JPH0427392A - Ｇ６アミラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は好アルカリ性バチルス属細菌由来のアミラーゼ
遺伝子に関する。更に詳細には、好アルカリ性バチルス
属細菌Ｈ−１６７株由来のマルトヘキサオース生成アミ
ラーゼ（Ｇ６アミラーゼ）をコードするアミラーゼ遺伝
子、及びアミラーゼ遺伝子発現用調節遺伝子に関する。

（従来の技術） 従来、澱粉からブドウ糖、麦芽糖などを製造するために
用いる酵素として、グルコアミラーゼ、β−アミラーゼ
、糖化型α−アミラーゼ、液化型α−アミラーゼなどの
アミラーゼが知られている。

最近では、α−１，４−グルコシド結合でグルコビラノ
ースが直鎖状に結合したマルトヘキサオースなどのオリ
ゴ糖がすぐれた各種特性を有することから、これらオリ
ゴ糖の食品、医薬品への用途開発が盛んに行われている
。

これらオリゴ糖を製造するために用いる酵素としては、
マルトヘキサオース生成アミラーゼ（Ｇ６アミラーゼ）
が知られており、例えばバチルス・サーキュランス［−
２株が産生するＧ６アミラーゼ［ＡＱｒｉｃ、Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、、　５１　（６）　、　１５２１〜１５２
７　（１９８７）］、バチルス属細菌Ｈ＝１６７株が産
生ずるＧ６アミラーゼ［特開昭６２−２０８２７８号公
報；　Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ可ｌ、４４３　
　（１９８８）　　：　ＡＤＤｌ、Ｈｉｃｒｏｂｉ。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、、２８．２８１　（１９８８）
　１などｈ＜ある。バチルス属細菌Ｈ−１６７株由来の
Ｇ６アミラーぜは、好アルカリ性バチルス属細菌が産生
するアミラーゼであって耐アルカリ性を示し安定ｐＨ範
囲が広く、耐熱性にも優れており、今後の開発が期待さ
れるものである。

遺伝子組換え技術を用いたＧ６アミラーゼの製造法につ
いての研究も行われており、例えば、バチルス・サーキ
ュランスＦ−２株由来のＧ６アミラーゼをコードする遺
伝子が明らかにされている（特公昭６３−５０７６号公
報）。また、バチルス属細菌１−１−１６７株由来の０
６アミラーゼについても、その遺伝子をベクターｐＢＲ
３２９を用いＴＥ、ＣＯｊ！ｌ　　ＨＢ１０１中でクロ
ーニングしＧ６アミラーゼが発現された例が報告されて
いる［＾ｇｒｉｃ、Ｂｉｏ１．ｃｈｅｉ、、　５３　（
２＞　、　４９１−４９５　（１９８９）］。

しかしながら、バチルス属細菌Ｈ−１６７株由来のＧ６
アミラーゼについてはそのアミノ酸配列は明らかにされ
ておらず、またそれをコードする遺伝子の＠呈配列の解
明も末だなされていない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明の目的は、好アル７Ｊり性バチルス属細菌Ｈ−１
６７株由来のＧ６アミラーゼをコードする遺伝子を提供
することにある。

本発明の他の目的は、好アルカリ性バチルス属細菌１−
１−１６７株由来のＧ６アミラーゼをコードする遺伝子
を発現するために用いる調節遺伝子を提供することにあ
る。

（課題を解決するための手段） 本発明によれば、 第１図に示すアミノ酸配列を有するＧ６アミラーゼある
いはそれと同様の酵素活性を有するポリペプチドをコー
ドするＧ６アミラーゼ遺伝子が提供される。

更に本発明によれば、 第２図に示すＤＮＡ塩基配列の８番目から２４３番目ま
でのＤＮＡ塩基配列を有するＧ６アミラーゼ遺伝子発現
用調節遺伝子が提供される。

以下に、本発明のＧ６アミラーゼ遺伝子及び調ＷＪ遺伝
子の塩基配列決定の方法及びそれら塩基配列の特徴等に
ついて詳細に説明する。

（１）　　遺伝子の供与体 本発明の遺伝子の供与体となった好アルカリ性バチルス
属細菌）−１−１６７株は、昭和６１年３月５日付けに
て工業技栴院微生物工業技術研究所に寄託され、受託番
号としてＦＥＲＭ　　Ｐ−８６８３が付与されており、
特開昭６２−２０８２７８号公報に報告されている。こ
の菌株は以下に述べる菌学的性質を有する。

（ａ）形態：単桿菌、大きさ（０，４〜０．７）Ｘ　（
２，０〜３．０）μｍ、ダラム陰性、運動性を有する。

球形〜楕円形の胞子を形成する。

（ｂ）生理学的性質 イ）硝酸塩の還元：＋ 口）脱窒反応； ハ）ＶＰテスト： 二）インドールの生成： ホ）ｌｉｉｉ化水素の生成： へ）澱粉の加水分解：＋ カゼインの加水分解： 無機窒素の利用： 色素の生成；＋ ウレアーゼ： オキシダーゼ：＋ ＋ カタラーゼ：＋ ソ） ツ） 酸素に対するＢ度：好気性 クエン酸の利用： ０−Ｆテスト：好気的及び嫌気的に酸を生成 耐塩性：１２％食塩濃度で生育 生育範囲（ｐＨ及び温度）：ｐＨ７−１２；最適ｐＨ９
−１０゜温度２０−５２℃；最適温度３５−４５℃。

炭素源の利用：Ｄ−グルコース、し−アラビノース、Ｄ
−キシロース、ンルトース、シュークロース及びソルビ
トールより好気的及び嫌気的に酸を生成する。しかし、
ガスの発生はない。

ＤＮＡ塩基組成：　ＤＮＡのＧＣ含有半は４６、３％。

バチルス属細菌）１−１６７株が産生するＧ６アミラー
ゼは、アラレカリ側（ｐＨ１０−１１＞にその最適作用
Ｄｌｌを有し、且つ熱安定性の高いマルトヘキサオース
生成アミラーゼである（特開昭６２−２０８２７８号公
報）。

（２）　　Ｇ６アミラーぜ遺伝そのクローニングつぎに
０６アミラーゼ遺伝子のクローニングの手順に付いて説
明する。好アルカリ性バチルス属鵬菌Ｈ−１６７株をＧ
６アミラーゼの遺伝子供与体として用い、クローニング
の為の宿主としては例えば大腸菌）−１８１０１株を用
いる。ベクターは例えばプラスミドＤＢＲ３２９を使用
する。

即ち、バチルス属細菌）−１−１６７株を培養してその
菌を回収し、そのクロモシーム１）ＮＡを例えばフェノ
ール法［Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ
＋ｃａＡｃｔａ　　７２．６１９−６２９　（１９６３
）コによりＷ４製する。これを制限酵素、例えば３ａｕ
３ＡＩで部分消化して密度勾配遠心法により処理して２
ｋｂ以上のＤＮＡ断片を得る。この断片を、あらかじめ
ＤＩ限酵素３ａｍＨＩで切断したプラスミドｐＢＲ３２
９にＴ　４１）　Ｎ　Ａリガーぜを用いて連結し、得ら
れる反応物を用いて大腸菌）−１８１０１株を形質転換
し、常法に従ってショットガンクローニングを行う。目
的とするＱ６アミラーぜ遺伝子を含有するクローンの選
別には、スターチ・アズール（Ｓｔａｒｃｈ　ａｚｕｌ
ｅ）　（Ｓｉｇｎａ社）及びクロラムフェニコールを含
むしＢ寒天培地上で形質転換体を培養して、コロニーの
周囲に明瞭なりリアゾーン（ｈａｌｏ）が形成されるコ
ロニーを選別することによって行う。

以上の手法により、目的のクローンが一株得られた。型
開の保持するプラスミドは、ｐＢＲ３２９の１３ａｍＨ
１部位に約３，３ｋｂのＧ６アミラーゼ遺伝子を含む挿
入断片を持っていた。木組換えプラスミドをｐｓＢ４０
４と命名した［＾ｇｒｉｃＢｉｏ１．Ｃｈｅｇｉ、、　
５３　（２）　、　４９１〜４９５　（１９８９）］。

このプラスミドｐＳＢ４０４上のＧ６アミラーゼ遺伝子
を以下に示す塩基配列決定に用いる。

ｆ３）　　Ｇ６アミラーゼ遺伝子の塩基配列の決定組換
えプラスミドｐＳＢ４０４上のＧ６アミラーピ遺伝その
塩基配列は、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシチェーンターミ
ネーション法［Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、、９４　。

４４１＜　１９７５）　：Ｐｒ０Ｃ，Ｎａｔｌ、ＡＣａ
ｄ、ＳＣｉ、　ｌｌ５Ａ７４．５４６３　（１９７７）
コに従って決定することができる。

即ち、例えば、Ｅ、ｃｏＪ！ｉ　　ＭＶ１１８４とＤＵ
Ｃ１１８、ｐＵｃコ１９の宿主ベクター系［宝酒造■コ
を用いて、Ｇ６アミラーゼ遺伝子のサブクローニングを
行う。対象とするＤＮＡ断片を効率良く無駄なく配列決
定するために、プラスミドｐｓＢ４０４の制限酵素地図
［ＡＯｒｌＣ，ＢＩＯＣｈｅｍ、、５３　（２）、４９
１〜４９５　（１９８９）を利用した強制りＵ−ニング
とデレージョン［Ｇｅｎｅ、２８，３５１〜３５９　（
１９８４）：Ｇｅｎｅ、３３，１０３〜１１９　（１９
８５）コを併用してサブクローニゲを行うのがよい。次
いでヘルパーファージＭ１３ＫＯ７［宝酒造■；Ｖｉｅ
ｉｒａ１．ａｎｄ　Ｈｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、　　（１９８
７）　Ｍｅｔｈｏｄｓｎ　Ｅｎｚｙｎ＋ｏｌｏｇＶ、　
１５３　、３−１１　Ｅを各サブクローンに感染させる
ことにより、対象とするＤＮＡ断片を含有するＤＮＡ−
重鎖がファージ粒子に包み込まれ、該ファージ粒子がサ
ブクローンの菌体外に放出される。このファージ粒子を
フェノール処理し、常法により塩基配列決定に必要な高
純度の一重鎖テンプレートＤＮＡが得られる。

このＤＮＡを用いて、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシチェー
ンターミネーション法に基いて塩基配列の決定を行うこ
とができる。

（４）　　塩基配列の特徴 上記の塩基配列決定法により、第２図に示すＤＮＡ塩基
配列が得られた。開始コドンＴＴＧ（２４４番目の塩基
）で始まり、終止コドンＴＡＧ（３１０９１０９番目わ
る、２．８６５ｂｐからなるオーブン・リーディング・
フレームが見い出された。このオーブン・リーディング
・フレームに対応するアミノ酸配列をアミノ酸の１文字
表記により第２図に同時に示した。また第２図で得られ
たアミノ酸配列（開始コドンに対応するＭがら、終止コ
ドンの前の」トンに対応するＰまで）を第１図に示した
。ここで得られた第１図に示すＧ６アミラーゼのアミノ
酸配列は本発明前によって初めて明らかにされたもので
ある。本発明では、第１図に示すアミノ酸配列をコード
する全てのＧ６アミラーゼ遺伝子が本発明の範囲内に包
含される。

また、本発明では、第１図に示すアミノ酸配列を有する
Ｇ６アミラーゼと四様の酵素活性を有するポリペプチド
をコードする遺伝子も本発明の範囲内に包含される。こ
のような遺伝子の例として以下のものが挙げられる。

即ち、微生物から高等植物、哺乳類に至るまでα−アミ
ラーゼのアミノ酸配列には、活性部位もしくは基質結合
部位にあたると思われる三つの共通部分が存在すること
が知られている［ＪＢｉｏｃｈｅｎ、、　９８．９５〜
１０３　（１９８５）　：＾ｐｐ１．Ｈｉｃｒｏｂｉｏ
１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．、　２３　、３５５〜３６
０　コ　。

以下に示す３つのアミノ酸配列： ＡＳｐ−Ａ　　Ｉ　　ａ−Ｖａ　　ｌ　　−１１ｅ−Ａ
ｓｎＨｉｓ（領域Ａ）； ＧＩＶ−Ｐｈｅ−△ｒｇ−１ｅｕ−ＡｓｐＡ　ｌ　ａ−
Ａ　ｌ　ａ−Ｌｙｓ−Ｈｉ　ｓ　（領１ＢＩＰｈｅ−Ｖ
ａ　　１−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｈｉ　　５ＡＳｐ（領域Ｃ
） がその共通配列である。ＤＮＡの塩基配列から推定した
Ｇ６アミラーゼのアミノ酸配列の中にもこれらの共通領
域が認められた。これらの共通領域Ａ、Ｂ、Ｃは第２図
のアミノ酸配列のＦに下線でそれぞれ示した。従ってこ
れらの共通領域Ａ、Ｂ、Ｃを少なくとも含有し、他のア
ミノ酸配列部分が置換あるいは欠失し、且つ第１図に示
すアミノ酸配列を有するＧ６アミラーゼと同様の酵素活
性を有するポリペプチドをコードする遺伝子も本発明に
包含される。

また、Ｇ６アミラーゼの分子間は本来、約１０ｏ、ｏｏ
ｏであるが、プロテアーゼによってＣ末端側が切断され
、約６０．０００までプロセッシングされることが知ら
れている［　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉ。

Ｃｈｅｌｌｌ、、５３（２）、４９１　〜４９５　　（
１９８９）］。このプロ廿ツシングによって酵素の及応
特異性や反応生成物などの品持性が変化するわけではな
いことも明らかになっている。従って、第１図に示すア
ミノ酸配列のＣ末端側から約１／′３までを欠失したア
ミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子も
本発明に包含される。

また、後述する実施例に示したように、バチルス属細菌
Ｈ−１６７株が産生するＧ６アミラーゼを実際に精製し
、そのＮ末端のアミノ酸配列を決定したところ、第１図
に示したアミノ酸配列の３４番目の３ｅｒから始まる配
列と一致した。従って、それより前の部分は菌体外への
分泌過程で、シグナルペプチドとして働き、切断された
ものと考えられる。このことから第１図のＮ末端のＭか
ら３３番目のへまでを欠失したアミノ酸配列からなるポ
リペプチドをコードする遺伝子も本発明に包含される。

第２図に示されているように、Ｇ６アミラーゼ遺伝子の
開始コドンの１０塩基上流にはリボソーム結合部位（Ｓ
Ｄ）と思われる配列 （ＡＧＧＡＧＡ＞が、更にその上流にはσ５５タイプの
プロモーター様配列（”　−３５″配列、ＴＴＧＡＴＴ
　：　”−１０″配列、ＴＡＧＡＡＴ　）［Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　　１１　、　２２３７
〜２２５５　（１９８３）］が、認められた。これらの
配列を含む、第２図に示す８番目から２４３番目までの
ＤＮＡ１！基配列からなる調節領域は新規なものであり
、例えばＥ、ｃｏｊ！　ｉでの各種のＧ６アミラーゼの
発現用に使用することが可能なものである。

第２図に示したように、終止コドンの約１００塩基を流
の３２１２〜３２２６番目及び３２３６〜３２５０番目
にはパリンドローム構造が認められ、ターミネータ−と
して機能しているものと考えられる。

（発明の効果） 本発明により明らかにされたＧ６アミラーゼ遺伝子を用
いることによって、広範囲の作用１）Ｈを有し耐熱性に
優れたマルトヘキサオース生成アミラ−ゼ（Ｇ６アミラ
ーゼ）を、例えば大腸−菌中で遺伝子組換え技術により
生産することが可能となる。

また、本発明で明らかにされたＧ６アミラーゼ遺伝子の
塩基配列に基づき、他の発現効率の高いＧ６アミラーゼ
遺伝子を開発することも可能であり、その工業的意義は
大きい。また本発明のＧ６アミラーゼ調節遺伝子は、各
種の０６アミラーゼ構造遺伝子を発現させるための調節
領域として使用することができる。

（実施例） 以下に実施例により本発明を更に詳細に説明する。

実施例 （１）使用菌株及びプラスミド 好アルカリ性バチルスＨ−１６７株（ＦＥＲＭＰ−８６
８３）を０６アミラーゼの遺伝子供与体として用いた。

クローニングの為の宿主としては大ｌＩ！！菌）−１８
１０１株を用い、ベクターはプラスミドｐＢＲ３２９を
使用した。

（２）　　培地及び培養条件 Ｈ−１６７株は、ｐＨ９のアルカリ培地（２％ポリペプ
トン、０．１％イースト１キス、０，１％Ｋ　ＨＰｏ　
、０．０２％Ｍｏ５Ｏ−７Ｈ２０゜１％溶性デンプン、
２．５％ＮａＨＣＯ３）を用いて培養した。Ｈ８１０１
株の培養には、ＬＢ培地を用いた。プラスミドを保持す
る菌を培養する場合には、ＬＢ培地にクロラムフェニコ
ールを２０μｇ／Ｉｄになるように添加した。

（３）　　クローニングの手順と結果 先ず上述のアルカリ培地を用いてＨ−１６７株を培養し
た（３７℃、４８時間）。続いて培養液から遠心分離（
８，ＯＯＯｒｐｍ　、３０ｍ１ｎ　＞　ニ依って菌を回
収し、クロモシームＤＮＡをフェノール法［斉藤、三浦
、Ｂｉｏｃｈｉｌｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ＾
ｃｔａ７２，６１９−６２９　（１９６３）コにより調
製した。これの約１０μ９を制限酵素５ａｕ３Ａｌ　　
２Ｕにて１０分間、部分分解した後、シ」糖密度勾配遠
心（ショ糖＋１ｆｆ！Ｉｊ［：５−２０％、２８．ＯＯ
Ｏｒｐｍ　、１７　ｈ）　にかけ、２ｋｂ以上のＤＮＡ
断片からなる画分を得た。

一方、１μ９のクローニングベクターｐ　Ｂ　Ｒ３２９
を１０１Ｊの制限酵素ＢａｍＨ１で切断した後、アルカ
リノオスノアターゼ処理を行なった。続いて、両者をＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて連結しく１６℃、−晩）、大
腸菌Ｈ８１０１株を形質転換した。形質転換法は、Ｌｅ
ｄｅｒｂｅｒｇとＣ０ｈｅｎらの方法［Ｊ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、１１０．１０７２〜１０７４（１９７４）］
に従って行った。即ち、プラスミド溶液５Ｃ１１（５０
ｎｇＤＮＡ）と、コンピテントな大腸菌１−１Ｂ　１０
１株の懸濁液２００μｌ（大腸菌の濃度Ｉ　Ｑ９ｃｅｌ
ｌ／ｍｅ）を混合し、水中で１時間保持した後、４２℃
で２分間加温処理した。

続いて、１１ｄのしＢ培地を加え、更に２時間、３７℃
で保持した後、０．２％５ｔａｒｃｈ　ａｚｕｌｅ（Ｓ
ｉｇｍａ社）及び２０μ９／ｌｄクロラムフエニコール
を含むＬＢ寒天培地（ＬＢ−８Ａプレート）に塗布した
。アミラーゼ活性は、本プレート上でコロニーの周囲に
形成される明瞭なりリアゾーン（ｈａ　ｌ　ｏ）として
検出された。結果として、目的のクローンが一株得られ
た。本クローンは、クロラムフェニコール耐性、テトラ
サイクリン感受性で、ＬＢ−８Ａプレート上で、〜１［
に・−の周りに大きなりリアゾーンを形成した。本国の
保持するプラスミドは、ｐＢＲ３２９の３ａｍＨ１部位
に約３．３ｋｂの挿入断片を持っていた。この挿入断片
が親株のＨ−１６７由来であることをリザンハイプリダ
イゼーションによって確認した。Ｈ−１６７株のクロモ
シームルＤＮＡＩ　ＯＨ２を制限酵素ＢａｍＨ１にて完
全に分解し、１％アガロースゲルを用いて、電気泳動を
行った。電気泳動後、アルカリ処理によって、ゲル中の
ＤＮＡを変性させてから、ニトロセルロースのフィルタ
ーに移して固定した。１方、プローブとしては、得られ
た組換えプラスミドを用い、これをニックトランスレー
ションキット（ＢＲＩ−社）を用いてビオチンラベル化
した。前記フィルターをビチオンラベル化したプローブ
の溶液に浸し、４５％ホルムアシド存在下、４２℃で１
６時間、ハイブリダイゼーションを行った。プローブの
溶液から取り出したフィルターを、よく洗浄した後、ス
トレプトアヒジン−アルカリフォスターゼ−ＮＢＴ色素
を用いて、プローブのハイ１リダイズしたバンドを発色
・可視化した。結果として、Ｈ−１６７株のクロモゾー
マルＤＮＡに、組換えプラスミドがハイブリダイズする
ことが確認され、り［１−ン化したＤＮＡ断片が、Ｈ−
１６７由来のものであることが証明された。また、この
プラスミドは大腸菌Ｈ８１０１株を高頻度でアミラーゼ
産生菌に形質転換した。得られた組換えプラスミドをｐ
ＳＢ４０４と命名した。

（４）　　Ｇ６アミラーゼ遺伝子の塩基配列の決組換え
プラスミドｐＳＢ４０４上の０６アミラーゼ遺伝子の塩
基配列をサンガーのジデオキシチェーンターミネーショ
ン法により決定した。Ｇ６アミラーゼの分子量（１００
，０００）を考慮すると、遺伝子はクローン化したＤＮ
Ａｌｌ１片のほぼ全体にわたっていると考えられたので
、塩基配列の決定も３．３ｋｂの挿入断片全体について
行なった。

まず、旦ユｃｏｊ！ｉ　　ＭＶ１１８４とｐＵＣ１１８
、ＤＵＣ１１９の宿主ベクター系を用いてＧ６アミラー
ゼ遺伝子のサブクローニングを行なった。目的の領域の
ＤＮＡ断片を無駄なくシーフェンスする為に、制限酵素
地図を利用した強制クローニングとデレージョンを併用
してサブクローンを進めた。

続いてヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を用いて一本鎖の
ＤＮＡを調製した。

サブクローニングしたプラスミドを保持する大腸菌ＭＶ
１１８４株をしＢ培地１ｍを用いて３７℃、１夜培養し
た。

１夜培養した液５０１１１に５０μｌのＭｌ　３ＫＯ７
、ファージ液を加え、３７℃で１時間保持し、感染を行
った。次に５ｊｌｉ！の２ｘＹＴ培地（１６ｇトリプト
ン、１０ｇ酵母抽出物、５９Ｎａｃｊ！／ｌ水）を加え
、３７℃で２０時間培養し１＝。

Ｇ）ＩＪｃＩ　１８、ＤＵＣ１１９は、その内部にＭ１
３ファージのインテグレーション領域を持っており、ヘ
ルパーファージＭ１３ＫＯ７の感染により一本鎖ＤＮＡ
となって、ファージ粒子に包み込まれ、菌体外に放出さ
れる。

遠心分離にて菌体を除いた上澄について１−のＰＥＧ溶
液（２０％ＰＥＧ、１５％ＮａｃＪ）を加え、ファージ
粒子を沈澱させた。

沈澱をＴＥバッファーに懸濁後、フェノール処叩にてタ
ンパク質を除いた後、エタノールにて沈澱濃縮し、高純
度の一本ＩＥＩＤＮＡを得た。こうして調製したＧ６ア
ミラーゼ遺伝子の部分断片に付いてその塩基配列をへＢ
１社製ＤＮＡ ５ｅｑｕｅｎｃｉｎｏ　ｓｙｓｔｅｍ、　ｍｏｄｅｌ　
　３７０　Ａを用い、サンガーのジデオキシチェーンタ
ーミネーション法によって決定した。

結果は第２図に示した通りである。

（５）　　塩基配列の特徴 開始コドンＴＴＧ　（２４４番目の塩基）で始まり、終
止］トンＴＡＧ（３１０９１０９番目）で終わる、２，
８６５ｂｐからなるオーブン・リーディング・フレーム
が見いだされた。

また開始コドンの１０塩基上流にはリポソーム結合部位
と思われる配列（ＡＧＧＡＧＡ）が、更にその上流には
σ５５タイプのプロモーター様配列（”　−３５″配列
、ｒ　ｒＧＡ　ｒ丁；　１１　１０　Ｉ＋配列、Ｔ　Ａ
　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｔ　）が認められた。終止コドンの約１
００塩基ト流にはパリンドローム構造が認められ、ター
ミネータ−として機能しているものと考えられた。

微生物から高等植物、哺乳類に至るまでα−アミラーゼ
のアミノ酸配列には、活性部位もしくは基質結合部位に
あたると思われる三つの共通部分が存在することが知ら
れている。Ａｓｐ−Ａ　ｌ　ａＶａｔ−１１ｅ−Ａｓｎ
−Ｈｉｓ（領域Ａ）、Ｇ　Ｉ　Ｖ−Ｐｈｅ−Ａｒに１−
ＬｅｌＪ−△ｓｐＡ　　ｌ　　ａ−Ａ　　ｌ　　ａ−Ｌ
ｙｓ　　−トｌｉｓ　　　（領　ＩＲＢ）　　　、Ｐｈ
ｅ−Ｖａ　１−ＡＳｐ−ＡＳｎ−Ｈｉ　５Ａｓｐ（領域
Ｃ）がその共通配列である。ＤＮＡの塩基配列から推定
したＧ６アミラーゼのアミノ酸配列の中にもこれらの共
通領域が、認められた（第２図、下線Ａ、Ｂ、Ｃ）。

Ｇ６アミラーゼを実際に精製し、Ｎ末端のアミノ酸配列
を決定したところ、冒頭に示したアミノ酸配列の３４番
目のｓｅｐから始まる配列と一致した。従って、それよ
り前の部分は菌体外への分泌過程で、シグナルペプチド
として働き、切断されたものと考えられる。

本酵素の分子ｉは本来、約１００．０００であるが、プ
ロテアーゼによってＣ末端側が切断され、約６０．００
０までプロセッシングされることが知られている［Ａｏ
ｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　５３　（２）　。

４９１〜４９５　（１９８９）］。また、このププロセ
ラシンによって酵素の反応特異性や反応生成物などの品
持性が変化するわけではないことも明らかになっている
［八ｐｐ１．ＨｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏ１
．．２８．２８１　（１９８８）　］　、このことから
、本遺伝子の後半、約１／３はＧ６アミラーゼの発瑣に
は必須ではないことが類推される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、好アルカリ性バチルス属細菌ト１−１６７株
由来のマルトヘキサホス生成アミラーゼ（Ｇ６アミラー
ゼ）のアミノ酸配列を示す。 第２図は、好アルカリ性バチルス属細菌Ｈ−１６７株由
来のＧ６アミラーゼ遺伝子及びそれに対応するアミノ酸
配列を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）第１図に示すアミノ酸配列を有するＧ６アミラー
   ゼあるいはそれと同様の酵素活性を有するポリペプチド
   をコードするＧ６アミラーゼ遺伝子。
2. （２）第２図に示すＤＮＡ塩基配列の２４４番目から３
   １０８番目までのＤＮＡ塩基配列である請求項第１項記
   載のＧ６アミラーゼ遺伝子。
3. （３）第２図に示すＤＮＡ塩基配列の８番目から２４３
   番目までのＤＮＡ塩基配列を有するＧ６アミラーゼ遺伝
   子発現用調節遺伝子。