JPH0521554B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、複合酵素反応による生理活性物質の
製造方法に関するものである。

（従来の技術） 近年、現行の化学工業の見直しから、生体内の
化学反応が注目されるようになり、生体内の化学
反応を工場内の反応器で再現しようとする試みが
盛んに行われるようになつてきている。元々、生
体内では生命を維持するために数多くの生合成反
応が酵素を触媒として営まれており、これらは化
学合成反応では合成困難な化合物を容易に与える
だけでなく、省エネルギー性、無公害性など社会
の要請に応える要素も有しているので、化学工業
界における必須の技術になろうとしている。こら
の中でも、加水分解反応、異性化反応などの技術
分野においては、既に実用化のレベルに達してい
るものもある。

しかし、生合成反応の中でも特に重要な反応で
ある結合反応を行うに当たつては、アデノシン−
5′−三リン酸（以下ATPという。）がエネルギー
源又は補助因子として必要である。この際、
ATPはエネルギー源又は補助因子として働いた
後、アデノシン−5′−二リン酸（以下ADPとい
う。）又はアデノシン−5′−一リン酸（以下AMP
という。）に分解され、消費されてしまうことに
なる。したがつて、結合反応を工業的に再現する
ためには、ATPが安価に供給されることが必要
であるが、現実にはATPは極めて高価な物質で
ある。それゆえに、ATPの消費後の姿である
ADP、AMP特に最低のエネルギーレベルに消費
されつくしたAMPをATPに再生変換すること
が、この問題点を打開する重要な技術となるので
ある。

ところが、このような結合反応による物質の製
造をATPを再生しながら行うという例はあまり
知られていない。例えば、消費されたATPを微
生物の解糖系を利用して再生又は補給しようとい
う考えがあり、ここでATPの原料としてAMPを
使用するという例がある（例えば、栃倉例辰六郎
ら有機合成化学、第39巻、第６号、487頁、1981
年）。しかし、このAMPはATPの消費後の姿で
なく、ATP源として別に加えるものであり、し
かもこの試みの結果はAMPのATPへの変換効率
は極めて悪いというものであつた（同上文献）。
すなわち、微生物の解糖系を利用する場合も、
ATPをその消費後の姿であるAMPから再生する
ということについては否定的な推測しか得られて
いなかつた。

従来、このような観点からATPをAMPに連続
的に消費して有用物質を合成するための反応器
（バイオリアクター）の概念が考えられ、このシ
ステムの完成が強く要望されていた。

本発明者らは、先にこれらの実情に鑑み、特に
最低のエネルギーレベルに分解した産物である
AMPをATPに変換再生することにつき鋭意検討
した結果、最適生育温度が50℃ないし85℃である
微生物の産生する変換酵素を使用すると、短時間
で高収率でAMPをATPに変換できることを見出
し、またAMPとATPとの混合比を特定の条件に
制御してAMPをATPに再生すると、安価でかつ
操作性良く、長時間安定してAMPを実質上ほと
んど100％ATPに変換できることを見出し、さら
に引続き検討を重ねた結果、この知見に基づいて
(a)AMPからATPに再生する反応系と、(b)ATP
を用いて生理活性物質を合成する反応系とを連結
することにより、最低のエネルギーレベルに分解
した産物であるAMPを原料として生理活性物質
が合成されることを見出し、特許出願した（特開
昭59−106296号公報参照）。

一方、ジー エム ホワイトサイズ（G.M.
Whitesides）らは、ADPからATPを再生する反
応系と、ATPを用いて生理活性物質を合成する
反応系とを同一の反応器で生理活性物質を合成し
た例を報告している。〔例えば、J.Org.Chem.48，
3130（1983）〕。

（発明が解決しようとする問題点） 上記特開昭59−106296号公報に記載の生理活性
物質合成反応系とATPをAMPから再生産する反
応系とを一つの反応器の中に共存せしめて、反応
器の一端より原料を供給し、反応器の他端から生
理活性物質を抜き出す方法（以下フロー法とい
う。）で長時間連続的に生理活性物質の合成を行
うと、反応装置の内部に沈澱が析出し、これによ
り装置の内部が詰まり、原料液の送液を中止せざ
るを得なかつた。また酵素を水不溶性担体に固定
化している場合、生成した沈澱がこの担体表面に
付着し、原料液と酵素の接触が妨げられるため
に、酵素活性が低下し、目的とする生理活性物質
の生成量が低下する傾向があつた。

一方、上記ホワイトサイズ（G.M.Whitesides）
らの方法は、ATPを再生する反応系がADPから
のものであるが、バツチ法によつて生理活性物質
を製造するため、その生産性は非常に低かつた。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、前期のフロー法で連続的に生理
活性物質を製造するうえでの問題点について鋭意
研究を重ねた結果、原料液中の２価の金属イオン
濃度を30mM以下にし、かつアデノシン−5′−リ
ン酸化物（以下AXPという。）の濃度を生理活性
物質前駆体の濃度よりも低くしたところ、上述の
問題点が解決され、フロー法で連続的に生理活性
物質が製造できることを見出し、本発明を完成し
た。

すなわち本発明は、ADPをATPに変換する酵
素と、ATPをADPに変換しながら生理活性物質
を合成する酵素を同一の反応器に共存せしめた複
合酵素反応系を用いて、該反応器の一端から生理
活性物質前駆体、アデノシン−5′−リン酸化物及
び２価の金属イオンを含む原料液を供給し、該反
応器の他端から生理活性物質を抜き出して製造す
るに際し、該反応器に供給する２価の金属イオン
の濃度を30mM以下にし、かつAXPの濃度を生
理活性物質前駆体の濃度よりも低くすることを特
徴とする複合酵素法による生理活性物質の製造方
法である。

本発明において、ATPをADPに変換して生理
活性物質を合成せしめる酵素反応（以下合成反応
という。）としては、例えば、NAD⁺を前駆体と
してNAD⁺キナーゼによりNADP⁺を合成する反
応、ジヒドロキシアセトンを前駆体としてグリセ
ロールキナーゼによりジヒドロキシアセトンリン
酸を合成する反応、グルコースを前駆体としてグ
ルコキナーゼによりグルコース６−リン酸を合成
する反応、リブロース５−リン酸を前駆体として
ホスホリブロキナーゼによりリブロース１，５−
ビスリン酸を合成する反応、グリセロールを前駆
体としてグリセロールキナーゼによりグリセロー
ル３−リン酸を合成する反応、クレアチンを前駆
体としてクレアチンキナーゼによりクレアチンリ
ン酸を合成する反応、グルタミン酸とシステイン
を前駆体としてγ−グルタミルシステイン合成酵
素によりγ−グルタミルシステインを合成する反
応、γ−グルタミルシステインとグリシンを前駆
体としてグルタチオン合成酵素によりグルタチオ
ンを合成する反応、アデノシンを前駆体としてア
デノシンキナーゼによりAMPを合成する反応、
グルタミン酸とアンモニアを前駆体としてグルタ
ミン合成酵素によりグルタミンを合成する反応、
コリンを前駆体としてコリンキナーゼによりホス
ホコリンを合成する反応、パントテン酸を前駆体
としてパントテン酸キナーゼにより4′−ホスホパ
ントテン酸を合成する反応、ピルピン酸を前駆体
としてピルビン酸キナーゼによりホスホエノーピ
ルビン酸を合成する反応などがあげられる。

本発明において、上記合成反応系でATPは消
費され、ADPになるわけであるが、このADPを
リン酸供与体の存在下にADPをATPに変換する
酵素によりATPに変換する（以下ATP再生反応
系という。）。このADPをATPに変換する酵素と
しては、例えば酢酸キナーゼ、カルバミン酸キナ
ーゼ、クレアチンキナーゼ、３−ホスホグリセリ
ン酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ポリリン酸
キナーゼなど多くのものが使用でき、またリン酸
供与体としては例えばアセチルリン酸、カルバモ
イルリン酸、クレアチンリン酸、３−ホスホグリ
セロイルリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ポ
リリン酸などが使用されるが、リン酸供与体の価
格、ATPへの変換活性、酵素の入手の容易さな
どを勘案すると、酢酸キナーゼを使用するのが最
も有利であり、この際リン酸供与体としてはアセ
チルリン酸が使用される。アセチルリン酸は、ア
ンモニウム塩、カリウム・リチウム塩、ナトリウ
ム塩などの塩として使用することができるが、入
手のしやすさから二ナトリウム塩を用いることが
好ましい。

このような酵素を使用することにより、生成
ADPをATPに再生しながら生理活性物質を合成
することが可能になるが、このうちADPをATP
に変換する酵素は、最適生育温度が50℃ないし85
℃である微生物の産生する酵素であることが望ま
しい。このような微生物としてはバチルス・ステ
アロサーモフイルス、バチルス・ブレビス、バチ
ルス・コアギユランス、バチルス・サーモプロテ
オリテイクス、バチルス・アシドカルダリウスな
どのバチルス属の微生物、クロストリジウム属の
微生物、サーモアクチノマイセス属の微生物、ア
クロモバクター属の微生物、ストレプトマイセス
属の微生物、ミクロポリスポラ属の微生物、サー
マス・アクアテイクス、サーマス・サーモフイル
ス、サーマス・フラブスなどのサーマス属の微生
物、サーモミクロビウム属の微生物、カルデリア
属の微生物などがあげられる。また、これら微生
物の遺伝子を導入した常温生育微生物も含まれ
る。これら微生物の中でも酢酸キナーゼの産生に
特に適したものはバチルス・ステアロサーモフイ
ルスである。この微生物から得られる酵素は精製
が容易であり、比活性が高い。研究当初において
は、最適生育温度が50℃ないし85℃である微生物
の産生する変換酵素を使用することは、常温での
ATP再生産には適しないと考えられていたが、
驚くべきことに常温で短時間、高収率で長時間安
定してAMPをATPに変換でき、これらの効果は
むしろ常温生物が産生する酵素をはるかにしのぐ
ものなのである。

本発明に用いられる反応器としては、同一の反
応器の中に生理活性物質を合成するための上記酵
素と、ATPを再生産するための上記酵素とを共
存させうるものであればいかなるものでもよい
が、各々の酵素量、原料液の濃度、PH及び供給速
度、反応温度などによつて反応器の大きさ及び形
状を選定すればよい。その反応器の形状として
は、例えば膜型の反応器、カラム型の反応器を使
用することができる。膜型反応器は、生理活性物
質が低分子物質の場合に特に有効に使用できる。
この際酵素は高分子物質であるので、各酵素はそ
のまま反応器の中にとどまつた状態で使用するこ
とができる。

次に、カラム型反応器は生理活性物質の如何を
問わず使用できる。この場合には、使用する各酵
素を適当な担体、例えばセルロース、デキストラ
ン、アガロースなどのよなうな多糖類の誘導体、
ポリスチレン、エチレン−マレイン酸共重合体、
架橋ポリアクリルアミドなどのようなビニルポリ
マーの誘導体、Ｌ−アラニンＬ−グルタミン酸共
重合体、ポリアスパラギン酸などのようなポリア
ミノ酸又はアミドの誘導体、ガラス、アルミナ、
ヒドロキシアパタイトなどのような無機物の誘導
体などに結合、包括あるいは吸着せしめて、いわ
ゆる固定化酵素としてカラムに充填して使用すれ
ばよい。

本発明において、上記した反応器に供給する原
料液としては、例えば生理活性物質前駆体、リン
酸供与体、AXP、２価の金属イオンなどが含ま
れており、その生理活性物質前駆体及びリン酸供
与体の例としては、先に述べた化合物があげられ
る。AXPとしては、ADPのみを使用することも
できるが、ATPのみ又はADPとATPの混合物の
いずれかを使用するよく、また生理活性物質合成
反応終了後、反応液から回収したAXPを再使用
してもよい。

本発明においてAXPの原料液中の濃度（モル
濃度）は、生理活性物質前駆体の濃度より常に低
く用いることが必要であり、その濃度としては生
理活性物質前駆体の濃度の0.01％ないし90％、好
ましくは0.1％ないし50％、より好ましくは0.5％
ないし10％である。

また、リン酸供与体の量としては、生理活性物
質前駆体と当量かあるいはそれ以上であることが
高収量の目的物を得るのに適している。

本発明において、２価の金属イオンの濃度を
30mM以下にすることが必要であり、特に20mM
以下にすることが沈澱の生成をより防ぐ意味から
しても好ましい。そのような金属イオンとして
は、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオ
ン、カルシウムイオン、コバルトイオン、カドミ
ウムイオン、バリウムイオンなどがあげられる。

本発明において、上記組成の原料液を連続的に
反応器の一端から供給し、反応器の他端から生理
活性物質を抜き出して生理活性物質が製造される
が、この原料液の供給に際し、原料液の濃度を上
記条件を満足するように制御する。原料液の濃度
を制御しながら連続的に反応器に供給する方法と
しては、例えばあらかじめすべて原料を所定の濃
度に調整した原料混合液を作成し、これをポンプ
などにより連続的に反応器に送液する方法、又は
原料をあらかじめ混合せずに各々の原料液を別々
に反応器に供給し、その送液速度により反応器入
口において所定の濃度に保つ方法などがあげられ
る。

（実施例） 次に、本発明を実施例及び比較例によつて具体
的に説明する。

実施例 １ 酢酸キナーゼとグルコキナーゼは市販バチル
ス・ステアロサーモフイルス由来の標品（生化学
工業販売）を使用し、CNBr−活性化セフアロー
ス4B（フアルマシア社製）に固定化した。固定化
酵素キナーゼ20ユニツトと固定化グルコキナーゼ
20ユニツトを一つのカラムに充填した。

次いで、5mM塩化マグネシウムを含む100mM
トリス塩酸緩衝液PH８に溶解した10mMグルコー
ス、1mMADP、15mMアセチルリン酸二ナトリ
ウム塩、20mMメルカプトエタノールからなる原
料液を30ml／時間の流速で固定化酵素カラムに供
給し、同速度でグルコース６−リン酸を連続的に
抜き取つた。

抜き取つたカラム溶出液中のグルコース６−リ
ン酸濃度は8.5mMであり、以後20時間にわたつ
て安定にグルコース６−リン酸が生成した。

このときのカラムの温度を30℃に保つた。

比較例 １ 実施例１における原料液中の塩化マグネシウム
濃度を40mMに変更した以外は、実施例１と全く
同様にして行つた。

その結果、２時間後にカラム内に沈澱が生成し
たので、カラムへの原料送液を中止した。

比較例 ２ 実施例１における原料液中のADP濃度を
20mMに変更した以外は、実施例１と全く同様に
して行つた。

その結果、３時間後にカラム内に沈澱が生成し
たので、カラムへの原料送液を中止した。

実施例 ２ 実施例１と同様にして固定化酢酸キナーゼ160
ユニツトと固定化グルコキナーゼ130ユニツトを
一つのカラムに充填した。

次いで5mM塩化マグネシウムを含む100mMト
リス塩酸緩衝液PH８に溶解した100mMグルコー
ス、1mM ADP、120mMアセチルリン酸二ナト
リウム塩、20mMメルカプトエタノールからなる
原料液を25ml／時間の流速で固定化酵素カラムに
供給し、同速度でグルコース６−リン酸を連続的
に抜き取つた。

抜き取つたカラム溶出液中のグルコース６−リ
ン酸濃度は100mMであり、以後40時間にわたつ
て 安定にグルコース６−リン酸が生成した。

このときのカラムの温度を30℃に保つた。

比較例 ３ 実施例２における原料液中の塩化マグネシウム
濃度を50mMに変更した以外は、実施例２と全く
同様にして行つた。

その結果、１時間後にカラム内に沈澱が生成し
たので、カラムへの原料送液を中止した。

比較例 ４ 実施例２における原料液中のADP濃度を
150mMに変更した以外は、実施例２と全く同様
にして行つた。

その結果、２時間後にカラム内に沈澱が生成し
たので、カラムへの原料送液を中止した。

実施例 ３ メソツド・イン・エンザイモロジー（Method
in Enzymology）17巻Ａ、第910頁、1970年、ア
カデミツクプレス発行の方法に従い、エンエリシ
ア・コリから調製したグルタミン合成酵素100ユ
ニツトと市販エンエリシア・コリ由来の酢酸キナ
ーゼ（ベーリンガ−・マンハイム社製）100ユニ
ツトを20mM塩化マグネシウムを含む100mMト
リス塩酸緩衝液PH7.5に溶解して、分子量30000の
限外濾過膜を使つた膜型反応器に封入した。

次いで、20mM塩化マグネシウムを含む
100mMトリス塩酸緩衝液PH7.5に溶解した50mM
塩化アンモニウム、50mML−グルタミン酸、
10mM ADP、80mMアセチルリン酸二ナトリウ
ム塩及び10mMメルカプトエタノールからなる原
料液を流速10ml／時間で供給し、同速度でグルタ
ミンを連続的に抜き取つた。

反応器からの流出液中の生成グルタミン濃度は
35mMに達し、以後６時間にわたつて安定にグル
タミンが生成した。

実施例 ４ 市販酢酸キナーゼ（生化学工業販売）とコリン
キナーゼ（ベーリンガ−・マンハイム社製）を
CNBr−活性化セフアロース4B（フアルマシア社
製）に固定化した。固定化酵素キナーゼ５ユニツ
トと固定化コリンキナーゼ５ユニツトを一つのカ
ラムに充填した。

次いで、15mM塩化マグネシウムを含む
100mMトリス塩酸緩衝液PH8.5に溶解した5mM
コリン、1mM ADP、8mMアセチルリン酸二ナ
トリウム塩、5mMジチオスレイトールからなる
原料液を５ml／時間の流速で固定化酵素カラムに
供給し、同速度でＯ−ホスホコリンを連続的に抜
き取つた。

抜き取つたカラム溶出液中のＯ−ホスホコリン
の濃度は4.5mMであり、以後８時間にわたつて
安定にＯ−ホスホコリンが生成した。

このときのカラムの温度を30℃に保つた。

（発明の効果） 本発明によれば、反応器内に沈澱が生じること
なくフロー法で連続的に生理活性物質を合成する
ことが可能になり、リアクターの操作性、目的生
理活性物質の生産性が著しく向上する。さらに、
反応器内の酵素の失活も防ぐことができ、長期の
連続運転が可能となる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アデノシン−5′−二リン酸をアデノシン−
   5′−三リン酸に変換する酵素と、アデノシン−
   5′−三リン酸をアデノシン−5′−二リン酸に変換
   しながら生理活性物質を合成する酵素を同一の反
   応器に共存せしめた複合酵素反応系を用いて、該
   反応器の一端から生理活性物質前駆体、アデノシ
   ン−5′−リン酸化物及び２価の金属イオンを含む
   原料液を供給し、該反応器の他端から生理活性物
   質を抜き出して生理活性物質を製造するに際し、
   該反応器に供給する２価の金属イオンの濃度を
   30mM以下にし、かつアデノシン−5′−リン酸化
   物の濃度を、生理活性物質前駆体の濃度よりも低
   くすることを特徴とする複合酵素法による生理活
   性物質の製造方法。