JPH0427865A - 血液凝固因子用分離剤およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は多孔質体にリガンドを導入した分離剤およびそ
の製造方法に関し、さらに詳しくは血漿または血液凝固
因子を含む試料から血液凝固因子、特に血液凝固第■因
子を効率よく分離回収するための血液凝固因子用分離剤
およびその製造方法に関する。

〔従来の技術〕

ヒトおよび動物の血液中には血液が凝固する過程に関連
するさまざまな物質（血液凝固因子）が含まれている。

血液凝固因子が欠乏することに起因するさまざまな疾病
が知られており、特に血液凝固第■因子を欠くことによ
る血友病Ａはこれらの疾病全体の８０％を占めている。

血友病Ａに対する根治療法は知られておらず、必要に応
じて血液凝固第■因子の補充療法が行われている。

血液凝固第■因子は、分子量約２６万のタンパク質で、
正常血漿中にはわずか０．１μｇ／ｍＱＬか含まれてい
ない。血液凝固第■因子は血漿中では、これとは別の血
液凝固因子である分子量５０万〜２０００万のタンパク
質からなるフォン・ビルブラント因子（ｖｏｎ　Ｖｉｌ
ｌｅｂｒａｎｄ　ｆａｃｔｏｒ、以下Ｖすｆと略す場合
がある）と複合体を形成している（本発明において、単
に血液凝固因子という場合、このような複合体も含む。

）。血漿中の血液凝固第■因子の濃度は低いため、血友
病Ａの患者に対して、全血や血漿をそのまま使用したの
では十分な量の血液凝固第■因子を補充することはでき
ない。そこで血液凝固第■因子の濃縮製剤の静脈内注射
が広く行われている。

血液凝固第■因子を濃縮するため、血漿からクリオプレ
シピテートを調製し、これを加熱濃縮したり、液体クロ
マトグラフィーによる精観が行われている。しかしこれ
らの方法による血液凝固第■因子の回収率（対血漿）は
、加熱濃縮法では１０％弱、液体クロマトグラフィーに
よる方法でも２０％程度と低い。

液体クロマトグラフィーによる方法は、血液凝固第■因
子またはＶすｆに対して親和性のある物質、例えばアミ
ノアルキル基（特開昭６０−１３６５１８号公報、特開
平１−１５７０００号公報）、モノクローナル抗体（特
開昭６４−１３０９９号公報、特開平１−２２１３９６
号公報）、コラーゲン（特開昭６３−１９８６３２号公
報等）などのリガントを支持体に結合させたものを分離
剤として用いている。

血液凝固第■因子を液体クロマトグラフィーで分離する
ために用いる分離剤としては、以下の特性が要求される
。

１）血漿タンパク質などと非特異的吸着を起こさないこ
と。

２）血液凝固第■因子とνＷｆとの複合体が浸透できる
細孔径を有し、かつ広い内部有効表面積を有し、吸着容
量が大であること。

３）　リガンドを結合する支持体が化学的、物理的に高
い安定性を有していること。

上述の従来技術ではアガロース、デキス［・ラン、セル
ロースなどから調製された分離剤を利用している。これ
らの分離剤は天然素材からなる支持体を用いたものであ
り、非特異的吸着が少ない点で優れている。しかしこれ
らの分離剤の前記２）に関する定量的な検討はなされて
おらず、このため吸着容量のｔＪｓさいものが使用され
る場合もあり、効率の悪い分離回収が行われている。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、血液凝固因子を高い回収率で、しかも
効率よく分離回収できる血液凝固因子用分離剤を提供す
ることである。

本発明の他の目的は、上記血液凝固因子用分離剤を簡単
に製造できる方法を提案することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は次の血液凝固因子用分離剤およびその製造方法
である。

（１）排除限界分子量が１．５　Ｘ　１０’以上の多孔
質体に、血液凝固因子に親和性を有する物質をリガンド
として結合させた分離剤であって、この分離剤の直径０
．１−以上の細孔表面積が１．５ｒｒｒ／＋＋＋Ｑ−分
離剤以上であることを特徴とする血液凝固因子用分離剤
。

（２）血液凝固因子が血液凝固第■因子または血液凝固
第■因子とフォン・ビルブラント因子との複合体である
上記（１）記載の血液凝固因子用分離剤。

（３）多孔質体が多糖類、合成有機高分子重合体、無機
高分子物質およびこれらの複合体からなる群から選ばれ
る１種または２種以上のものからなる上記（１）または
（２）記載の血液凝固因子用分離剤。

（４）多孔質体がグルコマンナン、プルラン、アガロー
ス、デンプン、セルロース、デキストラン、ポリビニル
アルコール、ポリスチレン、エチレン・無水マレイン酸
共重合体、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレ
ート、ガラス、シリカおよびアルミナからなる群から選
ばれる１種または２種以上のものである上記（１）また
は（２）記載の血液凝固因子用分離剤。

（５）リガンドが下記一般式〔１〕で表わされる基、コ
ラーゲンおよびモノクローナル抗体からなる群から選ば
れる１種または２種以上のものである上記（１）ないし
く４）のいずれかに記載の血液凝固因子用分離剤。

（式中、Ｒ１およびＲ２は水素原子または低級アルキル
基を示す。Ｒ１とＲ２とは同一でも異なっていてもよい
、Ｑは０または１、ｍは３〜８の整数、ｎはＯまたは１
、ＰはＯ〜５の整数を示す。）（６）排除限界分子量が
１．５　Ｘ　１０６以上の多孔質体を活性化剤により１
，１′−カルボニルジイミダゾール化、トレシル化、カ
ルボジイミド化、チオプロピル化、エポキシ化、臭化シ
アン化またはホルミル化して活性化した後、血液凝固因
子に親和性を有する物質をリガンドとして結合し、直径
０．ｌｌ１ｍ以上の細孔表面積を１．５ｍ２／ｍｌ−分
離剤以上にすることを特徴とする血液凝固因子用分離剤
の製造方法。

本発明で使用する多孔質体としては、分離しようとする
血液凝固因子が浸透できる空隙を有する多孔性の構造体
であって、分離に供される血液凝固因子を含有する液中
に含まれている他の物質、例えば血漿タンパク質等、と
非特異的吸着を起こさず、しかも物理的、化学的に安定
ではあるが、後述の活性化法等によりリガンドが導入で
きるものが使用でき、多孔質体を構成する素材は特に限
定されないに のような多孔質体としては、例えばグルコマンナン、プ
ルラン、アガロース、デンプン、セルロースおよびデキ
ストラン等の多糖類；ポリビニルアルコール、ポリスチ
レン、エチレン・無水マレイン酸共重合体、ポリアクリ
ルアミドおよびポリメチルメタクリレート等の合成有機
高分子重合体；ガラス、シリカおよびアルミナ等の無機
高分子物質；これらの複合体からなるものなどがあげら
れる。通常このような素材からなる多孔質体は粒子状で
あり、適当な架橋剤により架橋された架橋物であっても
よい。強度の点では架橋物の方が好ましい。また市販の
クロマトグラフィー用充填剤などを使用することもでき
る。

これらの中では、血漿タンパク質等との非特異的吸着が
少なく、物理的、化学的に安定で、しかも耐圧強度が大
きく高流速で通液可能な、グルコマンナンから調製され
る架橋グルコマンナン球状粒子が特に好ましい。この架
橋グルコマンナン球状粒子は、叶グルコースとＤ−マン
ノースを主要構成成分とするグルコマンナンが架橋剤に
より架橋された親水性のゲル粒子である。グルコマンナ
ンとしては、分子量が９Ｘ１０’〜２．４　Ｘ　１０’
、好ましくはｌＸｌ０’〜１，３　Ｘ　１０’のものが
望ましい。　このようなグルコマンナンとしては、コン
ニャクマンナンが好ましいが、これに限定されない。架
橋グルコマンナン球状粒子の排除限界分子量は、分離対
象に応じて後述の範囲の中から適当なものが使用できる
。

本発明においては、多孔質体としては、前記のような多
孔質体であって、ポリエチレングリコールを用いて測定
したリガンド結合前の排除限界分子量が１．５　Ｘ　１
０”以上、好ましくは２Ｘ１０’〜ｌＸ１０７、　さら
に好ましくは２Ｘ１０’〜５Ｘ１０’であり、しかもリ
ガンド結合後の直径０．１．ｎ以上の細孔表面積（以下
、単に細孔表面積という場合がある）が１．５ｍ／＋＋
＋Ｒ−分離剤以上になるものを使用する。

なお多孔質体の排除限界分子量は、多孔質体をカラムに
充填し、既知分子量のポリエチレングリコールの水溶液
を流し、示差屈折計などを用いて溶出量を測定し、溶出
試料の分子量に対して夫々の溶出量をプロットし、得ら
れる編線の屈曲点における分子量によって示される値で
ある。

多孔質体はリガンドを結合させて導入するための支持体
として使用される。

本発明の血液凝固因子用分離剤は、上記のような多孔質
体に血液凝固因子に親和性を有するリガンドを結合させ
て導入したものであって、直径０、ｌｌ１ｍ以上の細孔
表面積が１．５ｍ／＋＋＋４−分離剤以上、好ましくは
２ｒｄ／ｍＱ−分離剤以上、さらに好ましくは３ボ／−
Ｑ−分離剤以上のものである。

なお細孔表面積は５分離剤を真空乾燥した後、水銀圧入
法で細孔分布を測定し、この細孔分布測定から得られた
乾燥重量当りの表面積（ｒｒｒ／ｇ）と、別途求めた乾
燥重量当りの湿潤容量（水中に沈降させた際のｔＱ／ｇ
）の値とから、湿潤容量当りの表面積（ｒｒｆ／ＩＱ−
分離剤）を求めた値である。

本発明で導入されるリガンドとしては分離しようとする
血液凝固因子と特異的な相互作用（親和性）のある物質
であれば特に制限されず、例えば前記一般式〔１〕で表
わされる基、コラーゲンおよびモノクローナル抗体など
をあげることができ、これらを１種または２種以上使用
することができる。

前記一般式〔１〕で表わされる基としては、例えば下記
一般式〔２〕または〔３〕で表わされる基をあげること
ができる。

（式中、Ｒ１およびＲ２は前記一般式〔１〕　と同じも
のを示す。Ｑは０または１、ｍは３〜８の整数、ｐは２
〜５の整数を示す。） 前記一般式〔２〕で表わされる基としては、具体的には
４−アミノブチル基Ｃ−ＧＨｚ　（ＣＨ２）３　ＮＨ２
）、６−アミノヘキシル基（−ＣＨ，（ＣＨ，）ｓ　Ｎ
Ｈ２）、４−アミノブチルアミノ基（−ＮＨ（ＣＨ２）
４ＮＨｚ）、６−アミノへキシルアミノ基（−ＮＨ（Ｃ
Ｈ，）、　ＮＨ２）などをあげることができる。

前記一般式〔３〕　で表わされる基としては、具体的に
は４−アミノブチルカルバミルブチル基（−ＣＨ，（Ｃ
Ｈ２）、　Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ，）、Ｎ）１２　）、
３−アミノプロピルカルバミルブチル基（−Ｃ）Ｉ２（
ＣＨ２）３Ｃ（＝Ｏ）Ｎ）Ｉ　（ＣＨ２）３ＮＨ２）、
ジメチルアミノブチルカルバミルブチル基 （−Ｃ）１２（ＣＨ２）３Ｃ（＝０）ＮＨ（ＣＨ２）４
Ｎ（ＣＨ，）２）、ジメチルアミノプロピルカルバミル
ブチル基 （−ＣＨ２（ＣＨ２）３Ｃ（＝０）Ｎ）Ｉ（ＣＨ，）３
Ｎ（ＣＨ３）２）、ジメチルアミノプロピルカルバミル
ペンチル基 （−ＣＨ２（ＣＨ２）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１（２）、
Ｎ（ＣＨ３）２）、４−アミノブチルカルバミルブチル
アミノ基 （−Ｎ）Ｉ（ＣＨ，）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４Ｎ
Ｈ２）、　３−アミノプロピルカルバミルブチルアミノ
基 （−ＮＨ（−ＣＨ，）、Ｃ（＝０）ＮＨ（ＣＨ２）、　
ＮＨ２）、ジメチルアミノブチルカルバミルブチルアミ
ノ基 （−Ｎ）Ｉ　（ＣＨ，）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４
Ｎ　（ＣＨ３）２　）、　ジメチルアミノプロピルカル
バミルブチルアミノ基（−ＮＨ（−ＣＨｚ）４Ｃ（”０
）ＮＨ（ＣＨｚ）３Ｎ（ＣＨａ）ｚ）、ジメチルアミノ
プロピルカルバミルペンチルアミノ基（−Ｎ）１（ＣＨ
２）ＳＣ（＝Ｏ）Ｎ）Ｉ（Ｃ）１．）３Ｎ（ＣＨ３）り
などをあげることができる。

コラーゲンとしては■型コラーゲンをペプシン等により
酵素処理した限定分解物、■型コラーゲンなどが好まし
く使用できる。

リガンドは多孔質体に直接結合してもよいし、適当なス
ペーサを介して結合してもよい。

リガンドは、活性化剤により多孔質体中のある部位を１
，１′−カルボニルジイミダゾール化、トレシル化、カ
ルボジイミド化、チオプロピル化、エポキシ化、臭化シ
アン化またはホルミル化するなどして活性化した後、導
入することができる。

上記の活性化剤としては、例えば１，１′−カルボニル
ジイミダゾール、トレシルクロリド（２，２，２−トリ
フルオロエタンスルホニルクロリド）、塩酸１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
、１，４−ブタンジオールグリシジルエーテル、グルタ
ルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、臭化
シアン、ビスオキシラン、１．４−ビス（２，３−エポ
キシプロポキシ）ブタンなどをあげることができる。

次に、多孔質体として好適に使用される架橋グルコマン
ナン球状粒子について詳述する。

リガンドを導入する前の架橋グルコマンナン球状粒子は
、グルコマンナンを架橋して製造することができる。製
造方法の具体的な例を示せば、次のような方法があげら
れる。

まず市販のグルコマンナンをアルコール等で精製したグ
ルコマンナン精製物をホルムアミドまたはジメチルホル
ムアミドなどの溶媒に溶解し、触媒としてピリジンなど
を用い、酢酸、無水酢酸、プロピオン酸、酪酸、硝酸等
の酸を加えてグルコマンナンのエステルを生成する。

次に、グルコマンナンのエステルおよび多孔化剤を溶媒
に溶解する。溶媒としては、後記の水性媒質より沸点が
低く、かつ水性媒質に全く溶解しないか、または僅かし
か溶解しないものを使用する。このような溶媒として具
体的には、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素
およびトリクロロエチレン等の塩素化炭化水素系の有機
溶媒が使用され、これらを単独または混合して用いるこ
とができる。

グルコマンナンのエステルとしては、　はぼ０．３重量
％のクロロホルム溶液の３０℃で測定した粘度が８〜２
０ｃＰ、好ましくは９〜１２ｃＰとなるものを使用する
。

グルコマンナンのエステルの溶解濃度は、溶媒１００＋
ｎ１２に対して０．５〜１０ｇ、好ましくは０．５〜２
ｇの割合である。

多孔化剤は球状粒子を作った後、除去されて球状粒子を
多孔化するために使用されるもので、具体的には、デカ
リン、ｎ−カプリン酸メチル、テトラヒドロナフタレン
、デカヒドロナフタレン、エチルベンゼン、ジエチルベ
ンゼン、ドデカン酸メチル、トルエン、ヘキシルアルコ
ール、ヘプチルアルコールおよびオクチルアルコール等
の前記有機溶媒より高沸点を有し、かつグルコマンナン
のエステルを溶解しないものなどが使用される。

多孔化剤の濃度はグルコマンナンのエステル１ｇに対し
て１〜５ｍＱ、好ましくは２〜４ｍｆｌの割合である。

次に、上記のようにして得たグルコマンナンのエステル
の溶液を水性媒質中に懸濁させ、液滴を形成する。

水性媒質としては水または水に親水性保護コロイド、例
えばポリビニルアルコール、部分けん化ポリビニルアル
コール、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロー
ス、メチルセルロース、可溶性澱粉またはゼラチン等を
加えたものなどが使用できる。

親水性保護コロイドは０．１〜１０重量％、好ましくは
１〜５重量％水溶液として使用するのがよい。

また、水性媒質の使用量はグルコマンナンのエステルの
溶液の少なくとも２倍以上、好ましくは１０〜５０倍容
量とするのがよい。

水性媒質中に前記グルコマンナンのエステルの溶液を懸
濁させる方法としては、水性媒質中にグルコマンナンの
エステルの溶液を全量加え、攪拌して分散、懸濁する方
法や、水性媒質を攪拌状態とし、これにグルコマンナン
のエステルの溶液を一度にまたは滴下状に添加する方法
などがあげられる。

グルコマンナンのエステルは水不溶性であるため、水性
媒質中に微細に分散、懸濁する。この時粒状化と同時に
有機溶媒および多孔化剤の蒸発が始まり、ついには溶媒
および多孔化剤が実質的に除去されたグルコマンナンの
エステルの球状粒子が得られる。

液滴中の有機溶媒を蒸発除去する時の温度としては、水
性媒質の氷点以上で有機溶媒の沸点以下の温度が用いら
れるが、蒸発除去を促進させ、かつ粒子形状を良好に保
つためには有機溶媒の沸点より１〜５℃低い温度が好ま
しい。

球状粒子の形成は水性媒質を攪拌することによって行わ
れるが、攪拌速度を調節することにより任意の粒径のも
のが得られる。本発明の場合には、分離剤として適当な
粒径１〜５００μ脂の範囲のものが形成されるように攪
拌すればよい。

次に、グルコマンナンのエステルの球状粒子をけん化す
る。この場合、球状粒子の形状を壊さずにその形状を保
ちつつ、けん化できるけん他塔を用いることが必要であ
る。けん他塔の例としては水酸化ナトリウムまたは水酸
化カリウムのメタノール溶液や、水酸化ナトリウムまた
は水酸化カリウムを硫酸ナトリウム等の塩類水溶液に溶
解させた溶液などがあげられる。

次に、けん化されたグルコマンナンのエステルの球状粒
子を架橋する。架橋剤としては、例えばエビクロロヒド
リン、ジェポキシブタン、トリレンジイソシアナート、
ヘキサメチレンジイソシアナートなどの２官能性化合物
をあげることができる。これらの架橋剤は有機性媒体液
中に壇解させて架橋剤溶液として使用される。

架橋剤の有機性媒体液としては、例えば灯油または流動
パラフィンまたはその混合物（例えば容量比７：３）に
界面活性剤（非イオン界面活性剤、例えばソルビタン脂
肪酸エステル）を１〜２重量％混合したもの、あるいは
アセトンとジメチルスルホキシドとの混合液（例えば容
量比６：４）、アセトンとジメチルホルムアミドとの混
合液（例えば容量比２：３）などが用いられる。架橋剤
の濃度は上記架橋剤の有機性媒体液に対して０．０１〜
１５墓０ρ／Ｑの範囲である。

架橋剤溶液１００容量部に対して、けん化されたグルコ
マンナンのエステルの球状粒子を１〜５重量部加え、室
温〜７０℃で２４〜３６時間攪拌を続けることによりグ
ルコマンナンのエステルの球状粒子は架橋される。架橋
の程度は架橋剤の濃度により調節することができる。架
橋反応粒子を濾別し、アセトン次いで中性洗剤で洗浄し
、次に水洗することによって排除限界分子量が１，５×
１０６以上の架橋された架橋グルコマンナン球状粒子が
得られる。

このようにして得られた架橋グルコマンナン球状粒子は
耐圧性が高く、また化学的、物理的に極めて安定であり
、例えば各種有機溶媒、塩類溶液中でほとんど膨潤、収
縮が起こらない。従って、後述のリガンド導入の方法に
より有機溶媒や塩類を用いてリガンドを導入しても、粒
子の細孔構造が変化したり粒子が変形したり合一したり
することがない。従って、十分なポアサイズと表面積、
リガンド密度、吸着容量を有する分離剤を調製すること
ができる。さらに、架橋グルコマンナン球状粒子は耐熱
性に優れているため、オートクレーブなどで滅菌するこ
ともできる。

以上の方法はグルコマンナンから多孔質体を製造する方
法について詳述したものであるが、グルコマンナンの代
わりに前記多糖類を用いても同様の方法により排除限界
分子量が１．５　Ｘ　１０’以上の多孔質体を製造する
ことができる。

次に、多孔質体にリガンドを導入する方法について詳述
する。

まず、多孔質体を反応溶媒に十分接触させて膨潤させる
とともに気泡を脱気する。ここで使用する反応溶媒は次
の工程の多孔質体と活性化剤とを反応させるのに好適な
溶媒となる溶液を用いるのが好ましく、例えばジメチル
ホルムアミド、アセトンとピリジンとの混合液、水酸化
ナトリウムのホウ酸水素ナトリウム水溶液などをあげる
ことができる。

次に、前記活性化剤を加え、活性化剤と湿潤した多孔質
体を十分混合して反応させ、多孔質体を活性化する。活
性化は多孔質体中のある部位を１．１′−カルボニルジ
イミダゾール化、トレシル化、カルボジイミド化、チオ
プロピル化、エポキシ化。

臭化シアン化またはホルミル化するなどして、導入しよ
うとするリガンドをこの活性化した部位に結合させるた
めのものである。

活性化剤の使用割合は、使用する活性化剤の種類にもよ
るが、通常多孔質体１００重量部に対して２〜２００重
量部の割合で使用する６　活性化の反応条件は、通常反
応温度が０〜５０℃、反応時間が５分〜３時間である。

多孔質体を活性化するには、具体的には次のような方法
で行うことができる。

１．１′−カルボニルジイミダゾール化するには、多孔
質体をジメチルホルムアミド中で工、１′−カルボニル
ジイミダゾールと反応させる方法などがあげられる。

トレシル化するには、多孔質体をアセトンおよびピリジ
ン混合液中でトレシルクロリドと反応させる方法などが
あげられる。

チオプロピル化するには、多孔質体をエピクロルヒドリ
ンと反応させた後、チオ硫酸を反応させ、次にジチオス
レイトールで還元した後、　　２．２’−ジピリジルジ
スルフィドでジスルフィド化する方法などがあげられる
。

エポキシ化するには、多孔質体を水素化ホウ素ナトリウ
ムを含む０．３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液中でビスオキ
シラン（例えば１，４−ブタンジオールジグリシジルエ
ーテル）と反応させる方法などをあげることができる。

臭化シアン化するには、多孔質体を水酸化ナトリウム水
溶液中（ｐＨ１１〜１２）で臭化シアンと反応させる方
法などをあげることができる。

活性化後は活性化した多孔質体を濾過などにより分取し
た後、十分洗浄して活性化剤を除去する。

洗浄液は適宜選択できるが、例えばアセトンとピリジン
の混合液を反応溶媒とし、トレシルクロリドを活性化剤
として使用した場合は、アセトンと低濃度の塩酸との混
合液を使用するのが好ましい。

次に、リガンド含有液と活性化した多孔質体とを接触さ
せ、十分混合して多孔質体にリガンドを結合させて導入
する。この場合の反応条件は、通常反応温度が０〜４０
℃、反応時間が１５分〜２４時間である。リガンド含有
液は、リガンドを適当な緩衝液等に溶解させる方法など
により調製する。リガンドの使用量は、通常多孔質体中
の活性化部位との反応当量以上とするのが好ましい。

次に、リガンドを導入した多孔質体を濾過などにより分
取した後、十分洗浄する。洗浄液は適宜選択できるが、
例えば塩化ナトリウム水溶液、塩化ナトリウム含有酢酸
緩衝液、塩化ナトリウム含有重炭酸緩衝液、純水および
有機溶媒などをあげることができる。

次に、多孔質体中の未反応の活性化部位をブロッキング
する。ブロッキングは未ブロックの多孔質体を適当なブ
ロッキング剤（溶液）に０〜４０℃で３０分〜２４時間
浸漬して行うことができる。ブロッキング剤（溶液）と
しては、例えば塩化ナトリウム含有トリス−塩酸緩衝液
、モノエタノールアミンなどをあげることができる。

多孔質体を１，１′−カルボニルジイミダゾールで活性
化し、前記一般式〔１〕で表される基をリガンドとした
場合、得られる分離剤は、例えば（ここで、Ａは多孔質
体を示す。Ｒ１、Ｒ２、ｍ、　ｎおよびｐは前記一般式
〔１〕と同じものを示す。）の形となる。

多孔質体に導入するリガンドの量（以下、リガンド密度
という）は特に制限されないが、吸着に必要な十分な量
のリガンドを導入するのが好ましい。

架橋グルコマンナン球状粒子に上記方法によりリガンド
を導入した場合、得られる分離剤の排除限界分子量はリ
ガンド導入前の値とほぼ同じである。また架橋グルコマ
ンナン球状粒子にリガンドを導入して得られる分離剤は
耐圧強度に優れているため、高流速で使用することがで
き、時間当りの処理量を多くすることができる。

本発明の血液凝固因子用分離剤の使用方法は特に制限さ
れない０分離処理の対象としては、血液凝固因子、特に
血液凝固筒■因子またはｖｗｆ複合体があげられ、血漿
、クリオプレシピテート、コーン分画、血液凝固因子を
分泌する細胞を培養することによって得られた血液凝固
因子含有物など、血液凝固因子を含有するもの（以下、
原料という）を広く利用できる。

原料から血液凝固因子を分離するにはカラム法、バッチ
法などの分離方法が採用され、原料と本発明の分離剤を
適当な吸着緩衝液中で接触させて分離対象の血液凝固因
子を吸着させ、次に適当な脱着緩衝液中で血液凝固因子
を脱着させて回収することにより行うことができる。

カラム法で使用される吸着緩衝液としてはＰＩ（４，５
〜９．５、好ましくは５．５〜８．８のものをあげるこ
とができる。吸着緩衝液の代表的なものとしては、例え
ばビス−トリス−塩酸（ｐＨ５，５〜７．３）、トリエ
タノールアミン−塩酸（ｐＨ７，３〜７．７）、ジェタ
ノールアミン−塩酸（ＰＨ８，４〜８．８）　、ならび
にこれらの緩衝液に１ｍＭ程度の塩化カルシウムおよび
１００ｍＮ程度の塩化ナトリウムを添加したものなどを
あげることができる。また脱着緩衝液の代表的なものと
しては、上記吸着緩衝液に０．５〜３Ｍ程度の塩化ナト
リウムと５００１阿程度の塩化カルシウムとを添加した
ものをあげることができる。

分離処理には上記緩衝液の中から原料のＰＨにできるだ
け近いものを選択して使用するのが好ましい。

吸着時の流速ＬＶは通常５〜５００ｃｍ／ｈｒ、好まし
くは５０〜３００ｃｉ＊／ｈｒ、脱着時の流速ＬＶは通
常５〜５００ａｍ／ｈｒ、好ましくは５０〜３００ｃｍ
／ｈｒが望ましい。

バッチ法では、室温で原料と分離剤とが十分混合される
程度の振どう強度で１０分間以以上上うするのが好まし
い。バッチ法ではカラム法と同様の緩衝液が使用できる
。

本発明の血液凝固因子用分離剤は、排除限界分子量が１
，５×１０６以上の多孔質体を用いているため血液凝固
因子またはｖＷｆ複合体がスムーズに浸透でき、また細
孔表面積が１．５ｍ２／ｍｌ−分離剤以上と大きいため
、原料とリガンドとの接触効率が極めてよい。このため
血液凝固因子またはｖＷｆ複合体の吸着量が飛躍的に増
大するものと思われる。

また架橋グルコマンナン球状粒子は表面および内部のポ
アサイズが大きくなる傾向があるにもかかわらず、表面
の壁部分の幅も広くなって、耐圧強度が向上する。この
ポアサイズが、血液凝固因子、特に血液凝固筒■因子ま
たは血液凝固筒■因子とフォン・ビルブラント因子との
複合体の通過をスムースに行えるようにしているものと
推定される。

〔発明の効果〕

以上の通り１本発明によれば、血液凝固因子、特に血液
凝固筒■因子を高い回収率で、しかも効率よく分離回収
できる血液凝固因子用分離剤が得られる。特に多孔質体
として架橋グルコマンナン球状粒子を使用した場合には
、耐圧強度が大きく、高流速で通液できるので、さらに
効率よく分離回収できる血液凝固因子用分離剤が得られ
る。

また本発明によれば、上記のような優れた特性を有する
血液凝固因子用分離剤を容易に製造することができる。

〔実施例〕

次に本発明の実施例について説明する。なお血液凝固筒
■因子の濃度を示す単位Ｕｎｉｔｓはｒｕｎｉｔｓ血液
凝固第■因子：Ｃ」を示す。

（架橋グルコマンナン球状粒子の調製例）支持体となる
多孔質体の架橋グルコマンナン球状粒子を下記の方法で
調製した。

１）架橋グルコマンナン球状粒子Ａ工の調製コンニャク
マンナン粉６０ｇを約８０℃の水道水６ａに加え、攪拌
溶解した。この溶液を６Ｑのエタノール中に少しずつ滴
下し、生じた沈殿を濾別、風乾した後真空乾燥して精製
グルコマンナン（以下、グルコマンナンをＧＭと略する
場合がある）を得た。

上記精製グルコマンナン３０ｇをホルムアミドＩＱ中に
入れ、５５℃で７時間膨潤させた後、ピリジン３００ｍ
１２を加え、さらにその２時間後に無水酢酸３００ａＱ
を加え５５５℃で４日間反応させ、エステル化した。こ
の反応混合物を７Ωの水中に攪拌しながら加えた。生じ
た沈殿を濾別し、水洗、風乾した後真空乾燥した。得ら
れた粗酸化物を１０Ｑのアセトンに溶解し、不溶解分を
除いた後、約２００の水中に攪拌しながら加えた。生じ
た沈殿を濾別、風乾した後真空乾燥してグルコマンナン
の酢化物Ａを得た。この酢化物Ａの０，２９重意％のク
ロロホルム溶液の３０℃における粘度は１０ｃＰであっ
た。

上記酢化物Ａ　ｔｏｇを多孔化剤のｎ−カプリン酸メチ
ル３５ｍＱとともにクロロホルム５６０＋＋＋Ｑに溶解
した。

この溶液を５５℃の９０％けん化ポリビニルアルコール
の１重量％水溶液５Ｑ中に６０Ｏｒｐｍの攪拌速度で攪
拌しながら滴下し、攪拌した。２４時間後徐冷し、球状
粒子を濾別し、水洗した。

この球状粒子をメタノール２２５ｍＲとＩＯＮ　Ｎａ０
）Ｉ　２５−Ｑとの混合液中に加え、２時間攪拌してけ
ん化した。

その後けん化球状粒子を濾別し、アセトン２００＋＋１
２、ジメチルホルムアミド３００ｍＱ、エビクロロヒド
リン１０ｍｆｌの混合物中に加え、６０℃で２４時間反
応させて架橋した。粒子を回収し、水洗後アセトン抽出
して架橋グルコマンナン球状粒子ＡＸ　（以下、ＧＭ−
Ａ、と略す）を得た。

２）架橋グルコマンナン球状粒子Ａ２の調製酸化物Ａ１
０ｇを多孔化剤のデカリン２８ｔＱとともにクロロホル
ム１４０ｍＱに溶解した。この溶液を５５℃の９０％け
ん化ポリビニルアルコールの１重量％水溶液５Ｑ中に６
０Ｏｒｐｍの攪拌速度で攪拌しながら滴下し、攪拌した
。この際、粒子化槽内壁にバッフルプレートをつけて行
った。その他はＧＭ−Ａ１の調製と同様に行って架橋グ
ルコマンナン球状粒子Ａ２（以下、ＧＭ−Ａ、と略す）
を得た。

３）架橋グルコマンナン球状粒子Ａ３の調製酸化物Ａ１
０ｇを多孔化剤のデカリン３０ｔＱとともにクロロホル
ム７４０１Ｑに溶解した。この溶液を５５℃の９０％け
ん化ポリビニルアルコールの１重量％水溶液５Ｑ中に６
００ｒｐ■の撹拌速度で撹拌しながら滴下し、撹拌した
。この際１粒子化槽内壁にバッフルプレートをつけて行
った。その他はＧＭ−Ａ、の調製と同様に行って架橋グ
ルコマンナン球状粒子Ａ３（以下、ＧＭ−Ａ、と略す）
を得た。

４）架橋グルコマンナン球状粒子Ｂ１の調製ＧＭ−Ａ工
の調製において、多孔化剤のｎ−カプリン酸メチルをデ
カリンに代え１粒子化時の撹拌速度を５００ｒｐ層に変
えた以外はＧＭ−ム１の調製と同様にして架橋グルコマ
ンナン球状粒子Ｂ工（以下、ＧＭ−Ｂ□と略す）を得た
。

５）架橋グルコマンナン球状粒子Ｂ２の調製ＧＭ　−Ａ
□の調製に使用した精製グルコマンナン１５ｇをホルム
アミドとピリジンとの１対１（容量比）混合物１５０ｍ
ｆｌ中に入れ、室温で１２時間膨潤させた６上澄液を分
離して得た膨潤グルコマンナンと無水酢酸８５ｍＡをニ
ーダ−を用いて、５０℃で４日間反応させ、エステル化
した。得られた反応混合物をＧＭ　−Ａ□の調製と同様
にしてグルコマンナンの酢化物Ｂを得た。この酢化物Ｂ
の０．２９重量％のクロロホルム溶液の３０℃における
粘度は２．５ｃＰであった。

以下の操作はＧＭ　−Ａ工の調製と同様にして、架橋グ
ルコマンナン球状粒子Ｂ、（以下、ＧＭ　−８２と略す
）を得た。

６）架橋グルコマンナン球状粒子の物性ＧＭ−Ａ、〜Ａ
３．　ＧＭ−８１〜Ｂ２の各粒子の排除限界分子量をポ
リエチレングリコールを用いて測定した。

結果を表１に示す。

また各粒子を内径６ｍｍ、　　長さ１００鳳ｍのステン
レス製カラムに常法で充填し、高圧ポンプで流速をかけ
、圧力ゲージの目盛を読みとる方法で、通液流速と圧力
損失の関係を測定した。結果を表１に示す。

表 表１の結果から、いずれの架橋グルコマンナン球状粒子
も高流速の通液条件下でも流速と圧力損失は直線関係を
示し、耐圧性に優れていることがわかる。

（支持体にリガンドを導入した分離剤の調製）ｌ）架橋
グルコマンナン球状粒子 上記で得られた架橋グルコマンナン球状粒子ＧＭ−Ａ１
〜Ａ、、　ＧＭ−Ｂ□〜Ｂ２に、下記の方法によりアミ
ノブチルアミノ基、アミノへキシルアミノ基またはアミ
ノブチルカルバミルブチルアミノ基のリガンドを導入し
た。

ａ）　アミノへキシルアミノ基の導入 架橋グルコマンナン球状粒子ＧＭ−Ａ工〜Ａ３、ＧＭ−
８１〜Ｂ２を吸引濾過しながら水、続いてアセトンで洗
浄した後、真空乾燥した。この乾燥した架橋グルコマン
ナン球状粒子の所定量を所定量のジメチルホルムアミド
（以下、ＤＭＦと略す場合がある）に入れ、所定量の１
，１′−カルボニルジイミダゾール（以下、ＣＤＩと略
す場合がある）を加えて所定時間振どう攪拌した。こう
して得たＣＤＩ活性化粒子を吸引濾過で濾別し、ＤＭＦ
で洗浄した。

洗浄後のＣＤＩ活性化粒子の所定量を所定量のＤＭＦに
入れ、所定量の１．６−ジアミツヘキサン（以下、ＤＡ
Ｈと略す場合がある）を加えて所定時間振どう攪拌した
。こうして得たアミノへキシルアミノ基導入粒子を吸引
濾過で濾別し、ＤＮＦ、続いて水で洗浄し、分離剤Ａ１
〜Ａ３．分離剤ＢいＢ４を得た。これらのアミノへキシ
ルアミノ基導入粒子は２０容量％エタノール水溶液中で
保管した。なお一連の操作は室温で行った。導入条件を
表２に示す。

ｂ）　アミノブチルアミノ基の導入 １．６−ジアミツヘキサンの代わりに１．４−ジアミノ
ブタン（以下、ＤＡＢと略す場合がある）を用いた以外
はアミノへキシルアミノ基の導入と同様に行い。

分離剤Ｂ２を得た。導入条件を表２に示す。

Ｃ）　アミノブチルカルバミルブチルアミノ基の導入 所定量の５−アミノバレリック酸を、当量のＮａＯＨを
含む少量のＮａＯＨ水溶液と所定量のＤＭＦとの混合物
に溶解した。この溶液に前記アミノへキシルアミノ基の
導入の場合と同様の方法で得た洗浄後のＣＤＩ活性化粒
子を加え、１７時間振どう攪拌してＣＤＩ活性化部位と
５−アミノバレリック酸を反応させた。

こうして得た粒子を吸引濾過で濾別し、水、０．０５Ｎ
塩酸、水およびＤＭＦの順で洗浄した。

上記洗浄後の粒子を所定量のＤ肝に入れ、所定量のＮ−
ヒドロキシコハク酸イミドおよび塩酸１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを加え
て２６時間振どう攪拌した。こうして得たカルボジイミ
ド活性化粒子を吸引濾過で濾別し、ＤＭＦで洗浄した。

上記洗浄後の粒子を０．ＩＭ　ＮａＨＣＯ，および０．
５ＭＮａＣＱを含む所定量の１．４−ジアミノブタン水
溶液に加え、２．５時間振どう攪拌した。こうして得た
アミノブチルカルバミルブチルアミノ基導入粒子を吸引
濾過で濾別し、水で洗浄し、分離剤Ｂ３を得た。

このアミノブチルカルバミルブチルアミノ基導入粒子は
２０容量％エタノール水溶液中で保管した。

なお一連の操作は室温で行った。導入条件を表２に示す
。

２）市販の多孔質体 市販のセファクリルＳ−１０００（ファルマシア社製、
商品名、架橋剤Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド
を用いて架橋したアリルデキストランの架橋物からなる
粒子、以下Ｓ−１０００と略す場合がある）、セファロ
ーズＣＬ−４Ｂ　（ファルマシア社製、商品名、アガロ
ースからなる粒子、以下ＣＬ　−４Ｂと略す場合がある
）、セファローズＣＬ−２Ｂ　（ファルマシア社製、商
品名、アガロースからなる粒子、以下ＣＬ　−２８と略
す場合がある）またはトヨパールＨＶ−７５Ｃ（東ソー
（株）製、商品名、親水性ビニルポリマーからなる粒子
、以下Ｈｖ−７５Ｃと略す場合がある）にアミノへキシ
ルアミノ基を導入した。

ａ）　セファクリルＳ−１０００へのアミノへキシルア
ミノ基の導入 メスシリンダーで秤りとった８＋ａＱのセファクリルｓ
　−１ｏｏｏを吸引濾過し、さらにＤＭＦで洗浄し、置
換した。これを１６＋ａＱのＤＭＦに入れ、５００　ｐ
　ｍｏｌ／ｍｕ　−ゲルのＣＤＩを加えて２５℃で３０
分分間上う撹拌した。

こうして得たＣＤＩ活性化粒子を吸引濾過で濾別し、Ｄ
ＭＦで洗浄した。

洗浄後のＣＤＩ活性化粒子を、５００μｍｏｌ／ｍｆｌ
−ゲルのＤＡＨを含む８ｍＱのＤＭＦに入れ、２５℃で
３０分分間上う撹拌した。こうして得たアミノへキシル
アミノ基導入セファクリルＳ　−１０００を吸引濾過で
濾別し。

ＤＭＦ、続いて水で洗浄し、分離剤Ａ４を得た。この分
離剤Ａ、は２０容量％エタノール水溶液中で保管した。

導入条件を表２に示す。

ｂ）　セファローズＣＬ−４ＢまたはＣＬ−２Ｂへのア
ミノへキシルアミノ基の導入 市販のセファローズＣＬ−４ＢまたはＣＬ−２Ｂ粒子を
乾燥させずに、市販の状態がらＤＭＦを用いて常法によ
り溶媒置換してＣＤＩ活性化粒子を得た。

このようにして得たＣＤＩ活性化粒子へのアミノへキシ
ルアミノ基の導入は、架橋グルコマンナン球状粒子への
アミノへキシルアミノ基の導入方法と同様にして行い分
離剤Ｂ５、Ｂ６を得た。導入条件を表２に示す。

ｃ）トヨパールＨＷ−７５Ｇへのアミノへキシルアミノ
基の導入 微粒子をデカンテーションにより取り除いたトヨパール
ＨＷ−７５Ｃ７−Ｑを吸引濾過しながら水、続いてアセ
トンで洗浄した後、真空乾燥した。この乾燥したトヨパ
ールＨＷ−７５Ｃを１４社のＤＭＦに入れ、５００μｍ
ｏｌ／Ｊ−ゲルのＣＤＩを加えて２５℃で３０分分間上
う撹拌した。こうして得たＣＤＩ活性化粒子を吸引濾過
で濾別し、ＤＭＦで洗浄した。

洗浄後のＣＤＩ活性化粒子を、５００μ−〇１７ＩＩＱ
−ゲルのＤＡ）１を含む７ｍ１２のＤＭＦに入れ、２５
℃で３０分分間上う撹拌した。こうして得たアミノへキ
シルアミノ基導入トヨパールＨＷ−７５Ｃを吸引濾過で
濾別し。

ＤＭＦ、続いて水で洗浄し、分離剤Ｂ７を得た。この分
離剤Ｂ７は２０容量％エタノール水溶液中で保管した。

導入条件を表２に示す。

３）分離剤の分析 上記のようにして得た架橋グルコマンナン球状粒子また
は市販品にリガンドを導入した分離剤のリガンド導入前
後の粒子容量、リガンド密度および表面積を下記の方法
で測定した。

粒子容量：メスシリンダー中に分離剤と溶媒を入れ、１
日静置して容量を求めることにより測定した。

リガンド密度二所定量の分離剤を乾燥し、０．００５Ｎ
　ＨＣｌに加えて一夜静置し、ＨＣ４の消費量を０、Ｏ
ＩＮ　ＮａＯＨで滴定して算出した。

表面積：分離剤を真空乾燥し、マイクロメリティックス
社製のポアサイザ９３１０型を用いて水銀圧入法で細孔
分布を測定した。細孔分布測定により得られた乾燥重量
当りの表面積（ｒｒｒ／ｇ）と、別途求めた乾燥重量当
りの湿潤容量（水中に沈降させた際のｍｊ２／ｇ）の値
から湿潤容量当りの表面積（ｒｒｒ／ｍｆｉ−分離剤）
を求めた。

分析結果を表３に示す。なお、多孔質体Ｓ−１０００、
ＣＬ−４８，ＣＬ−２ＢおよびＨＷ−７５Ｃノ排除限界
分子量ハＧＭ−Ａ、と同様にして測定した値である。

表３の結果から、分離剤Ａ工〜Ａ４が本発明の分離剤に
相当する。

また表３の結果から、分離剤Ｂ、およびＢ６はリガンド
導入後に粒子容量が大幅に収縮したが、それ以外の分離
剤はいずれの多孔質体でも、あるいはいずれのリガンド
またはリガンド密度でも、粒子容量は変化していないこ
とがわかる。なお顕微鏡観察によると、分離剤Ｂ５およ
びＢ６には粒子の合一変形が認められたが、それ以外の
分離剤には粒子の合一、変形は認められなかった。

実施例１〜４ １）血液凝固第■因子含有試料（クリオプレシピテート
）の調製 ヒトの血漿ＩＱに対して大豆トリプシンインヒビター、
ベンズアミジンおよびフルオロリン酸ジイソプロピルを
この順序でそれぞれ１００ｍｇ／　＋２．１．５ｇ／ρ
、１ｍＭとなるように、０〜１０℃に保ちながらそれぞ
れ約１５分攪拌しながら加えた。

次に日周マクロゴール４０００　（ポリエチレングリコ
ール）を１重量％添加して３０〜４０分間攪拌した。

さらに０〜２℃でエタノールを３容量％となるように４
０〜５０分間かけてゆっくり滴下した。ときどき攪拌し
ながら約１時装置いた。

１時間後４℃で遠心分離し、沈殿物を４０ｍｍの５５ｍ
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解した。再度遠心
分離して上澄液を得、これを２６℃に温めた。この上澄
液に、２６℃に温めた２、６Ｍグリシン溶液（０，３Ｍ
ＮａＣＱおよび２５ＩＩＭトリス塩酸を含む、　ｐＨ６
，８）を、グリシンが２Ｍになるように加え、３０分間
攪拌した。

次に２６℃で遠心分離して上澄液を回収し、２０〜〜２
３℃で塩化ナトリウムを９０．６ｇ／　Ｑとなるように
加えて攪拌した。室温で遠心分離し、得られた沈殿物を
５５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解してクリ
オプレシピテート溶液を得た。

血液凝固第■因子の定量は、テストチーム・Ｆ■（Ｋａ
ｂｉ　Ｖｉｔｒｕ置ＡＢ装　Ｓｗｅｄｅｎ＠）を用いて
、エンドポイント法で行った。

試験に用いた血液凝固第■因子含有試料は表４の通りで
ある。

表４ ２）血液凝固第■因子の分離試験 ａ）バッチ法による吸着試験 １．５ｍｆｌ容のエッペンドルフサンプルバイアルに分
離剤を所定量入れ、緩衝液Ｂ　（２０＋ｗＭトリス塩酸
。

５００ｍＭ　Ｃａ１２．２８　ＮａＣＱ、　ｐＨ７，４
）で、次に緩衝液Ａ（２０ＩＩＩＭトリス塩酸、１＋ｗ
Ｍ　ＣａＣＱ２、１００ｍＭ　ＮａＣｌ２．　ｐＨ７，
４）で洗浄した。

クリオプレシピテート溶液を所定量加え、室温で１時間
攪拌した。次に１１００００ｒｐで３分間遠心分離し、
上澄液を回収して、試料の調製時の定量方法と同様の方
法で血液凝固第■因子を定量した。

分離剤Ａ□〜Ａ２について、上記方法で定量した血液凝
固第■因子の上澄液中の濃度と分離剤１■Ｑあたりの血
液凝固第■因子の吸着量との関係を求めた。また負荷し
たクリオプレシピテートの血液凝固第■因子濃度と吸着
後の上澄液の血液凝固第■因子濃度の差を求め、負荷し
たクリオプレシピテートの血液凝固第■因子に対する割
合（％）を血液凝固第■因子の吸着率とした。結果を表
５に示す。

さらに上澄液の血液凝固第■因子の濃度と吸着量との関
係を第１図に示す。

ｂ）　カラム法による吸着および脱着試験分離剤Ａｉを
常法により内径３＋＋＋ｍ、長さ４０ｍｍのガラスカラ
ムに充填した。室温でクリオプレシピテート溶液Ａ３０
０μＱをインジェクターで負荷した。

この時の流速は２５．５ｃｍ／ｈｒとした。流出液をＬ
ＩＶ（２８０ｎｍ）でモニターしながら、流出物がなく
なるまで前記緩衝液Ａを流した。

次に室温で前記緩衝液Ｂ１■Ｑをインジェクターで負荷
し、脱着を行った。この時の流速は８５ｃｍ／ｈｒとし
た。

カラムに吸着されずにブレークした血液凝固筒■因子濃
度および脱着した血液凝固筒■因子濃度をそれぞれ試料
の調製時の定量方法と同様にして定量した。

定量の結果、血液凝固節■因子の９８％が分離剤Ａ□に
吸着され、吸着された血液凝固節■因子の９９％が回収
された（実施例３）。

また、吸着および脱着時の流速を１７０ｃｍ／ｈｒとし
ても、血液凝固節■因子の吸着率および回収率は影響さ
れなかった（実施例４）。

実施例３および４の結果から１分離剤へ〇では、クリオ
プレシピテート溶液中の血液凝固節■因子を高流速下で
、効率よく分離できることがわかる。

比較例１〜７ １）血液凝固節■因子の分離試験 分離剤Ａ１〜Ａ２の代わりに分離剤Ｂ工〜ＢＧ、Ｂ、を
用いて、実施例１〜２と同様にしてバッチ法による吸着
試験を行った。結果を表５に示す。さらに比較例５およ
び７については、上澄液の血液凝固節■因子の濃度と吸
着量との関係を第１図に示す。

なお分離剤８つは市販品であるＥＡＨ−セファローズ４
Ｂ　（エポキシ活性化アミノヘキシルアミノ−セファロ
ーズ、ファルマシア社製、商品名）をそのまま使用した
。

表５の結果かられかるように、排除限界分子量１７０万
の架橋グルコマンナン球状粒子ＧＭ−Ａ１にアミノへキ
シルアミノ基を５３μ菖０Ω／ｍＱ−分離剤のリガンド
密度で導入した、直径０．１−以上の細孔表面積が３．
４ゴ／腫Ω−分離剤の分離剤Ａｉは、血液凝固筒■因子
濃度が高くなるほど大きな吸着容量を示し、上澄液の血
液凝固第■因子濃度が０．８６８　Ｕｎｉｔｓ／醜ト溶
液では３５．４Ｕｎｉｔｓ／ｍＲ−分離剤の吸着容量を
示した（実施例１）。この分離剤Ａ□を用いれば血液凝
固第■因子を分離剤に吸着させた後、血液凝固第■因子
を含まない緩衝液で洗浄することにより、容易に血液凝
固第■因子を脱着、回収できる。

また、排除限界分子量３００万の架橋グルコマンナン球
状粒子ＧＭ　−Ａ２にアミノへキシルアミノ基を７１μ
ｍｏＱ／ｒｒｒＱ−分離剤のリガンド密度で導入した、
直径０．１−以上の細孔表面積が４．３ｎ？／ｍＲ−分
離剤の分離剤Ａ２は、分離剤Ａ１よりさらに大きな吸着
容量を示した（実施例２）。

一方分離剤Ｂ□〜Ｂ６およびＢ、は、血液凝固第■因子
の吸着容量は低かった（比較例１〜７）。

実施例５〜８、比較例８〜１２ 分離剤Ａ、（実施例５）、分離剤Ａ！（実施例６）、分
離剤Ａ、（実施例７）、分離剤Ａ、（実施例８）、分離
剤Ｂ１（比較例８）１分離剤Ｂ４（比較例９）、分離剤
Ｂ５（比較例１０）、分離剤ＳＳ（比較例１１）または
分離剤Ｂ７（比較例１２）を用いて実施例１〜２と同様
にしてバッチ法による吸着試験を行い、血液凝固第■因
子の上澄液中の濃度と分離剤１ｔＱあたりの血液凝固第
■因子の吸着量との関係を求めた。上澄液の血液凝固第
■因子の濃度と吸着量との関係の代表的な例を第２図に
示す。

実施例９〜１２．比較例１３〜１５ 各分離剤の血液凝固第■因子の吸着量の比較を行った。

第２図から上澄液の血液凝固第■因子の濃度が０．５　
Ｕｎｉｔｓ／ｌＱのときの各分離剤の血液凝固第■因子
の吸着量を求めた。実施例８と比較例１２についてはグ
ラフを外そうして求めた。

こうして求めた各分離剤の血液凝固第■因子の吸着量と
、それぞれの分離剤の直径０．１４以上の細孔に基づく
細孔表面積との関係を第３図に示す。

データは実施例９（分離剤Ａ□）、実施例１０（分離剤
Ａ２）、実施例１１（分離剤Ａ、、）、実施例１２（分
離剤Ａ４）、比較例１３（分離剤Ｂ□）、比較例１４（
分離剤Ｂ４）、比較例１５（分離剤Ｂ、）とした。

実施例１３ １）■型コラーゲン限定分解物溶液の調製■型コラーゲ
ンを０．１Ｍ酢酸（ｐＨ２，９）に溶解して４鳳ｇ／ｍ
Ｑに調製した。　この際、プラスチック製サンプル管中
で泡がたたないように、溶解は回転式ローターを使って
３〜４時間かけて行った。続いて、■型コラーゲン溶液
１ｍＱにペプシンのｌｌ１ｇ／ｒｒｒＱ酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５，５）８０μＱを加え、３７℃で所定時
間消化した。次に１Ｍトリス溶液１４０−を加えてｐＨ
を７〜８に調整した。　さらに、分解したコラーゲン限
定分解物を還元するため、０．１Ｍジチオスレイトール
溶液（１００ｍＭリン酸緩衝液−５ｗＭ　ＥＤＴＡに溶
解、ｐＨ６，０）　１３６μＱを加えて３７℃で３０分
間反応させた。次に一３Ｈ基による再結合を保護するた
め、０．５Ｍモノヨードアセトアミド（２７５ｍＭトリ
ス塩酸に溶解、ｐＨ８，８）　８７　ｔｔ　Ｑを加えて
３０℃で１０分間反応させた。溶液内の未反応物と低分
子アミノ酸を除くため、０．ＩＭ　ＮａＨＣＯ，−０，
５Ｍ　ＮａＣｆ；ｔ、ｐＨ８，０の緩衝液に４℃の条件
で一晩透析して■型コラーゲン限定分解物溶液を得た。

２）トレシル化グルコマンナン球状粒子の調製乾燥した
架橋グルコマンナン球状粒子（ＧＭ−Ａ□と同様にして
測定した排除限界分子量＝２Ｘ１０’）０．４ｇをアセ
トン３Ｉｌｆｌおよびピリジン１５０μＱの混合液中に
入れた。この反応液の入ったサンプル管を軽く振とうし
た後、活性化剤としてのトレシルクロリド１００μｇを
加え、サンプル管を振とうさせながら１０分間反応させ
た。反応後吸引濾過してトレシル化グルコマンナン球状
粒子を得た。次にアセトン７０　：　５ｍＭ塩酸３０（
容量比）、アセトン３０　：　５ｍＭ塩酸７０（容量比
）および１ｇＭ塩酸の溶液で順次洗浄した。このように
して調製したトレシル化グルコマンナン球状粒子は１ｍ
Ｍ塩酸中で４℃で保存した（以下、トレシル化ＧＭ／　
１■Ｍ　ＨＣｌ２と表記する）。

３）分離剤の調製 トレシル化グルコマンナン球状粒子に■型コラーゲン限
定分解物を下記のようにして導入し１分離剤を調製した
。

適当量のトレシル化ＧＭ／　１　ｍＷ　ＨＣＱの懸濁液
を１０ｙａＱ容量のサンプル管に入れて遠心分離を行っ
た。

遠心分離後の上澄液をピペットで吸取り、トレシル化グ
ルコマンナン球状粒子と上澄液の体積比とが１＝１にな
るように調整した。遠心分離操作で固液分離した状態と
なったトレシル化ＧＭ／　１　ｍＭＨＣＱを均一な懸濁
液となるように撮り混ぜた後、すばやくメスピペットを
使って１ｍＱ吸取り、３ｍＱのセラムチューブ（住人化
学（株）製）に移した。遠心分離後、パスツールピペッ
トで上澄液のほぼ全量を吸取って除去した。

セラムチューブ内に残存したトレシル化グルコマンナン
球状粒子０．５鵬Ｑに対し、１ｍＭの■型コラーゲン限
定分解物溶液をポルチックスミキサ−で振動攪拌させな
がら加えた。最初の数分間は、反応液をそのまま振動攪
拌させた。その後、３０℃で３時間インキュベーターで
反応させた。３時間後に反応液を３Ｇ２のグラスフィル
ターで濾過し、固液分離した。このようにして得た分離
剤Ａ５は、０、ＩＭ　ＮａＨＣＯａ−０，５Ｍ　ＮａＣ
Ｑ緩衝液（ｐＨ８，０）およびＩＭＮａＣＱ溶液で洗浄
した。さらに未反応の残存トレシル基のブロッキングの
ため、０．１Ｍ　トリス塩酸−０，５Ｍ　Ｎａ（４緩衝
液（ＰＨ８，０）中に４℃で浸漬し、た。

分離剤Ａ□と同様にして測定した直径０．１４以上の細
孔表面積は３．Ｏｒ＆／ｍＵ−分離剤であった。

４）血液凝固節■因子の吸着実験 分離剤Ａ５を常法により内径３ｍｌｌ１、長さ４０ｍｍ
のガラスカラムに充填した。この方ラムに前記クリオプ
レシピテート溶液Ａ　５００ｄをインジェクターで負荷
し、緩衝液Ａ　（２０ｍＭ　トリス塩酸、１ｍＭ　Ｃａ
Ｃｕ５．１００ｍＭ　ＮａＣＱ、　ｐＨ７，４）を０．
０１ｍｆｌ／ｗｉｎの流速で通液した。流出液をＵＶ　
（２８０ｎｍ）でモニターしながら、流出物がなくなる
まで緩衝液Ａを通液した。流出液中の血液凝固節■因子
濃度をテストチーム・Ｆ■で定量し、負荷量との差から
分離剤Ａ、に吸着した血液凝固節■因子の量を求めた。

その結果分離剤Ａ。

１ｍＱ当りの血液凝固節■因子の吸着量は、１．３３Ｕ
ｎｉｔｓであった。また、負荷した血液凝固節■因子の
量に対する分離剤Ａ５に吸着した血液凝固節■因子の量
の比率は５３％であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１、実施例２、比較例５および比較例７
の結果を示すグラフ、第２図は実施例５〜８、 比較例８〜１２の結果を示すグラフ、 第３図 は実施例９〜１２、 比較例１３〜１５の結果を示すグラ フである。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）排除限界分子量が１．５×１０＾６以上の多孔質
   体に、血液凝固因子に親和性を有する物質をリガンドと
   して結合させた分離剤であって、この分離剤の直径０．
   １μｍ以上の細孔表面積が１．５ｍ＾２／ｍｌ−分離剤
   以上であることを特徴とする血液凝固因子用分離剤。
2. （２）血液凝固因子が血液凝固第VIII因子または血液凝
   固第VIII因子とフォン・ビルブラント因子との複合体で
   ある請求項（１）記載の血液凝固因子用分離剤。
3. （３）多孔質体が多糖類、合成有機高分子重合体、無機
   高分子物質およびこれらの複合体からなる群から選ばれ
   る１種または２種以上のものからなる請求項（１）また
   は（２）記載の血液凝固因子用分離剤。
4. （４）多孔質体がグルコマンナン、プルラン、アガロー
   ス、デンプン、セルロース、デキストラン、ポリビニル
   アルコール、ポリスチレン、エチレン・無水マレイン酸
   共重合体、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレ
   ート、ガラス、シリカおよびアルミナからなる群から選
   ばれる１種または２種以上のものである請求項（１）ま
   たは（２）記載の血液凝固因子用分離剤。
5. （５）リガンドが下記一般式〔１〕で表わされる基、コ
   ラーゲンおよびモノクローナル抗体からなる群から選ば
   れる１種または２種以上のものである請求項（１）ない
   し（４）のいずれかに記載の血液凝固因子用分離剤。 ▲数式、化学式、表等があります▼…〔１〕 （式中、Ｒ＾１およびＲ＾２は水素原子または低級アル
   キル基を示す。Ｒ＾１とＲ＾２とは同一でも異なってい
   てもよい。ｌは０または１、ｍは３〜８の整数、ｎは０
   または１、ｐは０〜５の整数を示す。）
6. （６）排除限界分子量が１．５×１０＾６以上の多孔質
   体を活性化剤により１，１′−カルボニルジイミダゾー
   ル化、トレシル化、カルボジイミド化、チオプロピル化
   、エポキシ化、臭化シアン化またはホルミル化して活性
   化した後、血液凝固因子に親和性を有する物質をリガン
   ドとして結合し、直径０．１μｍ以上の細孔表面積を１
   ．５ｍ＾２／ｍｌ−分離剤以上にすることを特徴とする
   血液凝固因子用分離剤の製造方法。