく電気化学発光性となる。従って−ラクタマーゼの存在は、これらの化合物のいずれかを使用するＥＣＬ計測器で高いレベルの感度を以って的なＥＣＬイムノアッセイとは異なって、本発明の酵素をベースとするＥＣＬイムノアッセイにおいては、電気化学発光的に活性のあるルテニウム複合体が抗体表面に結び付いた酵素によって接触的につくられる。従って、少数の（典型的には６〜８個の）ルテニウムラベルが光を発生することを一つの抗体が可能とするのに代えて、一つの抗体−酵素複合体は典型的には毎秒２０００個のルテニウムラベルを生成することができまた１０，０００またはそれ以上もの多くを生成することができよう。発明の概要慣用のＥＣＬをベースとするイムノアッセイではルテニウムでラベルされた抗体が使用される。本発明では、ルテニウムでラベルされた抗体が酵素でラベルされた抗体でおきかえられたイムノアッセイが見出されている。酵素はラクタマーゼである。トリプロピルアミン（ＴＰＡ）あるいは類似の還元剤は溶液から省かれそして、例えば感染に関連のあるアッセイの場合、ルテニウムでラベルされたペニシリンが代りに使用される。−ラクタマーゼでラベルされた抗体が存在すると、ルテニウムでラベルされた基質が接触的に加水分解され、ＥＣＬが莫大に増大する。酵素で生成されるＥＣＬ−活性のあるルテニウムは接触過程であり、ＥＣＬ活性のある分子を多く生成するので、このアッセイはルテニウムでラベルされた抗体のイムノアッセイの使用より優れている。広くいうならば、本発明は分析物を検出するための電気化学発光を基礎とするイムノアッセイを企図する。本発明では、抗体に、共役する−ラクタマーゼ、プロテアーゼまたは酸化還元酵素のような酵素およびＥＣＬラベルおよび酵素基質、望ましくはＥＣＬラベルで置換された基質例えばＥＣＬラベルで置換された抗生物質、ペプチド、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）が使用され、これらは一緒となって、毎秒数千個に及ぶＥＣＬ活性を有するラベルを接触的に生成できる抗体−酵素複合体を与える。電気化学発光法を分析物のための測定システムとして使用することの核心は、できるという認識である。ペニシリン、Ｒｕ−ＡｍｐおよびＲｕ−ＡＰＡは極めて弱い電気化学発光性を有するにすぎないが、これらは、−ラクタマーゼにより加水分解される時、電気化学発光性が著るしくなる。当技術に熟達する者にとって明らかであるように、本発明を実施するのに様々なアッセイ形式を用いることができる。これには、磁気ビーズ、または炭素の小繊維のような他の固体支持体を例えば使用するサンドイッチアッセイ、遊離−ラクタマーゼに共役する抗原を使用する競合アッセイ、選んだ分析物にも結合する抗体によって結合されているセグメントを含む組換えタンパク質が−ラクタマーゼであり、酵素が抗体結合によって不活性化されている競合アッセイ、および− ラクタマーゼが第２抗体に対するリポータであるＥＬＩＳＡがある。ニューヨークのStockton Press，１９９４年刊、D．Wild 編、The Immunoassay Handbook。図面の簡単な説明図１は−ラクタマーゼによるＲｕ−ＡＭＰおよびＲｕ−ＡＰＡの加水分解を示す。図２はＲｕ−ＡＭＰの合成を示す。図３はＲｕ−ＡＰＡの合成を示す。図４はＲｕ−ＡＰＡのアンモニウムヘキサフルオロホスフェート塩の基質スペクトルを示す。図５はＲｕ−ＡＰＡのアンモニウムヘキサフルオロホスフェート塩の陽子ＮＭＲスペクトルを示す。図６は５つの特異性−ラクタムの構造を示す。図７はＮａＯＨによる加水分解またはＲｕ−ＡＭＰの−ラクタマーゼ酵素による加水分解（左側）およびＲｕ−ＡＰＡの−ラクタマーゼ酵素による加水分解（右側）を示す。図８は異なる一連の試料について測定したＥＣＬの比較を示す。図９は異なる一連の試料について測定したＥＣＬの比較を示す。図１０は測定されたＥＣＬに対する加水分解されていないＲｕ−ＡＭＰの影響（黒丸）および加水分解されたＲｕ−ＡＭＰの影響（白丸）を示す。図１１は異なる一連の試料について測定したＥＣＬの比較を示す。図１２は測定されたＥＣＬに対する加水分解されていないＲｕ−ＡＰＡの影響（黒丸）および加水分解されたＲｕ−ＡＰＡの影響（白丸）を示す。図１３は異なる一連の試料について測定したＥＣＬの比較を示す。図１４はＥＣＬ酵素イムノアッセイを例示する。さまざまな濃度の分析物、ＰＴ１ハプテンを９６−ウェルプレート内で固定した。ウェルプレートに抗体−酵素共役体（−ラクタマーゼ酵素に共有結合した抗−ＲＴ１抗体）（直線１）または共役していない抗体または酵素（直線２〜４）のいずれかを入れた。分析物と結合しないタンパク質を除去するために洗浄した後、−ラクタマーゼ基質、ＰｅｎＧを添加した。ウェルプレート内の任意の−ラクタマーゼにＰｅｎＧを加水混合し、そしてＥＣＬ AnalyzerによりＥＣＬを読んだ。直線１は抗体−酵素共役体に関する結果を示す。直線２〜４は共役していない抗体または酵素を使用した結果を示す。発明の詳細な説明電気化学発光を基礎とするイムノアッセイを用いて分析物を測定する好ましい方法は以下の逐次的な段階による： 1. 分析物を含有する溶液中、磁気ビーズに固定された抗−分析物抗体を、− ラクタマーゼ抗−分析物抗体共役体と混合する。 2. 抗体を分析物と結合されて抗体−分析物−抗体「サンドイッチ」を作出した後、磁石でビーズを固定し、分析物以外に干渉する分子をことごとく洗浄除去しそして−ラクタマーゼ抗分析物抗体共役体の結合を解く。 3. ＥＣＬでラベルした基質をビーズに添加し、最適な反応時間を分析物の予想濃度によって決定して酵素を反応させそしてビーズを含有しないように上澄み液を取り出す。 4. 上澄み液の電気化学発光を測定しそしてそれを、加水分解された、ＥＣＬでラベルされた基質の濃度対電気化学発光の標準曲線と比較する。測定は、１６０２０ Industrial Drive，Gaithersburg，ＭＤ２０８７７ U.S.A アルの指示に従って実施することができる。ドまたはＮＡＤＨのような基質上で置換される。−ラクタマーゼを使用して酵素でラベルされた抗分析物もまたつくられる。ＥＣＬで置換された基質が、−ラクタマーゼでラベルされた抗体の存在下におかれる時、基質は接触的に加水分解さ状態は規準的発光メカニズムにより基底状態に衰微し、波長６２０nmを有する光子を放射する。ＥＣＬ検出体である有機化合物には例えばルブレンおよび９，１０−ジフェニルアントラセンがある。多くの有機金属化合物もまたＥＣＬ検出体であり、また最も好ましいのはルテニウムIIトリス−ビピリジンキレートのようなＲｕを含む化合物およびＯｓを含む化合物である。ここに開示する発明で有用な検出体は米国特許第５，３１０，６８７号に記載されており、その内容は参照によって本記載に含められている。これらの検出体は長期にわたって安定である。さらにこれらは安全でありかつ比較的安価である。これらは高度に特徴的な信号を発し、また自然界に存在しない。このような検出体の発光を基礎におく測定は感度が高く、迅速で、再現性がありまた単純な計器計測が利用される。信号が検出体の各分子から繰り返し発生されることにより、それを検出できる感度が増大する。本発明の好ましい電気化の同等物はいろいろな量で使用されてよい。これらの検出体は、試料の予備的処理を行なわずに生物学試料中で直接使用できる利点も有する。励起状態をつくるのに必要なエネルギーは、−ラクタムまたはペプチドの加水分解からあるいはＮＡＤ⁺のＮＡＤＨへの酸化により与えられる。励起状態にあ光子を放射する。動化できる。計測器の中心は電気化学フローセルであり、これにはＥＣＬ反応を開始するために作用電極と対向電極とが入っている。両電極とも金で製作されるのが好ましいが、他の材料も使用されており成功の程度は様々である。電極にいろいろな波型の電圧をかけるためにポテンショスタットが使用され、またＥＣＬ反応中に放射される光を検出するために単一の光電子増倍管（ＰＭＴ）が使用される。フローセルの下流の液体流路中にＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極が置かれ、そして種々の流体をフローセルを通過して吸引するために蠕動ポンプが使用される。典型的な順序では、アッセイ液体が試験管からフローセル内に抜き出されそして傾斜電圧を電極にかけて放射される光を計測することにより検体が定量化される。測定後、電気化学的クリーニング手続きのためpHの大きいクリーニング液がセル内に吸入される。次にセルに調整溶液が吸入されそして電極表面から再現性の著しく高い状態で出る波型をもつ電圧が加えられ、次の測定サイクルへの備えがなされる。ＥＣＬ反応は異なる多くの電圧波型によって効率的に開始することができる。作用電極電流およびＥＣＬ強度の測定は、例えば、三角波型を電極に印加することにより開始することができる。示された印加電圧は実際にはＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極で測定した電圧であり、また補償されていないかなりの抵抗の影響を含んでいる。従って作用電極に印加される電圧は示されたものよりかなり低い。三角波型は７５０ミリボルト／秒（ｍＶ／秒）で５６５ミリボルト（ｍＶ）から２８００ｍＶまで増加し次いで同じ割合で１０００ｍＶまで減少する。−ラクタム基質とＲｕ（ｂｐｙ）²⁺との双方の酸化は、印加電圧が１０００ｍＶに達し発光が起きる時に明らかになる。発光強度は、電極表面上の基質が消盡する結果、強度が低下するまで、印加電圧とともに増加する。観察される発光の強度は十分に大きく、光子計数方式または電流方式のいずれかで操作される慣用の光電子増倍器によって発光が容易に計測されることができる。電気化学発光を基礎とするイムノアッセイを用いて分析物を測定するのに好ましい方法は以下の逐次的段階による。 1.分析物を含有する溶液中で、磁気ビーズに固定された抗分析物抗体を、−ラクタマーゼ抗分析物抗体共役体と混合する。 2.抗体を分析物と結合させて抗体−分析物−抗体「サンドイッチ」を作出した後、磁石でビーズを固定し、分析物以外に干渉する分子をことごとく洗浄除去しそして−ラクタマーゼ抗分析物抗体共役体の結合を解く。 3.ＥＣＬでラベルした基質をビーズに添加し、最適な反応時間を分析物の予想濃度によって決定して酵素を反応させそしてビーズを含有しないように上澄み液を取り出す。 4.上澄み液の電気化学発光を測定しそしてそれを、加水分解された、ＥＣＬでラベルされた基質の濃度対電気化学発光の標準曲線と比較する。測定は確立目的とする−ラクタムが添加されている試料を次いで測定セルに入れ、最初の読みをとる。目的とする−ラクタムは、典型的には１０マイクロモル濃度と１．０ミリモル濃度との間の濃度で添加される。電気化学発光性検出体は典型的に１０⁶Ｍの濃度で存在する（範囲は１〜１５μＭ）。次に、酵素が存在するならば −ラクタマーゼで接触される加水分解が起りうることを保証するのに十分な時間、試料の入ったセルがインキュベートされる。この継続時間は５分から２時間の間で一般に変化する。試料および反応剤の濃度に応じてより長いおよびより短かい時間をかけることができる。関係するパラメータはすべて経験的なものであるので、その値は慣用技術により決定できる。インキュベーションの後、第２の読みをとる。読みに差があるなら、それは試料中に存在するラクタマーゼの活性と相関する。この点については図２を参照されたい。従って本発明の方法の性能にとって好適な装置および方法には、すでに述べたように、米国特許第５，０６８，０８８号、第５，０６１，４５５号および第５，１４７，８０６号ならびに第５，２２１，６０５号に記載のものがあり、これらの特許は参照によって本記載に明示的に含められている。加えて、測定システムにおいて検出体として使用するための電気化学発光分子には、米国特許第５，３１０，６８７号に記載の二座芳香族複素環の、ルテニウムおよびオスミウムの窒素含有配位子が含まれ、この特許は参照によって本記載に明示的に含められている。取扱いを容易にしそして標準化を促進するために、アッセイの実施に必要な物質の入ったキットをつくりあげることができる。キットに含められるべき物質は最終的目的に応じて変わるであろう。典型的にはキットに電気化学発光性検出体、必要なバッファー、および標準が含められよう。この標準は、アッセイの性能が求める較正にとって必要な化学的反応剤または印刷された形のもしくは電子的型式のデータ（経験的データ）であってよい。実施例本発明をすでに詳細に述べたにもかかわらず、本出願人は単に例示の目的で、そして本発明を理解に資するものとして以下の特定な例を示す。これらの例は限定的でもなくまた排除的でもない。従って添付する請求の範囲に記載する本出願人の発明の範囲は本明細書全体による教示に照らして決定されるべきである。（「Ｒｕ−ＡＰＡ」）の調整リーランド州、Rockville のIGEN,Inc．）を、pH８．０の０．２Ｍの重炭酸ナトリウム（３５０μＬ）中の６−アミノペニシラニン酸（１２．４mg）と混合し、そして室温で２時間反応を進行させた（図３）。２０分にわたって２０ｍＭからＩ００ｍＭに至る濃度勾配が直線状の、pH７．０の１．０ｍＬ／分の燐酸ナトリウムを使用する、Progel^TM−ＴＳＫＣＭ−５ＰＷカラム（７．５cm×７．５mm）米国、ペンシルバニア州、BellefonteのSupelco，Inc．）を装備したWaters（米国、マサチューセッツ州、Milford）のＨＰＬＣ装置を使用してＲｕ−ＡＰＡを精製した。ルテニウム錯体（モル消光係数は４５３ｎｍで１３，７００Ｍ^-1cm^-1 である）の吸光度を測定することにより基質を定量化した。製８．０の０．２Ｍの重炭酸ナトリウム（２５０μＬ）中のアンピシリン（２９．１mg）と混合し、そして室温で２時間反応を進行させた（図２）。１５分間にわたって２０ｍＭから１０ｍＭに至る濃度勾配が直線状の、pH７．０の１．０ｍＬ／分の燐酸ナトリウムを使用する、Progel^TM−ＴＳＪＣＭ−５ＰＷカラム（７．５cm×７．５mm）（米国、ペンシルバニア州、BellefonteのSupelco，Inc．）を装備したWaters（米国、マサチューセッツ州、Milford）のＨＰＬＣ装置を使用してＲｕ−ＡＭＰを精製した。ルテニウム錯体（モル消光係数は４５３ｎｍで１３，７００Ｍ^-1cm^-1である）の吸光度を測定することにより基質を定量化した。アンモニウムヘキサフルオロホスフェート塩の生成に引続いて、Ｒｕ−ＡＭＰの構造および純度を質量分光法および陽子ＮＭＲにより確定した（図４〜５）。構造中に第１級アミンを有する７−アミノセファロスポラニン酸のような別な共役体を生成することができる。反応および精製の条件は似ているであろうが、当技術に熟達する者にとって解決できるくらいある程度は異なる可能性はある。図６は５つの特定的−ラクタムの構造を示す。実施例２Ｒｕ−ＡＭＰ加水分解のＥＣＬアッセイ役していない）のＥＣＬを比較するために実験を行った。ＥＣＬ特性はＮａＯＨでの加水分解および酵素加水分解の前および後に比較された（図７）。Ｒｕ−ＡＭＰは−ラクタマーゼの極めて良い基質であることが判った。バシラスセレウス（Bacillus cereus）由来の−ラクタマーゼＩ（０．３ｎＭ）によるＲｕ−ＡＭＰ（３３μＭ）の加水分解を、Hitachi（米国、コネチカット州、Dan bury）のＵ３２００分光光度計を使用し、pH７．０の０．１Ｍの燐酸ナトリウムで２５℃において２４０ｎｍでの分光測光法によりモニターした。半減期（ｔ ¹ ／₂）分析によりＲｕ−ＡＭＰの酵素加水分解に関するkcat／Ｋｍ３．９×１０⁸ ／分・Ｍが得られた。い）との等モル混合物のＥＣＬの特性を同一濃度のＲｕ−ＡＭＰ共役体（加水分解されたまたは加水分解されていない）と比較した。別な実験で、アンピシリンおよびＲｕ−ＡＭＰを５０ｍＭのＮａＯＨによる（塩基加水分解）かまたはバシラスセレウス由来の３４７ｎＭの−ラクタムＩによる（酵素加水分解）かのいずれかで加水分解した。塩基加水分解の場合、３０．１μＭのＲｕ−ＡＭＰ、また脱イオン水の溶液１．０ｍＬに５ＭのＮａＯＨ５０μＬを添加した。３０分インキュベートの後、５ＭのＨＣｌ５０μＬで溶液を中和した。加水分解されない対応する実験では、３０．１μＭのＲｕ−ＡＭＰのあるいは３０．０μＭのアンピＨ₂Ｏを５０μＬ添加した。３０分インキュベートの後、５ＭのＮａＣｌを５０ μＬこれらの溶液に添加した。図８に示す結果は、(1)ＮａＯＨまたは−ラクタマーゼによるアンピシリンの加水分解は混合物のＥＣＬの増大を惹起し、また(2 )加水分解によって惹起されたＥＣＬの増大は、光を放射するルテニウム錯体が共有結合的にアンピシリンに結合している場合、劇的なまでに一層多いということを物中でアンピシリンが加水分解される場合にＥＣＬが１．５倍に増大したのに対して、Ｒｕ−ＡＭＰが加水分解される場合にはＥＣＬが５．２倍に増大した。酵素加水分解で類似する結果が得られた。すなわちアンピシリンと１倍に増大する一方、Ｒｕ−ＡＭＰの加水分解に際してはＥＣＬが９．８倍に増大した。これらの結論を確かなものにするデータは図８にある。同図は下記するものにつき実験的に測定した電気化学発光を左から右に示す。非加水分解のＲｕ−ＡＭＰ；ＮａＯＨ加水分解のＲｕ−ＡＭＰ；非加水分解のＲｕ−ＡＭＰ；および −ラクタマーゼ加水分解のＲｕ−ＡＭＰこの研究は、酵素によるインキュベートの時間が３０分から６０分に延長されていることが異なる酵素加水分解を用いる第２の実験で確認を行った（図９）。はＥＣＬを２．５倍に増大し、またＲｕ−ＡＭＰ共役体が加水分解される時、ＥＣＬを１１．１倍に増大した。これらの結論を確かなものにするデータは図９にある。同図は下記するものにつき実験的に測定した発光を左から右に示す。非加水分解のＲｕ−ＡＭＰ；および −ラクタマーゼ加水分解のＲｕ−ＡＭＰ。これらの結果は、−ラクタム環が加水分解される時に、実験的に測定される発図１０は加水分解により、低濃度のＲｕ−ＡＭＰが検出できることを示す。検出の下限界は５０ｎＭであることが判明した（加水分解されたＲｕ−ＡＭＰに関するＥＣＬの相対的な計測数が４６４であるのに対して加水分解されていないＲｕ−ＡＭＰの相対的計測数は−１５２であった）。これは、（共役していない）アンピシリンの加水分解の検出下限界５０００ｎＭと比較すると有利である。実施例３Ｒｕ−ＡＰＡ加水分解のＥＣＬアッセイＲｕ−ＡＰＡはＲｕ−ＡＭＰのＥＣＬ特性（加水分解の前および後の）とは異なる特性を有するであろうと考えられた。この差異はＡＰＡとＡＭＰとの間の構るのに用いられる第１級アミノ基との間の距離の差の結果であろう（図７）。Ｒｕ−ＡＭＰの場合、−ラクタム環は、Ｒｕ−ＡＰＡにおけるよりアミノ基から結合長さの３倍離れている。特に、Ｒｕ−ＡＰＡ（または別な−ラクタム共役体）の加水分解は、Ｒｕ−ＡＭＰ加水分解より幾分良い感度でＥＣＬにより検出できる。の混合物のＥＣＬ特性を比較した。ＥＣＬ特性はＮａＯＨ加水分解および酵素加水分解の前および後に比較した。次にデータを、実施例２に述べたＲｕ−ＡＭＰを用いる類似の実験の結果と比較した。Ｒｕ−ＡＭＰは−ラクタマーゼの極めて良い基質であることが判った。バシラスセレウス由来の−ラクタマーゼＩ（０．６ｎＭ）によるＲｕ−ＡＰＡ（２３μ Ｍ）の加水分解を、Hitachi（米国、コネチカット州、Danbury）のＵ３２００分光光度計を使用し、pH７．０の０．１Ｍの燐酸ナトリウムで２５℃において２４０ｎｍでの分光測光法によりモニターした。半減期（ｔ／２）分析により、Ｒｕ −ＡＭＰの酵素加水分解に関するKcat／Ｋｍ９．８×１０⁷／分・Ｍが得られた。い）との等モル混合物のＥＣＬの特性を同一濃度のＲｕ−ＡＰＡ共役体（加水分解されたまたは加水分解されていない）と比較した。別な実験で６−ＡＰＡおよびＲｕ−ＡＰＡを、５０ｍＭのＮａＯＨによる（塩基加水分解）かまたはバシラスセレウス由来の３．８μＭの−ラクタマーゼＩによる（酵素加水分解）かのいずれかで加水分解した。塩基加水分解の場合、２３．０μＭのＲｕ−ＡＰＡ、または２３．０μＭのＡ１．０ｍＬに５ＭのＮａＯＨ５０ｍＬを添加した。３０分の培養の後、５ＭのＨＣｌ５０μＬで溶液を中和した。加水分解されない対応する実験では、２３．０ μＭのＲｕ−ＡＰＡのあるいは２３．０μＭのＡＰＡと２３．０μＭの６０分の培養の後、５ＭのＮａＣｌを５０μＬこれらの溶液に添加した。図１１に示す結果は、(1)NａＯＨまたは−ラクタマーゼによる６−ＡＰＡ（共役したまたは共役していない）の加水分解は混合物のＥＣＬの増大を惹起し、また(2)加水分解によって惹起されたＥＣＬの増大は、光を放射するルテニウム錯体が共有結合的に６−ＡＰＡに結合している場合、劇的なまでに一層多いということを立証６−ＡＰＡ（非共役）が加水分解される場合にＥＣＬが１．９倍に増大したのに対して、Ｒｕ−ＡＰＡ（共役した）が加水分解される場合にはＥＣＬが１３．２倍に増大した。同様に、酵素加水分解に関しては、６−ＡＰＡとＥＣＬは１．４倍に増大したのに対し、Ｒｕ−ＡＰＡ（共役した）が加水分解される場合ＥＣＬは３１．８倍に増大した。これらの結論を確かなものにするデータは図１１にある。同図は下記するものにつき実験的に測定した発光を左から右に示す。非加水分解のＲｕ−ＡＰＡ；ＮａＯＨ加水分解のＲｕ−ＡＰＡ；非加水分解のＲｕ−ＡＰＡ；および −ラクタマーゼ加水分解のＡＰＡこの研究は６−ＡＰＡと電気化学発光性のルテニウム錯体との共役の結果、− ラクタム環が加水分解される時に電気化学発光を増大する分子内効果が生まれることを明瞭に示す。さらにアンピシリン共役体について実施例２で述べた結果と比較すると、Ｒｕ−ＡＰＡの加水分解はＲｕ−ＡＭＰの加水分解より著るしくより大きい電気化学発光を生むことが示される。ルテニウム原子はＲｕ−ＡＭＰにおけるよりＲｕ−ＡＰＡにおいて−ラクタム環に近接しているので、以上の結果は、ルテニウム錯体と−ラクタム環との間の距離は決定的な影響を及ぼすであろ −ラクタム加水分解に際して電気化学発光を一層劇的に変化させさえするであろう。図１２は極めて低い濃度のＲｕ−ＡＰＡの加水分解はＥＣＬで検出することができることを示す。一層特定的に図１２は、実験的に測定される電気化学発光に対する加水分解されていないＲｕ−ＡＰＡ（黒丸）および加水分解されたＲｕ− ＡＰＡ（白丸）の影響を示す。検出の下限界は５０ｎＭ（加水分解されたＲｕ− ＡＰＡに関する計器でのＥＣＬの相対的な計測数の読みが−３３であるのに対して加水分解されていないＲｕ−ＡＰＡ（共役した）のＥＣＬの相対的計測数は− ６４８であった）。これは（共役していない）アンピシリンの加水分解の検出限ための実験を行った。１０ｐＭのＲｕ−ＡＰＡの加水分解の際のＥＣＬの増大を、ない）が加水分解されるＥＣＬ標準曲線と比較した。６−ＡＰＡ標準曲線を外挿すると、この結果（図１３）により１０μＭのＲｕ−ＡＰＡ（共役している）の０μＭの６−ＡＰＡ（共役していない）の加水分解の際のＥＣＬの変化に等しい果、６−ＡＰＡ加水分解の際にみられるＥＣＬの変化が１２５倍となることが立証される。この結論を確かなものにするデータは、Ｒｕ−ＡＰＡ（共役している）それと比較して示す図１３中にある。三角印は１０μＭの加水分解されていないＲｕ−ＡＰＡ（白い三角）および加水分解されたＲｕ−ＡＰＡ（黒い三角）の電れていない６−ＡＰＡ（０〜１０００μＭ）（黒丸）および加水分解された６− ＡＰＡ（白丸）の電気化学発光作用を表わす。図１３の外挿線は１０μＭのＲｕ −ＡＰＡの加水分解に際しての電気化学発光の変化は、１０μＭのしての電気化学発光の変化と等しいことを示す。実施例４抗体−−ラクタマーゼ共役体の調製抗体−ラクタマーゼ共役体はすでに製造されている（Yolkenら、J．Immunol．Meth．７３（１９８４年）１０９〜１２３ページ；Svenssonら、Bioconj．Chem.５（１９９４年）２６２〜２６７ページ）。共役体は一般に、Sulfo-SMCC（スルホスクシンイミジル４−〔Ｎ−マレイミドメチル〕シクロヘキサン−１−カルボキシレート）のような市販で入手できる２官能性架橋剤を使用して製造され、本発明でもこれを使用した。二つのタンパク質を共有結合的に結合する別な方法が確立しており、これもまた用いられよう。抗体と酵素とが共役の後に生物学的活性を有する限り、任意の方法が好適である。 −ラクタマーゼ（３．７mg）を燐酸塩で緩衝化された０．５００ｍＬの食塩水（ＰＢＳ）中に溶解した。Sulfo-SMCC（５mg）を１．５００ｍＬのＰＢＳ中に溶解した。−ラクタマーゼの溶液とSulfo-SMCCの溶液とを混合して室温で４５分間反応させた。ハプテンＲＴ１に対して産生したモノクロナール抗体（５mg）をCentricon ３０コンセントレータ（concentrator）（Amicon）を使用してＰＢSへとバッファー交換した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ、５mg）をＰＢＳ中に溶解し、次いで抗−ＲＴ１抗体と混合して全体積を１，３００ｍＬとした。混合物を室温で３０分インキュベートし、ＴＴにＲＴ１のジサルファイド結合を還元させた。上記した二つの反応混合物中のタンパク質を、ＰＢＳで予め平衡化されている Sephadex Ｇ−２５ＭＰＤ−１０カラム（Pharmacia）を使用して脱塩した。回収したタンパク質は分光測光により２８０ｎｍで定量化した。収量は−ラクタマーゼ１．０mgおよび抗体３．１mgであることが判った。タンパク質溶液を次いで混合し、−ラクタマーゼと抗体とのモル比を１．５：１．０にした。タンパク質溶液を４℃で２２時間回転させて、酵素−抗体共役体を生成させた。反応に続いて、混合物をSephacryl Ｓ−３００カラム（Pharmacia）上でのクロマトグラフィーにかけた。三つの蛋白質の主ピークが得られた。クロマトグラフィー分離は大きさによるので、カラムから最初に溶離するピークは酵素−抗体共役体であると思われた。実施例５酵素イムノアッセイ −ラクタマーゼ−抗体共役体を使用するＥＣＬイムノアッセイは、質、ＰｅｎＧよりずっと高い感度で検出されるので、共役したＥＣＬ基質系を使用するのが好ましい。本発明では、抗体−酵素共役体（実施例４に記載のような−ラクタマーゼに結合した抗−ＲＴ１抗体）を使用してＥＣL酵素イムノアッセイを試験した。検体の存在は共役体の−ラクタマーゼ部分によってリポートされた。この部分はペニシリン、ＰｅｎＧを加水分解し、一方これが電気化学発光により値で読むことにより測定された。分析物Bovine Serum Albumin（ＢＳＡ）共役したＲＴ１ハプテン）を０、０．２、２．０および１０．０μｇ／mlで９６−ウェルプレート内で２時間３７℃においてインキュベートしてウェルプレートに付着させた。次に、各々のウェルにＰＢＳ中の３％ＢＳＡを２．００μＬ加えそしてウェルプレートを３７℃で約１時間インキュベートした。実施例４のクロマトグラフィー画分を５０μＬ、各ウェルに添加した。タンパク質のピークが最初に溶離した画分は、抗体−酵素共役体であると推測されるが、タンパク質のピークが遅れて溶離した画分は遊離した抗体または遊離した酵素であると推測され、これらはともに本実験でＥＣＬ信号を出さないはずである。ウェルプレートを４℃で１晩インキュベートし抗体−酵素共役体を分析物と結合させた。ウェルプレートを、０．０５％のTween を含有するＰＢＳで３回洗浄した。それぞれのウェルに１０ｍＭのＰｅｎＧを７５μＬ加えそしてウェルプレートを室温で３０分インキュベートして存在する−ラクタマーゼのすべてにＰｅｎＧ、を加水分解させた。インキュベーション段階の後、各ウェルから２５μＬを試験管に移し入れた。それぞれの試験管に１２０μＭのＥＣＬ酵素イムノアッセイの結果を図１４に示す。直線１に用いたタンパク質は上記で推測した抗体−酵素共役体であった。図１４で知りうるように、直線１のＥＣＬ計測数は分析物濃度の増加とともに増加する。このことは、抗体−酵素を促進する形にしたことを示している。試験した分析物の最低濃度の０．２μｇ／ｍＬでさえ検出可能であった。他の直線（２〜４）は遊離の抗体および遊離の酵素をおそらく代表する他のクロマトグラフィー画分を示す。対照実験と考えることのできるこれらの直線は分析物の濃度の増大に伴うＥＣＬの増大をほとんどを使用して分析物を感度良く検出するために、酵素イムノアッセイに抗体−酵素共役体が使用された。−ラクタム加水分解をＥＣＬにより検出するのに物より著しく感度が高いので、本明細書に述べた結果は、共役した基質を使用することによりおそらく大幅に改善されることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者リアング，パムアメリカ合衆国 22209 バージニア州アーリントン，エヌ．コロニアルテラス 1534

Claims

【特許請求の範囲】１．電気化学発光性ラベルおよび酵素基質の存在下で酵素と共役した抗−分析物を分析物と接触させそして電気化学発光を測定し、そしてこの電気化学発光を標準と比較することからなる分析物を検出しそして定量的に測定する方法。２．電気化学発光性ラベルと酵素基質とが共役している請求の範囲第１項記載の方法。３．酵素が−ラクタマーゼ、プロテアーゼまたは酸化還元酵素である請求の範囲第２項記載の方法。４．基質が抗生物質、ペプチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドである請求の範囲第２項記載の方法。５．基質が有機ＥＣＬ検出体または有機金属ＥＣＬ検出体でラベルされる請求の範囲第２項記載の方法。６．ＥＣＬ検出体がルブレン、９，１０−ジフェニルアントラセン、ルテニウム含有化合物およびオスミウム含有化合物からなる群から選択される請求の範囲第５項記載の方法。７．ＥＣＬ検出体がルテニウムIIトリス−ビピリジンキレートである請求の範囲第５項記載の方法。８．予め測定した量の、酵素と共役した抗−分析物と予め測定した量の電気化学発光性ラベルおよび酵素基質そして参照標準からなり、予め測定した量が一つの試料の測定を実施するのに十分である、検体を測定するためのキット。９．電気化学発光性ラベルと酵素とが共役している請求の範囲第８項記載のキット。 10．酵素が−ラクタマーゼ、プロテアーゼまたは酸化還元酵素である請求の範囲第９項記載のキット。 11．基質が抗生物質、ペプチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドである請求の範囲第９項記載のキット。 12．基質が有機ＥＣＬ検出体または有機金属ＥＣＬ検出体でラベルされている請求の範囲第９項記載のキット。 13．ＥＣＬ検出体がルブレン、９，１０−ジフェニルアントラセン、ルテニウム含有化合物およびオスミウム含有化合物からなる群から選択される請求の範囲第１２項記載のキット。 14．ＥＣＬ検出体がルテニウムIIトリス−ビピリジンキレートである請求の範囲第１２項記載のキット。 15．電気化学発光を発生する手段と電気化学発光を測定する手段とをさらに包含する請求の範囲第８項記載のキット。 16．−ラクタマーゼでラベルした抗−分析物を含む酵素と共役した抗−分析物組成物。 17．基質が抗生物質、ペプチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドである電気化学発光性のラベルされた酵素基質。 18．有機ＥＣＬ検出体または有機金属ＥＣＬ検出体である電気化学発光性ラベルを有する請求の範囲第１７項記載のラベルされた酵素基質。 19．ＥＣＬ検出体がルブレン、９，１０−ジフェニルアントラセン、ルテニウム含有化合物およびオスミウム含有化合物からなる群から選択される請求の範囲第１８項記載のラベルされた酵素基質。 20．ＥＣＬ検出体がルテニウムIIトリス−ビピリジンキレートである請求の範囲第１８項記載のラベルされた酵素基質。