JPH1075783A - 組換えダニアレルゲン - Google Patents
組換えダニアレルゲンInfo
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- JPH1075783A JPH1075783A JP8255401A JP25540196A JPH1075783A JP H1075783 A JPH1075783 A JP H1075783A JP 8255401 A JP8255401 A JP 8255401A JP 25540196 A JP25540196 A JP 25540196A JP H1075783 A JPH1075783 A JP H1075783A
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- Japan
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- polynucleotide
- mite
- recombinant
- allergen
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸配
列の全部又は一部をコードするポリヌクレオチド、配列
表の配列番号：２に記載の塩基配列の全部又は一部から
なるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むポリ
ヌクレオチドであって、ダニアレルゲン活性を有する蛋
白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチ
ドを含む発現ベクター、該発現ベクターから発現される
組換えダニアレルゲン、該組換えダニアレルゲンの製造
方法、該組換えダニアレルゲンを有効成分とするダニア
レルギー疾患治療剤及びダニアレルギー疾患診断薬。 【効果】本発明により、ダニアレルギー疾患の治療剤、
診断薬としてアナフィラキシー誘発性の不純物を含まな
い安全かつ有効な組換えダニアレルゲンを提供すること
が可能となった。
列の全部又は一部をコードするポリヌクレオチド、配列
表の配列番号：２に記載の塩基配列の全部又は一部から
なるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むポリ
ヌクレオチドであって、ダニアレルゲン活性を有する蛋
白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチ
ドを含む発現ベクター、該発現ベクターから発現される
組換えダニアレルゲン、該組換えダニアレルゲンの製造
方法、該組換えダニアレルゲンを有効成分とするダニア
レルギー疾患治療剤及びダニアレルギー疾患診断薬。 【効果】本発明により、ダニアレルギー疾患の治療剤、
診断薬としてアナフィラキシー誘発性の不純物を含まな
い安全かつ有効な組換えダニアレルゲンを提供すること
が可能となった。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アレルゲン活性を
有する組換えダニアレルゲン、その遺伝子、該遺伝子を
発現させ得る発現ベクター、発現ベクターで形質転換さ
れた形質転換体、該組換えダニアレルゲンの製造方法、
ダニアレルギー疾患治療剤、およびダニアレルギー疾患
診断薬に関するものである。
有する組換えダニアレルゲン、その遺伝子、該遺伝子を
発現させ得る発現ベクター、発現ベクターで形質転換さ
れた形質転換体、該組換えダニアレルゲンの製造方法、
ダニアレルギー疾患治療剤、およびダニアレルギー疾患
診断薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】屋内塵性ダニは、アトピー性皮膚炎、気
管支喘息等のアレルギー疾患の主要な原因として重要で
ある。従来、アレルギー疾患の治療剤としては、アレル
ギーの原因物質である減感作療法が、最も重要な根本治
療とされ、特に花粉症を始め屋内塵、真菌アレルギー等
の吸入性アレルゲンである回避困難な抗原で引き起こさ
れる疾患においては、その評価は今や確立されたものと
いえる。しかしながら、この減感作療法では感作抗原に
よるアナフィラキシーの危険が伴う為、安全な治療用抗
原の投与が必要とされ、そのような感作抗原の研究が進
められている。
管支喘息等のアレルギー疾患の主要な原因として重要で
ある。従来、アレルギー疾患の治療剤としては、アレル
ギーの原因物質である減感作療法が、最も重要な根本治
療とされ、特に花粉症を始め屋内塵、真菌アレルギー等
の吸入性アレルゲンである回避困難な抗原で引き起こさ
れる疾患においては、その評価は今や確立されたものと
いえる。しかしながら、この減感作療法では感作抗原に
よるアナフィラキシーの危険が伴う為、安全な治療用抗
原の投与が必要とされ、そのような感作抗原の研究が進
められている。
【０００３】ダニアレルギー疾患については、ヤケヒョ
ウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）及びコナ
ヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）の２種のダ
ニが、屋内塵中のアレルゲン源として重要であると報告
されている〔Allerg. Asthma, 10, 329 〜334 (1964);
J. Allergy, 42, 14〜 28 (1968)] 。これらのダニか
ら、主要ダニアレルゲンが分画され、それらはダニ排泄
物及び／又はダニ虫体中に含有されている分子量24-28k
D の糖蛋白（pI 4.6〜7.2)、及び／又は分子量14.5-20k
D の蛋白（pI 5〜7.2)であると報告されている〔J. Imm
unol.,125, 587〜592 (1980); J. Allergy Clin. Immun
ol.,76, 753 〜761 (1985); Immunol., 46, 679 〜687
(1982); Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 81, 214
〜223 (1986); J. Allergy Clin. Immunol.,75, 686 〜
692 (1985)等〕。
ウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）及びコナ
ヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）の２種のダ
ニが、屋内塵中のアレルゲン源として重要であると報告
されている〔Allerg. Asthma, 10, 329 〜334 (1964);
J. Allergy, 42, 14〜 28 (1968)] 。これらのダニか
ら、主要ダニアレルゲンが分画され、それらはダニ排泄
物及び／又はダニ虫体中に含有されている分子量24-28k
D の糖蛋白（pI 4.6〜7.2)、及び／又は分子量14.5-20k
D の蛋白（pI 5〜7.2)であると報告されている〔J. Imm
unol.,125, 587〜592 (1980); J. Allergy Clin. Immun
ol.,76, 753 〜761 (1985); Immunol., 46, 679 〜687
(1982); Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 81, 214
〜223 (1986); J. Allergy Clin. Immunol.,75, 686 〜
692 (1985)等〕。
【０００４】ダニアレルゲンの遺伝子クローニングとし
ては、ヤケヒョウヒダニの主要アレルゲンであるDer p
１（分子量：25,371) 及びDer p ２ (分子量：14,131)
について、また、コナヒョウヒダニの主要アレルゲンで
あるDer f １ (分子量：25,191) 及びDer f ２（分子
量：14,021）についても、それぞれの遺伝子がクローニ
ングされ塩基配列も決定されており〔Int. Arch. Aller
gy Appl. Immunol., 85,127〜129 (1988); J. Exp. Me
d., 167, 175 〜182 (1988); J. Exp. Med., 170, 145
7 〜1462 (1989); Int. Arch. Allergy Appl. Immuno
l., 91, 118 〜123(1990); Int. Arch. Allergy Appl.
Immunol., 91, 124〜129 (1990); Jpn. J.Allergol., 3
9, 557〜561 (1990); Clinical and Experimental Alle
rgy, 21, 25 〜32 (1991); Clinical and Experimental
Allergy, 21, 33 〜37 (1991) 〕、遺伝子組換え技術
によるダニアレルゲンの研究が試みられている。また、
Nishiyama,C.らは、分子量約30,000のアレルゲンとして
Der f ３を報告し、その塩基配列も決定されている〔FE
BS Lett., 377,62 〜66(1995)〕。一方、本発明者らも
既に特開平７−１１２９９９号公報において、ｍａ１
０，ｍａ３，ｍａ１５，ｍａ２９，ｍａ４４，ｍａ５
０，ｍａ１１３，ｍａ１１４，ｍａ１１５を報告し、特
開平７−２７８１９０号公報においては、抗Der f ２血
清と強い交差反応性を示すが、全く別の遺伝子であるｍ
ａ１２４を報告している。
ては、ヤケヒョウヒダニの主要アレルゲンであるDer p
１（分子量：25,371) 及びDer p ２ (分子量：14,131)
について、また、コナヒョウヒダニの主要アレルゲンで
あるDer f １ (分子量：25,191) 及びDer f ２（分子
量：14,021）についても、それぞれの遺伝子がクローニ
ングされ塩基配列も決定されており〔Int. Arch. Aller
gy Appl. Immunol., 85,127〜129 (1988); J. Exp. Me
d., 167, 175 〜182 (1988); J. Exp. Med., 170, 145
7 〜1462 (1989); Int. Arch. Allergy Appl. Immuno
l., 91, 118 〜123(1990); Int. Arch. Allergy Appl.
Immunol., 91, 124〜129 (1990); Jpn. J.Allergol., 3
9, 557〜561 (1990); Clinical and Experimental Alle
rgy, 21, 25 〜32 (1991); Clinical and Experimental
Allergy, 21, 33 〜37 (1991) 〕、遺伝子組換え技術
によるダニアレルゲンの研究が試みられている。また、
Nishiyama,C.らは、分子量約30,000のアレルゲンとして
Der f ３を報告し、その塩基配列も決定されている〔FE
BS Lett., 377,62 〜66(1995)〕。一方、本発明者らも
既に特開平７−１１２９９９号公報において、ｍａ１
０，ｍａ３，ｍａ１５，ｍａ２９，ｍａ４４，ｍａ５
０，ｍａ１１３，ｍａ１１４，ｍａ１１５を報告し、特
開平７−２７８１９０号公報においては、抗Der f ２血
清と強い交差反応性を示すが、全く別の遺伝子であるｍ
ａ１２４を報告している。
【０００５】一方、ダニアレルギー疾患の診断方法とし
ては、従来、問診を主体とし、屋内塵（ハウスダスト）
抽出物および／またはダニ虫体抽出物を用いる皮内反応
試験が殆どであり、まれに、RAST(radio allergosorbe
nt test)法による血清中のIgE 抗体価（相対値）の測
定、吸入誘発試験、鼻粘膜誘発試験を併用する程度であ
り、ダニアレルギー疾患を直接的に診断するのはかなり
困難であった。
ては、従来、問診を主体とし、屋内塵（ハウスダスト）
抽出物および／またはダニ虫体抽出物を用いる皮内反応
試験が殆どであり、まれに、RAST(radio allergosorbe
nt test)法による血清中のIgE 抗体価（相対値）の測
定、吸入誘発試験、鼻粘膜誘発試験を併用する程度であ
り、ダニアレルギー疾患を直接的に診断するのはかなり
困難であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従来、屋内塵性ダニを
特異抗原とする気管支喘息の減感作治療法には、屋内塵
（ハウスダスト）抽出液が用いられてきているが、化学
的にはその組成が極めて不明確であり、しかも多種類の
不純物を含み、アナフィラキシー誘発の可能性があるた
めに投与量が極度に制限され、治療効果が極めて低いの
が現状である。したがって、有効性及び安全性の観点か
ら、有用な減感作治療用抗原の出現が望まれると同時に
そのような高品質減感作治療用抗原の安定供給が期待さ
れている。本発明者らは、精製ダニアレルゲンである高
分子粗ダニ排泄物画分に減感作治療に有効なアレルゲン
が存在することを見出しているが、安全で確実に奏効す
るに充分量のダニアレルゲンを安定供給するには、ダニ
飼育物からのダニアレルゲンの抽出、精製による方法で
は、量産性がなく量的に限界があるので安定供給は困難
である。また、従来より前記のように、遺伝子組換え技
術により種々の組換えダニアレルゲンについて報告され
ているが、実際の治療に有効なよりダニアレルゲン活性
の高い組換えダニアレルゲンの提供が望まれている。
特異抗原とする気管支喘息の減感作治療法には、屋内塵
（ハウスダスト）抽出液が用いられてきているが、化学
的にはその組成が極めて不明確であり、しかも多種類の
不純物を含み、アナフィラキシー誘発の可能性があるた
めに投与量が極度に制限され、治療効果が極めて低いの
が現状である。したがって、有効性及び安全性の観点か
ら、有用な減感作治療用抗原の出現が望まれると同時に
そのような高品質減感作治療用抗原の安定供給が期待さ
れている。本発明者らは、精製ダニアレルゲンである高
分子粗ダニ排泄物画分に減感作治療に有効なアレルゲン
が存在することを見出しているが、安全で確実に奏効す
るに充分量のダニアレルゲンを安定供給するには、ダニ
飼育物からのダニアレルゲンの抽出、精製による方法で
は、量産性がなく量的に限界があるので安定供給は困難
である。また、従来より前記のように、遺伝子組換え技
術により種々の組換えダニアレルゲンについて報告され
ているが、実際の治療に有効なよりダニアレルゲン活性
の高い組換えダニアレルゲンの提供が望まれている。
【０００７】本発明の目的は、まさにこの点にあり、ダ
ニアレルギー疾患の治療剤、診断薬としてアナフィラキ
シー誘発性不純物を含まない安全かつ有効な組換えダニ
アレルゲンを提供することにある。即ち、本発明の第１
の目的は、ダニ虫体由来の遺伝子を提供することにあ
る。本発明の第２の目的は、本発明の遺伝子を発現させ
得る発現ベクターを提供することにある。本発明の第３
の目的は、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られ
るアレルゲン活性を有する新規なダニアレルゲンを提供
することにある。本発明の第４の目的は、該遺伝子を発
現させ得る発現ベクターで形質転換された形質転換体を
提供することにある。本発明の第５の目的は、該組換え
ダニアレルゲンの製造方法を提供することにある。本発
明の第６の目的は、本発明の組換えダニアレルゲンを有
効成分とする新規なダニアレルギー疾患治療剤を提供す
ることにある。本発明の第７の目的は、本発明の組換え
ダニアレルゲンを有効成分とする新規なダニアレルギー
疾患診断薬を提供することにある。
ニアレルギー疾患の治療剤、診断薬としてアナフィラキ
シー誘発性不純物を含まない安全かつ有効な組換えダニ
アレルゲンを提供することにある。即ち、本発明の第１
の目的は、ダニ虫体由来の遺伝子を提供することにあ
る。本発明の第２の目的は、本発明の遺伝子を発現させ
得る発現ベクターを提供することにある。本発明の第３
の目的は、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られ
るアレルゲン活性を有する新規なダニアレルゲンを提供
することにある。本発明の第４の目的は、該遺伝子を発
現させ得る発現ベクターで形質転換された形質転換体を
提供することにある。本発明の第５の目的は、該組換え
ダニアレルゲンの製造方法を提供することにある。本発
明の第６の目的は、本発明の組換えダニアレルゲンを有
効成分とする新規なダニアレルギー疾患治療剤を提供す
ることにある。本発明の第７の目的は、本発明の組換え
ダニアレルゲンを有効成分とする新規なダニアレルギー
疾患診断薬を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、治療に著効な
画分に対する抗血清を用いて遺伝子工学的手法により、
減感作著効抗原ダニアレルゲンをコードする遺伝子を見
出し、更に研究を重ねて本発明を完成した。
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、治療に著効な
画分に対する抗血清を用いて遺伝子工学的手法により、
減感作著効抗原ダニアレルゲンをコードする遺伝子を見
出し、更に研究を重ねて本発明を完成した。
【０００９】即ち、本発明の要旨は、（１） 配列表の
配列番号：１に記載のアミノ酸配列の全部又は一部をコ
ードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを
含むポリヌクレオチドであって、ダニアレルゲン活性を
有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、（２）
配列表の配列番号：２に記載の塩基配列の全部又は一部
からなるポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを
含むポリヌクレオチドであって、ダニアレルゲン活性を
有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、（３）
配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸配列、又はその
一部からなるアミノ酸配列において、１又は２以上のア
ミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１
つを生じさせ、かつ、ダニアレルゲン活性を有する蛋白
質をコードするポリヌクレオチド、（４） 前記（１）
〜（３）いずれか記載のポリヌクレオチドにハイブリダ
イズ可能なポリヌクレオチドであって、かつ、ダニアレ
ルゲン活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチ
ド、（５） 前記（１）〜（４）いずれか記載のポリヌ
クレオチドを含む発現ベクター、（６） 前記（５）記
載の発現ベクターから発現される組換えダニアレルゲ
ン、（７） 該組換えダニアレルゲンが他の蛋白質との
融合蛋白質である前記（６）記載の組換えダニアレルゲ
ン、（８） 前記（５）記載の発現ベクターで形質転換
された細菌、酵母又は動物細胞、（９） 前記（８）記
載の細菌、酵母又は動物細胞を該遺伝子の発現可能な条
件下で培養して、組換えダニアレルゲンを産生させ、次
いで該組換えダニアレルゲンを回収することを特徴とす
る組換えダニアレルゲンの製造方法、（１０） 前記
（８）記載の細菌、酵母又は動物細胞を該遺伝子の発現
可能な条件下で培養して、融合組換えダニアレルゲンを
産生させ、該融合組換えダニアレルゲンを回収し、次い
で、融合している他の蛋白質を脱離せしめることを特徴
とする組換えダニアレルゲンの製造方法、（１１） 前
記（６）又は（７）いずれか記載の組換えダニアレルゲ
ンを有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤、（１
２） 前記（６）又は（７）いずれか記載の組換えダニ
アレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患診断
薬、に関する。
配列番号：１に記載のアミノ酸配列の全部又は一部をコ
ードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを
含むポリヌクレオチドであって、ダニアレルゲン活性を
有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、（２）
配列表の配列番号：２に記載の塩基配列の全部又は一部
からなるポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを
含むポリヌクレオチドであって、ダニアレルゲン活性を
有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、（３）
配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸配列、又はその
一部からなるアミノ酸配列において、１又は２以上のア
ミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも１
つを生じさせ、かつ、ダニアレルゲン活性を有する蛋白
質をコードするポリヌクレオチド、（４） 前記（１）
〜（３）いずれか記載のポリヌクレオチドにハイブリダ
イズ可能なポリヌクレオチドであって、かつ、ダニアレ
ルゲン活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチ
ド、（５） 前記（１）〜（４）いずれか記載のポリヌ
クレオチドを含む発現ベクター、（６） 前記（５）記
載の発現ベクターから発現される組換えダニアレルゲ
ン、（７） 該組換えダニアレルゲンが他の蛋白質との
融合蛋白質である前記（６）記載の組換えダニアレルゲ
ン、（８） 前記（５）記載の発現ベクターで形質転換
された細菌、酵母又は動物細胞、（９） 前記（８）記
載の細菌、酵母又は動物細胞を該遺伝子の発現可能な条
件下で培養して、組換えダニアレルゲンを産生させ、次
いで該組換えダニアレルゲンを回収することを特徴とす
る組換えダニアレルゲンの製造方法、（１０） 前記
（８）記載の細菌、酵母又は動物細胞を該遺伝子の発現
可能な条件下で培養して、融合組換えダニアレルゲンを
産生させ、該融合組換えダニアレルゲンを回収し、次い
で、融合している他の蛋白質を脱離せしめることを特徴
とする組換えダニアレルゲンの製造方法、（１１） 前
記（６）又は（７）いずれか記載の組換えダニアレルゲ
ンを有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤、（１
２） 前記（６）又は（７）いずれか記載の組換えダニ
アレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患診断
薬、に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ
であり、例えば生ダニ虫体からｍＲＮＡを調製し、その
ｍＲＮＡを鋳型として常法によりｃＤＮＡを合成するこ
とにより得られるが、分子中にダニアレルゲン活性を有
するアミノ酸配列をコードしているものである。ここで
用いられるダニは特に限定されるものではないが、屋内
塵性ダニであるコナヒョウヒダニやヤケヒョウヒダニ等
が用いられる。具体的には配列番号：２が例示される。
配列番号：２の塩基配列は、前記のDerp １、Der p
２、Der f １及びDer f ２について報告されている配列
と比較して相同性はないが、Der f ３とは約８５％の相
同性を示すものである。
する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ
であり、例えば生ダニ虫体からｍＲＮＡを調製し、その
ｍＲＮＡを鋳型として常法によりｃＤＮＡを合成するこ
とにより得られるが、分子中にダニアレルゲン活性を有
するアミノ酸配列をコードしているものである。ここで
用いられるダニは特に限定されるものではないが、屋内
塵性ダニであるコナヒョウヒダニやヤケヒョウヒダニ等
が用いられる。具体的には配列番号：２が例示される。
配列番号：２の塩基配列は、前記のDerp １、Der p
２、Der f １及びDer f ２について報告されている配列
と比較して相同性はないが、Der f ３とは約８５％の相
同性を示すものである。
【００１１】ダニ虫体から本発明のポリヌクレオチドを
取得するには、後述の実施例において詳述するように、
ダニ虫体の全ＲＮＡ画分からポリ(A)mＲＮＡ画分を回収
し、市販のｃＤＮＡ合成キット等を用いてｃＤＮＡを合
成する。該ｃＤＮＡをファージベクターλＥｘＣｅｌｌ
（ファルマシア社製）に連結後、ギガパック プラス
（ストラタジーン社製）等を用いてイン・ビトロパッケ
ジーングし、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライ
ブラリーを抗血清を用いて免疫スクリーニングを行い、
陽性のクローンを得る。さらに、全てのプラークが陽性
になるまで二次スクリーニングを繰り返し、目的のクロ
ーンを得る。
取得するには、後述の実施例において詳述するように、
ダニ虫体の全ＲＮＡ画分からポリ(A)mＲＮＡ画分を回収
し、市販のｃＤＮＡ合成キット等を用いてｃＤＮＡを合
成する。該ｃＤＮＡをファージベクターλＥｘＣｅｌｌ
（ファルマシア社製）に連結後、ギガパック プラス
（ストラタジーン社製）等を用いてイン・ビトロパッケ
ジーングし、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライ
ブラリーを抗血清を用いて免疫スクリーニングを行い、
陽性のクローンを得る。さらに、全てのプラークが陽性
になるまで二次スクリーニングを繰り返し、目的のクロ
ーンを得る。
【００１２】本発明で使用する抗血清（抗ＨＭ２血清と
いう）は、以下のようにして得られる。凍結殺虫済みの
ダニ培養物に重量換算で、１０倍量の飽和食塩水を加
え、室温で１時間穏やかに攪拌後、該食塩水を遠心分離
し、上清表面に浮遊するダニ虫体を吸引濾過により回収
する。沈殿にさらに重量換算で１０倍量の１０ｍＭ Ｐ
Ｂ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を加えて同様に攪拌、
遠心分離を２回繰り返す。得られた抽出物を水道水に対
して透析し、分子量１万カットの限外濾過膜に３回かけ
る。膜に保持された高分子画分をゲル濾過クロマトグラ
フィーにかけて、分子量３０〜４０ｋＤの画分を透析、
減圧濃縮後、凍結乾燥したものを高分子粗ダニ排泄物抗
原ＨＭ２とする。該抗原を含む生理食塩水と同容量のフ
ロイント完全アジュバンド（ナカライテスク社製）を混
合し、ウサギに免疫し、抗体価をチェックしながら隔週
追加免疫を行う。２０００倍希釈の該抗血清が１００ｎ
ｇのＨＭ２を検出できるようになった時点で、ウサギの
全採血を行う。採取した血液を遠心分離し、上清にＮａ
Ｎ3 を０．１％の濃度となるように添加し、３ｍｌずつ
分注して凍結保存し、抗ＨＭ２血清とする。
いう）は、以下のようにして得られる。凍結殺虫済みの
ダニ培養物に重量換算で、１０倍量の飽和食塩水を加
え、室温で１時間穏やかに攪拌後、該食塩水を遠心分離
し、上清表面に浮遊するダニ虫体を吸引濾過により回収
する。沈殿にさらに重量換算で１０倍量の１０ｍＭ Ｐ
Ｂ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を加えて同様に攪拌、
遠心分離を２回繰り返す。得られた抽出物を水道水に対
して透析し、分子量１万カットの限外濾過膜に３回かけ
る。膜に保持された高分子画分をゲル濾過クロマトグラ
フィーにかけて、分子量３０〜４０ｋＤの画分を透析、
減圧濃縮後、凍結乾燥したものを高分子粗ダニ排泄物抗
原ＨＭ２とする。該抗原を含む生理食塩水と同容量のフ
ロイント完全アジュバンド（ナカライテスク社製）を混
合し、ウサギに免疫し、抗体価をチェックしながら隔週
追加免疫を行う。２０００倍希釈の該抗血清が１００ｎ
ｇのＨＭ２を検出できるようになった時点で、ウサギの
全採血を行う。採取した血液を遠心分離し、上清にＮａ
Ｎ3 を０．１％の濃度となるように添加し、３ｍｌずつ
分注して凍結保存し、抗ＨＭ２血清とする。
【００１３】次に、得られたクローンよりプラスミドＤ
ＮＡを回収し、ＥｃｏＲＩで消化して図１に示すよう
に、本発明では７個のクローンより約９００〜１５００
ｂｐの断片を得る。該断片をｐＵＣ１９（宝酒造社製）
にサブクローニングし、常法により、例えばサイクルシ
ークエンス法により塩基配列を決定する。これらのクロ
ーンＮｏ．１、２、３、４、５、６、７をそれぞれ、ma
g125、mag126、mag127、mag128、mag129、mag130、mag1
31と命名する。これらのクローンの一例として、クロー
ンＮｏ．３（mag127）の塩基配列を、配列表の配列番
号：２に示す。
ＮＡを回収し、ＥｃｏＲＩで消化して図１に示すよう
に、本発明では７個のクローンより約９００〜１５００
ｂｐの断片を得る。該断片をｐＵＣ１９（宝酒造社製）
にサブクローニングし、常法により、例えばサイクルシ
ークエンス法により塩基配列を決定する。これらのクロ
ーンＮｏ．１、２、３、４、５、６、７をそれぞれ、ma
g125、mag126、mag127、mag128、mag129、mag130、mag1
31と命名する。これらのクローンの一例として、クロー
ンＮｏ．３（mag127）の塩基配列を、配列表の配列番
号：２に示す。
【００１４】本発明のポリヌクレオチドは、例えば配列
番号：１に記載のアミノ酸配列の全部又は一部をコード
するポリヌクレオチドであって、ダニアレルゲン活性を
有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドであり、ま
た、配列番号：２に記載の塩基配列の全部又は一部から
なるポリヌクレオチドであって、ダニアレルゲン活性を
有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである。
尚、これらのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド
も本発明に含まれる。さらに、配列番号：１に記載のア
ミノ酸配列、又はその一部からなるアミノ酸配列におい
て、１又は２以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又
は置換の少なくとも１つを生じさせ、かつ、ダニアレル
ゲン活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド
も本発明のポリヌクレオチドである。これらのポリヌク
レオチドにハイブリダイズ可能であって、かつ、ダニア
レルゲン活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオ
チドも本発明に含まれる。ハイブリダイズ可能なとは、
例えば以下の条件で該ポリヌクレオチドとハイブリッド
を形成することができることをいう。サザンブロッティ
ング法によりニトロセルロース膜上にＤＮＡを転写、固
定後、ハイブリダイゼーション緩衝液〔５０％ フォル
ムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ
７．０）、１０× デンハルツ（Denhardt, s)溶液、１
００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ〕中で４２℃で一晩反応
させることによりハイブリッドを形成することができる
ポリヌクレオチドである。
番号：１に記載のアミノ酸配列の全部又は一部をコード
するポリヌクレオチドであって、ダニアレルゲン活性を
有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドであり、ま
た、配列番号：２に記載の塩基配列の全部又は一部から
なるポリヌクレオチドであって、ダニアレルゲン活性を
有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである。
尚、これらのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド
も本発明に含まれる。さらに、配列番号：１に記載のア
ミノ酸配列、又はその一部からなるアミノ酸配列におい
て、１又は２以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又
は置換の少なくとも１つを生じさせ、かつ、ダニアレル
ゲン活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド
も本発明のポリヌクレオチドである。これらのポリヌク
レオチドにハイブリダイズ可能であって、かつ、ダニア
レルゲン活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオ
チドも本発明に含まれる。ハイブリダイズ可能なとは、
例えば以下の条件で該ポリヌクレオチドとハイブリッド
を形成することができることをいう。サザンブロッティ
ング法によりニトロセルロース膜上にＤＮＡを転写、固
定後、ハイブリダイゼーション緩衝液〔５０％ フォル
ムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ
７．０）、１０× デンハルツ（Denhardt, s)溶液、１
００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ〕中で４２℃で一晩反応
させることによりハイブリッドを形成することができる
ポリヌクレオチドである。
【００１５】本発明の発現ベクターは、細菌、酵母又は
動物細胞中において、本発明の遺伝子を発現させ得るよ
うに結合している発現ベクターであれば特に限定されな
い。発現ベクターの構築に用いられるベクターＤＮＡ
は、広く普及した入手の容易なものが用いられる。例え
ば、ｐＵＣ19、ｐＴＶ118 Ｎ (宝酒造社製）、ｐＵＥＸ
２（アマシャム社製）、ｐＧＥＸ−４Ｔ、ｐＫＫ233-2
(ファルマシア社製）、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ（クロンテッ
ク社製）等が挙げられる。
動物細胞中において、本発明の遺伝子を発現させ得るよ
うに結合している発現ベクターであれば特に限定されな
い。発現ベクターの構築に用いられるベクターＤＮＡ
は、広く普及した入手の容易なものが用いられる。例え
ば、ｐＵＣ19、ｐＴＶ118 Ｎ (宝酒造社製）、ｐＵＥＸ
２（アマシャム社製）、ｐＧＥＸ−４Ｔ、ｐＫＫ233-2
(ファルマシア社製）、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ（クロンテッ
ク社製）等が挙げられる。
【００１６】本発明の発現ベクターの構築方法は、特に
限定されるものではなく常法により行なうことができ
る。例えば、図１に示すダニアレルゲンｃＤＮＡのＥｃ
ｏＲＩで消化した断片を、プラスミドｐＵＣ19のマルチ
クローニング部位のＥｃｏＲＩ部位に挿入することがで
きる。また、該断片をプラスミドベクターｐＧＥＸ−４
ＴのＥｃｏＲＩ部位に連結して発現ベクターを得ること
ができる。
限定されるものではなく常法により行なうことができ
る。例えば、図１に示すダニアレルゲンｃＤＮＡのＥｃ
ｏＲＩで消化した断片を、プラスミドｐＵＣ19のマルチ
クローニング部位のＥｃｏＲＩ部位に挿入することがで
きる。また、該断片をプラスミドベクターｐＧＥＸ−４
ＴのＥｃｏＲＩ部位に連結して発現ベクターを得ること
ができる。
【００１７】本発明の発現ベクターで形質転換された細
菌、酵母又は動物細胞は、本発明の遺伝子を発現し得る
ものであれば特に制限されないが、例えば、細菌として
は大腸菌、枯草菌等が、酵母としてはサッカロマイセス
・セレビィシエ等が、動物細胞としては、チャイニーズ
・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヨトウガの卵巣細
胞であるＳｆ ２１細胞やＳｆ ９細胞、サルＣＯＳ細
胞、マウス線維芽細胞等が挙げられる。
菌、酵母又は動物細胞は、本発明の遺伝子を発現し得る
ものであれば特に制限されないが、例えば、細菌として
は大腸菌、枯草菌等が、酵母としてはサッカロマイセス
・セレビィシエ等が、動物細胞としては、チャイニーズ
・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヨトウガの卵巣細
胞であるＳｆ ２１細胞やＳｆ ９細胞、サルＣＯＳ細
胞、マウス線維芽細胞等が挙げられる。
【００１８】本発明の組換えダニアレルゲンは、前述の
ような本発明のポリヌクレオチドからコードされるポリ
ペプチドであり、アレルゲン活性を有するものである。
具体的には、例えば配列番号：１のアミノ酸配列の全部
又は一部を有するポリペプチドが挙げられる。
ような本発明のポリヌクレオチドからコードされるポリ
ペプチドであり、アレルゲン活性を有するものである。
具体的には、例えば配列番号：１のアミノ酸配列の全部
又は一部を有するポリペプチドが挙げられる。
【００１９】また、本発明の組換えダニアレルゲンは、
そのアミノ酸配列のうち、１個又は複数のアミノ酸の置
換、欠失、挿入又は付加によって種々変異されたもので
あっても、アレルゲン活性を有するものは本発明の組換
えダニアレルゲンに含まれる。このような変異体は、例
えば組換えＤＮＡ技術により、ＤＮＡの特定の部位に変
異を誘発することにより得られる。
そのアミノ酸配列のうち、１個又は複数のアミノ酸の置
換、欠失、挿入又は付加によって種々変異されたもので
あっても、アレルゲン活性を有するものは本発明の組換
えダニアレルゲンに含まれる。このような変異体は、例
えば組換えＤＮＡ技術により、ＤＮＡの特定の部位に変
異を誘発することにより得られる。
【００２０】本発明の組換えダニアレルゲンには、直接
発現に加えて、他の蛋白質との融合蛋白質として発現さ
れたものも含まれ、以下、該融合蛋白質を融合組換えダ
ニアレルゲンという。ここで、融合する他の蛋白質とし
ては特に限定されないが、例えば、β−ガラクトシダー
ゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、プロテイン
Ａ、マルトース結合蛋白質等が挙げられる。
発現に加えて、他の蛋白質との融合蛋白質として発現さ
れたものも含まれ、以下、該融合蛋白質を融合組換えダ
ニアレルゲンという。ここで、融合する他の蛋白質とし
ては特に限定されないが、例えば、β−ガラクトシダー
ゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、プロテイン
Ａ、マルトース結合蛋白質等が挙げられる。
【００２１】本発明の組換えダニアレルゲンは、アレル
ゲン活性に必須な領域のみのペプチド断片であってもよ
く、また、アレルゲン活性に必須な領域からなるもので
あってもよい。また、ダニアレルゲン蛋白質のみを発現
させて得られたものの他に、融合蛋白質として発現した
ものから他の蛋白質を脱離せしめて得られたものでもよ
い。
ゲン活性に必須な領域のみのペプチド断片であってもよ
く、また、アレルゲン活性に必須な領域からなるもので
あってもよい。また、ダニアレルゲン蛋白質のみを発現
させて得られたものの他に、融合蛋白質として発現した
ものから他の蛋白質を脱離せしめて得られたものでもよ
い。
【００２２】要約すれば、本発明の組換えダニアレルゲ
ンは、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られ、ダ
ニアレルゲン活性を有する蛋白質である。
ンは、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られ、ダ
ニアレルゲン活性を有する蛋白質である。
【００２３】該アレルゲンを以下の免疫学的手法により
さらに解析することができる。 （１）抗原性 ダニアレルギー患者プール血清中の特異IgE 、ウサギ抗
ダニ虫体血清、ウサギ抗ＨＭ２血清とのELISA 反応性、
及び発現組換えダニアレルゲンをSDS-PAGE後ニトロセル
ロース膜にブロットし上記抗血清との反応性により判断
する。 （２）ダニアレルゲン活性 HPLC(High performance liquid chromatography)を用い
たダニアレルギー患者白血球ヒスタミン遊離試験により
判断する。即ち、ダニアレルギー疾患患者の血液及びこ
の血液から遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に
懸濁した血球浮遊液の一定量を、組換えダニアレルゲン
を滴定試薬として用いて滴定し、アレルゲン刺激により
好塩基球から遊離するヒスタミン量をHPLCを用いて測定
する〔アレルギー，37, 725(1988) 〕。 （３）アナフィラキシー反応の非誘導性 常法により、融合蛋白質またはダニアレルゲン蛋白質で
モルモットを免疫し、追加免疫時にアナフィラキシー反
応について観察する。
さらに解析することができる。 （１）抗原性 ダニアレルギー患者プール血清中の特異IgE 、ウサギ抗
ダニ虫体血清、ウサギ抗ＨＭ２血清とのELISA 反応性、
及び発現組換えダニアレルゲンをSDS-PAGE後ニトロセル
ロース膜にブロットし上記抗血清との反応性により判断
する。 （２）ダニアレルゲン活性 HPLC(High performance liquid chromatography)を用い
たダニアレルギー患者白血球ヒスタミン遊離試験により
判断する。即ち、ダニアレルギー疾患患者の血液及びこ
の血液から遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に
懸濁した血球浮遊液の一定量を、組換えダニアレルゲン
を滴定試薬として用いて滴定し、アレルゲン刺激により
好塩基球から遊離するヒスタミン量をHPLCを用いて測定
する〔アレルギー，37, 725(1988) 〕。 （３）アナフィラキシー反応の非誘導性 常法により、融合蛋白質またはダニアレルゲン蛋白質で
モルモットを免疫し、追加免疫時にアナフィラキシー反
応について観察する。
【００２４】本発明の組換えダニアレルゲンの製造方法
は、本発明の遺伝子を発現させ得る発現ベクターで形質
転換された細菌、酵母又は動物細胞を該遺伝子の発現可
能な条件下で培養して、組換えダニアレルゲンを産生さ
せ、次いで該組換えダニアレルゲンを回収することによ
る。
は、本発明の遺伝子を発現させ得る発現ベクターで形質
転換された細菌、酵母又は動物細胞を該遺伝子の発現可
能な条件下で培養して、組換えダニアレルゲンを産生さ
せ、次いで該組換えダニアレルゲンを回収することによ
る。
【００２５】また、融合組換えダニアレルゲン発現プラ
スミドを含有する大腸菌形質転換株を用いての組換えダ
ニアレルゲンの製造方法として、次のような方法が例示
される。ｐＧＥＸ−４ＴのｌａｃＺプロモーターの下流
に組換えダニアレルゲンＤＮＡとグルタチオンＳ−トラ
ンスフェラーゼＤＮＡをフレームが合うように連結した
プラスミドを含有する大腸菌形質転換株を常法により振
盪培養し対数増殖させ、この対数増殖期を維持させなが
らβ−ガラクトシダーゼ・インデューサー添加で融合蛋
白質を誘導合成させる。宿主細胞として用いられる大腸
菌としては、例えば大腸菌JM105 （ファルマシア社製）
が用いられ、mag125〜131 を発現させるプラスミドベク
ターで形質転換された株を、それぞれ、E.coli JM105-O
L125 (FERM P-15819) 、E.coli JM105-OL126 (FERM P-1
5820) 、E.coli JM105-OL127 (FERM P-15821) 、E.coli
JM105-OL128 (FERM P-15822) 、E.coli JM105-OL129
(FERM P-15823) 、E.coli JM105-OL130 (FERM P-15824)
、E.coli JM105-OL131 (FERM P-15825) と命名する。
スミドを含有する大腸菌形質転換株を用いての組換えダ
ニアレルゲンの製造方法として、次のような方法が例示
される。ｐＧＥＸ−４ＴのｌａｃＺプロモーターの下流
に組換えダニアレルゲンＤＮＡとグルタチオンＳ−トラ
ンスフェラーゼＤＮＡをフレームが合うように連結した
プラスミドを含有する大腸菌形質転換株を常法により振
盪培養し対数増殖させ、この対数増殖期を維持させなが
らβ−ガラクトシダーゼ・インデューサー添加で融合蛋
白質を誘導合成させる。宿主細胞として用いられる大腸
菌としては、例えば大腸菌JM105 （ファルマシア社製）
が用いられ、mag125〜131 を発現させるプラスミドベク
ターで形質転換された株を、それぞれ、E.coli JM105-O
L125 (FERM P-15819) 、E.coli JM105-OL126 (FERM P-1
5820) 、E.coli JM105-OL127 (FERM P-15821) 、E.coli
JM105-OL128 (FERM P-15822) 、E.coli JM105-OL129
(FERM P-15823) 、E.coli JM105-OL130 (FERM P-15824)
、E.coli JM105-OL131 (FERM P-15825) と命名する。
【００２６】該形質転換株の培養終了後、集菌した菌体
は、種々のプロテアーゼインヒビターを含む緩衝液に懸
濁して超音波処理で破壊される。細胞デブリスにある膜
局在性の蛋白をフェニルメタンスルフォニル・フルオリ
ド、モノヨード酢酸、ペプスタチンＡ、エチレンジアミ
ン四酢酸等のプロテアーゼインヒビター及びラウリル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ−100 、ノニデッ
トＰ40等の界面活性剤を含む緩衝液で抽出する。その抽
出液から、又は培養濃縮液から得られたダニアレルゲン
・グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合蛋白質を、
例えばグルタチオン固定化アフィニティクロマトグラフ
ィー及び抗ダニ虫体抗体固定化アフィニティクロマトグ
ラフィー等で精製する。なお、グルタチオン固定化担体
は、ファルマシア社製のものである。また、抗ダニ虫体
抗体固定化担体は、活性化されたトレシル担体（例え
ば、トレシルＧＭゲル（栗田工業社製）、トレシルトヨ
パール（東ソー社製）、トレシルセファロース（ファル
マシア社製）等が用いられる）にウサギ抗ダニ虫体抗体
を共有結合させたものである。
は、種々のプロテアーゼインヒビターを含む緩衝液に懸
濁して超音波処理で破壊される。細胞デブリスにある膜
局在性の蛋白をフェニルメタンスルフォニル・フルオリ
ド、モノヨード酢酸、ペプスタチンＡ、エチレンジアミ
ン四酢酸等のプロテアーゼインヒビター及びラウリル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ−100 、ノニデッ
トＰ40等の界面活性剤を含む緩衝液で抽出する。その抽
出液から、又は培養濃縮液から得られたダニアレルゲン
・グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合蛋白質を、
例えばグルタチオン固定化アフィニティクロマトグラフ
ィー及び抗ダニ虫体抗体固定化アフィニティクロマトグ
ラフィー等で精製する。なお、グルタチオン固定化担体
は、ファルマシア社製のものである。また、抗ダニ虫体
抗体固定化担体は、活性化されたトレシル担体（例え
ば、トレシルＧＭゲル（栗田工業社製）、トレシルトヨ
パール（東ソー社製）、トレシルセファロース（ファル
マシア社製）等が用いられる）にウサギ抗ダニ虫体抗体
を共有結合させたものである。
【００２７】精製された融合組換えダニアレルゲンは、
プロテアーゼで消化し、ELISA 及びダニアレルギー疾患
患者白血球ヒスタミン遊離試験（アレルギー, 37, 725
(1988) ）でモニター下に、例えばゲル濾過クロマトグ
ラフィー、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、
アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフ
ィー、クロマトフォカシング、等電点電気泳動法、ゲル
電気泳動法等の公知の精製法を単独又は組み合わせて分
画する。
プロテアーゼで消化し、ELISA 及びダニアレルギー疾患
患者白血球ヒスタミン遊離試験（アレルギー, 37, 725
(1988) ）でモニター下に、例えばゲル濾過クロマトグ
ラフィー、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、
アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフ
ィー、クロマトフォカシング、等電点電気泳動法、ゲル
電気泳動法等の公知の精製法を単独又は組み合わせて分
画する。
【００２８】本発明のダニアレルギー疾患治療剤は前記
の精製された組換えダニアレルゲンを有効成分とするも
のであり、各種のダニアレルギー疾患の治療剤として用
いられる。ここでダニアレルギー疾患とは、アトピー性
気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、
アトピー性皮膚炎等、ダニの特異抗原が原因となるあら
ゆるアレルギー疾患をいう。
の精製された組換えダニアレルゲンを有効成分とするも
のであり、各種のダニアレルギー疾患の治療剤として用
いられる。ここでダニアレルギー疾患とは、アトピー性
気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、
アトピー性皮膚炎等、ダニの特異抗原が原因となるあら
ゆるアレルギー疾患をいう。
【００２９】本発明のダニアレルギー疾患治療剤の調製
方法は、特に制限はないが、例えば、前記の方法により
精製された組換えダニアレルゲンを乾燥して粉末状で採
取し、ダニアレルギー疾患に対する減感作治療剤として
用いられる。本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、減
感作治療剤として用いられる場合、そのままで、または
必要に応じて一般的に用いられるアジュバントや各種の
添加剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化
剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を常法により
添加した配合剤として用いることができる。例えば、粉
末状の精製された組換えダニアレルゲンをフェノールを
添加した生理食塩水に溶解し、減感作治療用抗原の原液
として用いる。
方法は、特に制限はないが、例えば、前記の方法により
精製された組換えダニアレルゲンを乾燥して粉末状で採
取し、ダニアレルギー疾患に対する減感作治療剤として
用いられる。本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、減
感作治療剤として用いられる場合、そのままで、または
必要に応じて一般的に用いられるアジュバントや各種の
添加剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化
剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を常法により
添加した配合剤として用いることができる。例えば、粉
末状の精製された組換えダニアレルゲンをフェノールを
添加した生理食塩水に溶解し、減感作治療用抗原の原液
として用いる。
【００３０】本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、通
常の投与経路例えば経皮、経口、皮内、皮下、筋肉内、
腹腔内等の投与方法により行なうことができる。更に、
例えば、トローチ、舌下錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パ
ップ剤、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経粘膜薬
としても使用することができる。また、本発明のダニア
レルギー疾患治療剤の投与量及び投与回数は、投与経
路、症状などに応じて成人１回あたり約20μｇ以下の範
囲となるように適宜選択し、毎週１回程度投与される。
常の投与経路例えば経皮、経口、皮内、皮下、筋肉内、
腹腔内等の投与方法により行なうことができる。更に、
例えば、トローチ、舌下錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パ
ップ剤、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経粘膜薬
としても使用することができる。また、本発明のダニア
レルギー疾患治療剤の投与量及び投与回数は、投与経
路、症状などに応じて成人１回あたり約20μｇ以下の範
囲となるように適宜選択し、毎週１回程度投与される。
【００３１】また、本発明のダニアレルギー疾患治療剤
は、ダニアレルギー疾患に対する治療剤のみならず予防
剤としても有用である。また、アナフィラキシー誘発作
用もなく、人体に対して安全に用いることができる。
は、ダニアレルギー疾患に対する治療剤のみならず予防
剤としても有用である。また、アナフィラキシー誘発作
用もなく、人体に対して安全に用いることができる。
【００３２】本発明のダニアレルギー疾患診断薬は、ダ
ニアレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及びダニア
レルギー診断用滴定試薬として用いられる。皮内反応診
断試薬として用いる場合は、前記の方法により精製され
た組換えダニアレルゲンを常法により調製して得るが、
例えば組換えダニアレルゲンを乾燥して粉末状とし、こ
れをフェノールを含む生理食塩水で溶解し、希釈して用
いる。皮内反応診断試薬として用いる方法は、常法に従
って用いられる。
ニアレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及びダニア
レルギー診断用滴定試薬として用いられる。皮内反応診
断試薬として用いる場合は、前記の方法により精製され
た組換えダニアレルゲンを常法により調製して得るが、
例えば組換えダニアレルゲンを乾燥して粉末状とし、こ
れをフェノールを含む生理食塩水で溶解し、希釈して用
いる。皮内反応診断試薬として用いる方法は、常法に従
って用いられる。
【００３３】また、ダニアレルギー診断用滴定試薬とし
て用いる場合も同様に常法により調製されるが、例え
ば、組換えダニアレルゲンをハンクス緩衝液で適当に溶
解し、希釈してヒスタミン遊離滴定用試薬として用い
る。この方法は通常、以下の操作手順によりなされる。
即ち、ダニアレルギー疾患患者の血液及びこの血液から
遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に懸濁した血
球浮遊液の一定量を、組換えダニアレルゲンを滴定試薬
として用いて滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球か
ら遊離するヒスタミン量をHPLCを用いて測定する〔アレ
ルギー，37, 725(1988) 〕。
て用いる場合も同様に常法により調製されるが、例え
ば、組換えダニアレルゲンをハンクス緩衝液で適当に溶
解し、希釈してヒスタミン遊離滴定用試薬として用い
る。この方法は通常、以下の操作手順によりなされる。
即ち、ダニアレルギー疾患患者の血液及びこの血液から
遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に懸濁した血
球浮遊液の一定量を、組換えダニアレルゲンを滴定試薬
として用いて滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球か
ら遊離するヒスタミン量をHPLCを用いて測定する〔アレ
ルギー，37, 725(1988) 〕。
【００３４】このヒスタミン遊離滴定では、最大遊離量
の50％量（滴定曲線の変曲点）から遊離されるヒスタミ
ン量を求める。この滴定では、（１）血球浮遊液の滴定
値から患者のアレルゲン感受性を直接測定することにな
る。（２）血漿と組換えダニアレルゲンとを予め反応さ
せた後、その液で血球浮遊液を滴定して得られる値（血
液滴定曲線値）は、通常、組換えダニアレルゲンで血球
浮遊液を滴定して得られる値（血球浮遊液滴定曲線値）
より高い値が得られる。これは、血漿中にアレルゲン中
和能を持つIgG 抗体（遮断抗体）が存在するためであ
る。従って、対血液滴定曲線の、対血球浮遊液滴定曲線
からのシフトの大きさから、遮断抗体価が得られる。ア
レルゲン感受性とこの遮断抗体価から、ダニアレルギー
の正確な診断が可能となる。また、このヒスタミン遊離
滴定試験は減感作治療効果のモニターとしても有用であ
る。
の50％量（滴定曲線の変曲点）から遊離されるヒスタミ
ン量を求める。この滴定では、（１）血球浮遊液の滴定
値から患者のアレルゲン感受性を直接測定することにな
る。（２）血漿と組換えダニアレルゲンとを予め反応さ
せた後、その液で血球浮遊液を滴定して得られる値（血
液滴定曲線値）は、通常、組換えダニアレルゲンで血球
浮遊液を滴定して得られる値（血球浮遊液滴定曲線値）
より高い値が得られる。これは、血漿中にアレルゲン中
和能を持つIgG 抗体（遮断抗体）が存在するためであ
る。従って、対血液滴定曲線の、対血球浮遊液滴定曲線
からのシフトの大きさから、遮断抗体価が得られる。ア
レルゲン感受性とこの遮断抗体価から、ダニアレルギー
の正確な診断が可能となる。また、このヒスタミン遊離
滴定試験は減感作治療効果のモニターとしても有用であ
る。
【００３５】
【実施例】以下に、実施例をあげて本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。尚、各実施例において使用した試薬は特記しない
限り、ナカライテスク、片山化学、和光純薬、シグマ、
ディフコなどから購入した市販のものを使用した。ま
た、制限酵素などの遺伝子工学用試薬は宝酒造、東洋
紡、ベーリンガーマンハイムなどから購入し、販売者の
指示に従って使用した。
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。尚、各実施例において使用した試薬は特記しない
限り、ナカライテスク、片山化学、和光純薬、シグマ、
ディフコなどから購入した市販のものを使用した。ま
た、制限酵素などの遺伝子工学用試薬は宝酒造、東洋
紡、ベーリンガーマンハイムなどから購入し、販売者の
指示に従って使用した。
【００３６】本実施例で使用した培地の組成は、以下に
示す通りである。 ＬＢ培地（１Ｌ） バクト トリプトン １０ｇ バクト イースト エキストラクト ５ｇ ＮａＣｌ ５ｇ ＮＺＹＭ培地（１Ｌ） ＮＺ アミン １０ｇ ＮａＣｌ ５ｇ バクト イースト エキストラクト ５ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２ｇ ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整する。 ２×ＹＴ培地（１Ｌ） バクト トリプトン １６ｇ バクト イースト エキストラクト ８ｇ ＮａＣｌ ５ｇ
示す通りである。 ＬＢ培地（１Ｌ） バクト トリプトン １０ｇ バクト イースト エキストラクト ５ｇ ＮａＣｌ ５ｇ ＮＺＹＭ培地（１Ｌ） ＮＺ アミン １０ｇ ＮａＣｌ ５ｇ バクト イースト エキストラクト ５ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２ｇ ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整する。 ２×ＹＴ培地（１Ｌ） バクト トリプトン １６ｇ バクト イースト エキストラクト ８ｇ ＮａＣｌ ５ｇ
【００３７】実施例１ ダニ全ＲＮＡの抽出とダニアレルゲンポリ(A)mＲＮＡの
分離：常法によりコナヒョウヒダニを培養増殖させて得
られる生ダニ虫体６g を200ｍｌの5.5 Ｍイソチアン酸
グアニジン (片山化学社製) 液中で石英砂10ｇとともに
乳鉢中ですりつぶし遠心分離(9000rpm、 10分間、４℃）
し、その上清を、18Ｇの注射針をつけた50ｍｌ容のシリ
ンジで吸入、射出を繰り返すことにより、ＤＮＡを部分
切断した。再度遠心分離した上清を、17ｍｌのトリフル
オロ酢酸セシウム溶液 (片山化学社製) に対して16ｍｌ
の割合で重層し、85,000×ｇで24時間 (15℃, HITACHI
SCP55H swing PRS-27-2)密度勾配遠心分離を行い、管底
にペレットを形成する全ＲＮＡ画分を回収した。次に、
オリゴ（ｄＴ）セルロース（ベーリンガーマンハイム社
製）カラムを用いて、得られた全ＲＮＡ画分からポリ
(A)mＲＮＡ画分を精製した。
分離：常法によりコナヒョウヒダニを培養増殖させて得
られる生ダニ虫体６g を200ｍｌの5.5 Ｍイソチアン酸
グアニジン (片山化学社製) 液中で石英砂10ｇとともに
乳鉢中ですりつぶし遠心分離(9000rpm、 10分間、４℃）
し、その上清を、18Ｇの注射針をつけた50ｍｌ容のシリ
ンジで吸入、射出を繰り返すことにより、ＤＮＡを部分
切断した。再度遠心分離した上清を、17ｍｌのトリフル
オロ酢酸セシウム溶液 (片山化学社製) に対して16ｍｌ
の割合で重層し、85,000×ｇで24時間 (15℃, HITACHI
SCP55H swing PRS-27-2)密度勾配遠心分離を行い、管底
にペレットを形成する全ＲＮＡ画分を回収した。次に、
オリゴ（ｄＴ）セルロース（ベーリンガーマンハイム社
製）カラムを用いて、得られた全ＲＮＡ画分からポリ
(A)mＲＮＡ画分を精製した。
【００３８】実施例２ ダニアレルゲンｃＤＮＡの合成：次に、このポリ(A)mＲ
ＮＡのうち５μｇを鋳型とし、ｃＤＮＡ合成キット（フ
ァルマシア社製) を用いてそのマニュアルに従ってｃＤ
ＮＡを合成し、その両端にNot I 部位を含んだ１３mer
のEcoRI リンカーを接続した。
ＮＡのうち５μｇを鋳型とし、ｃＤＮＡ合成キット（フ
ァルマシア社製) を用いてそのマニュアルに従ってｃＤ
ＮＡを合成し、その両端にNot I 部位を含んだ１３mer
のEcoRI リンカーを接続した。
【００３９】実施例３ ダニアレルゲンｃＤＮＡライブラリーの作製：実施例２
で合成したｃＤＮＡのうちの１／１０量を、１μｇのEc
oRI 消化λExCellベクター( ファルマシア社製）と混合
し、これをエタノールで濃縮した後２００ unitsのＴ４
ＤＮＡリガーゼを加えて12℃で15時間反応させることに
より、ｃＤＮＡをλExCellのEcoRI 部位に挿入した。こ
の反応液から、イン・ビトロパッケージングキット (ギ
ガパック プラス, ストラタジーン社製) を用いてその
マニュアルにしたがって、ｃＤＮＡライブラリーを作製
した。最終的に６．６μｇのポリ(A)mＲＮＡから合計９
４，８００ pfu(plaque forming unit) のｃＤＮＡライ
ブラリーを得た。
で合成したｃＤＮＡのうちの１／１０量を、１μｇのEc
oRI 消化λExCellベクター( ファルマシア社製）と混合
し、これをエタノールで濃縮した後２００ unitsのＴ４
ＤＮＡリガーゼを加えて12℃で15時間反応させることに
より、ｃＤＮＡをλExCellのEcoRI 部位に挿入した。こ
の反応液から、イン・ビトロパッケージングキット (ギ
ガパック プラス, ストラタジーン社製) を用いてその
マニュアルにしたがって、ｃＤＮＡライブラリーを作製
した。最終的に６．６μｇのポリ(A)mＲＮＡから合計９
４，８００ pfu(plaque forming unit) のｃＤＮＡライ
ブラリーを得た。
【００４０】実施例４ ウサギ抗ＨＭ２血清の調製：凍結殺虫済みのダニ培養物
に重量換算で、１０倍量の飽和食塩水を加え、室温で１
時間穏やかに攪拌後、該食塩水を遠心分離し、上清表面
に浮遊するダニ虫体を吸引濾過により回収した。沈殿に
さらに重量換算で１０倍量の１０ｍＭ ＰＢ（リン酸緩
衝液、ｐＨ７．４）を加えて同様に攪拌、遠心分離を２
回繰り返した。得られた抽出物を水道水に対して透析
し、分子量１万カットの限外濾過膜に３回かけた。膜に
保持された高分子画分をゲル濾過クロマトグラフィーに
かけて、分子量３０〜４０ｋＤの画分を透析、減圧濃縮
後、凍結乾燥したものを高分子粗ダニ排泄物抗原ＨＭ２
とした。１００μｇの該抗原を含む０．５ｍｌの生理食
塩水と同容量のフロイント完全アジュバンド（ナカライ
テスク社製）を混合し、ウサギに免疫し、抗体価をチェ
ックしながら隔週追加免疫を行った。実施例７に記載の
方法で、２０００倍希釈の該抗血清がメンブレン上の１
００ｎｇのＨＭ２抗原を検出できるようになった時点
で、ウサギの全採血を行った。採取した血液を１，５０
０ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清に２０％ＮａＮ3
を０．１％の終濃度となるように添加し、３ｍｌずつ分
注して凍結保存し、使用時に解凍して抗ＨＭ２血清とし
た。
に重量換算で、１０倍量の飽和食塩水を加え、室温で１
時間穏やかに攪拌後、該食塩水を遠心分離し、上清表面
に浮遊するダニ虫体を吸引濾過により回収した。沈殿に
さらに重量換算で１０倍量の１０ｍＭ ＰＢ（リン酸緩
衝液、ｐＨ７．４）を加えて同様に攪拌、遠心分離を２
回繰り返した。得られた抽出物を水道水に対して透析
し、分子量１万カットの限外濾過膜に３回かけた。膜に
保持された高分子画分をゲル濾過クロマトグラフィーに
かけて、分子量３０〜４０ｋＤの画分を透析、減圧濃縮
後、凍結乾燥したものを高分子粗ダニ排泄物抗原ＨＭ２
とした。１００μｇの該抗原を含む０．５ｍｌの生理食
塩水と同容量のフロイント完全アジュバンド（ナカライ
テスク社製）を混合し、ウサギに免疫し、抗体価をチェ
ックしながら隔週追加免疫を行った。実施例７に記載の
方法で、２０００倍希釈の該抗血清がメンブレン上の１
００ｎｇのＨＭ２抗原を検出できるようになった時点
で、ウサギの全採血を行った。採取した血液を１，５０
０ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清に２０％ＮａＮ3
を０．１％の終濃度となるように添加し、３ｍｌずつ分
注して凍結保存し、使用時に解凍して抗ＨＭ２血清とし
た。
【００４１】実施例５ ダニアレルゲンｃＤＮＡのクローニング：実施例３で得
られたｃＤＮＡライブラリーの１８５，０００個の組換
え体について、実施例４で得られたウサギ抗ＨＭ２血清
を用いて免疫スクリーニングを行った。以下に、免疫ス
クリーニングの詳しいプロトコールを記載する。大腸菌
ＮＭ５２２（ファルマシア社製）を０．２％マルトース
を含むＬＢ培地（５ｍｌ）でＯＤ600 ＝１．０になるま
で培養し、培養液を９，０００ｒｐｍで５分間遠心分離
した。菌体に１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 水溶液をＯＤ600 ＝
２．０になるように加え、さらに１プレート当り約２，
０００個のプラークを形成するように希釈したファージ
溶液を等容量加え、激しく攪拌した。該溶液を３７℃で
１５分間保温し、溶解後４２℃に保温したＬＢトップア
ガー（ＬＢ＋０．７％バクトアガー）と混合し、ＬＢプ
レート（ＬＢ＋１．５％バクトアガー）上に重層した。
該プレートを３７℃で６時間保温した後、予め１０ｍＭ
イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（IPT
G) を浸漬させて乾燥したニトロセルロースメンブレン
(Hibond−C,アマシャム社製) でプレート上を覆い、さ
らに37℃で３時間培養して誘導合成されるβ−ガラクト
シダーゼ融合蛋白を転写した。
られたｃＤＮＡライブラリーの１８５，０００個の組換
え体について、実施例４で得られたウサギ抗ＨＭ２血清
を用いて免疫スクリーニングを行った。以下に、免疫ス
クリーニングの詳しいプロトコールを記載する。大腸菌
ＮＭ５２２（ファルマシア社製）を０．２％マルトース
を含むＬＢ培地（５ｍｌ）でＯＤ600 ＝１．０になるま
で培養し、培養液を９，０００ｒｐｍで５分間遠心分離
した。菌体に１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 水溶液をＯＤ600 ＝
２．０になるように加え、さらに１プレート当り約２，
０００個のプラークを形成するように希釈したファージ
溶液を等容量加え、激しく攪拌した。該溶液を３７℃で
１５分間保温し、溶解後４２℃に保温したＬＢトップア
ガー（ＬＢ＋０．７％バクトアガー）と混合し、ＬＢプ
レート（ＬＢ＋１．５％バクトアガー）上に重層した。
該プレートを３７℃で６時間保温した後、予め１０ｍＭ
イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（IPT
G) を浸漬させて乾燥したニトロセルロースメンブレン
(Hibond−C,アマシャム社製) でプレート上を覆い、さ
らに37℃で３時間培養して誘導合成されるβ−ガラクト
シダーゼ融合蛋白を転写した。
【００４２】該メンブレンをプレートから剥がし、ブロ
ッキング溶液（１％スキムミルクを含むＴＢＳ(50mM Tr
is−HCl, pH 7.6, 150mM NaCl)溶液）中で１時間振盪さ
せ、ウサギ抗ＨＭ２血清( ブロッキング溶液で500 倍に
希釈) 、さらにパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG
抗体 (カッペル社製, 5000倍TBS 希釈) とそれぞれ１時
間ずつ反応させ、各反応後ＴＢＳＴ（0.05％ツィーン２
０を含むＴＢＳ）及びＴＢＳで５分間３回ずつ洗浄し
た。発色は0.01％過酸化水素の存在下、0.6 ｍｇ／ｍｌ
のジアミノベンジジン四塩酸塩と 0.03 ％ NiCl2を含む
TBS 溶液中で行なった。黒色を呈したシグナルの位置と
合致するプラークをピックアップしてＳＭ(１Ｍ Tris-H
Cl, pH7.5, 0.1 Ｍ NaCl, 10mM MgSO4,0.01％ゼラチ
ン）緩衝液に懸濁し、陽性クローンとして保存した。
ッキング溶液（１％スキムミルクを含むＴＢＳ(50mM Tr
is−HCl, pH 7.6, 150mM NaCl)溶液）中で１時間振盪さ
せ、ウサギ抗ＨＭ２血清( ブロッキング溶液で500 倍に
希釈) 、さらにパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG
抗体 (カッペル社製, 5000倍TBS 希釈) とそれぞれ１時
間ずつ反応させ、各反応後ＴＢＳＴ（0.05％ツィーン２
０を含むＴＢＳ）及びＴＢＳで５分間３回ずつ洗浄し
た。発色は0.01％過酸化水素の存在下、0.6 ｍｇ／ｍｌ
のジアミノベンジジン四塩酸塩と 0.03 ％ NiCl2を含む
TBS 溶液中で行なった。黒色を呈したシグナルの位置と
合致するプラークをピックアップしてＳＭ(１Ｍ Tris-H
Cl, pH7.5, 0.1 Ｍ NaCl, 10mM MgSO4,0.01％ゼラチ
ン）緩衝液に懸濁し、陽性クローンとして保存した。
【００４３】一次スクリーニングで発色したプラークを
さらに二次スクリーニングの結果、新規ダニアレルゲン
をコードする本発明の遺伝子（ｍａｇ１２５〜１３１）
を含む７個のクローンを得た。
さらに二次スクリーニングの結果、新規ダニアレルゲン
をコードする本発明の遺伝子（ｍａｇ１２５〜１３１）
を含む７個のクローンを得た。
【００４４】実施例６ ダニアレルゲン遺伝子の塩基配列決定：次に、得られた
７個のクローンより公知の方法により大腸菌ＮＰ６６に
感染させた後、プラスミドＤＮＡを回収し、ＥｃｏＲＩ
で消化して図１に示すように、約９００〜１５００ｂｐ
の断片を得た。該断片をｐＵＣ１９（宝酒造社製）にサ
ブクローニングし、ジーンアンプＰＣＲシステム９６０
０（パーキン−エルマー社製）を用いてＰＣＲでＤＮＡ
の増幅を行った後、ＡＬＦｒｅｄ ＤＮＡ シークエン
サー（ファルマシア社製）を用いるサイクルシークエン
ス法により塩基配列を決定した。得られた結果のうち、
Ｎｏ．３のクローンの塩基配列を配列表の配列番号：２
に示す。配列番号：２の塩基配列を有する遺伝子は、De
r f ３と約８５％の相同性を示し、mag127と命名した。
７個のクローンより公知の方法により大腸菌ＮＰ６６に
感染させた後、プラスミドＤＮＡを回収し、ＥｃｏＲＩ
で消化して図１に示すように、約９００〜１５００ｂｐ
の断片を得た。該断片をｐＵＣ１９（宝酒造社製）にサ
ブクローニングし、ジーンアンプＰＣＲシステム９６０
０（パーキン−エルマー社製）を用いてＰＣＲでＤＮＡ
の増幅を行った後、ＡＬＦｒｅｄ ＤＮＡ シークエン
サー（ファルマシア社製）を用いるサイクルシークエン
ス法により塩基配列を決定した。得られた結果のうち、
Ｎｏ．３のクローンの塩基配列を配列表の配列番号：２
に示す。配列番号：２の塩基配列を有する遺伝子は、De
r f ３と約８５％の相同性を示し、mag127と命名した。
【００４５】実施例７ ドット・スポットテストによるＨＭ２抗原の検出：６系
列のＨＭ２抗原溶液（２，１，０．５，０．２，０．
１，０．０５，０．０２，０．０１μｇ／μｌ）を調製
し、その０．５μｌずつをニトロセルロースメンブレン
（アマシャム社製）にスポットした。該メンブレンを、
実施例５に記載のブロッキング溶液中で１時間振盪後、
ブロッキング溶液で適宜希釈したウサギ抗ＨＭ２血清、
さらにパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG 抗体 (カ
ッペル社製, 5000倍TBS 希釈) とそれぞれ１時間ずつ反
応させ、各反応後ＴＢＳＴ及びＴＢＳで５分間３回ずつ
洗浄した。発色は0.01％過酸化水素の存在下、0.6 ｍｇ
／ｍｌのジアミノベンジジン四塩酸塩と 0.03 ％ NiCl2
を含むＴＢＳ溶液中で行ない、検出可能な抗原量を測定
した。
列のＨＭ２抗原溶液（２，１，０．５，０．２，０．
１，０．０５，０．０２，０．０１μｇ／μｌ）を調製
し、その０．５μｌずつをニトロセルロースメンブレン
（アマシャム社製）にスポットした。該メンブレンを、
実施例５に記載のブロッキング溶液中で１時間振盪後、
ブロッキング溶液で適宜希釈したウサギ抗ＨＭ２血清、
さらにパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG 抗体 (カ
ッペル社製, 5000倍TBS 希釈) とそれぞれ１時間ずつ反
応させ、各反応後ＴＢＳＴ及びＴＢＳで５分間３回ずつ
洗浄した。発色は0.01％過酸化水素の存在下、0.6 ｍｇ
／ｍｌのジアミノベンジジン四塩酸塩と 0.03 ％ NiCl2
を含むＴＢＳ溶液中で行ない、検出可能な抗原量を測定
した。
【００４６】実施例８ 融合蛋白質として発現して得られる融合蛋白質（ＧＳＴ
−Ｍａｇ１２７）及び組換えダニアレルゲンＭａｇ１２
７の精製：プラスミドpGEX-4T （アマシャム社製）のＥ
ｃｏＲＩ部位にダニアレルゲン遺伝子ｍａｇ１２７を挿
入し、Ｔ−４ ＤＮＡリガーゼで連結し、得られた組換
えプラスミドをE. coli JM105 に形質転換した。この形
質転換株をストレプトマイシン３０μｇ／ｍｌ、アンピ
シリン１００μｇ／ｍｌを含有する２ｘＹＴ培地中、３
７℃で、６００ｎｍのＯＤが１．０になるまで培養し
た。ついで、最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添
加した後３時間目に集菌し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１
回洗浄した。再度集菌した細胞を２ｍＭのＥＤＴＡおよ
び０．１％の２−メルカプトエタノールを含有するＰＢ
Ｓ（ｐＨ７．４）中で超音波処理することにより溶解
し、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）
と融合したＭａｇ１２７を含む不溶性画分を回収した。
次いで、調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、２リットルの
培養液から３．７５ｍｇの融合蛋白質（ＧＳＴ−Ｍａｇ
１２７）を５７ＫＤのバンドから得た。得られた融合蛋
白質を、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２．５ｍＭのＣａ
Ｃｌ2 を含む５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）
中、トロンビン（１μｇ／５００μｇ融合蛋白質）で消
化し、ＧＳＴを切り離し、ついでＧＳＴを除去するた
め、５０％（Ｖ／Ｖ）グルタチオン固定化セファロース
カラムにかけ、さらにブチル−セファロースカラムでＭ
ａｇ１２７の精製を行った。得られた精製Ｍａｇ１２７
はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２９ＫＤの単一のバンドを
還元条件下のゲル上で示した。
−Ｍａｇ１２７）及び組換えダニアレルゲンＭａｇ１２
７の精製：プラスミドpGEX-4T （アマシャム社製）のＥ
ｃｏＲＩ部位にダニアレルゲン遺伝子ｍａｇ１２７を挿
入し、Ｔ−４ ＤＮＡリガーゼで連結し、得られた組換
えプラスミドをE. coli JM105 に形質転換した。この形
質転換株をストレプトマイシン３０μｇ／ｍｌ、アンピ
シリン１００μｇ／ｍｌを含有する２ｘＹＴ培地中、３
７℃で、６００ｎｍのＯＤが１．０になるまで培養し
た。ついで、最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添
加した後３時間目に集菌し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１
回洗浄した。再度集菌した細胞を２ｍＭのＥＤＴＡおよ
び０．１％の２−メルカプトエタノールを含有するＰＢ
Ｓ（ｐＨ７．４）中で超音波処理することにより溶解
し、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）
と融合したＭａｇ１２７を含む不溶性画分を回収した。
次いで、調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、２リットルの
培養液から３．７５ｍｇの融合蛋白質（ＧＳＴ−Ｍａｇ
１２７）を５７ＫＤのバンドから得た。得られた融合蛋
白質を、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２．５ｍＭのＣａ
Ｃｌ2 を含む５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）
中、トロンビン（１μｇ／５００μｇ融合蛋白質）で消
化し、ＧＳＴを切り離し、ついでＧＳＴを除去するた
め、５０％（Ｖ／Ｖ）グルタチオン固定化セファロース
カラムにかけ、さらにブチル−セファロースカラムでＭ
ａｇ１２７の精製を行った。得られた精製Ｍａｇ１２７
はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２９ＫＤの単一のバンドを
還元条件下のゲル上で示した。
【００４７】実施例９ 組換えダニアレルゲンＭａｇ１２７における皮内反応試
験：組換えダニアレルゲンＭａｇ１２７のアレルゲン活
性をダニアレルギー患者９例及び健常者１例に対して皮
内反応試験で検定した。尚、皮内反応試験の前に、組換
えダニアレルゲンＭａｇ１２７中に含まれるエンドトキ
シンの量をトキシカラーシステム（ＬＳ−６セット、生
化学工業社製）を用いて測定したところ、エンドトキシ
ンの量は１．０ＥＵ／ｍｌ未満であった。
験：組換えダニアレルゲンＭａｇ１２７のアレルゲン活
性をダニアレルギー患者９例及び健常者１例に対して皮
内反応試験で検定した。尚、皮内反応試験の前に、組換
えダニアレルゲンＭａｇ１２７中に含まれるエンドトキ
シンの量をトキシカラーシステム（ＬＳ−６セット、生
化学工業社製）を用いて測定したところ、エンドトキシ
ンの量は１．０ＥＵ／ｍｌ未満であった。
【００４８】実施例１０ ドットブロットテスト（Ｄｏｔ ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ
ｔｅｓｔ）：組換えダニアレルゲンＭａｇ１２７の
０．１、０．０１、０．００１％溶液の１μｌをニトロ
セルロースメンブレン（ハイボンド−Ｃ、アマシャム社
製）にブロットし、ブロッキング溶液（１％スキムミル
ク、１５０ｍｌのＮａＣｌ、０．０２％チメロサール、
０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む１０ｍｍｏｌトリス
塩酸バッファー〔ｐＨ７．５〕溶液）に室温で１時間浸
漬した。ついで、ＩｇＥ染色のために、ダニアレルギー
患者のプール血清の１０倍希釈液をメンブレン上に注
ぎ、冷所で一夜インキュベートした。
ｔｅｓｔ）：組換えダニアレルゲンＭａｇ１２７の
０．１、０．０１、０．００１％溶液の１μｌをニトロ
セルロースメンブレン（ハイボンド−Ｃ、アマシャム社
製）にブロットし、ブロッキング溶液（１％スキムミル
ク、１５０ｍｌのＮａＣｌ、０．０２％チメロサール、
０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む１０ｍｍｏｌトリス
塩酸バッファー〔ｐＨ７．５〕溶液）に室温で１時間浸
漬した。ついで、ＩｇＥ染色のために、ダニアレルギー
患者のプール血清の１０倍希釈液をメンブレン上に注
ぎ、冷所で一夜インキュベートした。
【００４９】このメンブレンを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で完全に洗浄したのち、ビ
オチンと結合したヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（ザ バインデ
ィンサイト社製）を含むＴＢＳＴ溶液中に室温で１時間
反応した。ついで、ストレプトアビジン−ペルオキシダ
ーゼ（タゴ社製）を含むＴＢＳＴ溶液に室温で１時間浸
漬した。ＴＢＳＴで完全に洗浄した後、免疫反応をした
スポットは、メンブレンを０．０３％の過酸化水素、
０．０３％塩化ニッケル、０．０６％ジアミノベンジジ
ン（ＤＡＢ）を含む５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ
７．６）とともにインキュベートすることにより、検出
した。該メンブレンを乾燥した後、着色したスポットを
対照として用いたＤｆｂ（ダニ虫体由来のアレルゲン）
およびスギ（スギ花粉）と比較した。その結果、強力な
アレルゲンであることが示された。
０を含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で完全に洗浄したのち、ビ
オチンと結合したヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（ザ バインデ
ィンサイト社製）を含むＴＢＳＴ溶液中に室温で１時間
反応した。ついで、ストレプトアビジン−ペルオキシダ
ーゼ（タゴ社製）を含むＴＢＳＴ溶液に室温で１時間浸
漬した。ＴＢＳＴで完全に洗浄した後、免疫反応をした
スポットは、メンブレンを０．０３％の過酸化水素、
０．０３％塩化ニッケル、０．０６％ジアミノベンジジ
ン（ＤＡＢ）を含む５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ
７．６）とともにインキュベートすることにより、検出
した。該メンブレンを乾燥した後、着色したスポットを
対照として用いたＤｆｂ（ダニ虫体由来のアレルゲン）
およびスギ（スギ花粉）と比較した。その結果、強力な
アレルゲンであることが示された。
【００５０】実施例１１ 融合蛋白質ＧＳＴ−Ｍａｇ１２７及び組換えダニアレル
ゲンＭａｇ１２７のアレルゲン活性の測定：融合蛋白質
ＧＳＴ−Ｍａｇ１２７及び組換えダニアレルゲンＭａｇ
１２７のアレルゲン活性をダニアレルギー患者白血球ヒ
スタミン遊離試験により測定した。アレルギー，37, 72
5(1988) に記載の方法に従って、ダニアレルギー疾患患
者の血液及びこの血液から遠心分離により得られた血球
画分を緩衝液に懸濁した血球浮遊液の一定量を、該融合
蛋白質及び該組換えダニアレルゲンを滴定試薬（抗原）
として用いて滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球か
ら遊離するヒスタミン量をHPLCを用いて測定した。いず
れの抗原にもヒスタミン遊離活性を認めた。
ゲンＭａｇ１２７のアレルゲン活性の測定：融合蛋白質
ＧＳＴ−Ｍａｇ１２７及び組換えダニアレルゲンＭａｇ
１２７のアレルゲン活性をダニアレルギー患者白血球ヒ
スタミン遊離試験により測定した。アレルギー，37, 72
5(1988) に記載の方法に従って、ダニアレルギー疾患患
者の血液及びこの血液から遠心分離により得られた血球
画分を緩衝液に懸濁した血球浮遊液の一定量を、該融合
蛋白質及び該組換えダニアレルゲンを滴定試薬（抗原）
として用いて滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球か
ら遊離するヒスタミン量をHPLCを用いて測定した。いず
れの抗原にもヒスタミン遊離活性を認めた。
【００５１】
【発明の効果】本発明により、ダニアレルギー疾患の治
療剤、診断薬としてアナフィラキシー誘発性の不純物を
含まない安全かつ有効な組換えダニアレルゲンを提供す
ることが可能となった。
療剤、診断薬としてアナフィラキシー誘発性の不純物を
含まない安全かつ有効な組換えダニアレルゲンを提供す
ることが可能となった。
【００５２】
配列番号：１ 配列の長さ：２５７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Ile Leu Ile Val Val Leu Leu Ala Ala Asn Asn Trp Xaa Thr Pro 5 10 15 Ile Leu Pro Thr Ser Pro Asn Ala Thr Ile Val Gly Gly Val Lys Ala 20 25 30 Gln Ala Gly Asp Cys Xaa Tyr Gln Ile Ser Leu Gln Xaa Ser Arg His 35 40 45 Phe Cys Gly Gly Ser Ile Leu Xaa Glu Tyr Trp Xaa Leu Thr Pro Ala 50 55 60 Xaa Cys Val Asn Gly Gln Ser Ala Lys Lys Leu Ser Ile Arg Tyr Asn 65 70 75 80 Thr Leu Lys His Ala Ser Xaa Gly Glu Lys Ile Gln Val Ala Glu Ile 85 90 95 Tyr Gln His Gly Asn Tyr Asp Ser Met Thr Ile Asp Asn Asp Val Ala 100 105 110 Leu Ile Xaa Leu Lys Thr Pro Met Thr Met Xaa Gln Thr Asn Ala Lys 115 120 125 Pro Val Pro Leu Pro Ala Gln Gly Ser Xaa Val Lys Val Gly Asp Lys 130 135 140 Xaa Xaa Val Ser Gly Trp Gly Tyr Leu Gln Gly Gly Ser Tyr Ser Xaa 145 150 155 160 Pro Ser Glu Leu Gln Arg Val Asp Ile Asp Val Val Ser Arg Glu Gln 165 170 175 Xaa Xaa Gln Leu Tyr Ser Lys Ala Gly Ala Asp Val Ser Glu Asn Met 180 185 190 Ile Cys Gly Gly Gly Ser Ala Asn Gly Gly Phe Asp Ser Ser Gln Arg 195 200 205 Asp Ser Cys Gly Pro Phe Val Asp Trp Ser Thr Lys Gln Ile Val Gly 210 215 220 Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Arg Lys Gly Tyr Pro Gly Val 225 230 235 240 Tyr Thr Leu Val Gly Asn Phe Val Asp Arg Ile Glu Pro Lys Arg Pro 245 250 255 Gln
【００５３】配列番号：２ 配列の長さ：９７１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：コナヒョウヒダニ 組織の種類：虫体 配列： TGATGATTTT AATTGTCGTG TTATTGGCTG CAAACAATTG GGVCACACCG ATTCTTCCAA 60 CATCACCAAA TGCAACTATT GTTGGTGGTG TTAAAGCACA AGCCGGTGAT TGTBCATATC 120 AAATTTCATT GCAAWCAAGC AGGCATTTTT GTGGTGGTAG TATCCTGGRT GAATATTGGR 180 TCTTGACCCC TGCACAWTGT GTCAATGGAC AATCAGCAAA AAAACTTTCA ATTCGTTACA 240 ATACTCTTAA ACATGCATCT KGTGGTGAAA AGATTCAAGT GGCGGAAATT TATCAACATG 300 GAAATTATGA TAGCATGACT ATCGATAATG ATGTTGCATT GATAAAVCTC AAAACACCAA 360 TGACAATGGV TCAAACAAAT GCTAAACCCG TACCATTACC AGCACAAGGG TCARATGTAA 420 AAGTTGGTGA TAAAATKCGK GTTTCTGGTT GGGGTTATCT TCAGGGAGGG AGTTATTCAA 480 TMCCATCGGA ATTACAACGT GTTGATATTG ATGTTGTATC ACGGGAACAA TKTDACCAAT 540 TATATTCAAA AGCAGGCGCC GATGTTAGTG AAAATATGAT TTGCGGTGGT GGTAGTGCTA 600 ATGGTGGGTT TGATTCAAGT CAAAGGGATT CTTGCGGCCC TTTTGTTGAT TGGTCCACTA 660 AACAAATTGT TGGTATTGTT TCATGGGGTT ATGGTTGTGC CCGTAAAGGT TATCCAGGTG 720 TCTATACTCT TGTTGGTAAT TTTGTCGACC GGATTGAACC AAAACGCCCC CAGTGAATGA 780 TAAAAATGGC AACAACAGGT CACAATGGCG CGATAATACC CTTACGCGCA ATGATTATGG 840 GGGGGAGAAT TGCCGTGGGG CTGCCATCGC TTTATGTTTT ATCGAAAGTA AAAAAACAAA 900 ATCAATATTG TTAAGAGAAT TGATGTTTTG TTTCGTAAAA AGAAWATTGA ATGAACAACC 960 ACCAGWAAAA A 971
【図１】図１は、ダニアレルゲン遺伝子mag125〜131 の
制限酵素地図の概略図である。
制限酵素地図の概略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (12)
- 【請求項１】 配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸
配列の全部又は一部をコードするポリヌクレオチド、又
は該ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであっ
て、ダニアレルゲン活性を有する蛋白質をコードするポ
リヌクレオチド。 - 【請求項２】 配列表の配列番号：２に記載の塩基配列
の全部又は一部からなるポリヌクレオチド、又は該ポリ
ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、ダニア
レルゲン活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオ
チド。 - 【請求項３】 配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸
配列、又はその一部からなるアミノ酸配列において、１
又は２以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換
の少なくとも１つを生じさせ、かつ、ダニアレルゲン活
性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 請求項１〜３いずれか１項に記載のポリ
ヌクレオチドにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド
であって、かつ、ダニアレルゲン活性を有する蛋白質を
コードするポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のポ
リヌクレオチドを含む発現ベクター。 - 【請求項６】 請求項５記載の発現ベクターから発現さ
れる組換えダニアレルゲン。 - 【請求項７】 該組換えダニアレルゲンが他の蛋白質と
の融合蛋白質である請求項６記載の組換えダニアレルゲ
ン。 - 【請求項８】 請求項５記載の発現ベクターで形質転換
された細菌、酵母又は動物細胞。 - 【請求項９】 請求項８記載の細菌、酵母又は動物細胞
を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、組換えダニ
アレルゲンを産生させ、次いで該組換えダニアレルゲン
を回収することを特徴とする組換えダニアレルゲンの製
造方法。 - 【請求項１０】 請求項８記載の細菌、酵母又は動物細
胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、融合組換
えダニアレルゲンを産生させ、該融合組換えダニアレル
ゲンを回収し、次いで、融合している他の蛋白質を脱離
せしめることを特徴とする組換えダニアレルゲンの製造
方法。 - 【請求項１１】 請求項６又は７いずれかに記載の組換
えダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患
治療剤。 - 【請求項１２】 請求項６又は７いずれかに記載の組換
えダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患
診断薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8255401A JPH1075783A (ja) | 1996-09-04 | 1996-09-04 | 組換えダニアレルゲン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8255401A JPH1075783A (ja) | 1996-09-04 | 1996-09-04 | 組換えダニアレルゲン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1075783A true JPH1075783A (ja) | 1998-03-24 |
Family
ID=17278259
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8255401A Pending JPH1075783A (ja) | 1996-09-04 | 1996-09-04 | 組換えダニアレルゲン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1075783A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT501101A1 (de) * | 2004-12-02 | 2006-06-15 | Biomay Prod & Handel | Allergie-immuntherapie |
-
1996
- 1996-09-04 JP JP8255401A patent/JPH1075783A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT501101A1 (de) * | 2004-12-02 | 2006-06-15 | Biomay Prod & Handel | Allergie-immuntherapie |
| AT501101B1 (de) * | 2004-12-02 | 2008-01-15 | Biomay Ag | Protein-allergen-derivat |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050802 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20051202 |