JPH04288100A - 組換えダニアレルゲン - Google Patents
組換えダニアレルゲンInfo
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- JPH04288100A JPH04288100A JP3104949A JP10494991A JPH04288100A JP H04288100 A JPH04288100 A JP H04288100A JP 3104949 A JP3104949 A JP 3104949A JP 10494991 A JP10494991 A JP 10494991A JP H04288100 A JPH04288100 A JP H04288100A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アレルゲン活性を有す
る組換えダニアレルゲンに関するものである。 【０００２】 【従来の技術】屋内塵性ダニは、アトピー性気管支喘息
等のアレルギー疾患の主要な原因として重要である。従
来、アレルギー疾患の治療剤としては、アレルギーの原
因物質である減感作療法が、最も重要な根本治療とされ
、特に花粉症を始め屋内塵、真菌アレルギー等の吸入性
アレルゲンである回避困難な抗原で引き起こされる疾患
においては、その評価は今や確立されたものといえる。 しかしながら、この減感作療法では感作抗原によるアナ
フィラキシーの危険が伴う為、安全な治療用抗原の投与
が必要とされ、そのような感作抗原の研究が進められて
いる。 【０００３】ダニアレルギー疾患については、ヤケヒョ
ウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅ
ｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）及びコナヒョウヒダニ（Ｄｅｒ
ｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）の２種
のダニが、屋内塵中のアレルゲン源として重要であると
報告されている〔Ａｌｌｅｒｇ． Ａｓｔｈｍａ， １
０， ３２９ 〜３３４ （１９６４）； Ｊ． Ａｌ
ｌｅｒｇｙ， ４２， １４〜 ２８ （１９６８）］
。これらのダニから、主要ダニアレルゲンが分画され
、それらはダニ排泄物及び／又はダニ虫体中に含有され
ている分子量２４−２８ｋＤ の糖蛋白（ｐＩ ４．６
〜７．２）、及び／又は分子量１４．５−２０ｋＤ の
蛋白（ｐＩ ５〜７．２）であると報告されている〔Ｊ
． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２５， ５８７〜５９２ （
１９８０）； Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，７６， ７５３ 〜７６１ （１９８
５）； Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ４６， ６７９ 〜６８
７ （１９８２）； Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅ
ｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ８１， ２
１４〜２２３ （１９８６）； Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ
Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７５， ６８６ 〜
６９２ （１９８５）等〕。しかし、減感作治療用抗原
として有効かつ安全なものは、未だ得られていないのが
実情である。 【０００４】ダニアレルゲンの遺伝子クローニングとし
ては、ヤケヒョウヒダニの主要アレルゲンであるＤｅｒ
ｐ Ｉ （分子量：２５，３７１） 及びＤｅｒ
ｐ ＩＩ （分子量：１４，１３１と１７，４６０）
について、また、コナヒョウヒダニの主要アレルゲンで
あるＤｅｒ ｆ ＩＩ（開始コドン未同定のため分子量
未定）についても、それぞれの遺伝子がクローニングさ
れ塩基配列も決定されており〔Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ．
Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ８
５， １２７〜１２９ （１９８８）； Ｊ． Ｅｘｐ
． Ｍｅｄ．， １６７， １７５ 〜１８２ （１
９８８）； Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７０，
１４５７ 〜１４６２ （１９８９）； Ｉｎｔ． Ａ
ｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．， ９１， １１８ 〜１２３ （１９９０）；
Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ９１， １２４〜１２９ （１９
９０）；Ｊｐｎ． Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｏｌ．， ３９
， ５５７〜５６１ （１９９０）〕、遺伝子組換え技
術によるダニアレルゲンの研究が試みられている。しか
しながら、未だ感作抗原として使用し得るものは得られ
ていない。 【０００５】一方、ダニアレルギー疾患の診断方法とし
ては、従来、問診を主体とし、屋内塵（ハウスダスト）
抽出物及び／又はダニ虫体抽出物を用いる皮内反応試験
が殆どであり、まれに、ＲＡＳＴ（ｒａｄｉｏ ａｌ
ｌｅｒｇｏｓｏｒｂｅｎｔ ｔｅｓｔ）法による血清中
のＩｇＥ 抗体価（相対値）の測定、吸入誘発試験、鼻
粘膜誘発試験を併用する程度であり、ダニアレルギー疾
患を直接的に診断するのはかなり困難であった。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】従来、屋内塵性ダニを
特異抗原とする気管支喘息の減感作治療法には、屋内塵
（ハウスダスト）抽出液が用いられてきているが、化学
的にはその組成が極めて不明確であり、しかも多種類の
不純物を含み、アナフィラキシー誘発の可能性があるた
めに投与量が極度に制限され、治療効果が極めて低いの
が現状である。したがって、有効性及び安全性の観点か
ら、有用な減感作治療用抗原の出現が望まれると同時に
そのような高品質減感作治療用抗原の安定供給が期待さ
れている。しかしながら、このような安全で確実に奏効
するに充分量のダニアレルゲンを安定供給するには、ダ
ニ飼育物からのダニアレルゲンの抽出、精製による方法
では、量産性がなく量的に限界があるので安定供給は困
難である。 【０００７】本発明の目的は、まさにこの点にあり、ダ
ニアレルギー疾患の治療剤、診断薬としてアナフィラキ
シー誘発性の不純物を含まない安全かつ有効な組換えダ
ニアレルゲンを提供することにある。即ち、本発明の第
１の目的は、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得ら
れるアレルゲン活性を有する組換えダニアレルゲンを提
供することにある。本発明の第２の目的は、該ダニアレ
ルゲンをコードする遺伝子を提供することにある。本発
明の第３の目的は、アレルゲン活性を有する活性断片と
してのダニアレルゲン断片を提供することにある。本発
明の第４の目的は、ダニアレルゲンに含まれるエピトー
プを有するポリペプチド、又は該エピトープと免疫学的
に同一であるとみなされ得るエピトープを有するポリペ
プチドを提供することにある。本発明の第５の目的は、
前記のエピトープを有するポリペプチドをコードする遺
伝子を提供することにある。本発明の第６の目的は、本
発明の遺伝子を発現させ得る発現ベクターを提供するこ
とにある。本発明の第７の目的は、該遺伝子を発現させ
得る発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供す
ることにある。本発明の第８の目的は、該組換えダニア
レルゲンの製造方法を提供することにある。本発明の第
９の目的は、本発明の組換えダニアレルゲンを有効成分
とする新規なダニアレルギー疾患治療剤を提供すること
にある。本発明の第１０の目的は、本発明の組換えダニ
アレルゲンを有効成分とする新規なダニアレルギー疾患
診断薬を提供することにある。本発明の第１１の目的は
、本発明のダニアレルゲン断片を有効成分とする新規な
ダニアレルギー疾患治療剤を提供することにある。本発
明の第１２の目的は、本発明のダニアレルゲン断片を有
効成分とする新規なダニアレルギー疾患診断薬を提供す
ることにある。本発明の第１３の目的は、本発明のエピ
トープを有するポリペプチドを有効成分とする新規なダ
ニアレルギー疾患治療剤を提供することにある。本発明
の第１４の目的は、本発明のエピトープを有するポリペ
プチドを有効成分とする新規なダニアレルギー疾患診断
薬を提供することにある。 【０００８】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ダニ虫体から
強いアレルゲン活性を有するダニアレルゲンをコードす
る遺伝子を見出し、更に研究を重ねて本発明を完成した
。 【０００９】即ち、本発明の要旨は、（１）ダニ虫体由
来の遺伝子の発現によって得られる、以下の部分的アミ
ノ酸配列（配列番号：１）を含んでいる組換えダニアレ
ルゲン、 Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ （２）ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる、
以下のアミノ酸配列（配列番号：２）を含んでいる組換
えダニアレルゲン、 Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｔｈ
ｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａ
ｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ
Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｍ
ｅｔ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａ
ｒｇ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｉｌ
ｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｍ
ｅｔ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｒ
ｇ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｈ
ｉｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌ
ｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｈ
ｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌ
ｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓ
ｐ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ
Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔ
ｙｒ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒ
ｇ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｖ
ａｌ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｎ（３）前記（１）又は
（２） 記載のアミノ酸配列を含むアレルゲン活性を有
する蛋白質をコードしているダニ虫体由来の遺伝子、（
４） 図１０において示される塩基配列において、少な
くとも上流より約１７０ｂｐ〜約２７０ｂｐ 、約２７
０ｂｐ 〜約４００ｂｐ または約１７０ｂｐ 〜約４
００ｂｐ の領域内にコードされているアミノ酸配列を
含有してなるダニアレルゲン断片、（５） ダニアレル
ゲンに含まれるエピトープを有するポリペプチド、又は
該エピトープと免疫学的に同一であるとみなされ得るエ
ピトープを有するポリペプチド、（６）前記（５）記載
のポリペプチドをコードしている遺伝子、（７）前記（
３）又は（５）記載の遺伝子を発現させ得る発現ベクタ
ー、（８）前記（７）記載の発現ベクターで形質転換さ
れた細菌、酵母又は哺乳動物細胞、（９）前記（８）記
載の細菌、酵母又は哺乳動物細胞を該遺伝子の発現可能
な条件下で培養して、組換えダニアレルゲンを産生させ
、次いで該組換えダニアレルゲンを回収することを特徴
とする組換えダニアレルゲンの製造方法、（１０）前記
（１）又は（２）記載の組換えダニアレルゲンを有効成
分とするダニアレルギー疾患治療剤、（１１） 前記（
１）又は（２）記載の組換えダニアレルゲンを有効成分
とするダニアレルギー疾患診断薬、（１１） 前記（４
）記載のダニアレルゲン断片を有効成分とするダニアレ
ルギー疾患治療剤、（１３） 前記（４）記載のダニア
レルゲン断片を有効成分とするダニアレルギー疾患診断
薬、（１４） 前記（５）記載のポリペプチドを有効成
分とするダニアレルギー疾患治療剤、並びに、（１５）
前記（５）記載のポリペプチドを有効成分とするダニ
アレルギー疾患診断薬、に関する。 【００１０】本発明の組換えダニアレルゲンは、ダニ虫
体由来の遺伝子の発現によって得られるものであり、こ
こで用いられるダニは特に限定されるものではないが、
屋内塵性ダニであるコナヒョウヒダニやヤケヒョウヒダ
ニ等が用いられる。 【００１１】本発明の組換えダニアレルゲンは、部分的
アミノ酸配列として以下の配列（配列番号：１）を含ん
でいる蛋白質であって、アレルゲン活性を有するもので
ある。 Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ 【００１２】さらに、前記部分的アミノ酸配列を含む次
のようなアミノ酸配列（配列番号：２）を含む蛋白質で
あって、アレルゲン活性を有するものである。 Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｔｈ
ｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａ
ｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ
Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｍ
ｅｔ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａ
ｒｇ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｉｌ
ｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｍ
ｅｔ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｒ
ｇ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｈ
ｉｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌ
ｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｈ
ｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌ
ｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓ
ｐ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ
Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔ
ｙｒ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒ
ｇ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｖ
ａｌ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｎ【００１３】また、本発
明の組換えダニアレルゲンは、前記アミノ酸配列のうち
１個又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加又は転位に
よって種々変異されたものであっても、アレルゲン活性
を有するものは本発明の組換えダニアレルゲンに含まれ
る。このような変異体は、天然のアレル変異体又は組換
えＤＮＡ技術により、例えばＤＮＡの特定の部位に突然
変異を誘発することにより得られる。 【００１４】本発明の組換えダニアレルゲンには、他の
蛋白質との融合蛋白として発現されたものも含まれる。 本明細書では、他の蛋白質と融合して発現した組換えダ
ニアレルゲンを特に融合組換えダニアレルゲンという場
合がある。融合する他の蛋白質としては特に限定されな
いが、例えば、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ等が挙げられる
。 【００１５】本発明の組換えダニアレルゲンは、アレル
ゲン活性に必須な領域のみの蛋白質断片であってもよく
、また、アレルゲン活性に必須なドメインからなるもの
であってもよい。例えば、本明細書においては、アレル
ゲン活性を有する活性断片を、ダニアレルゲン断片とい
うが、具体的には図１０において示される塩基配列にお
いて、少なくとも上流より約１７０ｂｐ 〜約２７０ｂ
ｐ 、約２７０ｂｐ 〜約４００ｂｐ または約１７０
ｂｐ 〜約４００ｂｐ の領域内にコードされているア
ミノ酸配列を含有してなる断片が挙げられる。また、ダ
ニアレルゲン蛋白質のみを発現させて得られたものの他
に、融合蛋白質として発現したものから他の蛋白質を脱
離せしめて得られたものでもよい。 【００１６】要約すれば、本発明の組換えダニアレルゲ
ンは、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる前
記のアミノ酸配列を実質的に含んでいる、アレルゲン活
性を有する蛋白質である。 【００１７】本発明の組換えダニアレルゲンとして、大
腸菌で発現されたβ−ガラクトシダーゼとの融合組換え
ダニアレルゲンが以下のように例示される。即ち、大腸
菌で発現された融合組換えダニアレルゲンは、Ｕｌｔｒ
ｏｇｅｌ ＡｃＡ ４４ （ＬＫＢ社製）を用いたゲル
濾過クロマトグラフィー、抗β−ガラクトシダーゼ抗体
固定化アフィニティクロマトグラフィー及び抗ダニ虫体
抗体固定化アフィニティクロマトグラフィーで精製され
、組換えダニアレルゲンとして下記のような性質を持つ
。 ■ 色及び性状：白色 ■ 水溶性 ：易溶性 ■ 分子量 ：約４０，０００である。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥで｛（融合蛋白質の分子量）−（β−
ガラクトシダーゼの分子量）｝で見積もる。 ■ 部分的アミノ酸配列（配列番号：１）として次の
ものを含む。 Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ あるいは、前記部分的アミノ酸配列（配列番号：１）を
含む、次のアミノ酸配列（配列番号：２）を含むもので
ある。 Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｔｈ
ｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａ
ｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ
Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｍ
ｅｔ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａ
ｒｇ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｉｌ
ｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｍ
ｅｔ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｒ
ｇ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｈ
ｉｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌ
ｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｈ
ｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌ
ｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓ
ｐ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ
Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔ
ｙｒ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒ
ｇ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｖ
ａｌ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｎ■ 抗原性を有する。 ダニアレルギー患者プール血清中の特異ＩｇＧ 、ウサ
ギ抗ダニ虫体血清、ウサギ抗β−ガラクトシダーゼとの
ＥＬＩＳＡ 反応性及び発現蛋白のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後
、ニトロセルロース膜にブロットし上記抗血清との反応
性により判断する。■ アレルゲン活性を有する。Ｈ
ＰＬＣ（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕ
ｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いたダニア
レルギー患者白血球ヒスタミン遊離試験により判断する
。■ アナフィラキシー反応を誘導しない。常法によ
り、融合蛋白質またはダニアレルゲン蛋白質でモルモッ
トを免疫し、追加免疫時にアナフィラキシー反応につい
て観察する。 【００１８】本発明のダニ虫体由来の遺伝子は、生ダニ
虫体からｍＲＮＡを調製し、そのｍＲＮＡを鋳型として
常法によりｃＤＮＡを合成することにより得られるが、
分子中に前記のアミノ酸配列を含むアレルゲン活性を有
する蛋白質をコードしているものであり、該部分的アミ
ノ酸配列をコードしているＤＮＡとしては、具体的には
以下のような配列（配列番号：１）が例示される。 ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＡＡ
ＣＣＡ ＴＴＧ ＣＧＡ ＴＴＣ ＡＧＡ ＧＡＣ Ａ
ＴＣ ＡＣＴ ＧＴＣ ＧＡＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＧＡ
Ａ ＡＡＴ ＧＣＣ ＴＡＴ ＡＴＣ ＡＡＡ ＡＡＴ
ＧＧＣ ＡＡＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＴＴＧ ＴＣＧ
ＣＴＴ ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＣＡ ＡＣＡ Ｔ
ＴＧ ＡＧＴ ＴＴＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＡＡ ＧＣ
Ｃ ＧＡＴ ＧＧＡ ＡＡＡ ＡＴＣ ＧＡＣ ＡＴＧ
ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＴＡ ＴＣＧ
ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＧＴ ＧＣＡ Ｔ
ＣＧ ＴＴＧ ＡＡＡ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＣＡ ＡＡ
Ｇ ＡＡＡ ＴＡＣ ＡＡＣ ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＡＴ
ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＡＡ ＴＴＧ ＡＧＴ ＧＣＡ
ＴＣＧ ＡＴＣ あるいは、前記塩基配列を含む、次のような塩基配列（
配列番号：２）が例示される。 ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＡＡ
ＣＣＡ ＴＴＧ ＣＧＡ ＴＴＣ ＡＧＡ ＧＡＣ Ａ
ＴＣ ＡＣＴ ＧＴＣ ＧＡＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＧＡ
Ａ ＡＡＴ ＧＣＣ ＴＡＴ ＡＴＣ ＡＡＡ ＡＡＴ
ＧＧＣ ＡＡＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＴＴＧ ＴＣＧ
ＣＴＴ ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＣＡ ＡＣＡ Ｔ
ＴＧ ＡＧＴ ＴＴＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＡＡ ＧＣ
Ｃ ＧＡＴ ＧＧＡ ＡＡＡ ＡＴＣ ＧＡＣ ＡＴＧ
ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＴＡ ＴＣＧ
ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＧＴ ＧＣＡ Ｔ
ＣＧ ＴＴＧ ＡＡＡ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＣＡ ＡＡ
Ｇ ＡＡＡ ＴＡＣ ＡＡＣ ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＡＴ
ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＡＡ ＴＴＧ ＡＧＴ ＧＣＡ
ＴＣＧ ＡＴＣ ＧＴＡ ＡＡＣ ＣＣＡ ＣＧＡ Ｔ
ＴＧ ＴＣＡ ＴＧＧ ＣＡＴ ＣＡＡ ＴＡＣ ＡＣ
Ｇ ＡＡＡ ＣＧＣ ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＧＴ ＧＡＡ
ＴＡＣ ＡＡＧ ＡＧＴ ＧＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ
ＣＴＡ ＴＣＧ ＴＴＧ ＣＧＡ ＴＣＧ ＴＣＧ Ｇ
ＡＣ ＡＴＴ ＧＣＴ ＣＴＣ ＡＡＧ ＡＴＴ ＡＣ
Ｇ ＡＴＧ ＣＣＴ ＧＡＴ ＴＡＴ ＡＡＴ ＴＣＧ
ＡＡＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＣＧＡ
ＣＡＡ ＧＧＴ ＧＡＴ ＣＡＡ ＡＴＣ ＡＡＣ Ａ
ＴＧ ＧＡＣ ＡＴＣ ＧＡＴ ＧＧＴ ＡＣＡ ＴＴ
Ｇ ＡＴＣ ＧＡＡ ＧＧＴ ＣＡＴ ＧＣＡ ＣＡＡ
ＧＧＡ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＧＡ ＧＡＡ ＧＧＴ
ＡＡＡ ＡＴＣ ＣＡＣ ＡＴＴ ＡＡＡ ＧＧＴ Ａ
ＧＡ ＣＡＡ ＡＣＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＧＡＧ ＡＴ
Ｃ ＧＡＡ ＴＣＣ ＡＡＣ ＴＡＣ ＣＧＡ ＴＡＣ
ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＣＴＡ ＡＴＣ
ＡＴＣ ＧＡＡ ＣＣＧ ＧＴＣ ＡＡＧ ＡＧＴ Ｇ
ＡＡ ＡＡＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＡＡ ＧＧ
Ｃ ＧＴＴ ＣＴＴ ＴＣＣ ＣＧＴ ＡＡＧ ＧＴＧ
ＣＣＡ ＴＣＡ ＣＡＴ ＣＴＧ ＡＣＡ ＣＴＡ
ＧＡＡ ＡＣＡ ＣＣＡ ＣＧＡ ＧＴＣ ＡＡＧ Ａ
ＴＧ ＡＡＴ ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＡＴ ＧＡＴ ＣＧ
Ａ ＴＡＴ ＧＣＡ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＴＧ
ＴＴＣ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＡＴ ＴＡＴ ＧＡＴ
ＧＧＣ ＡＴＣ ＣＡＣ ＴＴＣ ＧＡＧ ＡＡＡ Ｃ
ＡＴ ＡＣＣ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＡＡ ＴＡＣ ＧＡ
Ａ ＣＣＴ ＧＧＣ ＧＴＴ ＣＧＡ ＴＡＣ ＡＡＧ
ＡＴＣ ＡＴＣ ＧＧＣ ＡＡＴ ＧＧＡ ＡＡＡ
ＣＴＣ ＡＡＧ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＧＣ ＣＧＣ Ｃ
ＡＣ ＴＡＴ ＴＣＴ ＡＴＣ ＧＡＴ ＧＴＧ ＣＡ
Ａ ＧＧＴ ＡＴＴ ＣＣＡ ＣＧＣ ＡＡＡ ＧＣＡ
ＴＴＣ ＡＡＴ ＣＴＧ ＧＡＣ ＧＣＴ ＧＡＣ
ＴＴＧ ＡＴＧ ＧＡＴ ＴＴＣ ＡＡＡ ＣＴＧ Ａ
ＡＡ ＧＴＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＣＣＡ ＧＡＡ ＧＡ
Ｔ ＡＧＣ ＡＡＴ ＡＡＡ ＧＣＴ ＣＡＡ ＴＴＣ
ＡＧＣ ＴＡＣ ＡＣＡ ＴＴＣ ＡＡＣ ＧＡＡ
ＴＡＴ ＡＣＣ ＧＡＧ ＡＣＣ ＧＡＡ ＧＡＡ Ｔ
ＡＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＡＴ ＣＣＡ ＣＡＴ ＣＧ
Ｔ ＧＣＣ ＴＡＴ ＴＡＴ ＧＴＴ ＡＡＴ ＴＧＧ
ＴＴＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＡＴＴ ＣＧＣ ＡＡＡ
ＴＡＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＡＴ ＴＴＣ ＡＴＣ Ｇ
ＴＣ ＧＡＡ ＧＡＣ ＡＡＣこのＤＮＡ配列は、前記
のＤｅｒ ｐ Ｉ 、Ｄｅｒ ｐ ＩＩ及びＤｅｒ ｆ
ＩＩＩ について報告されているものと比較して相同
性のないものである。 【００１９】本発明のダニ虫体由来の遺伝子は、ｃＤＮ
Ａの全塩基鎖長が約１．２ｋｂｐ（アガロース電気泳動
法、但し、リンカーを除くと１１４３ｂｐ （約１．１
ｋｂｐ） であるが、実際の発現では、その前の停止コ
ドンで終了するので、翻訳される塩基鎖長は、停止コド
ンを含めて１０２６ｂｐ （約１ｋｂｐ）である）であ
って、図４に示す制限酵素地図を有するものである。 【００２０】本発明の発現ベクターは、形質転換された
細菌、酵母又は哺乳動物細胞中において、前記の本発明
の遺伝子を発現させ得るように結合している発現ベクタ
ーである。発現ベクターの構築に用いられるベクターＤ
ＮＡは、特に制限されず、広く普及した入手の容易なも
のが用いられる。例えば、ｐＵＣ１８、ｐＴＶ１１８
Ｎ （宝酒造社製）、ｐＵＥＸ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ社
製）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 社製）
、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等が挙げ
られる。本発明の発現ベクターは、例えば、λｇｔ１１
ファージに組み込まれたダニアレルゲンのｃＤＮＡを、
Ｋｐｎ Ｉ−Ｓａｃ Ｉ 消化し、プラスミドベクター
ｐＵＣ１８のＫｐｎＩ−Ｓａｃ Ｉ 部位に連結して発
現ベクターｐＡＫ１を得ることができる。また、ｐＡＫ
１のＥｃｏＲ Ｉ消化断片を同様にｐＵＣ１８のＥｃｏ
Ｒ Ｉ部位に連結して発現ベクターｐＡＫＥ１を得るこ
とができる。さらに、ｐＡＫＥ１のＥｃｏＲ Ｉ消化断
片を予めＥｃｏＲＩ消化で開裂したｐＵＥＸ２（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社製）に連結して発現ベクターｐＡＥＸ２０
１ を得ることができる。 【００２１】本発明の発現ベクターで形質転換された細
菌、酵母又は哺乳動物細胞は、本発明の遺伝子を発現し
得るものであれば特に制限されないが、例えば、細菌と
しては大腸菌、枯草菌等が、酵母としてはサッカロマイ
セス・シェレビィシェー等が、哺乳動物細胞としては、
チャイニーズ・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル
ＣＯＳ細胞、マウス・フィブロプラスト等が挙げられる
。 【００２２】本発明の組換えダニアレルゲンの製造方法
は、本発明の遺伝子を発現させ得る発現ベクターで形質
転換された細菌、酵母又は哺乳動物細胞を該遺伝子の発
現可能な条件下で培養して、組換えダニアレルゲンを産
生させ、次いで該組換えダニアレルゲンを回収すること
による。即ち、例えばダニアレルゲンのｃＤＮＡが挿入
された融合蛋白発現プラスミドを含有する大腸菌形質転
換株を用いての組換えダニアレルゲンの製造方法として
、次のような方法が例示される。 【００２３】まず、ダニアレルゲンのｃＤＮＡが挿入さ
れたβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白発現プラスミド
を含有する大腸菌形質転換株を常法により振盪培養し対
数増殖させ、この対数増殖期を維持させながら温度ジャ
ンプで、又はβ−ガラクトシダーゼ・インデューサー添
加で融合蛋白質を誘導合成させる。宿主細胞として用い
られる大腸菌としては、例えばＥ． ｃｏｌｉ ｐｏｐ
２１３６ （Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）が用いられ、発現
ベクターで形質転換された株をＥ． ｃｏｌｉ ｐｏｐ
２１３６ ＯＬ−１と命名（微工研菌寄第 １１６５５
号）する。培養終了後、集菌した菌体は、セリン・シス
テイン・アスパラギン酸・金属プロテアーゼインヒビタ
ーを含む緩衝液に懸濁して超音波処理で破壊される。細
胞デブリスにある膜局在性の蛋白をフェニルメタンスル
フォニル・フルオリド、モノヨード酢酸、ペプスタチン
Ａ、エチレンジアミン四酢酸等の蛋白分解酵素阻害剤及
びラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ−１
００ 、ノニデットＰ４０等の界面活性剤を含む緩衝液
で抽出する。その抽出液から、又は培養濃縮液から得ら
れたダニアレルゲン・β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質
を、例えばＵｌｔｒｏｇｅｌＡｃＡ ４４ （ＬＫＢ社
製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、抗β−ガラ
クトシダーゼ抗体固定化アフィニティクロマトグラフィ
ー及び抗ダニ虫体抗体固定化アフィニティクロマトグラ
フィー等で精製する。 なお、抗β−ガラクトシダーゼ抗体固定化担体は、抗β
−ガラクトシダーゼ抗体（５Ｐｒｉｍｅ →３Ｐｒｉｍ
ｅ 社製）を、活性化されたトレシル担体（例えば、ト
レシルＧＭゲル（栗田工業社製）、トレシルトヨパール
（東ソー社製）、トレシルセファロース（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ 社製）等が用いられる）に共有結合させたもの
である。また、抗ダニ虫体抗体固定化担体は、上述の活
性化担体にウサギ抗ダニ虫体抗体を共有結合させたもの
である。 【００２４】精製された組換えダニアレルゲン融合蛋白
質は、プロテアーゼで消化し、ＥＬＩＳＡ 及びダニア
レルギー疾患患者白血球ヒスタミン遊離試験（アレルギ
ー， ３７， ７２５（１９８８） ）でモニター下に
、例えばゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラ
フィー、疎水クロマトグラフィー、クロマトフォカシン
グ、焦点電気泳動法、ゲル電気泳動法等の公知の精製法
を単独又は組み合わせて分画し、活性画分から抗β−ガ
ラクトシダーゼ抗体固定化アフィニティカラムを通して
β−ガラクトシダーゼに由来する蛋白成分を吸収除去す
る。更に、抗ダニ虫体抗体固定化アフィニティカラムで
組換えダニアレルゲンの断片の精製を行なう。 【００２５】また、前記方法で精製されたものの蛋白質
分解酵素、例えば、プロナーゼ、スブチリシン、サーモ
リシン、トリプシン等による消化物や臭化シアン、２−
ニトロ−５−チオシアノ安息香酸、ヒドロキシルアミン
等の化学処理による分解物からのダニアレルゲンの断片
の精製も前記の方法を単独または組み合わせて行なうこ
とができる。 【００２６】また、本発明の組換えダニアレルゲンの製
造方法は、ダニアレルゲン蛋白質の直接発現に加えて、
ダニアレルゲンが他の蛋白質と介在配列を介して融合し
た融合組換えダニアレルゲンとして発現したものを回収
し、次いで融合している他の蛋白質を脱離せしめること
により組換えダニアレルゲンを製造する方法も包含して
いる。融合させる他の蛋白質としては、例えばβ−ガラ
クトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
、プロテインＡ等、一般的に融合蛋白とすることが知ら
れているものが用いられる。 【００２７】他の蛋白質を脱離せしめる方法も公知の方
法が用いられるが、例えば他の蛋白質がβ−ガラクトシ
ダーゼで、ダニアレルゲン蛋白質との間にコラーゲンや
フィブリノーゲン蛋白質の一部が介在している場合には
、コラゲナーゼやトロンビンが用いられ、前記の方法を
単独または組み合わせることによって、ダニアレルゲン
蛋白質を精製する。 【００２８】また、本発明のダニアレルゲン断片は、該
断片のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡを常法によ
り調製して、発現ベクターを構築し、適当な宿主にて発
現させることにより容易に組換えダニアレルゲンとして
得ることができる。更に、該ダニアレルゲン断片を、常
法の固相合成法により合成して合成ダニアレルゲンとし
て、単独にまたは、適当な担体、例えばヒト血清アルブ
ミン、皮内投与で安全性が確認されているホヤ抗原等に
結合させて用いることも出来る。 【００２９】また、本発明のダニ虫体由来のダニアレル
ゲンに含まれるエピトープを有するポリペプチド又は該
エピトープと免疫学的に同一であるとみなされ得るエピ
トープを有するポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（
配列番号：３）、 Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａ
ｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅ
ｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ又は、以下のアミノ酸配列
（配列番号：４）を含有するポリペプチドが挙げられる
。 Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａ
ｒｇ Ｓｅｒ ＳｅｒＡｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａまた、こ
れらのポリペプチドをコードしている遺伝子としては、
以下のＤＮＡ配列（配列番号：３）を含有するもの、 ＡＴＧ ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＴＡ
ＴＣＧ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＧＴ Ｇ
ＣＡ ＴＣＧ ＴＴＧ ＡＡＡ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＣ
Ａ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＣ又は、以下のＤＮＡ配列（
配列番号：４）を含有するものが挙げられる。 ＧＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＴＡ ＴＣＧ ＴＴＧ Ｃ
ＧＡ ＴＣＧ ＴＣＧＧＡＣ ＡＴＴ ＧＣＴ【００３
０】本発明のダニ虫体由来のダニアレルゲンに含まれる
エピトープを有するポリペプチド又は該エピトープと免
疫学的に同一であるとみなされ得るエピトープを有する
ポリペプチドは、前記のようなものが挙げられ、ダニア
レルギー疾患治療剤あるいはダニアレルギー疾患診断薬
における有効成分として用いる場合、いずれも用いるこ
とができるが、抗原性は配列番号：４のものがより高い
ので好ましく用いられる。 【００３１】本発明のダニアレルギー疾患治療剤は前記
の精製された組換えダニアレルゲン、ダニアレルゲン断
片あるいはエピトープを有するポリペプチドを有効成分
とするものであり、各種のダニアレルギー疾患の治療剤
として用いられる。ここでダニアレルギー疾患とは、ア
トピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性
結膜炎、アトピー性皮膚炎等、ダニの特異抗原が原因と
なるあらゆるアレルギー疾患をいう。 【００３２】本発明のダニアレルギー疾患治療剤の調製
方法は、特に制限はないが、例えば、前記の方法により
精製された組換えダニアレルゲン、前記の方法に準じて
精製されたダニアレルゲン断片あるいはエピトープを有
するポリペプチドを乾燥して粉末状で採取し、ダニアレ
ルギー疾患に対する減感作治療剤として用いられる。本
発明のダニアレルギー疾患治療剤は、減感作治療剤とし
て用いられる場合、そのままで、または必要に応じて一
般的に用いられるアジュバントや各種の添加剤、例えば
安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛
化剤、保存剤、着色剤等を常法により添加した配合剤と
して用いることができる。例えば、粉末状の精製された
組換えダニアレルゲンをフェノールを添加した生理食塩
水に溶解し、減感作治療用抗原の原液として用いる。 【００３３】本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、通
常の投与経路例えば経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内
等の投与方法により行なうことができる。更に、例えば
、トローチ、舌下錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤
、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経粘膜薬として
も使用することができる。本発明のダニアレルギー疾患
治療剤の投与量及び投与回数は、投与経路、症状などに
応じて成人１回あたり約２０μｇ以下の範囲となるよう
に適宜選択し、毎週１回程度投与される。また、本発明
のダニアレルギー疾患治療剤は、ダニアレルギー疾患に
対する治療剤のみならず予防剤としても有用である。ま
た、アナフィラキシー誘発作用もなく、人体に対して安
全に用いることができる。 【００３４】本発明のダニアレルギー疾患診断薬は、ダ
ニアレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及びダニア
レルギー診断用滴定試薬として用いられる。皮内反応診
断試薬として用いる場合は、前記の方法により精製され
た組換えダニアレルゲン、前記の方法に準じて精製され
たダニアレルゲン断片あるいはエピトープを有するポリ
ペプチドを常法により調製して得るが、例えば組換えダ
ニアレルゲンを乾燥して粉末状とし、これをフェノール
を含む生理食塩水で溶解し、希釈して用いる。皮内反応
診断試薬として用いる方法は、常法に従って用いられる
。 【００３５】また、ダニアレルギー診断用滴定試薬とし
て用いる場合も同様に常法により調製されるが、例えば
、組換えダニアレルゲンをハンクス緩衝液で適当に溶解
し、希釈してヒスタミン遊離滴定用試薬として用いる。 この方法は通常、以下の操作手順によりなされる。 即ち、ダニアレルギー疾患患者の血液及びこの血液から
遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に懸濁した血
球浮遊液の一定量を、組換えダニアレルゲンを滴定試薬
として用いて滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球（
白血球の一種）から遊離するヒスタミン量をＨＰＬＣを
用いて測定する〔アレルギー，３７， ７２５（１９８
８） 〕。 【００３６】このヒスタミン遊離滴定では、最大遊離量
の５０％量（滴定曲線の変曲点）から遊離されるヒスタ
ミン量を求める。この滴定では、（１）血球浮遊液の滴
定値から患者のアレルゲン感受性を直接測定することに
なる。（２）血漿と組換えダニアレルゲンとを予め反応
させた後、その液で血球浮遊液を滴定して得られる値（
血液滴定曲線値）は、通常、組換えダニアレルゲンで血
球浮遊液を滴定して得られる値（血球浮遊液滴定曲線値
）より高い値が得られる。これは、血漿中にアレルゲン
中和能を持つＩｇＧ 抗体（遮断抗体）が存在するため
である。従って、対血液滴定曲線の、対血球浮遊液滴定
曲線からのシフトの大きさから、遮断抗体価が得られる
。アレルゲン感受性とこの遮断抗体価から、ダニアレル
ギーの正確な診断が可能となる。また、このヒスタミン
遊離滴定試験は減感作治療効果のモニターとしても有用
である。 【００３７】 【実施例】以下に、実施例をあげて本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。 【００３８】実施例１ ダニ全ＲＮＡの抽出：常法によりコナヒョウヒダニを培
養増殖させて得られる生ダニ虫体６ｇ を２００ｍｌの
５．５ Ｍイソチアン酸グアニジン （片山化学社製）
液中で石英砂１０ｇとともに乳鉢中ですりつぶし遠心
分離し、その上清を、１８Ｇの注射針をつけた５０ｍｌ
容のシリンジで吸入、射出を繰り返すことにより、ＤＮ
Ａを部分切断した。再度遠心分離した上清を、１７ｍｌ
のトリフルオロ酢酸セシウム溶液 （片山化学社製）
に対して１６ｍｌの割合で重層し、８５，０００×ｇで
２４時間 （１５℃， ＨＩＴＡＣＨＩ ＳＣＰ５５Ｈ
ｓｗｉｎｇ ＰＲＳ−２７−２）密度勾配遠心分離を
行い、管底にペレットを形成する全ＲＮＡ画分を回収し
た。これを４．０ Ｍイソチアン酸グアニジン溶液に溶
解後、エタノール沈澱して１ｍｌＴＥ （１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ７．５， １ｍＭ ＥＤＴＡ
）溶液とした。 【００３９】実施例２ ダニアレルゲンＰｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡの分離：このダ
ニ全ＲＮＡのＴＥ溶液を、６５℃にて１０分間熱処理し
て急冷後、等量の１ＭＮａＣｌ を加えて、予めＳＴＥ
（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ７．５，
１ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．５Ｍ ＮａＣｌ）溶液で平
衡化したオリゴ （ｄＴ） セルロースカラム （カラ
ム体積０．５ ｍｌ， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ 社製） にかけた。素通り液を再度カラム
にリサイクルした後、２．５ 倍量のＳＴＥ 溶液で、
カラムを洗浄した。洗浄後ＴＥ溶液でｐｏｌｙ（Ａ）ｍ
ＲＮＡを溶出した。ここでは、０．２ ｍｌずつのフラ
クションを取り、臭化エチジウムによるスポットテスト
でＲＮＡが含まれる画分をプールした。このカラムによ
る精製を再度行い、プールした画分からエタノール沈澱
によりＲＮＡを回収して、ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ画分
とした。濃度既知のＲＮＡ溶液希釈系列とともにスポッ
トテストを行なって収量を測定したところ、約２０μｇ
であった。 【００４０】実施例３ ダニアレルゲンｃＤＮＡの合成：次に、このｐｏｌｙ（
Ａ）ｍＲＮＡのうち５μｇを鋳型とし、ｃＤＮＡ合成キ
ット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 社製） でそのマニュアル
に従って、Ｅｃｏ ＲＩ部位を含んだ１３ｍｅｒ のリ
ンカーを両端に持つｃＤＮＡを合成した。 【００４１】実施例４ ダニアレルゲンｃＤＮＡライブラリーの作製：このｃＤ
ＮＡのうちの１／５ 量を、１μｇのＥｃｏ ＲＩ消化
λｇｔｌｌ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍ 社製）と混合し、これをエタノールで
濃縮した後２００ｕｎｉｔｓのＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇ
ａｓｅ を加えて１２℃で１５時間反応させることによ
り、ｃＤＮＡをλｇｔｌｌのＥｃｏ ＲＩ部位に挿入し
た。この反応液から、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング
キット （Ｇｉｇａｐａｃｋ ＰＬＵＳ， Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ社製） を
用いてそのマニュアルにしたがって、ｃＤＮＡライブラ
リーを作製した。このライブラリー作製操作を２度行い
、最終的に２μｇのｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡから合計４
１，０００ ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ
ｕｎｉｔ）のｃＤＮＡライブラリーを得た。 【００４２】実施例５ ダニアレルゲンｃＤＮＡのクローニング：このｃＤＮＡ
の挿入されたλｇｔｌｌファージを懸濁したＳＭ （１
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ７．５， ０．１Ｍ
ＮａＣｌ１０ｍＭ ＭｇＳＯ４， ２％ ｇｅｌ
ａｔｉｎ） 液と一晩培養したＥ． ｃｏｌｉ Ｙ１０
９０ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙ
ｓｔｅｍ 社製）とを３７℃で３０分間振盪培養するこ
とにより、宿主にファージを感染させ、これをＬＢ寒天
培地 （１％ Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎｅ， ０．
５％ Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ， １
．５ ％ Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ （Ｄｉｆｃｏ社製）
， ０．５％ ＮａＣｌ）上に、１プレート当り約２，
０００ 個のプラークを形成するように撒いた。４２℃
で３時間培養後、予め１０ｍＭイソプロピル−１−チオ
−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ） を浸漬させて乾
燥したニトロセルロースメンブレン （Ｈｉｂｏｎｄ−
Ｃ， Ａｍｅｒｓｈａｍ 社製）で培地表面を覆い、さ
らに３７℃で３時間培養して誘導合成されるβ−ガラク
トシダーゼ融合蛋白を転写した。このニトロセルロース
メンブレンを２％ＢＳＡ を含むＴＢＳ（１０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．０， ０．９％
ＮａＣｌ） 溶液中で一晩ブロッキングした後、ウサギ
抗ダニ虫体抗原血清 （１００ 倍ＴＢＳ 希釈） 、
さらにパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ 抗体
（Ｃａｐｐｅｌ社製， ２０００倍ＴＢＳ 希釈）
とそれぞれ１時間ずつ反応させ、発色は０．０１％過酸
化水素の存在下、０．４ ｍｇ／ｍｌのジアミノベンジ
ジン四塩酸塩を含むＴＢＳ 溶液中で行なった。なお、
ウサギ抗ダニ虫体抗原血清は全ダニ飼育物から飽和食塩
、ＰＢＳでダニ虫体を浮遊させ、更にＰＢＳで洗浄した
ダニ虫体を磨砕して、これを免疫源としてウサギに１０
週間毎週追加免疫して得られた抗血清である。茶褐色を
呈したシグナルの位置と合致するプラークをピックアッ
プしてＳＭに懸濁し、陽性クローンとして保存した。 【００４３】実施例６ λｇｔｌｌファージベクターを用いた融合蛋白質の発現
：実施例５の免疫スクリーニングで得られた陽性クロー
ンを、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｙ１０９０ の一晩培養液５０
μｌとともに１００ μｌの１００ ｍＭ ＩＰＴＧ
を含む３ｍｌ ＬＢ 液体培地で３７℃にて８時間振盪
培養し、その培養上清を蒸留水に対して透析、凍結乾燥
してウエスタンブロット用のサンプルとした。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥは、Ｌａｅｍｍｌｉ らの方法（Ｎａｔｕｒ
ｅ， ２２７， ６８０〜６８５（１９７０））に従っ
て行い、２ｍｇのサンプルを、ポリアクリルアミド濃度
５％、定常電流１５ｍＡの条件下で泳動した。その後、
ＳＤＳ −ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ （１９２
ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ−２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ
８．３， ０．１％ ＳＤＳ， ２０％ ｍｅｔｈａｎ
ｏｌ）中で、８−１０Ｖ／ｃｍ、２時間の泳動により、
アクリルアミドゲルからイモビロン（ｐｏｒｅ ｓｉｚ
ｅ ０．４５μｍ ， ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ 社製 ）
膜へ転写した。このイモビロン膜を、Ａｕｒｏ Ｄｙｅ
（ＪＡＮＳＳＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ社製） で蛋白染色及び、ダニアレルギ
ー患者プール血清、ウサギ抗ダニ虫体抗原血清、ウサギ
抗β−ガラクトシダーゼ抗体（５Ｐｒｉｍｅ →３Ｐｒ
ｉｍｅ社製）を用いて免疫染色し、ダニアレルゲン融合
蛋白質を検出した （図１） 。 【００４４】実施例７ 組換えプラスミドの構築：次に、これら抗血清と反応す
るダニアレルゲン・β−ガラクトシダーゼ融合蛋白をコ
ードするｃＤＮＡの挿入されたλｇｔｌｌファージ・ク
ローンから、そのＤＮＡを回収した後Ｅｃｏ ＲＩ消化
し、この消化物を、アガロースゲル電気泳動にかけてｃ
ＤＮＡ鎖長を約１．２ｋｂｐ （リンカーも含めて）
と決定した （図２、図中の矢印）。次に、このｃＤＮ
Ａの挿入されたλｇｔｌｌファージＤＮＡをＫｐｎ Ｉ
−Ｓａｃ Ｉ 消化し、その断片 （約３．３ｋｂｐ）
をプラスミドベクターｐＵＣ１８（宝酒造社製） の
Ｋｐｎ Ｉ−ＳａｃＩ 部位に連結し、Ｈａｎａｈａｎ
の方法（ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｖｏｌ． １，
Ｇｌｏｖｅｒ， Ｄ．Ｍ． ｅｄ．， ｐｐ． １０
９−１３６， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９８５））
に従ってＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ （宝酒造社製）
に形質転換した（図３） 。得られた組換えプラスミド
をｐＡＫ １ と名付け、これを用いて制限酵素地図
（リンカーを除いて１，１４４ｂｐ）を作成した（図４
） 。 【００４５】実施例８ ダニアレルゲンｃＤＮＡの塩基配列の決定：このプラス
ミドｐＡＫ １ のＥｃｏ ＲＩ消化断片を、同じプラ
スミドベクターｐＵＣ１８ のＥｃｏ ＲＩ部位に連結
し、同様にＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に形質転換した
（図５） 。得られた組換えプラスミドをｐＡＫＥ
１と名付け、これを用いて制限酵素地図（リンカーを除
いて９４０ｂｐ）を作成した （図４） 。次に、この
組換えプラスミドｐＡＫ １及びｐＡＫＥ １を、Ｅｃ
ｏ ＲＩやＢａｍ ＨＩなどで消化して得られる種々の
断片を含有するファージベクターＭ１３ｍｐ１８ 及び
ｍｐ１９ （宝酒造社製） の形質転換株の培養上清か
ら常法により一本鎖ＤＮＡを調製し、Ｓｅｑｕｅｎａｓ
ｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（東洋紡績社製） を用い
たジデオキシターミネーション法により、塩基配列の一
部を決定した （配列番号：１）。さらに、同方法によ
り塩基配列について繰り返し検討したところ、前記の塩
基配列（配列番号：１）を含む約１．１ｋｂｐ （リン
カーを除く） の塩基配列を決定した（配列番号：２）
。 【００４６】実施例９ 高発現ベクターの構築：組換えプラスミドｐＡＫＥ １
のＥｃｏＲＩ消化断片 （９４０ｂｐ）をアガロースゲ
ル電気泳動し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ＩＩキット （Ｂ
ＩＯ １０１ 社製） で抽出し、これを予めＥｃｏ
ＲＩ消化で開裂したベクターｐＵＥＸ２ （Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ 社製）へ翻訳方向とフレームが合うように連結
した （図６）。 【００４７】実施例１０ 融合蛋白質として発現：この得られた組換えプラスミド
を、ｐＡＥＸ２０１ と名付け、これをＥ． ｃｏｌｉ
ｐｏｐ２１３６ （Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に形質転
換した。この形質転換株を５００ ｍｌ ＳＢＡ液体培
地 （２．４ ％Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａ
ｃｔ， １．２％Ｂａｃｔｏ ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ，
Ｏ．５ ％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ， ０．１ Ｍ Ｐｏｔ
ａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ， ｐＨ７．５，
５０ｍｇ／ｍｌ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）中で、２８℃
にて６００ｎｍ におけるＯＤ値が０．６ となるまで
振盪培養し、５６℃に保温したＳＢＡ 培地を等量加え
た後、４２℃にて９０分間振盪培養した。この４２℃へ
の温度シフトによる融合蛋白の誘導合成の間、ＯＤ値を
０．６ から１．０ の間に維持するよう新鮮なＳＢＡ
を適時、適量加えた。培養終了後、培養液を遠心分離
して集菌し、滅菌水で洗浄した菌体を１０ｍｌのプロテ
アーゼ阻害液 （０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ
７．５， １ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．１ｍＭ ｐｈｅ
ｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉ
ｄｅ， １ｍＭ ｉｏｄｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，
５ｍＭ １，２−ｅｐｏｘｙ −３− （ｐ−ｎｉｔｒ
ｏｐｈｅｎｏｘｙ） −ｐｒｏｐａｎｅ）に懸濁した。 この懸濁液を１０−２０ ｋＨｚの超音波で処理 （１
分間を１０回） して細胞を破壊し、遠心分離後ペレッ
トを１０ｍｌの０．０２％ＳＤＳ 溶液に懸濁した。再
度遠心分離してペレットを形成する膜局在蛋白を１０ｍ
ｌの２％ＳＤＳ 溶液に完全溶解した。この抽出物の凍
結乾燥物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を図７に示
す。 【００４８】実施例１１ 組換えダニアレルゲン融合蛋白質の精製：この抽出物の
凍結乾燥物は、５００ ｍｌ培養液から１２２ ｍｇで
あった。 その５ｍｇを５００ μｌの水に溶解し、その液を、Ｕ
ｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ４４（ＬＫＢ社製，１．４
×５０ｃｍ） ＋ＡＧ １１Ａ８ （Ｂｉｏ Ｒａｄ社
製， １．４ ×１４ｃｍ） の連結カラムにのせ、展
開溶媒として脱イオン水を流速１０ｍｌ／ｈｒで展開し
、ボイドボリュームに溶出される画分を集めた （図８
） 。この画分の凍結乾燥物は、０．６ ｍｇであった
。更に、抗β−ガラクトシダーゼ抗体固定化アフィニテ
ィカラムを通し、次に、抗ダニ虫体抗体固定化アフィニ
ティカラムで精製を行なった。抗β−ガラクトシダーゼ
抗体固定化アフィニティカラムは、抗β−ガラクトシダ
ーゼ抗体（５Ｐｒｉｍｅ →３Ｐｒｉｍｅ社製） をト
レシルＧＭゲル（栗田工業社製）に固定化させたものを
用いた。抗ダニ虫体抗体固定化アフィニティカラムは、
実施例５に記載のウサギ抗ダニ虫体抗原血清を硫安分画
し、次いでプロテインＡカラムを用いて精製した抗体を
トレシルＧＭゲルに固定化させたものを用いた。 【００４９】実施例１２ 精製融合蛋白質を用いたヒスタミン遊離試験：精製した
抗原液（１ｍｇ／ ｍｌ）を適宜希釈し、この溶液２０
０ μｌにハンクス液で洗浄したダニ喘息患者の血球浮
遊液２００ μｌを加え、３７℃、３０分間反応させた
。１，４００ｒｐｍ、１０分間遠心してその上清２００
μｌをとり、これに６０％過塩素酸１０μｌを加え、
激しく攪拌し、１０，０００ｒｐｍ 、１０分間遠心し
て除蛋白した。この上清１５０ μｌをとり、ＨＰＬＣ
でその１００ μｌ中に存在するヒスタミン量を測定し
た。なお、ここで全ヒスタミン量の測定は、遠心分離に
より血球を除く操作をせずに以下の操作を同様に行なっ
て求めた。得られた結果について、横軸に抗原の濃度を
、縦軸に（遊離ヒスタミン量／全ヒスタミン量）×１０
０ をとって図９に示した。ここでその変曲点の濃度を
比較すると粗虫体抗原よりも、このダニアレルゲン融合
蛋白質は２００ 倍以上の低濃度で反応していることを
示している。 【００５０】実施例１３ 組換えダニアレルゲン断片の調製：ｃＤＮＡの９７０ｂ
ｐ のＥｃｏ ＲＩフラグメントを挿入したｐＵＥＸ２
を用いてＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ （宝酒造
社製Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 用Ｄｅｌｅｔｉｏｎ
ｋｉｔ） によりｃＤＮＡの下流からのディレーショ
ンを行ない、図１０に示すような１０種類のディレーシ
ョンした塩基鎖長のｃＤＮＡを得た。これらを大腸菌に
導入し、最初２８℃において、ニトロセルロース膜上で
生育させ、続いて４２℃、２時間の誘導発現及び１００
℃におけるＳＤＳ での溶菌後、ニトロセルロース膜
に吸着した菌体成分について、抗ダニ抗原抗血清を用い
た酵素免疫抗体法によって抗原活性の有無を検定した。 その結果を図１０に示すが、図中の左から６番目のスポ
ットで、約４００ｂｐ までの欠損で残存する活性が７
番目の約２７０ｂｐ までの欠損によって大部分が消失
し、さらに８番目の約１７０ｂｐ までの欠損によって
完全に消失していることが判明した。このことから、抗
体結合能には少なくとも上流より約１７０ｂｐ 〜約２
７０ｂｐ 、約２７０ｂｐ 〜約４００ｂｐ または約
１７０ｂｐ 〜約４００ｂｐ の領域が必要であること
が推測され、この領域のアミノ酸配列を含む組換えダニ
アレルゲン断片がダニアレルギー疾患治療剤、診断薬の
有効成分として用いることができることが判明した。 【００５１】実施例１４ エピトープを有するポリペプチドの調製実施例１３で得
られた結果をもとに、実施例１３と同様の方法によりＥ
ｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ （宝酒造社製Ｋｉｌｏ
−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 用Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｋｉｔ）
の反応時間を調節することにより、図１１に示すように
１７０ｂｐ 〜４００ｂｐ 領域中のエピトープ領域の
特定を行い、１８１ｂｐ 〜２４６ｂｐ と３４３ｂｐ
〜３７８ｂｐの２つの領域がエピトープ部分として必須
であることがわかった。酵素切断点までの塩基配列の決
定は、Ｔｏｙｏｂｏ社製ＴＡＱｕｅｎｃｅを用いて行っ
た。これらの塩基配列から予想されるアミノ酸配列（配
列番号３、配列番号４）を含有するポリペプチドは、常
法により、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ社製ペプチドシンセサイザーで容易に合成して得られ
る。 【００５２】実施例１５ ダニアレルギー疾患治療剤の調製：精製されたアレルゲ
ン活性成分を乾燥して粉末状で採取してダニアレルギー
疾患に対する減感作治療剤として用いる。０．５ ％フ
ェノールを添加した０．９ ％生理食塩水を溶媒として
、アレルゲン活性成分を１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、
減感作治療用抗原の原液とする。 【００５３】実施例１６ ダニアレルギー疾患診断薬の調製：精製されたアレルゲ
ン活性成分を乾燥して粉末状で採取してダニアレルギー
疾患に対する皮内反応診断試薬及びダニアレルギー診断
用滴定試薬として用いる。皮内反応診断試薬には、０．
５％フェノールを添加した０．９ ％生理食塩水を溶媒
に、アレルゲン活性成分の２０万倍希釈液を調製して用
いる。また、ダニアレルギー診断用滴定試薬には、アレ
ルゲン活性成分を１ｍｇ／ｍｌの濃度でハンクス緩衝液
に溶解し、これをヒスタミン遊離滴定用試薬の原液とし
、その希釈液を用いる。 【００５４】 【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ起源 生物名：コナヒョウヒダニ 組織の種類：虫体 ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＡＡ
ＣＣＡ ＴＴＧ ＣＧＡ ＴＴＣ ＡＧＡ ＧＡＣ Ａ
ＴＣ ＡＣＴ ＧＴＣ ＧＡＡ ４８ Ｐｈｅ
Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌ
ｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ １
５ １０
１５
ＧＧＡ ＡＡＣ ＧＡＡ ＡＡＴ ＧＣＣ ＴＡＴ
ＡＴＣ ＡＡＡ ＡＡＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＣＴＴ Ｃ
ＡＴ ＴＴＧ ＴＣＧ ＣＴＴ ９６ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌ
ｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅ
ｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ２０
２５
３０
ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＣＡ ＡＣＡ ＴＴＧ
ＡＧＴ ＴＴＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＡＡ ＧＣＣ Ｇ
ＡＴ ＧＧＡ ＡＡＡ ＡＴＣ １４４ Ｍｅｔ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌ
ｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌ
ｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ ３５
４０
４５ Ｇ
ＡＣ ＡＴＧ ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＴ
Ａ ＴＣＧ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＧＴ
ＧＣＡ ＴＣＧ ＴＴＧ １９２ Ａｓｐ Ｍｅ
ｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ ５０
５５
６０ ＡＡＡ ＡＴＴ
ＧＡＴ ＴＣＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＣ ＡＡＣ
ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＡＡ Ｔ
ＴＧ ＡＧＴ ２４０ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ
Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐ
ｈｅ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅ
ｒ ６５ ７
０ ７５
８０ ＧＣＡ
ＴＣＧ ＡＴＣ
２４９ Ａｌａ Ｓｅｒ
Ｉｌｅ 【００５５】配列番号：２ 配列の長さ：１０２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ起源 生物名：コナヒョウヒダニ 組織の種類：虫体 ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＡＡ
ＣＣＡ ＴＴＧ ＣＧＡ ＴＴＣ ＡＧＡ ＧＡＣ Ａ
ＴＣ ＡＣＴ ＧＴＣ ＧＡＡ ４８ Ｐｈｅ
Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌ
ｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ １
５ １０
１５
ＧＧＡ ＡＡＣ ＧＡＡ ＡＡＴ ＧＣＣ ＴＡＴ
ＡＴＣ ＡＡＡ ＡＡＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＣＴＴ Ｃ
ＡＴ ＴＴＧ ＴＣＧ ＣＴＴ ９６ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌ
ｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅ
ｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ２
０ ２５
３０
ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＣＡ ＡＣＡ ＴＴＧ
ＡＧＴ ＴＴＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＡＡ ＧＣＣ Ｇ
ＡＴ ＧＧＡ ＡＡＡ ＡＴＣ １４４ Ｍｅｔ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌ
ｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌ
ｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ ３５
４０
４５ ＧＡＣ
ＡＴＧ ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＴＡ
ＴＣＧ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＧＴ Ｇ
ＣＡ ＴＣＧ ＴＴＧ １９２ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐ
ｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓｅ
ｒ Ｌｅｕ ５０
５５
６０ ＡＡＡ ＡＴＴ
ＧＡＴ ＴＣＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＣ ＡＡＣ
ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＡＡ Ｔ
ＴＧ ＡＧＴ ２４０ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ
Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐ
ｈｅ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅ
ｒ ６５ ７
０ ７５
８０ Ｇ
ＣＡ ＴＣＧ ＡＴＣ ＧＴＡ ＡＡＣ ＣＣＡ ＣＧ
Ａ ＴＴＧ ＴＣＡ ＴＧＧ ＣＡＴ ＣＡＡ ＴＡＣ
ＡＣＧ ＡＡＡ ＣＧＣ ２８８ Ａｌａ Ｓｅ
ｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｔｈｒ
Ｌｙｓ Ａｒｇ
８５ ９０
９５
ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＧＴ ＧＡＡ ＴＡＣ ＡＡ
Ｇ ＡＧＴ ＧＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＴＡ ＴＣＧ
ＴＴＧ ＣＧＡ ＴＣＧ ＴＣＧ ３３６ Ａｓ
ｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ
Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
１００ １０５
１１０
ＧＡＣ ＡＴＴ ＧＣＴ ＣＴＣ ＡＡＧ ＡＴ
Ｔ ＡＣＧ ＡＴＧ ＣＣＴ ＧＡＴ ＴＡＴ ＡＡＴ
ＴＣＧ ＡＡＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ３８４ Ａｓ
ｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ １１５
１２０
１２５
ＴＡＴ ＴＣＡ ＣＧＡ ＣＡＡ ＧＧＴ ＧＡ
Ｔ ＣＡＡ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＣ
ＧＡＴ ＧＧＴ ＡＣＡ ＴＴＧ ４３２ Ｔｙ
ｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｎ
Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ １３０
１３５
１４０ ＡＴＣ
ＧＡＡ ＧＧＴ ＣＡＴ ＧＣＡ ＣＡＡ ＧＧＡ
ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＧＡ ＧＡＡ ＧＧＴ ＡＡＡ Ａ
ＴＣ ＣＡＣ ＡＴＴ ４８０ Ｉｌｅ Ｇｌｕ
Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉ
ｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉ
ｓ Ｉｌｅ １４５
１５０ １５５
１６０ Ａ
ＡＡ ＧＧＴ ＡＧＡ ＣＡＡ ＡＣＴ ＧＡＴ ＴＴ
Ｃ ＧＡＧ ＡＴＣ ＧＡＡ ＴＣＣ ＡＡＣ ＴＡＣ
ＣＧＡ ＴＡＣ ＧＡＡ ５２８ Ｌｙｓ Ｇｌ
ｙ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ
Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ
Ｔｙｒ Ｇｌｕ
１６５ １７０
１７５
ＧＡＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＣＴＡ ＡＴＣ ＡＴＣ
ＧＡＡ ＣＣＧ ＧＴＣ ＡＡＧ ＡＧＴ ＧＡＡ Ａ
ＡＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＴＴＧ ５７６ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐ
ｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌ
ｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ １
８０ １８５
１９０
ＧＡＡ ＧＧＣ ＧＴＴ ＣＴＴ ＴＣＣ ＣＧＴ
ＡＡＧ ＧＴＧ ＣＣＡ ＴＣＡ ＣＡＴ ＣＴＧ Ａ
ＣＡ ＣＴＡ ＧＡＡ ＡＣＡ ６２４ Ｇｌｕ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｖ
ａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｇｌｕ Ｔｈｒ １９５
２００
２０５ Ｃ
ＣＡ ＣＧＡ ＧＴＣ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＡＴ ＡＴ
Ｇ ＡＡＡ ＴＡＴ ＧＡＴ ＣＧＡ ＴＡＴ ＧＣＡ
ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ６７２ Ｐｒｏ Ａｒ
ｇ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｌｙｓ
Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ
Ｖａｌ Ｌｙｓ ２１０
２１５
２２０ ＧＴＧ ＴＴＣ
ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＡＴ ＴＡＴ ＧＡＴ ＧＧＣ
ＡＴＣ ＣＡＣ ＴＴＣ ＧＡＧ ＡＡＡ ＣＡＴ Ａ
ＣＣ ＧＡＴ ７２０ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｈ
ｉｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ａｓ
ｐ ２２５ ２３０
２３５
２４０ ＡＴＴ Ｇ
ＡＡ ＴＡＣ ＧＡＡ ＣＣＴ ＧＧＣ ＧＴＴ ＣＧ
Ａ ＴＡＣ ＡＡＧ ＡＴＣ ＡＴＣ ＧＧＣ ＡＡＴ
ＧＧＡ ＡＡＡ ７６８ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｙ
ｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ
Ｌｙｓ ２４５
２５０
２５５ ＣＴＣ Ａ
ＡＧ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＧＣ ＣＧＣ ＣＡＣ ＴＡ
Ｔ ＴＣＴ ＡＴＣ ＧＡＴ ＧＴＧ ＣＡＡ ＧＧＴ
ＡＴＴ ＣＣＡ ８１６ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓ
ｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ
Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ
Ｐｒｏ ２６０
２６５
２７０ ＣＧＣ Ａ
ＡＡ ＧＣＡ ＴＴＣ ＡＡＴ ＣＴＧ ＧＡＣ ＧＣ
Ｔ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＧＡＴ ＴＴＣ ＡＡＡ
ＣＴＧ ＡＡＡ ８６４ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｌｙｓ ２７５
２８０
２８５ ＧＴＧ ＡＧＣ ＡＡＧ Ｃ
ＣＡ ＧＡＡ ＧＡＴ ＡＧＣ ＡＡＴ ＡＡＡ ＧＣ
Ｔ ＣＡＡ ＴＴＣ ＡＧＣ ＴＡＣ ＡＣＡ ＴＴＣ
９１２ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ
２９０ ２９５
３００
ＡＡＣ ＧＡＡ Ｔ
ＡＴ ＡＣＣ ＧＡＧ ＡＣＣ ＧＡＡ ＧＡＡ ＴＡ
Ｔ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＡＴ ＣＣＡ ＣＡＴ ＣＧＴ
ＧＣＣ ９６０ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｔｈ
ｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌｕ
Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ａｌａ
３０５ ３１０
３１５
３２０ ＴＡＴ Ｔ
ＡＴ ＧＴＴ ＡＡＴ ＴＧＧ ＴＴＧ ＡＧＴ ＴＣ
Ｃ ＡＴＴ ＣＧＣ ＡＡＡ ＴＡＣ ＡＴＣ ＣＡＧ
ＡＡＴ ＴＴＣ １００８ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｖａ
ｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｐｈｅ ３２５
３３０
３３５
ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＡＡ ＧＡＣ ＡＡＣ
１０２３ Ｉｌｅ
Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｎ
３４０ 【００５６】 配列番号：３ 配列の長さ：６６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ起源 生物名：コナヒョウヒダニ 組織の種類：虫体 ＡＴＧ ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＴＡ
ＴＣＧ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＧＴ Ｇ
ＣＡ ＴＣＧ ＴＴＧ ＡＡＡ ４８ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐ
ｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓｅ
ｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ １
５ １０
１５ Ａ
ＴＴ ＧＡＴ ＴＣＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＣ
６６ Ｉｌｅ Ａｓ
ｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ
２０ 【００５７】 配列番号：４ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ起源 生物名：コナヒョウヒダニ 組織の種類：虫体 ＧＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＴＡ ＴＣＧ ＴＴＧ
ＣＧＡ ＴＣＧ ＴＣＧ ＧＡＣ ＡＴＴ ＧＣＴ
３６ Ａｓｐ
Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓ
ｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ １
５
１０
る組換えダニアレルゲンに関するものである。 【０００２】 【従来の技術】屋内塵性ダニは、アトピー性気管支喘息
等のアレルギー疾患の主要な原因として重要である。従
来、アレルギー疾患の治療剤としては、アレルギーの原
因物質である減感作療法が、最も重要な根本治療とされ
、特に花粉症を始め屋内塵、真菌アレルギー等の吸入性
アレルゲンである回避困難な抗原で引き起こされる疾患
においては、その評価は今や確立されたものといえる。 しかしながら、この減感作療法では感作抗原によるアナ
フィラキシーの危険が伴う為、安全な治療用抗原の投与
が必要とされ、そのような感作抗原の研究が進められて
いる。 【０００３】ダニアレルギー疾患については、ヤケヒョ
ウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅ
ｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）及びコナヒョウヒダニ（Ｄｅｒ
ｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）の２種
のダニが、屋内塵中のアレルゲン源として重要であると
報告されている〔Ａｌｌｅｒｇ． Ａｓｔｈｍａ， １
０， ３２９ 〜３３４ （１９６４）； Ｊ． Ａｌ
ｌｅｒｇｙ， ４２， １４〜 ２８ （１９６８）］
。これらのダニから、主要ダニアレルゲンが分画され
、それらはダニ排泄物及び／又はダニ虫体中に含有され
ている分子量２４−２８ｋＤ の糖蛋白（ｐＩ ４．６
〜７．２）、及び／又は分子量１４．５−２０ｋＤ の
蛋白（ｐＩ ５〜７．２）であると報告されている〔Ｊ
． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２５， ５８７〜５９２ （
１９８０）； Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，７６， ７５３ 〜７６１ （１９８
５）； Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ４６， ６７９ 〜６８
７ （１９８２）； Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅ
ｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ８１， ２
１４〜２２３ （１９８６）； Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ
Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７５， ６８６ 〜
６９２ （１９８５）等〕。しかし、減感作治療用抗原
として有効かつ安全なものは、未だ得られていないのが
実情である。 【０００４】ダニアレルゲンの遺伝子クローニングとし
ては、ヤケヒョウヒダニの主要アレルゲンであるＤｅｒ
ｐ Ｉ （分子量：２５，３７１） 及びＤｅｒ
ｐ ＩＩ （分子量：１４，１３１と１７，４６０）
について、また、コナヒョウヒダニの主要アレルゲンで
あるＤｅｒ ｆ ＩＩ（開始コドン未同定のため分子量
未定）についても、それぞれの遺伝子がクローニングさ
れ塩基配列も決定されており〔Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ．
Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ８
５， １２７〜１２９ （１９８８）； Ｊ． Ｅｘｐ
． Ｍｅｄ．， １６７， １７５ 〜１８２ （１
９８８）； Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７０，
１４５７ 〜１４６２ （１９８９）； Ｉｎｔ． Ａ
ｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．， ９１， １１８ 〜１２３ （１９９０）；
Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ９１， １２４〜１２９ （１９
９０）；Ｊｐｎ． Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｏｌ．， ３９
， ５５７〜５６１ （１９９０）〕、遺伝子組換え技
術によるダニアレルゲンの研究が試みられている。しか
しながら、未だ感作抗原として使用し得るものは得られ
ていない。 【０００５】一方、ダニアレルギー疾患の診断方法とし
ては、従来、問診を主体とし、屋内塵（ハウスダスト）
抽出物及び／又はダニ虫体抽出物を用いる皮内反応試験
が殆どであり、まれに、ＲＡＳＴ（ｒａｄｉｏ ａｌ
ｌｅｒｇｏｓｏｒｂｅｎｔ ｔｅｓｔ）法による血清中
のＩｇＥ 抗体価（相対値）の測定、吸入誘発試験、鼻
粘膜誘発試験を併用する程度であり、ダニアレルギー疾
患を直接的に診断するのはかなり困難であった。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】従来、屋内塵性ダニを
特異抗原とする気管支喘息の減感作治療法には、屋内塵
（ハウスダスト）抽出液が用いられてきているが、化学
的にはその組成が極めて不明確であり、しかも多種類の
不純物を含み、アナフィラキシー誘発の可能性があるた
めに投与量が極度に制限され、治療効果が極めて低いの
が現状である。したがって、有効性及び安全性の観点か
ら、有用な減感作治療用抗原の出現が望まれると同時に
そのような高品質減感作治療用抗原の安定供給が期待さ
れている。しかしながら、このような安全で確実に奏効
するに充分量のダニアレルゲンを安定供給するには、ダ
ニ飼育物からのダニアレルゲンの抽出、精製による方法
では、量産性がなく量的に限界があるので安定供給は困
難である。 【０００７】本発明の目的は、まさにこの点にあり、ダ
ニアレルギー疾患の治療剤、診断薬としてアナフィラキ
シー誘発性の不純物を含まない安全かつ有効な組換えダ
ニアレルゲンを提供することにある。即ち、本発明の第
１の目的は、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得ら
れるアレルゲン活性を有する組換えダニアレルゲンを提
供することにある。本発明の第２の目的は、該ダニアレ
ルゲンをコードする遺伝子を提供することにある。本発
明の第３の目的は、アレルゲン活性を有する活性断片と
してのダニアレルゲン断片を提供することにある。本発
明の第４の目的は、ダニアレルゲンに含まれるエピトー
プを有するポリペプチド、又は該エピトープと免疫学的
に同一であるとみなされ得るエピトープを有するポリペ
プチドを提供することにある。本発明の第５の目的は、
前記のエピトープを有するポリペプチドをコードする遺
伝子を提供することにある。本発明の第６の目的は、本
発明の遺伝子を発現させ得る発現ベクターを提供するこ
とにある。本発明の第７の目的は、該遺伝子を発現させ
得る発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供す
ることにある。本発明の第８の目的は、該組換えダニア
レルゲンの製造方法を提供することにある。本発明の第
９の目的は、本発明の組換えダニアレルゲンを有効成分
とする新規なダニアレルギー疾患治療剤を提供すること
にある。本発明の第１０の目的は、本発明の組換えダニ
アレルゲンを有効成分とする新規なダニアレルギー疾患
診断薬を提供することにある。本発明の第１１の目的は
、本発明のダニアレルゲン断片を有効成分とする新規な
ダニアレルギー疾患治療剤を提供することにある。本発
明の第１２の目的は、本発明のダニアレルゲン断片を有
効成分とする新規なダニアレルギー疾患診断薬を提供す
ることにある。本発明の第１３の目的は、本発明のエピ
トープを有するポリペプチドを有効成分とする新規なダ
ニアレルギー疾患治療剤を提供することにある。本発明
の第１４の目的は、本発明のエピトープを有するポリペ
プチドを有効成分とする新規なダニアレルギー疾患診断
薬を提供することにある。 【０００８】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ダニ虫体から
強いアレルゲン活性を有するダニアレルゲンをコードす
る遺伝子を見出し、更に研究を重ねて本発明を完成した
。 【０００９】即ち、本発明の要旨は、（１）ダニ虫体由
来の遺伝子の発現によって得られる、以下の部分的アミ
ノ酸配列（配列番号：１）を含んでいる組換えダニアレ
ルゲン、 Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ （２）ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる、
以下のアミノ酸配列（配列番号：２）を含んでいる組換
えダニアレルゲン、 Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｔｈ
ｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａ
ｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ
Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｍ
ｅｔ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａ
ｒｇ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｉｌ
ｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｍ
ｅｔ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｒ
ｇ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｈ
ｉｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌ
ｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｈ
ｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌ
ｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓ
ｐ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ
Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔ
ｙｒ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒ
ｇ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｖ
ａｌ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｎ（３）前記（１）又は
（２） 記載のアミノ酸配列を含むアレルゲン活性を有
する蛋白質をコードしているダニ虫体由来の遺伝子、（
４） 図１０において示される塩基配列において、少な
くとも上流より約１７０ｂｐ〜約２７０ｂｐ 、約２７
０ｂｐ 〜約４００ｂｐ または約１７０ｂｐ 〜約４
００ｂｐ の領域内にコードされているアミノ酸配列を
含有してなるダニアレルゲン断片、（５） ダニアレル
ゲンに含まれるエピトープを有するポリペプチド、又は
該エピトープと免疫学的に同一であるとみなされ得るエ
ピトープを有するポリペプチド、（６）前記（５）記載
のポリペプチドをコードしている遺伝子、（７）前記（
３）又は（５）記載の遺伝子を発現させ得る発現ベクタ
ー、（８）前記（７）記載の発現ベクターで形質転換さ
れた細菌、酵母又は哺乳動物細胞、（９）前記（８）記
載の細菌、酵母又は哺乳動物細胞を該遺伝子の発現可能
な条件下で培養して、組換えダニアレルゲンを産生させ
、次いで該組換えダニアレルゲンを回収することを特徴
とする組換えダニアレルゲンの製造方法、（１０）前記
（１）又は（２）記載の組換えダニアレルゲンを有効成
分とするダニアレルギー疾患治療剤、（１１） 前記（
１）又は（２）記載の組換えダニアレルゲンを有効成分
とするダニアレルギー疾患診断薬、（１１） 前記（４
）記載のダニアレルゲン断片を有効成分とするダニアレ
ルギー疾患治療剤、（１３） 前記（４）記載のダニア
レルゲン断片を有効成分とするダニアレルギー疾患診断
薬、（１４） 前記（５）記載のポリペプチドを有効成
分とするダニアレルギー疾患治療剤、並びに、（１５）
前記（５）記載のポリペプチドを有効成分とするダニ
アレルギー疾患診断薬、に関する。 【００１０】本発明の組換えダニアレルゲンは、ダニ虫
体由来の遺伝子の発現によって得られるものであり、こ
こで用いられるダニは特に限定されるものではないが、
屋内塵性ダニであるコナヒョウヒダニやヤケヒョウヒダ
ニ等が用いられる。 【００１１】本発明の組換えダニアレルゲンは、部分的
アミノ酸配列として以下の配列（配列番号：１）を含ん
でいる蛋白質であって、アレルゲン活性を有するもので
ある。 Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ 【００１２】さらに、前記部分的アミノ酸配列を含む次
のようなアミノ酸配列（配列番号：２）を含む蛋白質で
あって、アレルゲン活性を有するものである。 Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｔｈ
ｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａ
ｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ
Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｍ
ｅｔ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａ
ｒｇ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｉｌ
ｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｍ
ｅｔ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｒ
ｇ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｈ
ｉｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌ
ｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｈ
ｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌ
ｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓ
ｐ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ
Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔ
ｙｒ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒ
ｇ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｖ
ａｌ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｎ【００１３】また、本発
明の組換えダニアレルゲンは、前記アミノ酸配列のうち
１個又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加又は転位に
よって種々変異されたものであっても、アレルゲン活性
を有するものは本発明の組換えダニアレルゲンに含まれ
る。このような変異体は、天然のアレル変異体又は組換
えＤＮＡ技術により、例えばＤＮＡの特定の部位に突然
変異を誘発することにより得られる。 【００１４】本発明の組換えダニアレルゲンには、他の
蛋白質との融合蛋白として発現されたものも含まれる。 本明細書では、他の蛋白質と融合して発現した組換えダ
ニアレルゲンを特に融合組換えダニアレルゲンという場
合がある。融合する他の蛋白質としては特に限定されな
いが、例えば、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ等が挙げられる
。 【００１５】本発明の組換えダニアレルゲンは、アレル
ゲン活性に必須な領域のみの蛋白質断片であってもよく
、また、アレルゲン活性に必須なドメインからなるもの
であってもよい。例えば、本明細書においては、アレル
ゲン活性を有する活性断片を、ダニアレルゲン断片とい
うが、具体的には図１０において示される塩基配列にお
いて、少なくとも上流より約１７０ｂｐ 〜約２７０ｂ
ｐ 、約２７０ｂｐ 〜約４００ｂｐ または約１７０
ｂｐ 〜約４００ｂｐ の領域内にコードされているア
ミノ酸配列を含有してなる断片が挙げられる。また、ダ
ニアレルゲン蛋白質のみを発現させて得られたものの他
に、融合蛋白質として発現したものから他の蛋白質を脱
離せしめて得られたものでもよい。 【００１６】要約すれば、本発明の組換えダニアレルゲ
ンは、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる前
記のアミノ酸配列を実質的に含んでいる、アレルゲン活
性を有する蛋白質である。 【００１７】本発明の組換えダニアレルゲンとして、大
腸菌で発現されたβ−ガラクトシダーゼとの融合組換え
ダニアレルゲンが以下のように例示される。即ち、大腸
菌で発現された融合組換えダニアレルゲンは、Ｕｌｔｒ
ｏｇｅｌ ＡｃＡ ４４ （ＬＫＢ社製）を用いたゲル
濾過クロマトグラフィー、抗β−ガラクトシダーゼ抗体
固定化アフィニティクロマトグラフィー及び抗ダニ虫体
抗体固定化アフィニティクロマトグラフィーで精製され
、組換えダニアレルゲンとして下記のような性質を持つ
。 ■ 色及び性状：白色 ■ 水溶性 ：易溶性 ■ 分子量 ：約４０，０００である。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥで｛（融合蛋白質の分子量）−（β−
ガラクトシダーゼの分子量）｝で見積もる。 ■ 部分的アミノ酸配列（配列番号：１）として次の
ものを含む。 Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ あるいは、前記部分的アミノ酸配列（配列番号：１）を
含む、次のアミノ酸配列（配列番号：２）を含むもので
ある。 Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｔｈ
ｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａ
ｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ
Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｍ
ｅｔ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａ
ｒｇ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｉｌ
ｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｍ
ｅｔ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｒ
ｇ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｈ
ｉｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌ
ｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｈ
ｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌ
ｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓ
ｐ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ
Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔ
ｙｒ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒ
ｇ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｖ
ａｌ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｎ■ 抗原性を有する。 ダニアレルギー患者プール血清中の特異ＩｇＧ 、ウサ
ギ抗ダニ虫体血清、ウサギ抗β−ガラクトシダーゼとの
ＥＬＩＳＡ 反応性及び発現蛋白のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後
、ニトロセルロース膜にブロットし上記抗血清との反応
性により判断する。■ アレルゲン活性を有する。Ｈ
ＰＬＣ（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕ
ｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いたダニア
レルギー患者白血球ヒスタミン遊離試験により判断する
。■ アナフィラキシー反応を誘導しない。常法によ
り、融合蛋白質またはダニアレルゲン蛋白質でモルモッ
トを免疫し、追加免疫時にアナフィラキシー反応につい
て観察する。 【００１８】本発明のダニ虫体由来の遺伝子は、生ダニ
虫体からｍＲＮＡを調製し、そのｍＲＮＡを鋳型として
常法によりｃＤＮＡを合成することにより得られるが、
分子中に前記のアミノ酸配列を含むアレルゲン活性を有
する蛋白質をコードしているものであり、該部分的アミ
ノ酸配列をコードしているＤＮＡとしては、具体的には
以下のような配列（配列番号：１）が例示される。 ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＡＡ
ＣＣＡ ＴＴＧ ＣＧＡ ＴＴＣ ＡＧＡ ＧＡＣ Ａ
ＴＣ ＡＣＴ ＧＴＣ ＧＡＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＧＡ
Ａ ＡＡＴ ＧＣＣ ＴＡＴ ＡＴＣ ＡＡＡ ＡＡＴ
ＧＧＣ ＡＡＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＴＴＧ ＴＣＧ
ＣＴＴ ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＣＡ ＡＣＡ Ｔ
ＴＧ ＡＧＴ ＴＴＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＡＡ ＧＣ
Ｃ ＧＡＴ ＧＧＡ ＡＡＡ ＡＴＣ ＧＡＣ ＡＴＧ
ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＴＡ ＴＣＧ
ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＧＴ ＧＣＡ Ｔ
ＣＧ ＴＴＧ ＡＡＡ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＣＡ ＡＡ
Ｇ ＡＡＡ ＴＡＣ ＡＡＣ ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＡＴ
ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＡＡ ＴＴＧ ＡＧＴ ＧＣＡ
ＴＣＧ ＡＴＣ あるいは、前記塩基配列を含む、次のような塩基配列（
配列番号：２）が例示される。 ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＡＡ
ＣＣＡ ＴＴＧ ＣＧＡ ＴＴＣ ＡＧＡ ＧＡＣ Ａ
ＴＣ ＡＣＴ ＧＴＣ ＧＡＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＧＡ
Ａ ＡＡＴ ＧＣＣ ＴＡＴ ＡＴＣ ＡＡＡ ＡＡＴ
ＧＧＣ ＡＡＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＴＴＧ ＴＣＧ
ＣＴＴ ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＣＡ ＡＣＡ Ｔ
ＴＧ ＡＧＴ ＴＴＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＡＡ ＧＣ
Ｃ ＧＡＴ ＧＧＡ ＡＡＡ ＡＴＣ ＧＡＣ ＡＴＧ
ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＴＡ ＴＣＧ
ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＧＴ ＧＣＡ Ｔ
ＣＧ ＴＴＧ ＡＡＡ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＣＡ ＡＡ
Ｇ ＡＡＡ ＴＡＣ ＡＡＣ ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＡＴ
ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＡＡ ＴＴＧ ＡＧＴ ＧＣＡ
ＴＣＧ ＡＴＣ ＧＴＡ ＡＡＣ ＣＣＡ ＣＧＡ Ｔ
ＴＧ ＴＣＡ ＴＧＧ ＣＡＴ ＣＡＡ ＴＡＣ ＡＣ
Ｇ ＡＡＡ ＣＧＣ ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＧＴ ＧＡＡ
ＴＡＣ ＡＡＧ ＡＧＴ ＧＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ
ＣＴＡ ＴＣＧ ＴＴＧ ＣＧＡ ＴＣＧ ＴＣＧ Ｇ
ＡＣ ＡＴＴ ＧＣＴ ＣＴＣ ＡＡＧ ＡＴＴ ＡＣ
Ｇ ＡＴＧ ＣＣＴ ＧＡＴ ＴＡＴ ＡＡＴ ＴＣＧ
ＡＡＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＣＧＡ
ＣＡＡ ＧＧＴ ＧＡＴ ＣＡＡ ＡＴＣ ＡＡＣ Ａ
ＴＧ ＧＡＣ ＡＴＣ ＧＡＴ ＧＧＴ ＡＣＡ ＴＴ
Ｇ ＡＴＣ ＧＡＡ ＧＧＴ ＣＡＴ ＧＣＡ ＣＡＡ
ＧＧＡ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＧＡ ＧＡＡ ＧＧＴ
ＡＡＡ ＡＴＣ ＣＡＣ ＡＴＴ ＡＡＡ ＧＧＴ Ａ
ＧＡ ＣＡＡ ＡＣＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＧＡＧ ＡＴ
Ｃ ＧＡＡ ＴＣＣ ＡＡＣ ＴＡＣ ＣＧＡ ＴＡＣ
ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＣＴＡ ＡＴＣ
ＡＴＣ ＧＡＡ ＣＣＧ ＧＴＣ ＡＡＧ ＡＧＴ Ｇ
ＡＡ ＡＡＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＡＡ ＧＧ
Ｃ ＧＴＴ ＣＴＴ ＴＣＣ ＣＧＴ ＡＡＧ ＧＴＧ
ＣＣＡ ＴＣＡ ＣＡＴ ＣＴＧ ＡＣＡ ＣＴＡ
ＧＡＡ ＡＣＡ ＣＣＡ ＣＧＡ ＧＴＣ ＡＡＧ Ａ
ＴＧ ＡＡＴ ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＡＴ ＧＡＴ ＣＧ
Ａ ＴＡＴ ＧＣＡ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＴＧ
ＴＴＣ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＡＴ ＴＡＴ ＧＡＴ
ＧＧＣ ＡＴＣ ＣＡＣ ＴＴＣ ＧＡＧ ＡＡＡ Ｃ
ＡＴ ＡＣＣ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＡＡ ＴＡＣ ＧＡ
Ａ ＣＣＴ ＧＧＣ ＧＴＴ ＣＧＡ ＴＡＣ ＡＡＧ
ＡＴＣ ＡＴＣ ＧＧＣ ＡＡＴ ＧＧＡ ＡＡＡ
ＣＴＣ ＡＡＧ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＧＣ ＣＧＣ Ｃ
ＡＣ ＴＡＴ ＴＣＴ ＡＴＣ ＧＡＴ ＧＴＧ ＣＡ
Ａ ＧＧＴ ＡＴＴ ＣＣＡ ＣＧＣ ＡＡＡ ＧＣＡ
ＴＴＣ ＡＡＴ ＣＴＧ ＧＡＣ ＧＣＴ ＧＡＣ
ＴＴＧ ＡＴＧ ＧＡＴ ＴＴＣ ＡＡＡ ＣＴＧ Ａ
ＡＡ ＧＴＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＣＣＡ ＧＡＡ ＧＡ
Ｔ ＡＧＣ ＡＡＴ ＡＡＡ ＧＣＴ ＣＡＡ ＴＴＣ
ＡＧＣ ＴＡＣ ＡＣＡ ＴＴＣ ＡＡＣ ＧＡＡ
ＴＡＴ ＡＣＣ ＧＡＧ ＡＣＣ ＧＡＡ ＧＡＡ Ｔ
ＡＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＡＴ ＣＣＡ ＣＡＴ ＣＧ
Ｔ ＧＣＣ ＴＡＴ ＴＡＴ ＧＴＴ ＡＡＴ ＴＧＧ
ＴＴＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＡＴＴ ＣＧＣ ＡＡＡ
ＴＡＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＡＴ ＴＴＣ ＡＴＣ Ｇ
ＴＣ ＧＡＡ ＧＡＣ ＡＡＣこのＤＮＡ配列は、前記
のＤｅｒ ｐ Ｉ 、Ｄｅｒ ｐ ＩＩ及びＤｅｒ ｆ
ＩＩＩ について報告されているものと比較して相同
性のないものである。 【００１９】本発明のダニ虫体由来の遺伝子は、ｃＤＮ
Ａの全塩基鎖長が約１．２ｋｂｐ（アガロース電気泳動
法、但し、リンカーを除くと１１４３ｂｐ （約１．１
ｋｂｐ） であるが、実際の発現では、その前の停止コ
ドンで終了するので、翻訳される塩基鎖長は、停止コド
ンを含めて１０２６ｂｐ （約１ｋｂｐ）である）であ
って、図４に示す制限酵素地図を有するものである。 【００２０】本発明の発現ベクターは、形質転換された
細菌、酵母又は哺乳動物細胞中において、前記の本発明
の遺伝子を発現させ得るように結合している発現ベクタ
ーである。発現ベクターの構築に用いられるベクターＤ
ＮＡは、特に制限されず、広く普及した入手の容易なも
のが用いられる。例えば、ｐＵＣ１８、ｐＴＶ１１８
Ｎ （宝酒造社製）、ｐＵＥＸ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ社
製）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 社製）
、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等が挙げ
られる。本発明の発現ベクターは、例えば、λｇｔ１１
ファージに組み込まれたダニアレルゲンのｃＤＮＡを、
Ｋｐｎ Ｉ−Ｓａｃ Ｉ 消化し、プラスミドベクター
ｐＵＣ１８のＫｐｎＩ−Ｓａｃ Ｉ 部位に連結して発
現ベクターｐＡＫ１を得ることができる。また、ｐＡＫ
１のＥｃｏＲ Ｉ消化断片を同様にｐＵＣ１８のＥｃｏ
Ｒ Ｉ部位に連結して発現ベクターｐＡＫＥ１を得るこ
とができる。さらに、ｐＡＫＥ１のＥｃｏＲ Ｉ消化断
片を予めＥｃｏＲＩ消化で開裂したｐＵＥＸ２（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社製）に連結して発現ベクターｐＡＥＸ２０
１ を得ることができる。 【００２１】本発明の発現ベクターで形質転換された細
菌、酵母又は哺乳動物細胞は、本発明の遺伝子を発現し
得るものであれば特に制限されないが、例えば、細菌と
しては大腸菌、枯草菌等が、酵母としてはサッカロマイ
セス・シェレビィシェー等が、哺乳動物細胞としては、
チャイニーズ・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル
ＣＯＳ細胞、マウス・フィブロプラスト等が挙げられる
。 【００２２】本発明の組換えダニアレルゲンの製造方法
は、本発明の遺伝子を発現させ得る発現ベクターで形質
転換された細菌、酵母又は哺乳動物細胞を該遺伝子の発
現可能な条件下で培養して、組換えダニアレルゲンを産
生させ、次いで該組換えダニアレルゲンを回収すること
による。即ち、例えばダニアレルゲンのｃＤＮＡが挿入
された融合蛋白発現プラスミドを含有する大腸菌形質転
換株を用いての組換えダニアレルゲンの製造方法として
、次のような方法が例示される。 【００２３】まず、ダニアレルゲンのｃＤＮＡが挿入さ
れたβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白発現プラスミド
を含有する大腸菌形質転換株を常法により振盪培養し対
数増殖させ、この対数増殖期を維持させながら温度ジャ
ンプで、又はβ−ガラクトシダーゼ・インデューサー添
加で融合蛋白質を誘導合成させる。宿主細胞として用い
られる大腸菌としては、例えばＥ． ｃｏｌｉ ｐｏｐ
２１３６ （Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）が用いられ、発現
ベクターで形質転換された株をＥ． ｃｏｌｉ ｐｏｐ
２１３６ ＯＬ−１と命名（微工研菌寄第 １１６５５
号）する。培養終了後、集菌した菌体は、セリン・シス
テイン・アスパラギン酸・金属プロテアーゼインヒビタ
ーを含む緩衝液に懸濁して超音波処理で破壊される。細
胞デブリスにある膜局在性の蛋白をフェニルメタンスル
フォニル・フルオリド、モノヨード酢酸、ペプスタチン
Ａ、エチレンジアミン四酢酸等の蛋白分解酵素阻害剤及
びラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ−１
００ 、ノニデットＰ４０等の界面活性剤を含む緩衝液
で抽出する。その抽出液から、又は培養濃縮液から得ら
れたダニアレルゲン・β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質
を、例えばＵｌｔｒｏｇｅｌＡｃＡ ４４ （ＬＫＢ社
製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、抗β−ガラ
クトシダーゼ抗体固定化アフィニティクロマトグラフィ
ー及び抗ダニ虫体抗体固定化アフィニティクロマトグラ
フィー等で精製する。 なお、抗β−ガラクトシダーゼ抗体固定化担体は、抗β
−ガラクトシダーゼ抗体（５Ｐｒｉｍｅ →３Ｐｒｉｍ
ｅ 社製）を、活性化されたトレシル担体（例えば、ト
レシルＧＭゲル（栗田工業社製）、トレシルトヨパール
（東ソー社製）、トレシルセファロース（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ 社製）等が用いられる）に共有結合させたもの
である。また、抗ダニ虫体抗体固定化担体は、上述の活
性化担体にウサギ抗ダニ虫体抗体を共有結合させたもの
である。 【００２４】精製された組換えダニアレルゲン融合蛋白
質は、プロテアーゼで消化し、ＥＬＩＳＡ 及びダニア
レルギー疾患患者白血球ヒスタミン遊離試験（アレルギ
ー， ３７， ７２５（１９８８） ）でモニター下に
、例えばゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラ
フィー、疎水クロマトグラフィー、クロマトフォカシン
グ、焦点電気泳動法、ゲル電気泳動法等の公知の精製法
を単独又は組み合わせて分画し、活性画分から抗β−ガ
ラクトシダーゼ抗体固定化アフィニティカラムを通して
β−ガラクトシダーゼに由来する蛋白成分を吸収除去す
る。更に、抗ダニ虫体抗体固定化アフィニティカラムで
組換えダニアレルゲンの断片の精製を行なう。 【００２５】また、前記方法で精製されたものの蛋白質
分解酵素、例えば、プロナーゼ、スブチリシン、サーモ
リシン、トリプシン等による消化物や臭化シアン、２−
ニトロ−５−チオシアノ安息香酸、ヒドロキシルアミン
等の化学処理による分解物からのダニアレルゲンの断片
の精製も前記の方法を単独または組み合わせて行なうこ
とができる。 【００２６】また、本発明の組換えダニアレルゲンの製
造方法は、ダニアレルゲン蛋白質の直接発現に加えて、
ダニアレルゲンが他の蛋白質と介在配列を介して融合し
た融合組換えダニアレルゲンとして発現したものを回収
し、次いで融合している他の蛋白質を脱離せしめること
により組換えダニアレルゲンを製造する方法も包含して
いる。融合させる他の蛋白質としては、例えばβ−ガラ
クトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
、プロテインＡ等、一般的に融合蛋白とすることが知ら
れているものが用いられる。 【００２７】他の蛋白質を脱離せしめる方法も公知の方
法が用いられるが、例えば他の蛋白質がβ−ガラクトシ
ダーゼで、ダニアレルゲン蛋白質との間にコラーゲンや
フィブリノーゲン蛋白質の一部が介在している場合には
、コラゲナーゼやトロンビンが用いられ、前記の方法を
単独または組み合わせることによって、ダニアレルゲン
蛋白質を精製する。 【００２８】また、本発明のダニアレルゲン断片は、該
断片のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡを常法によ
り調製して、発現ベクターを構築し、適当な宿主にて発
現させることにより容易に組換えダニアレルゲンとして
得ることができる。更に、該ダニアレルゲン断片を、常
法の固相合成法により合成して合成ダニアレルゲンとし
て、単独にまたは、適当な担体、例えばヒト血清アルブ
ミン、皮内投与で安全性が確認されているホヤ抗原等に
結合させて用いることも出来る。 【００２９】また、本発明のダニ虫体由来のダニアレル
ゲンに含まれるエピトープを有するポリペプチド又は該
エピトープと免疫学的に同一であるとみなされ得るエピ
トープを有するポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（
配列番号：３）、 Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａ
ｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅ
ｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ又は、以下のアミノ酸配列
（配列番号：４）を含有するポリペプチドが挙げられる
。 Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａ
ｒｇ Ｓｅｒ ＳｅｒＡｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａまた、こ
れらのポリペプチドをコードしている遺伝子としては、
以下のＤＮＡ配列（配列番号：３）を含有するもの、 ＡＴＧ ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＴＡ
ＴＣＧ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＧＴ Ｇ
ＣＡ ＴＣＧ ＴＴＧ ＡＡＡ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＣ
Ａ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＣ又は、以下のＤＮＡ配列（
配列番号：４）を含有するものが挙げられる。 ＧＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＴＡ ＴＣＧ ＴＴＧ Ｃ
ＧＡ ＴＣＧ ＴＣＧＧＡＣ ＡＴＴ ＧＣＴ【００３
０】本発明のダニ虫体由来のダニアレルゲンに含まれる
エピトープを有するポリペプチド又は該エピトープと免
疫学的に同一であるとみなされ得るエピトープを有する
ポリペプチドは、前記のようなものが挙げられ、ダニア
レルギー疾患治療剤あるいはダニアレルギー疾患診断薬
における有効成分として用いる場合、いずれも用いるこ
とができるが、抗原性は配列番号：４のものがより高い
ので好ましく用いられる。 【００３１】本発明のダニアレルギー疾患治療剤は前記
の精製された組換えダニアレルゲン、ダニアレルゲン断
片あるいはエピトープを有するポリペプチドを有効成分
とするものであり、各種のダニアレルギー疾患の治療剤
として用いられる。ここでダニアレルギー疾患とは、ア
トピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性
結膜炎、アトピー性皮膚炎等、ダニの特異抗原が原因と
なるあらゆるアレルギー疾患をいう。 【００３２】本発明のダニアレルギー疾患治療剤の調製
方法は、特に制限はないが、例えば、前記の方法により
精製された組換えダニアレルゲン、前記の方法に準じて
精製されたダニアレルゲン断片あるいはエピトープを有
するポリペプチドを乾燥して粉末状で採取し、ダニアレ
ルギー疾患に対する減感作治療剤として用いられる。本
発明のダニアレルギー疾患治療剤は、減感作治療剤とし
て用いられる場合、そのままで、または必要に応じて一
般的に用いられるアジュバントや各種の添加剤、例えば
安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛
化剤、保存剤、着色剤等を常法により添加した配合剤と
して用いることができる。例えば、粉末状の精製された
組換えダニアレルゲンをフェノールを添加した生理食塩
水に溶解し、減感作治療用抗原の原液として用いる。 【００３３】本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、通
常の投与経路例えば経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内
等の投与方法により行なうことができる。更に、例えば
、トローチ、舌下錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤
、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経粘膜薬として
も使用することができる。本発明のダニアレルギー疾患
治療剤の投与量及び投与回数は、投与経路、症状などに
応じて成人１回あたり約２０μｇ以下の範囲となるよう
に適宜選択し、毎週１回程度投与される。また、本発明
のダニアレルギー疾患治療剤は、ダニアレルギー疾患に
対する治療剤のみならず予防剤としても有用である。ま
た、アナフィラキシー誘発作用もなく、人体に対して安
全に用いることができる。 【００３４】本発明のダニアレルギー疾患診断薬は、ダ
ニアレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及びダニア
レルギー診断用滴定試薬として用いられる。皮内反応診
断試薬として用いる場合は、前記の方法により精製され
た組換えダニアレルゲン、前記の方法に準じて精製され
たダニアレルゲン断片あるいはエピトープを有するポリ
ペプチドを常法により調製して得るが、例えば組換えダ
ニアレルゲンを乾燥して粉末状とし、これをフェノール
を含む生理食塩水で溶解し、希釈して用いる。皮内反応
診断試薬として用いる方法は、常法に従って用いられる
。 【００３５】また、ダニアレルギー診断用滴定試薬とし
て用いる場合も同様に常法により調製されるが、例えば
、組換えダニアレルゲンをハンクス緩衝液で適当に溶解
し、希釈してヒスタミン遊離滴定用試薬として用いる。 この方法は通常、以下の操作手順によりなされる。 即ち、ダニアレルギー疾患患者の血液及びこの血液から
遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に懸濁した血
球浮遊液の一定量を、組換えダニアレルゲンを滴定試薬
として用いて滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球（
白血球の一種）から遊離するヒスタミン量をＨＰＬＣを
用いて測定する〔アレルギー，３７， ７２５（１９８
８） 〕。 【００３６】このヒスタミン遊離滴定では、最大遊離量
の５０％量（滴定曲線の変曲点）から遊離されるヒスタ
ミン量を求める。この滴定では、（１）血球浮遊液の滴
定値から患者のアレルゲン感受性を直接測定することに
なる。（２）血漿と組換えダニアレルゲンとを予め反応
させた後、その液で血球浮遊液を滴定して得られる値（
血液滴定曲線値）は、通常、組換えダニアレルゲンで血
球浮遊液を滴定して得られる値（血球浮遊液滴定曲線値
）より高い値が得られる。これは、血漿中にアレルゲン
中和能を持つＩｇＧ 抗体（遮断抗体）が存在するため
である。従って、対血液滴定曲線の、対血球浮遊液滴定
曲線からのシフトの大きさから、遮断抗体価が得られる
。アレルゲン感受性とこの遮断抗体価から、ダニアレル
ギーの正確な診断が可能となる。また、このヒスタミン
遊離滴定試験は減感作治療効果のモニターとしても有用
である。 【００３７】 【実施例】以下に、実施例をあげて本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。 【００３８】実施例１ ダニ全ＲＮＡの抽出：常法によりコナヒョウヒダニを培
養増殖させて得られる生ダニ虫体６ｇ を２００ｍｌの
５．５ Ｍイソチアン酸グアニジン （片山化学社製）
液中で石英砂１０ｇとともに乳鉢中ですりつぶし遠心
分離し、その上清を、１８Ｇの注射針をつけた５０ｍｌ
容のシリンジで吸入、射出を繰り返すことにより、ＤＮ
Ａを部分切断した。再度遠心分離した上清を、１７ｍｌ
のトリフルオロ酢酸セシウム溶液 （片山化学社製）
に対して１６ｍｌの割合で重層し、８５，０００×ｇで
２４時間 （１５℃， ＨＩＴＡＣＨＩ ＳＣＰ５５Ｈ
ｓｗｉｎｇ ＰＲＳ−２７−２）密度勾配遠心分離を
行い、管底にペレットを形成する全ＲＮＡ画分を回収し
た。これを４．０ Ｍイソチアン酸グアニジン溶液に溶
解後、エタノール沈澱して１ｍｌＴＥ （１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ７．５， １ｍＭ ＥＤＴＡ
）溶液とした。 【００３９】実施例２ ダニアレルゲンＰｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡの分離：このダ
ニ全ＲＮＡのＴＥ溶液を、６５℃にて１０分間熱処理し
て急冷後、等量の１ＭＮａＣｌ を加えて、予めＳＴＥ
（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ７．５，
１ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．５Ｍ ＮａＣｌ）溶液で平
衡化したオリゴ （ｄＴ） セルロースカラム （カラ
ム体積０．５ ｍｌ， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ 社製） にかけた。素通り液を再度カラム
にリサイクルした後、２．５ 倍量のＳＴＥ 溶液で、
カラムを洗浄した。洗浄後ＴＥ溶液でｐｏｌｙ（Ａ）ｍ
ＲＮＡを溶出した。ここでは、０．２ ｍｌずつのフラ
クションを取り、臭化エチジウムによるスポットテスト
でＲＮＡが含まれる画分をプールした。このカラムによ
る精製を再度行い、プールした画分からエタノール沈澱
によりＲＮＡを回収して、ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ画分
とした。濃度既知のＲＮＡ溶液希釈系列とともにスポッ
トテストを行なって収量を測定したところ、約２０μｇ
であった。 【００４０】実施例３ ダニアレルゲンｃＤＮＡの合成：次に、このｐｏｌｙ（
Ａ）ｍＲＮＡのうち５μｇを鋳型とし、ｃＤＮＡ合成キ
ット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 社製） でそのマニュアル
に従って、Ｅｃｏ ＲＩ部位を含んだ１３ｍｅｒ のリ
ンカーを両端に持つｃＤＮＡを合成した。 【００４１】実施例４ ダニアレルゲンｃＤＮＡライブラリーの作製：このｃＤ
ＮＡのうちの１／５ 量を、１μｇのＥｃｏ ＲＩ消化
λｇｔｌｌ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍ 社製）と混合し、これをエタノールで
濃縮した後２００ｕｎｉｔｓのＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇ
ａｓｅ を加えて１２℃で１５時間反応させることによ
り、ｃＤＮＡをλｇｔｌｌのＥｃｏ ＲＩ部位に挿入し
た。この反応液から、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング
キット （Ｇｉｇａｐａｃｋ ＰＬＵＳ， Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ社製） を
用いてそのマニュアルにしたがって、ｃＤＮＡライブラ
リーを作製した。このライブラリー作製操作を２度行い
、最終的に２μｇのｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡから合計４
１，０００ ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ
ｕｎｉｔ）のｃＤＮＡライブラリーを得た。 【００４２】実施例５ ダニアレルゲンｃＤＮＡのクローニング：このｃＤＮＡ
の挿入されたλｇｔｌｌファージを懸濁したＳＭ （１
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ７．５， ０．１Ｍ
ＮａＣｌ１０ｍＭ ＭｇＳＯ４， ２％ ｇｅｌ
ａｔｉｎ） 液と一晩培養したＥ． ｃｏｌｉ Ｙ１０
９０ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙ
ｓｔｅｍ 社製）とを３７℃で３０分間振盪培養するこ
とにより、宿主にファージを感染させ、これをＬＢ寒天
培地 （１％ Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎｅ， ０．
５％ Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ， １
．５ ％ Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ （Ｄｉｆｃｏ社製）
， ０．５％ ＮａＣｌ）上に、１プレート当り約２，
０００ 個のプラークを形成するように撒いた。４２℃
で３時間培養後、予め１０ｍＭイソプロピル−１−チオ
−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ） を浸漬させて乾
燥したニトロセルロースメンブレン （Ｈｉｂｏｎｄ−
Ｃ， Ａｍｅｒｓｈａｍ 社製）で培地表面を覆い、さ
らに３７℃で３時間培養して誘導合成されるβ−ガラク
トシダーゼ融合蛋白を転写した。このニトロセルロース
メンブレンを２％ＢＳＡ を含むＴＢＳ（１０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．０， ０．９％
ＮａＣｌ） 溶液中で一晩ブロッキングした後、ウサギ
抗ダニ虫体抗原血清 （１００ 倍ＴＢＳ 希釈） 、
さらにパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ 抗体
（Ｃａｐｐｅｌ社製， ２０００倍ＴＢＳ 希釈）
とそれぞれ１時間ずつ反応させ、発色は０．０１％過酸
化水素の存在下、０．４ ｍｇ／ｍｌのジアミノベンジ
ジン四塩酸塩を含むＴＢＳ 溶液中で行なった。なお、
ウサギ抗ダニ虫体抗原血清は全ダニ飼育物から飽和食塩
、ＰＢＳでダニ虫体を浮遊させ、更にＰＢＳで洗浄した
ダニ虫体を磨砕して、これを免疫源としてウサギに１０
週間毎週追加免疫して得られた抗血清である。茶褐色を
呈したシグナルの位置と合致するプラークをピックアッ
プしてＳＭに懸濁し、陽性クローンとして保存した。 【００４３】実施例６ λｇｔｌｌファージベクターを用いた融合蛋白質の発現
：実施例５の免疫スクリーニングで得られた陽性クロー
ンを、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｙ１０９０ の一晩培養液５０
μｌとともに１００ μｌの１００ ｍＭ ＩＰＴＧ
を含む３ｍｌ ＬＢ 液体培地で３７℃にて８時間振盪
培養し、その培養上清を蒸留水に対して透析、凍結乾燥
してウエスタンブロット用のサンプルとした。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥは、Ｌａｅｍｍｌｉ らの方法（Ｎａｔｕｒ
ｅ， ２２７， ６８０〜６８５（１９７０））に従っ
て行い、２ｍｇのサンプルを、ポリアクリルアミド濃度
５％、定常電流１５ｍＡの条件下で泳動した。その後、
ＳＤＳ −ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ （１９２
ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ−２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ
８．３， ０．１％ ＳＤＳ， ２０％ ｍｅｔｈａｎ
ｏｌ）中で、８−１０Ｖ／ｃｍ、２時間の泳動により、
アクリルアミドゲルからイモビロン（ｐｏｒｅ ｓｉｚ
ｅ ０．４５μｍ ， ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ 社製 ）
膜へ転写した。このイモビロン膜を、Ａｕｒｏ Ｄｙｅ
（ＪＡＮＳＳＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ社製） で蛋白染色及び、ダニアレルギ
ー患者プール血清、ウサギ抗ダニ虫体抗原血清、ウサギ
抗β−ガラクトシダーゼ抗体（５Ｐｒｉｍｅ →３Ｐｒ
ｉｍｅ社製）を用いて免疫染色し、ダニアレルゲン融合
蛋白質を検出した （図１） 。 【００４４】実施例７ 組換えプラスミドの構築：次に、これら抗血清と反応す
るダニアレルゲン・β−ガラクトシダーゼ融合蛋白をコ
ードするｃＤＮＡの挿入されたλｇｔｌｌファージ・ク
ローンから、そのＤＮＡを回収した後Ｅｃｏ ＲＩ消化
し、この消化物を、アガロースゲル電気泳動にかけてｃ
ＤＮＡ鎖長を約１．２ｋｂｐ （リンカーも含めて）
と決定した （図２、図中の矢印）。次に、このｃＤＮ
Ａの挿入されたλｇｔｌｌファージＤＮＡをＫｐｎ Ｉ
−Ｓａｃ Ｉ 消化し、その断片 （約３．３ｋｂｐ）
をプラスミドベクターｐＵＣ１８（宝酒造社製） の
Ｋｐｎ Ｉ−ＳａｃＩ 部位に連結し、Ｈａｎａｈａｎ
の方法（ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｖｏｌ． １，
Ｇｌｏｖｅｒ， Ｄ．Ｍ． ｅｄ．， ｐｐ． １０
９−１３６， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９８５））
に従ってＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ （宝酒造社製）
に形質転換した（図３） 。得られた組換えプラスミド
をｐＡＫ １ と名付け、これを用いて制限酵素地図
（リンカーを除いて１，１４４ｂｐ）を作成した（図４
） 。 【００４５】実施例８ ダニアレルゲンｃＤＮＡの塩基配列の決定：このプラス
ミドｐＡＫ １ のＥｃｏ ＲＩ消化断片を、同じプラ
スミドベクターｐＵＣ１８ のＥｃｏ ＲＩ部位に連結
し、同様にＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に形質転換した
（図５） 。得られた組換えプラスミドをｐＡＫＥ
１と名付け、これを用いて制限酵素地図（リンカーを除
いて９４０ｂｐ）を作成した （図４） 。次に、この
組換えプラスミドｐＡＫ １及びｐＡＫＥ １を、Ｅｃ
ｏ ＲＩやＢａｍ ＨＩなどで消化して得られる種々の
断片を含有するファージベクターＭ１３ｍｐ１８ 及び
ｍｐ１９ （宝酒造社製） の形質転換株の培養上清か
ら常法により一本鎖ＤＮＡを調製し、Ｓｅｑｕｅｎａｓ
ｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（東洋紡績社製） を用い
たジデオキシターミネーション法により、塩基配列の一
部を決定した （配列番号：１）。さらに、同方法によ
り塩基配列について繰り返し検討したところ、前記の塩
基配列（配列番号：１）を含む約１．１ｋｂｐ （リン
カーを除く） の塩基配列を決定した（配列番号：２）
。 【００４６】実施例９ 高発現ベクターの構築：組換えプラスミドｐＡＫＥ １
のＥｃｏＲＩ消化断片 （９４０ｂｐ）をアガロースゲ
ル電気泳動し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ＩＩキット （Ｂ
ＩＯ １０１ 社製） で抽出し、これを予めＥｃｏ
ＲＩ消化で開裂したベクターｐＵＥＸ２ （Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ 社製）へ翻訳方向とフレームが合うように連結
した （図６）。 【００４７】実施例１０ 融合蛋白質として発現：この得られた組換えプラスミド
を、ｐＡＥＸ２０１ と名付け、これをＥ． ｃｏｌｉ
ｐｏｐ２１３６ （Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に形質転
換した。この形質転換株を５００ ｍｌ ＳＢＡ液体培
地 （２．４ ％Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａ
ｃｔ， １．２％Ｂａｃｔｏ ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ，
Ｏ．５ ％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ， ０．１ Ｍ Ｐｏｔ
ａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ， ｐＨ７．５，
５０ｍｇ／ｍｌ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）中で、２８℃
にて６００ｎｍ におけるＯＤ値が０．６ となるまで
振盪培養し、５６℃に保温したＳＢＡ 培地を等量加え
た後、４２℃にて９０分間振盪培養した。この４２℃へ
の温度シフトによる融合蛋白の誘導合成の間、ＯＤ値を
０．６ から１．０ の間に維持するよう新鮮なＳＢＡ
を適時、適量加えた。培養終了後、培養液を遠心分離
して集菌し、滅菌水で洗浄した菌体を１０ｍｌのプロテ
アーゼ阻害液 （０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ
７．５， １ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．１ｍＭ ｐｈｅ
ｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉ
ｄｅ， １ｍＭ ｉｏｄｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，
５ｍＭ １，２−ｅｐｏｘｙ −３− （ｐ−ｎｉｔｒ
ｏｐｈｅｎｏｘｙ） −ｐｒｏｐａｎｅ）に懸濁した。 この懸濁液を１０−２０ ｋＨｚの超音波で処理 （１
分間を１０回） して細胞を破壊し、遠心分離後ペレッ
トを１０ｍｌの０．０２％ＳＤＳ 溶液に懸濁した。再
度遠心分離してペレットを形成する膜局在蛋白を１０ｍ
ｌの２％ＳＤＳ 溶液に完全溶解した。この抽出物の凍
結乾燥物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を図７に示
す。 【００４８】実施例１１ 組換えダニアレルゲン融合蛋白質の精製：この抽出物の
凍結乾燥物は、５００ ｍｌ培養液から１２２ ｍｇで
あった。 その５ｍｇを５００ μｌの水に溶解し、その液を、Ｕ
ｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ４４（ＬＫＢ社製，１．４
×５０ｃｍ） ＋ＡＧ １１Ａ８ （Ｂｉｏ Ｒａｄ社
製， １．４ ×１４ｃｍ） の連結カラムにのせ、展
開溶媒として脱イオン水を流速１０ｍｌ／ｈｒで展開し
、ボイドボリュームに溶出される画分を集めた （図８
） 。この画分の凍結乾燥物は、０．６ ｍｇであった
。更に、抗β−ガラクトシダーゼ抗体固定化アフィニテ
ィカラムを通し、次に、抗ダニ虫体抗体固定化アフィニ
ティカラムで精製を行なった。抗β−ガラクトシダーゼ
抗体固定化アフィニティカラムは、抗β−ガラクトシダ
ーゼ抗体（５Ｐｒｉｍｅ →３Ｐｒｉｍｅ社製） をト
レシルＧＭゲル（栗田工業社製）に固定化させたものを
用いた。抗ダニ虫体抗体固定化アフィニティカラムは、
実施例５に記載のウサギ抗ダニ虫体抗原血清を硫安分画
し、次いでプロテインＡカラムを用いて精製した抗体を
トレシルＧＭゲルに固定化させたものを用いた。 【００４９】実施例１２ 精製融合蛋白質を用いたヒスタミン遊離試験：精製した
抗原液（１ｍｇ／ ｍｌ）を適宜希釈し、この溶液２０
０ μｌにハンクス液で洗浄したダニ喘息患者の血球浮
遊液２００ μｌを加え、３７℃、３０分間反応させた
。１，４００ｒｐｍ、１０分間遠心してその上清２００
μｌをとり、これに６０％過塩素酸１０μｌを加え、
激しく攪拌し、１０，０００ｒｐｍ 、１０分間遠心し
て除蛋白した。この上清１５０ μｌをとり、ＨＰＬＣ
でその１００ μｌ中に存在するヒスタミン量を測定し
た。なお、ここで全ヒスタミン量の測定は、遠心分離に
より血球を除く操作をせずに以下の操作を同様に行なっ
て求めた。得られた結果について、横軸に抗原の濃度を
、縦軸に（遊離ヒスタミン量／全ヒスタミン量）×１０
０ をとって図９に示した。ここでその変曲点の濃度を
比較すると粗虫体抗原よりも、このダニアレルゲン融合
蛋白質は２００ 倍以上の低濃度で反応していることを
示している。 【００５０】実施例１３ 組換えダニアレルゲン断片の調製：ｃＤＮＡの９７０ｂ
ｐ のＥｃｏ ＲＩフラグメントを挿入したｐＵＥＸ２
を用いてＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ （宝酒造
社製Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 用Ｄｅｌｅｔｉｏｎ
ｋｉｔ） によりｃＤＮＡの下流からのディレーショ
ンを行ない、図１０に示すような１０種類のディレーシ
ョンした塩基鎖長のｃＤＮＡを得た。これらを大腸菌に
導入し、最初２８℃において、ニトロセルロース膜上で
生育させ、続いて４２℃、２時間の誘導発現及び１００
℃におけるＳＤＳ での溶菌後、ニトロセルロース膜
に吸着した菌体成分について、抗ダニ抗原抗血清を用い
た酵素免疫抗体法によって抗原活性の有無を検定した。 その結果を図１０に示すが、図中の左から６番目のスポ
ットで、約４００ｂｐ までの欠損で残存する活性が７
番目の約２７０ｂｐ までの欠損によって大部分が消失
し、さらに８番目の約１７０ｂｐ までの欠損によって
完全に消失していることが判明した。このことから、抗
体結合能には少なくとも上流より約１７０ｂｐ 〜約２
７０ｂｐ 、約２７０ｂｐ 〜約４００ｂｐ または約
１７０ｂｐ 〜約４００ｂｐ の領域が必要であること
が推測され、この領域のアミノ酸配列を含む組換えダニ
アレルゲン断片がダニアレルギー疾患治療剤、診断薬の
有効成分として用いることができることが判明した。 【００５１】実施例１４ エピトープを有するポリペプチドの調製実施例１３で得
られた結果をもとに、実施例１３と同様の方法によりＥ
ｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ （宝酒造社製Ｋｉｌｏ
−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 用Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｋｉｔ）
の反応時間を調節することにより、図１１に示すように
１７０ｂｐ 〜４００ｂｐ 領域中のエピトープ領域の
特定を行い、１８１ｂｐ 〜２４６ｂｐ と３４３ｂｐ
〜３７８ｂｐの２つの領域がエピトープ部分として必須
であることがわかった。酵素切断点までの塩基配列の決
定は、Ｔｏｙｏｂｏ社製ＴＡＱｕｅｎｃｅを用いて行っ
た。これらの塩基配列から予想されるアミノ酸配列（配
列番号３、配列番号４）を含有するポリペプチドは、常
法により、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ社製ペプチドシンセサイザーで容易に合成して得られ
る。 【００５２】実施例１５ ダニアレルギー疾患治療剤の調製：精製されたアレルゲ
ン活性成分を乾燥して粉末状で採取してダニアレルギー
疾患に対する減感作治療剤として用いる。０．５ ％フ
ェノールを添加した０．９ ％生理食塩水を溶媒として
、アレルゲン活性成分を１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、
減感作治療用抗原の原液とする。 【００５３】実施例１６ ダニアレルギー疾患診断薬の調製：精製されたアレルゲ
ン活性成分を乾燥して粉末状で採取してダニアレルギー
疾患に対する皮内反応診断試薬及びダニアレルギー診断
用滴定試薬として用いる。皮内反応診断試薬には、０．
５％フェノールを添加した０．９ ％生理食塩水を溶媒
に、アレルゲン活性成分の２０万倍希釈液を調製して用
いる。また、ダニアレルギー診断用滴定試薬には、アレ
ルゲン活性成分を１ｍｇ／ｍｌの濃度でハンクス緩衝液
に溶解し、これをヒスタミン遊離滴定用試薬の原液とし
、その希釈液を用いる。 【００５４】 【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ起源 生物名：コナヒョウヒダニ 組織の種類：虫体 ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＡＡ
ＣＣＡ ＴＴＧ ＣＧＡ ＴＴＣ ＡＧＡ ＧＡＣ Ａ
ＴＣ ＡＣＴ ＧＴＣ ＧＡＡ ４８ Ｐｈｅ
Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌ
ｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ １
５ １０
１５
ＧＧＡ ＡＡＣ ＧＡＡ ＡＡＴ ＧＣＣ ＴＡＴ
ＡＴＣ ＡＡＡ ＡＡＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＣＴＴ Ｃ
ＡＴ ＴＴＧ ＴＣＧ ＣＴＴ ９６ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌ
ｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅ
ｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ２０
２５
３０
ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＣＡ ＡＣＡ ＴＴＧ
ＡＧＴ ＴＴＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＡＡ ＧＣＣ Ｇ
ＡＴ ＧＧＡ ＡＡＡ ＡＴＣ １４４ Ｍｅｔ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌ
ｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌ
ｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ ３５
４０
４５ Ｇ
ＡＣ ＡＴＧ ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＴ
Ａ ＴＣＧ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＧＴ
ＧＣＡ ＴＣＧ ＴＴＧ １９２ Ａｓｐ Ｍｅ
ｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ ５０
５５
６０ ＡＡＡ ＡＴＴ
ＧＡＴ ＴＣＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＣ ＡＡＣ
ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＡＡ Ｔ
ＴＧ ＡＧＴ ２４０ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ
Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐ
ｈｅ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅ
ｒ ６５ ７
０ ７５
８０ ＧＣＡ
ＴＣＧ ＡＴＣ
２４９ Ａｌａ Ｓｅｒ
Ｉｌｅ 【００５５】配列番号：２ 配列の長さ：１０２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ起源 生物名：コナヒョウヒダニ 組織の種類：虫体 ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＡＡ
ＣＣＡ ＴＴＧ ＣＧＡ ＴＴＣ ＡＧＡ ＧＡＣ Ａ
ＴＣ ＡＣＴ ＧＴＣ ＧＡＡ ４８ Ｐｈｅ
Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌ
ｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ １
５ １０
１５
ＧＧＡ ＡＡＣ ＧＡＡ ＡＡＴ ＧＣＣ ＴＡＴ
ＡＴＣ ＡＡＡ ＡＡＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＣＴＴ Ｃ
ＡＴ ＴＴＧ ＴＣＧ ＣＴＴ ９６ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌ
ｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅ
ｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ２
０ ２５
３０
ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＣＡ ＡＣＡ ＴＴＧ
ＡＧＴ ＴＴＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＡＡ ＧＣＣ Ｇ
ＡＴ ＧＧＡ ＡＡＡ ＡＴＣ １４４ Ｍｅｔ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌ
ｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌ
ｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ ３５
４０
４５ ＧＡＣ
ＡＴＧ ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＴＡ
ＴＣＧ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＧＴ Ｇ
ＣＡ ＴＣＧ ＴＴＧ １９２ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐ
ｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓｅ
ｒ Ｌｅｕ ５０
５５
６０ ＡＡＡ ＡＴＴ
ＧＡＴ ＴＣＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＣ ＡＡＣ
ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＡＡ Ｔ
ＴＧ ＡＧＴ ２４０ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ
Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐ
ｈｅ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅ
ｒ ６５ ７
０ ７５
８０ Ｇ
ＣＡ ＴＣＧ ＡＴＣ ＧＴＡ ＡＡＣ ＣＣＡ ＣＧ
Ａ ＴＴＧ ＴＣＡ ＴＧＧ ＣＡＴ ＣＡＡ ＴＡＣ
ＡＣＧ ＡＡＡ ＣＧＣ ２８８ Ａｌａ Ｓｅ
ｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｔｈｒ
Ｌｙｓ Ａｒｇ
８５ ９０
９５
ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＧＴ ＧＡＡ ＴＡＣ ＡＡ
Ｇ ＡＧＴ ＧＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＴＡ ＴＣＧ
ＴＴＧ ＣＧＡ ＴＣＧ ＴＣＧ ３３６ Ａｓ
ｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ
Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
１００ １０５
１１０
ＧＡＣ ＡＴＴ ＧＣＴ ＣＴＣ ＡＡＧ ＡＴ
Ｔ ＡＣＧ ＡＴＧ ＣＣＴ ＧＡＴ ＴＡＴ ＡＡＴ
ＴＣＧ ＡＡＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ３８４ Ａｓ
ｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ １１５
１２０
１２５
ＴＡＴ ＴＣＡ ＣＧＡ ＣＡＡ ＧＧＴ ＧＡ
Ｔ ＣＡＡ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＣ
ＧＡＴ ＧＧＴ ＡＣＡ ＴＴＧ ４３２ Ｔｙ
ｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｎ
Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ １３０
１３５
１４０ ＡＴＣ
ＧＡＡ ＧＧＴ ＣＡＴ ＧＣＡ ＣＡＡ ＧＧＡ
ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＧＡ ＧＡＡ ＧＧＴ ＡＡＡ Ａ
ＴＣ ＣＡＣ ＡＴＴ ４８０ Ｉｌｅ Ｇｌｕ
Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉ
ｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉ
ｓ Ｉｌｅ １４５
１５０ １５５
１６０ Ａ
ＡＡ ＧＧＴ ＡＧＡ ＣＡＡ ＡＣＴ ＧＡＴ ＴＴ
Ｃ ＧＡＧ ＡＴＣ ＧＡＡ ＴＣＣ ＡＡＣ ＴＡＣ
ＣＧＡ ＴＡＣ ＧＡＡ ５２８ Ｌｙｓ Ｇｌ
ｙ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ
Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ
Ｔｙｒ Ｇｌｕ
１６５ １７０
１７５
ＧＡＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＣＴＡ ＡＴＣ ＡＴＣ
ＧＡＡ ＣＣＧ ＧＴＣ ＡＡＧ ＡＧＴ ＧＡＡ Ａ
ＡＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＴＴＧ ５７６ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐ
ｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌ
ｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ １
８０ １８５
１９０
ＧＡＡ ＧＧＣ ＧＴＴ ＣＴＴ ＴＣＣ ＣＧＴ
ＡＡＧ ＧＴＧ ＣＣＡ ＴＣＡ ＣＡＴ ＣＴＧ Ａ
ＣＡ ＣＴＡ ＧＡＡ ＡＣＡ ６２４ Ｇｌｕ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｖ
ａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｇｌｕ Ｔｈｒ １９５
２００
２０５ Ｃ
ＣＡ ＣＧＡ ＧＴＣ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＡＴ ＡＴ
Ｇ ＡＡＡ ＴＡＴ ＧＡＴ ＣＧＡ ＴＡＴ ＧＣＡ
ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ６７２ Ｐｒｏ Ａｒ
ｇ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｌｙｓ
Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ
Ｖａｌ Ｌｙｓ ２１０
２１５
２２０ ＧＴＧ ＴＴＣ
ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＡＴ ＴＡＴ ＧＡＴ ＧＧＣ
ＡＴＣ ＣＡＣ ＴＴＣ ＧＡＧ ＡＡＡ ＣＡＴ Ａ
ＣＣ ＧＡＴ ７２０ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｈ
ｉｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ａｓ
ｐ ２２５ ２３０
２３５
２４０ ＡＴＴ Ｇ
ＡＡ ＴＡＣ ＧＡＡ ＣＣＴ ＧＧＣ ＧＴＴ ＣＧ
Ａ ＴＡＣ ＡＡＧ ＡＴＣ ＡＴＣ ＧＧＣ ＡＡＴ
ＧＧＡ ＡＡＡ ７６８ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｙ
ｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ
Ｌｙｓ ２４５
２５０
２５５ ＣＴＣ Ａ
ＡＧ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＧＣ ＣＧＣ ＣＡＣ ＴＡ
Ｔ ＴＣＴ ＡＴＣ ＧＡＴ ＧＴＧ ＣＡＡ ＧＧＴ
ＡＴＴ ＣＣＡ ８１６ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓ
ｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ
Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ
Ｐｒｏ ２６０
２６５
２７０ ＣＧＣ Ａ
ＡＡ ＧＣＡ ＴＴＣ ＡＡＴ ＣＴＧ ＧＡＣ ＧＣ
Ｔ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＧＡＴ ＴＴＣ ＡＡＡ
ＣＴＧ ＡＡＡ ８６４ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｌｙｓ ２７５
２８０
２８５ ＧＴＧ ＡＧＣ ＡＡＧ Ｃ
ＣＡ ＧＡＡ ＧＡＴ ＡＧＣ ＡＡＴ ＡＡＡ ＧＣ
Ｔ ＣＡＡ ＴＴＣ ＡＧＣ ＴＡＣ ＡＣＡ ＴＴＣ
９１２ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ
２９０ ２９５
３００
ＡＡＣ ＧＡＡ Ｔ
ＡＴ ＡＣＣ ＧＡＧ ＡＣＣ ＧＡＡ ＧＡＡ ＴＡ
Ｔ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＡＴ ＣＣＡ ＣＡＴ ＣＧＴ
ＧＣＣ ９６０ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｔｈ
ｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌｕ
Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ａｌａ
３０５ ３１０
３１５
３２０ ＴＡＴ Ｔ
ＡＴ ＧＴＴ ＡＡＴ ＴＧＧ ＴＴＧ ＡＧＴ ＴＣ
Ｃ ＡＴＴ ＣＧＣ ＡＡＡ ＴＡＣ ＡＴＣ ＣＡＧ
ＡＡＴ ＴＴＣ １００８ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｖａ
ｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｐｈｅ ３２５
３３０
３３５
ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＡＡ ＧＡＣ ＡＡＣ
１０２３ Ｉｌｅ
Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｎ
３４０ 【００５６】 配列番号：３ 配列の長さ：６６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ起源 生物名：コナヒョウヒダニ 組織の種類：虫体 ＡＴＧ ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＴＡ
ＴＣＧ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＧＴ Ｇ
ＣＡ ＴＣＧ ＴＴＧ ＡＡＡ ４８ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐ
ｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓｅ
ｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ １
５ １０
１５ Ａ
ＴＴ ＧＡＴ ＴＣＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＣ
６６ Ｉｌｅ Ａｓ
ｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ
２０ 【００５７】 配列番号：４ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ起源 生物名：コナヒョウヒダニ 組織の種類：虫体 ＧＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＴＡ ＴＣＧ ＴＴＧ
ＣＧＡ ＴＣＧ ＴＣＧ ＧＡＣ ＡＴＴ ＧＣＴ
３６ Ａｓｐ
Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓ
ｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ １
５
１０
【図１】Ｅ． ｃｏｌｉ Ｙ１０９０ を宿主として、
ダニアレルゲンｃＤＮＡの挿入されたλｇｔｌｌにより
発現されたダニアレルゲン融合蛋白質をＳＤＳ −ＰＡ
ＧＥ分析後、ニトロセルロース膜にブロットし、蛋白染
色と免疫染色をした結果を示した図である。図中、レー
ン１は分子量マーカー（β−ガラクトシダーゼ：約１３
万）を、レーン２はＥ． ｃｏｌｉＹ１０９０ 細胞全
蛋白を、レーン３はウサギ抗ダニ虫体抗原抗血清を用い
た組換えダニアレルゲンの免疫染色（矢印）を示す。
ダニアレルゲンｃＤＮＡの挿入されたλｇｔｌｌにより
発現されたダニアレルゲン融合蛋白質をＳＤＳ −ＰＡ
ＧＥ分析後、ニトロセルロース膜にブロットし、蛋白染
色と免疫染色をした結果を示した図である。図中、レー
ン１は分子量マーカー（β−ガラクトシダーゼ：約１３
万）を、レーン２はＥ． ｃｏｌｉＹ１０９０ 細胞全
蛋白を、レーン３はウサギ抗ダニ虫体抗原抗血清を用い
た組換えダニアレルゲンの免疫染色（矢印）を示す。
【図２】ダニアレルゲンをコードするｃＤＮＡのアガロ
ース電気泳動の結果を示した図である。
ース電気泳動の結果を示した図である。
【図３】組換えプラスミドｐＡＫ １ の構築を示した
図である。
図である。
【図４】ダニアレルゲンをコードするｃＤＮＡの制限酵
素地図を示した図である。
素地図を示した図である。
【図５】組換えプラスミドｐＡＫＥ １の構築を示した
図である。
図である。
【図６】組換えプラスミドｐＡＥＸ２０１ の構築を示
した図である。
した図である。
【図７】Ｅ． ｃｏｌｉ ｐｏｐ２１３６ を宿主とし
てｐＡＥＸ２０１ により発現したダニアレルゲン融合
蛋白質のＳＤＳ −ＰＡＧＥ分析の結果を示した図であ
る。図中、レーン１は分子量マーカーを、レーン２はプ
ラスミドｐＵＥＸ２ を含有するＥ． ｃｏｌｉ ｐｏ
ｐ２１３６ 細胞全蛋白を、レーン３はプラスミドｐＡ
ＥＸ２０１を含有するＥ． ｃｏｌｉ ｐｏｐ２１３６
細胞全蛋白を、レーン４はプラスミドｐＡＥＸ２０１
を含有するＥ． ｃｏｌｉ ｐｏｐ２１３６ 膜局在蛋
白（組換えダニアレルゲンを矢印で示す）を示す。
てｐＡＥＸ２０１ により発現したダニアレルゲン融合
蛋白質のＳＤＳ −ＰＡＧＥ分析の結果を示した図であ
る。図中、レーン１は分子量マーカーを、レーン２はプ
ラスミドｐＵＥＸ２ を含有するＥ． ｃｏｌｉ ｐｏ
ｐ２１３６ 細胞全蛋白を、レーン３はプラスミドｐＡ
ＥＸ２０１を含有するＥ． ｃｏｌｉ ｐｏｐ２１３６
細胞全蛋白を、レーン４はプラスミドｐＡＥＸ２０１
を含有するＥ． ｃｏｌｉ ｐｏｐ２１３６ 膜局在蛋
白（組換えダニアレルゲンを矢印で示す）を示す。
【図８】ダニアレルゲン融合蛋白質を、連結Ｕ１ｔｒｏ
ｇｅｌ ＡｃＡ ４４及びＡＧ １１Ａ８ カラムでゲ
ル濾過及びＳＤＳ の除去をした結果を示した図である
。
ｇｅｌ ＡｃＡ ４４及びＡＧ １１Ａ８ カラムでゲ
ル濾過及びＳＤＳ の除去をした結果を示した図である
。
【図９】ダニアレルゲン融合蛋白質でダニ喘息患者洗浄
血球を滴定した結果を示した図である。
血球を滴定した結果を示した図である。
【図１０】組換えダニアレルゲンのディレーションミュ
ータントに関する抗原活性の有無を示した図である。図
中の○印の断片が抗原活性のあることを示す。
ータントに関する抗原活性の有無を示した図である。図
中の○印の断片が抗原活性のあることを示す。
【図１１】組換えダニアレルゲンのディレーションミュ
ータントに関する抗原活性の有無を示した図である。図
中の−，＋，＋＋＋はディレーションミュータントａ，
ｂ，ｃ，ｄについての抗原活性の程度を示す。
ータントに関する抗原活性の有無を示した図である。図
中の−，＋，＋＋＋はディレーションミュータントａ，
ｂ，ｃ，ｄについての抗原活性の程度を示す。
Claims (29)
- 【請求項１】 ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって
得られる、以下の部分的アミノ酸配列（配列番号：１）
を含んでいる組換えダニアレルゲン。 Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ - 【請求項２】 ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって
得られる、以下のアミノ酸配列（配列番号：２）を含ん
でいる組換えダニアレルゲン。 Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｔｈ
ｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａ
ｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ
Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｍ
ｅｔ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａ
ｒｇ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｉｌ
ｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｍ
ｅｔ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｒ
ｇ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｈ
ｉｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌ
ｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｈ
ｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌ
ｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓ
ｐ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ
Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔ
ｙｒ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒ
ｇ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｖ
ａｌ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｎ - 【請求項３】 請求項
１又は２記載の遺伝子がコナヒョウヒダニ虫体由来の遺
伝子である請求項１又は２記載の組換えダニアレルゲン
。 - 【請求項４】 分子量が約４０，０００（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）である請求項１、２又は３記載の組換えダニア
レルゲン。 - 【請求項５】 全塩基鎖長が約１．２ｋｂｐ（アガロ
ース電気泳動法）であって、図４の制限酵素地図を有す
る遺伝子の発現によって得られるものである請求項１〜
４記載の組換えダニアレルゲン。 - 【請求項６】 請求項１〜５記載の組換えダニアレル
ゲンが他の蛋白質と融合していることを特徴とする融合
組換えダニアレルゲン。 - 【請求項７】 請求項６記載の他の蛋白質がβ−ガラ
クトシダーゼである請求項６記載の融合組換えダニアレ
ルゲン。 - 【請求項８】 分子中に以下の部分的アミノ酸配列（
配列番号：１）を含むアレルゲン活性を有する蛋白質を
コードしているダニ虫体由来の遺伝子。 Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ - 【請求項９】 分子中に以下のアミノ酸配列（配列番
号：２）を含むアレルゲン活性を有する蛋白質をコード
しているダニ虫体由来の遺伝子。 Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｔｈ
ｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａ
ｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ
Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｍ
ｅｔ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａ
ｒｇ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｉｌ
ｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｍ
ｅｔ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｒ
ｇ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｈ
ｉｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌ
ｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｈ
ｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌ
ｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓ
ｐ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ
Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔ
ｙｒ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒ
ｇ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｖ
ａｌ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｎ - 【請求項１０】 以下
のＤＮＡ配列（配列番号：１）を含むものである請求項
８記載ダニ虫体由来の遺伝子。 ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＡＡ
ＣＣＡ ＴＴＧ ＣＧＡ ＴＴＣ ＡＧＡ ＧＡＣ Ａ
ＴＣ ＡＣＴ ＧＴＣ ＧＡＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＧＡ
Ａ ＡＡＴ ＧＣＣ ＴＡＴ ＡＴＣ ＡＡＡ ＡＡＴ
ＧＧＣ ＡＡＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＴＴＧ ＴＣＧ
ＣＴＴ ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＣＡ ＡＣＡ Ｔ
ＴＧ ＡＧＴ ＴＴＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＡＡ ＧＣ
Ｃ ＧＡＴ ＧＧＡ ＡＡＡ ＡＴＣ ＧＡＣ ＡＴＧ
ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＴＡ ＴＣＧ
ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＧＴ ＧＣＡ Ｔ
ＣＧ ＴＴＧ ＡＡＡ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＣＡ ＡＡ
Ｇ ＡＡＡ ＴＡＣ ＡＡＣ ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＡＴ
ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＡＡ ＴＴＧ ＡＧＴ ＧＣＡ
ＴＣＧ ＡＴＣ - 【請求項１１】 以下のＤＮＡ配列（配列番号：２）
を含むものである請求項９記載のダニ虫体由来の遺伝子
。 ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＡＡ
ＣＣＡ ＴＴＧ ＣＧＡ ＴＴＣ ＡＧＡ ＧＡＣ Ａ
ＴＣ ＡＣＴ ＧＴＣ ＧＡＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＧＡ
Ａ ＡＡＴ ＧＣＣ ＴＡＴ ＡＴＣ ＡＡＡ ＡＡＴ
ＧＧＣ ＡＡＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＴＴＧ ＴＣＧ
ＣＴＴ ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＣＡ ＡＣＡ Ｔ
ＴＧ ＡＧＴ ＴＴＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＡＡ ＧＣ
Ｃ ＧＡＴ ＧＧＡ ＡＡＡ ＡＴＣ ＧＡＣ ＡＴＧ
ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＴＡ ＴＣＧ
ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＧＴ ＧＣＡ Ｔ
ＣＧ ＴＴＧ ＡＡＡ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＣＡ ＡＡ
Ｇ ＡＡＡ ＴＡＣ ＡＡＣ ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＡＴ
ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＡＡ ＴＴＧ ＡＧＴ ＧＣＡ
ＴＣＧ ＡＴＣ ＧＴＡ ＡＡＣ ＣＣＡ ＣＧＡ Ｔ
ＴＧ ＴＣＡ ＴＧＧ ＣＡＴ ＣＡＡ ＴＡＣ ＡＣ
Ｇ ＡＡＡ ＣＧＣ ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＧＴ ＧＡＡ
ＴＡＣ ＡＡＧ ＡＧＴ ＧＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ
ＣＴＡ ＴＣＧ ＴＴＧ ＣＧＡ ＴＣＧ ＴＣＧ Ｇ
ＡＣ ＡＴＴ ＧＣＴ ＣＴＣ ＡＡＧ ＡＴＴ ＡＣ
Ｇ ＡＴＧ ＣＣＴ ＧＡＴ ＴＡＴ ＡＡＴ ＴＣＧ
ＡＡＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＣＧＡ
ＣＡＡ ＧＧＴ ＧＡＴ ＣＡＡ ＡＴＣ ＡＡＣ Ａ
ＴＧ ＧＡＣ ＡＴＣ ＧＡＴ ＧＧＴ ＡＣＡ ＴＴ
Ｇ ＡＴＣ ＧＡＡ ＧＧＴ ＣＡＴ ＧＣＡ ＣＡＡ
ＧＧＡ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＧＡ ＧＡＡ ＧＧＴ
ＡＡＡ ＡＴＣ ＣＡＣ ＡＴＴ ＡＡＡ ＧＧＴ Ａ
ＧＡ ＣＡＡ ＡＣＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＧＡＧ ＡＴ
Ｃ ＧＡＡ ＴＣＣ ＡＡＣ ＴＡＣ ＣＧＡ ＴＡＣ
ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＣＴＡ ＡＴＣ
ＡＴＣ ＧＡＡ ＣＣＧ ＧＴＣ ＡＡＧ ＡＧＴ Ｇ
ＡＡ ＡＡＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＡＡ ＧＧ
Ｃ ＧＴＴ ＣＴＴ ＴＣＣ ＣＧＴ ＡＡＧ ＧＴＧ
ＣＣＡ ＴＣＡ ＣＡＴ ＣＴＧ ＡＣＡ ＣＴＡ
ＧＡＡ ＡＣＡ ＣＣＡ ＣＧＡ ＧＴＣ ＡＡＧ Ａ
ＴＧ ＡＡＴ ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＡＴ ＧＡＴ ＣＧ
Ａ ＴＡＴ ＧＣＡ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＴＧ
ＴＴＣ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＡＴ ＴＡＴ ＧＡＴ
ＧＧＣ ＡＴＣ ＣＡＣ ＴＴＣ ＧＡＧ ＡＡＡ Ｃ
ＡＴ ＡＣＣ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＡＡ ＴＡＣ ＧＡ
Ａ ＣＣＴ ＧＧＣ ＧＴＴ ＣＧＡ ＴＡＣ ＡＡＧ
ＡＴＣ ＡＴＣ ＧＧＣ ＡＡＴ ＧＧＡ ＡＡＡ
ＣＴＣ ＡＡＧ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＧＣ ＣＧＣ Ｃ
ＡＣ ＴＡＴ ＴＣＴ ＡＴＣ ＧＡＴ ＧＴＧ ＣＡ
Ａ ＧＧＴ ＡＴＴ ＣＣＡ ＣＧＣ ＡＡＡ ＧＣＡ
ＴＴＣ ＡＡＴ ＣＴＧ ＧＡＣ ＧＣＴ ＧＡＣ
ＴＴＧ ＡＴＧ ＧＡＴ ＴＴＣ ＡＡＡ ＣＴＧ Ａ
ＡＡ ＧＴＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＣＣＡ ＧＡＡ ＧＡ
Ｔ ＡＧＣ ＡＡＴ ＡＡＡ ＧＣＴ ＣＡＡ ＴＴＣ
ＡＧＣ ＴＡＣ ＡＣＡ ＴＴＣ ＡＡＣ ＧＡＡ
ＴＡＴ ＡＣＣ ＧＡＧ ＡＣＣ ＧＡＡ ＧＡＡ Ｔ
ＡＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＡＴ ＣＣＡ ＣＡＴ ＣＧ
Ｔ ＧＣＣ ＴＡＴ ＴＡＴ ＧＴＴ ＡＡＴ ＴＧＧ
ＴＴＧ ＡＧＴ ＴＣＣ ＡＴＴ ＣＧＣ ＡＡＡ
ＴＡＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＡＴ ＴＴＣ ＡＴＣ Ｇ
ＴＣ ＧＡＡ ＧＡＣ ＡＡＣ - 【請求項１２】 図１
０において示される塩基配列において、少なくとも上流
より約１７０ｂｐ 〜約２７０ｂｐ 、約２７０ｂｐ
〜約４００ｂｐ または約１７０ｂｐ 〜約４００ｂｐ
の領域内にコードされているアミノ酸配列を含有して
なるダニアレルゲン断片。 - 【請求項１３】 ダニ虫体由来のダニアレルゲンに含
まれるエピトープを有するポリペプチド。 - 【請求項１４】 ダニ虫体由来のダニアレルゲンに含
まれるエピトープと免疫学的に同一であるとみなされ得
るエピトープを有するポリペプチド。 - 【請求項１５】 以下のアミノ酸配列（配列番号：３
）を含有する請求項１３又は１４記載のポリペプチド。 Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓ
ｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌ
ａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ＬｙｓＩｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ - 【請求項１６】 以下のアミ
ノ酸配列（配列番号：４）を含有する請求項１３又は１
４記載のポリペプチド。Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅ
ｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ
Ｉｌｅ Ａｌａ - 【請求項１７】 請求項１５又は１
６記載のポリペプチドをコードしている遺伝子。 - 【請求項１８】 以下のＤＮＡ配列（配列番号：３）
を含むものである請求項１７記載の遺伝子。 ＡＴＧ ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＴＡ
ＴＣＧ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＧＴ Ｇ
ＣＡ ＴＣＧ ＴＴＧ ＡＡＡ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＣ
Ａ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＣ - 【請求項１９】 以下の
ＤＮＡ配列（配列番号：４）を含むものである請求項１
７記載の遺伝子。ＧＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＴＡ Ｔ
ＣＧ ＴＴＧ ＣＧＡＴＣＧ ＴＣＧ ＧＡＣ ＡＴＴ
ＧＣＴ - 【請求項２０】 形質転換された細菌、酵母
又は哺乳動物細胞中において、請求項８〜１１記載の遺
伝子を発現させ得る発現ベクター。 - 【請求項２１】 請求項２０記載の発現ベクターで形
質転換された細菌、酵母又は哺乳動物細胞。 - 【請求項２２】 請求項２１記載の細菌、酵母又は哺
乳動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、
組換えダニアレルゲンを産生させ、次いで該組換えダニ
アレルゲンを回収することを特徴とする組換えダニアレ
ルゲンの製造方法。 - 【請求項２３】 請求項２１記載の細菌、酵母又は哺
乳動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、
融合組換えダニアレルゲンを産生させ、該融合組換えダ
ニアレルゲンを回収し、次いで、融合している他の蛋白
質を脱離せしめることを特徴とする組換えダニアレルゲ
ンの製造方法。 - 【請求項２４】 請求項１〜５記載の組換えダニアレ
ルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤。 - 【請求項２５】 請求項１〜５記載の組換えダニアレ
ルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患診断薬。 - 【請求項２６】 請求項１２記載のダニアレルゲン断
片を有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤。 - 【請求項２７】 請求項１２記載のダニアレルゲン断
片を有効成分とするダニアレルギー疾患診断薬。 - 【請求項２８】 請求項１５または１６記載のポリペ
プチドを有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤。 - 【請求項２９】 請求項１５または１６記載のポリペ
プチドを有効成分とするダニアレルギー疾患診断薬。
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