JPH04293482A - スーパーオキシドジスムターゼとＦｃの複合体 - Google Patents
スーパーオキシドジスムターゼとＦｃの複合体Info
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- JPH04293482A JPH04293482A JP3080381A JP8038191A JPH04293482A JP H04293482 A JPH04293482 A JP H04293482A JP 3080381 A JP3080381 A JP 3080381A JP 8038191 A JP8038191 A JP 8038191A JP H04293482 A JPH04293482 A JP H04293482A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血中で長い半減期を有
することを特徴とするスーパーオキシドジスムターゼに
関し、さらに詳しくは、スーパーオキシド（Ｏ２ −
）による生体組織障害の治療に有用な、Ｆｃ断片を結合
することによるスーパーオキシドジスムターゼの血中持
続性の改良に関する。
することを特徴とするスーパーオキシドジスムターゼに
関し、さらに詳しくは、スーパーオキシド（Ｏ２ −
）による生体組織障害の治療に有用な、Ｆｃ断片を結合
することによるスーパーオキシドジスムターゼの血中持
続性の改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】スーパーオキシドジスムターゼ（以下Ｓ
ＯＤと略記することがある）は、生体内で発生するスー
パーオキシド（Ｏ２ − ）を消失させる酵素である。 Ｏ２ − は生体組織に対して毒性が極めて強く、ＳＯ
ＤはＯ２ − が要因となっている各種の組織障害（例
えば、変形性関節炎、慢性関節リウマチ、放射線照射に
よる障害、紫外線による障害、未熟児酸素症、虚血性疾
患症、心筋梗塞など）に対する有効な治療薬としての使
用が可能である。このようにＳＯＤは医薬品として非常
に有望であるが、ＳＯＤを静脈投与すると血中半減期が
短く（約５分）、速やかに代謝されるという欠点がある
。そのために静脈投与ではＳＯＤの薬理効果が充分に発
揮されない場合が多い。
ＯＤと略記することがある）は、生体内で発生するスー
パーオキシド（Ｏ２ − ）を消失させる酵素である。 Ｏ２ − は生体組織に対して毒性が極めて強く、ＳＯ
ＤはＯ２ − が要因となっている各種の組織障害（例
えば、変形性関節炎、慢性関節リウマチ、放射線照射に
よる障害、紫外線による障害、未熟児酸素症、虚血性疾
患症、心筋梗塞など）に対する有効な治療薬としての使
用が可能である。このようにＳＯＤは医薬品として非常
に有望であるが、ＳＯＤを静脈投与すると血中半減期が
短く（約５分）、速やかに代謝されるという欠点がある
。そのために静脈投与ではＳＯＤの薬理効果が充分に発
揮されない場合が多い。
【０００３】ＳＯＤの血中半減期の短さを改良するため
、これまでに様々な試みがなされてきた。例えば、ＳＯ
Ｄに疎水性有機酸を結合し、血中でアルブミンに結合さ
せて腎からの排泄を遅らせたもの〔特開昭６３−２１１
２３８号公報、井上正康ら：フリーラジカルの臨床，日
本医学館，Ｖｏｌ．２，８３（１９８７）、井上正康ら
：ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ Ｖｏｌ． ４，Ｎｏ．
４，３０２（１９８７）〕、ＳＯＤにポリエチレングリ
コール〔Ｐｙａｔａｋ， Ｐ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．
：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉ
ｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２９，Ｎｏ．
１，１１３（１９８０）〕やフィコール〔Ｐｅｔｒｏ
ｎｅ， Ｗ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． ：Ｐｒｏｃｅｅｄ
ｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆＡｍｅｒｉｃａ， Ｖｏｌ．
７７，Ｎｏ． ２，１１５９（１９８０）〕のような高
分子をつけて、巨大分子化して腎からの排泄を遅らせた
ものなどが知られている。
、これまでに様々な試みがなされてきた。例えば、ＳＯ
Ｄに疎水性有機酸を結合し、血中でアルブミンに結合さ
せて腎からの排泄を遅らせたもの〔特開昭６３−２１１
２３８号公報、井上正康ら：フリーラジカルの臨床，日
本医学館，Ｖｏｌ．２，８３（１９８７）、井上正康ら
：ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ Ｖｏｌ． ４，Ｎｏ．
４，３０２（１９８７）〕、ＳＯＤにポリエチレングリ
コール〔Ｐｙａｔａｋ， Ｐ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．
：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉ
ｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２９，Ｎｏ．
１，１１３（１９８０）〕やフィコール〔Ｐｅｔｒｏ
ｎｅ， Ｗ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． ：Ｐｒｏｃｅｅｄ
ｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆＡｍｅｒｉｃａ， Ｖｏｌ．
７７，Ｎｏ． ２，１１５９（１９８０）〕のような高
分子をつけて、巨大分子化して腎からの排泄を遅らせた
ものなどが知られている。
【０００４】しかしながら、ポリエチレングリコールや
フィコールを用いて修飾したものでは、活性保持率が（
ＳＯＤと比較して）５０％以下に低下する。また、上記
いずれの場合でも、ＳＯＤに結合した修飾物はヒトの体
内には存在しない物質を用いているので、安全性に問題
を残している。かかる観点から、ヒトの生体成分をＳＯ
Ｄに結合させて安全性の高い安定化されたＳＯＤを提供
する提案もなされている。そのようなものとしては、例
えばヒトの血漿蛋白質をＳＯＤと結合させたもの（特開
平１−２６９４９０号公報）などがある。しかし、ラッ
トにおける血中持続性はまだ不充分であるし、分子量が
大きくなりすぎるため、組織への浸透性が悪くなる可能
性がある。いずれにしても、必ずしも医薬品として実用
的手法とは言いがたい。
フィコールを用いて修飾したものでは、活性保持率が（
ＳＯＤと比較して）５０％以下に低下する。また、上記
いずれの場合でも、ＳＯＤに結合した修飾物はヒトの体
内には存在しない物質を用いているので、安全性に問題
を残している。かかる観点から、ヒトの生体成分をＳＯ
Ｄに結合させて安全性の高い安定化されたＳＯＤを提供
する提案もなされている。そのようなものとしては、例
えばヒトの血漿蛋白質をＳＯＤと結合させたもの（特開
平１−２６９４９０号公報）などがある。しかし、ラッ
トにおける血中持続性はまだ不充分であるし、分子量が
大きくなりすぎるため、組織への浸透性が悪くなる可能
性がある。いずれにしても、必ずしも医薬品として実用
的手法とは言いがたい。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、血中
で長い半減期を有することを特徴とするＳＯＤを提供す
ることにある。本発明の他の目的は、生体内の酸素分子
から発生したＯ２ − による生体組織障害の治療に有
用で、なおかつ、安全性、抗原性および活性保持率いず
れにおいても充分に満足のいくＳＯＤを提供することに
ある。
で長い半減期を有することを特徴とするＳＯＤを提供す
ることにある。本発明の他の目的は、生体内の酸素分子
から発生したＯ２ − による生体組織障害の治療に有
用で、なおかつ、安全性、抗原性および活性保持率いず
れにおいても充分に満足のいくＳＯＤを提供することに
ある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、スーパーオキ
シドジスムターゼと免疫グロブリンのＦｃ断片との複合
体である。スーパーオキシドジスムターゼは、分子量約
３２，０００と小さいため、血中に投与しても速やかに
腎から排泄されてしまう。一方、免疫グロブリンの血中
半減期は、約２０日と非常に長い。ＩｇＧをＦａｂ断片
とＦｃ断片に分離し、それぞれの血中半減期を調べると
、Ｆａｂ断片が数時間なのに対し、Ｆｃ断片は４３〜１
００時間もある。従って、免疫グロブリンの血中半減期
の長さを決定している要因は、Ｆｃ断片にあると考えら
れる。そこで、本発明者らは、ＳＯＤにＦｃ断片を結合
すれば血中半減期が顕著に延長できると考えた。
シドジスムターゼと免疫グロブリンのＦｃ断片との複合
体である。スーパーオキシドジスムターゼは、分子量約
３２，０００と小さいため、血中に投与しても速やかに
腎から排泄されてしまう。一方、免疫グロブリンの血中
半減期は、約２０日と非常に長い。ＩｇＧをＦａｂ断片
とＦｃ断片に分離し、それぞれの血中半減期を調べると
、Ｆａｂ断片が数時間なのに対し、Ｆｃ断片は４３〜１
００時間もある。従って、免疫グロブリンの血中半減期
の長さを決定している要因は、Ｆｃ断片にあると考えら
れる。そこで、本発明者らは、ＳＯＤにＦｃ断片を結合
すれば血中半減期が顕著に延長できると考えた。
【０００７】本発明でＦｃ断片の結合に使用されるＳＯ
Ｄとしては、種々の起源に由来するＳＯＤが挙げられる
。例えば、ヒトＳＯＤ、遺伝子組み換え技術によって製
造されたＳＯＤ、あるいは動物、例えばウシや植物、微
生物中に含まれているＳＯＤなどが使用できる。また、
哺乳類の細胞質に存在するＣｕ・Ｚｎ−ＳＯＤ、哺乳類
のミトコンドリアに存在するＭｎ−ＳＯＤ、バクテリア
に存在するＦｅ−ＳＯＤのいずれも使用可能である。こ
れらのうち、ヒトに対する医薬製剤としての抗原性をな
くすため、ヒトＳＯＤおよび遺伝子組み換え技術によっ
て製造されるヒトＳＯＤが好ましく使用される。 また、Ｍｎ−ＳＯＤは細胞親和性が少ないため一般に良
い薬効成績が得られにくく、バクテリアに存在するＦｅ
−ＳＯＤは抗原性が問題になるので、Ｃｕ・Ｚｎ−ＳＯ
Ｄが好ましく使用される。
Ｄとしては、種々の起源に由来するＳＯＤが挙げられる
。例えば、ヒトＳＯＤ、遺伝子組み換え技術によって製
造されたＳＯＤ、あるいは動物、例えばウシや植物、微
生物中に含まれているＳＯＤなどが使用できる。また、
哺乳類の細胞質に存在するＣｕ・Ｚｎ−ＳＯＤ、哺乳類
のミトコンドリアに存在するＭｎ−ＳＯＤ、バクテリア
に存在するＦｅ−ＳＯＤのいずれも使用可能である。こ
れらのうち、ヒトに対する医薬製剤としての抗原性をな
くすため、ヒトＳＯＤおよび遺伝子組み換え技術によっ
て製造されるヒトＳＯＤが好ましく使用される。 また、Ｍｎ−ＳＯＤは細胞親和性が少ないため一般に良
い薬効成績が得られにくく、バクテリアに存在するＦｅ
−ＳＯＤは抗原性が問題になるので、Ｃｕ・Ｚｎ−ＳＯ
Ｄが好ましく使用される。
【０００８】また、本発明で使用されるＦｃ断片も、人
体への投与から考えてヒト由来の免疫グロブリンのＦｃ
を使用する。例えば、ＩｇＧ１、２、３、４、ＩｇＡ１
、２、ＩｇＭなどの免疫グロブリンのＦｃ断片が使用可
能である。
体への投与から考えてヒト由来の免疫グロブリンのＦｃ
を使用する。例えば、ＩｇＧ１、２、３、４、ＩｇＡ１
、２、ＩｇＭなどの免疫グロブリンのＦｃ断片が使用可
能である。
【０００９】ＳＯＤは、２つの相同なサブユニットから
なっている。サブユニット間はジスルフィド結合ではな
く、疎水結合により非常に強く結合している。ＳＯＤは
、温和な条件下で化学修飾可能なアミノ酸残基を分子内
に多く含有している。例えば、ヒト赤血球型ＳＯＤは、
１分子当たりチオール基を４個、アミノ基を４４個もっ
ており、Ｆｃ断片を結合するのに利用することができる
。また、ＩｇＧのＦｃ断片は、分子量約５０，０００で
、２つの相同なサブユニットからなる。サブユニット間
は２つのジスルフィド結合により結合しており、また、
各サブユニット中に１つずつジスルフィド結合がある。 これらのジスルフィド結合を還元して遊離チオール基に
すれば、これを利用してＳＯＤと結合することができる
。
なっている。サブユニット間はジスルフィド結合ではな
く、疎水結合により非常に強く結合している。ＳＯＤは
、温和な条件下で化学修飾可能なアミノ酸残基を分子内
に多く含有している。例えば、ヒト赤血球型ＳＯＤは、
１分子当たりチオール基を４個、アミノ基を４４個もっ
ており、Ｆｃ断片を結合するのに利用することができる
。また、ＩｇＧのＦｃ断片は、分子量約５０，０００で
、２つの相同なサブユニットからなる。サブユニット間
は２つのジスルフィド結合により結合しており、また、
各サブユニット中に１つずつジスルフィド結合がある。 これらのジスルフィド結合を還元して遊離チオール基に
すれば、これを利用してＳＯＤと結合することができる
。
【００１０】本発明のＳＯＤとＦｃ断片との複合体は、
ＳＯＤとＦｃ断片との間に架橋を生成させて製造される
。タンパク質同士を架橋するための架橋剤としては、従
来、グルタルアルデヒドのような対称二価架橋剤が使用
されてきたが、この架橋剤はタンパク質の種々の側鎖と
複雑な反応を行うので、例えばＳＯＤ分子内、ＳＯＤ分
子間またはＦｃ分子内、Ｆｃ分子間の架橋ができてしま
い、目的とするＳＯＤとＦｃとの複合体以外に余分な複
合体ができてしまうという欠点がある。
ＳＯＤとＦｃ断片との間に架橋を生成させて製造される
。タンパク質同士を架橋するための架橋剤としては、従
来、グルタルアルデヒドのような対称二価架橋剤が使用
されてきたが、この架橋剤はタンパク質の種々の側鎖と
複雑な反応を行うので、例えばＳＯＤ分子内、ＳＯＤ分
子間またはＦｃ分子内、Ｆｃ分子間の架橋ができてしま
い、目的とするＳＯＤとＦｃとの複合体以外に余分な複
合体ができてしまうという欠点がある。
【００１１】そこで本発明のＳＯＤとＦｃ断片との複合
体は、ＳＯＤの反応基、ＮＨ２ 基に対して架橋剤Ｘを
、ＳＨ基に対して架橋剤Ｙを結合させ、一方Ｆｃ断片は
還元剤でＳＨ基を露出させる。その後、架橋剤Ｘまたは
Ｙを結合させたＳＯＤとＳＨ基を露出させたＦｃ断片を
混合して、ＳＯＤとＦｃ断片とを架橋剤ＸまたはＹを介
して共有結合させる。この場合、すべての反応がおだや
かな条件下（例えば、室温、中性付近のｐＨ）で行われ
ることは、ＳＯＤなどのタンパク質の安定性から考えて
も必要である。
体は、ＳＯＤの反応基、ＮＨ２ 基に対して架橋剤Ｘを
、ＳＨ基に対して架橋剤Ｙを結合させ、一方Ｆｃ断片は
還元剤でＳＨ基を露出させる。その後、架橋剤Ｘまたは
Ｙを結合させたＳＯＤとＳＨ基を露出させたＦｃ断片を
混合して、ＳＯＤとＦｃ断片とを架橋剤ＸまたはＹを介
して共有結合させる。この場合、すべての反応がおだや
かな条件下（例えば、室温、中性付近のｐＨ）で行われ
ることは、ＳＯＤなどのタンパク質の安定性から考えて
も必要である。
【００１２】架橋剤Ｘは、ＳＯＤのＮＨ２ 基とＦｃ断
片のＳＨ基を架橋する化合物であり、Ｒ１ −Ａ−Ｒ２
で表される。ここで、Ｒ１ はアミノ基と反応する１
価の活性基で、Ｒ１ としては例えば下記式（Ｉ）、（
ＩＩＩ） または（ＩＶ）
片のＳＨ基を架橋する化合物であり、Ｒ１ −Ａ−Ｒ２
で表される。ここで、Ｒ１ はアミノ基と反応する１
価の活性基で、Ｒ１ としては例えば下記式（Ｉ）、（
ＩＩＩ） または（ＩＶ）
【化３】
【化４】
【化５】
で表される基が挙げられ、このなかでアミノ基に対する
特異性、温和な反応条件を特徴とする上記式（Ｉ）で表
される基が好ましく使用される。
特異性、温和な反応条件を特徴とする上記式（Ｉ）で表
される基が好ましく使用される。
【００１３】また、Ｒ２ はチオール基に反応する１価
の活性基であり、かかる基としては、例えば下記式（Ｉ
Ｉ） または（Ｖ） 〜（ＶＩＩＩ）
の活性基であり、かかる基としては、例えば下記式（Ｉ
Ｉ） または（Ｖ） 〜（ＶＩＩＩ）
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
で表される基が挙げられ、これらのうち、ＳＨ基に対す
る特異性、温和な反応条件を特徴とする上記式（ＩＩ）
で表される基が好ましく使用される。
る特異性、温和な反応条件を特徴とする上記式（ＩＩ）
で表される基が好ましく使用される。
【００１４】また、Ａは２価の有機基であり、この例と
しては、例えば−（ＣＨ２ ）ｎ −（ただし、ｎは１
〜１０の整数）、ｐ−フェニレン基、ｍ−フェニレン基
が挙げられる。
しては、例えば−（ＣＨ２ ）ｎ −（ただし、ｎは１
〜１０の整数）、ｐ−フェニレン基、ｍ−フェニレン基
が挙げられる。
【００１５】また、架橋剤ＹはＳＯＤのチオール基とＦ
ｃ断片のチオール基を架橋する化合物であり、Ｒ３ −
Ｂ−Ｒ４ で表される。ここでＲ３ およびＲ４ はチ
オール基に反応する１価の活性基であり、これらの基と
しては上記基Ｒ２ として挙げられた基が挙げられ、Ｒ
２ と同様に上記式（ＩＩ） で表される基が好ましく
使用される。ＢはＡと同様に２価の有機基であり、この
例としては上記基Ａとして挙げられた基が挙げられる。
ｃ断片のチオール基を架橋する化合物であり、Ｒ３ −
Ｂ−Ｒ４ で表される。ここでＲ３ およびＲ４ はチ
オール基に反応する１価の活性基であり、これらの基と
しては上記基Ｒ２ として挙げられた基が挙げられ、Ｒ
２ と同様に上記式（ＩＩ） で表される基が好ましく
使用される。ＢはＡと同様に２価の有機基であり、この
例としては上記基Ａとして挙げられた基が挙げられる。
【００１６】ＳＯＤとＦｃ断片との反応に際しては、ｐ
Ｈ５〜９、望ましくはｐＨ７に調整した緩衝液にＳＯＤ
を５〜１０ｍｇ／ｍｌに溶解した後、Ｎ−スクシニミジ
ル−４−（Ｎ−マレイミド）ブチレート（以下ＳＭＢＵ
と略す）などの架橋剤をＳＯＤ１モルに対し１〜１００
倍モル添加し、反応させ、ＳＯＤ１分子当たり、０．５
〜５個の活性基を導入する。一方、Ｆｃ断片は、還元剤
によりＳＨ基を露出させ、活性基を導入したＳＯＤ１モ
ルに対し０．５〜１０倍モル、望ましくはＳＯＤ：Ｆｃ
＝１：１になるように加え、反応させ、ＳＯＤとＦｃの
複合体を作成する。
Ｈ５〜９、望ましくはｐＨ７に調整した緩衝液にＳＯＤ
を５〜１０ｍｇ／ｍｌに溶解した後、Ｎ−スクシニミジ
ル−４−（Ｎ−マレイミド）ブチレート（以下ＳＭＢＵ
と略す）などの架橋剤をＳＯＤ１モルに対し１〜１００
倍モル添加し、反応させ、ＳＯＤ１分子当たり、０．５
〜５個の活性基を導入する。一方、Ｆｃ断片は、還元剤
によりＳＨ基を露出させ、活性基を導入したＳＯＤ１モ
ルに対し０．５〜１０倍モル、望ましくはＳＯＤ：Ｆｃ
＝１：１になるように加え、反応させ、ＳＯＤとＦｃの
複合体を作成する。
【００１７】本発明のＳＯＤとＦｃ断片との複合体は架
橋剤を用いずに、例えば遺伝子組み換え技術を用いても
作成することが可能である。例えばＤＮＡレベルでＳＯ
ＤとＦｃを結合させ、大腸菌または動物細胞などで発現
させれば、ＳＯＤとＦｃの融合タンパクを得ることがで
きる。このＳＯＤとＦｃの融合タンパクが本発明で述べ
るＳＯＤとＦｃ断片の複合体の特徴をもつことは容易に
推測される。
橋剤を用いずに、例えば遺伝子組み換え技術を用いても
作成することが可能である。例えばＤＮＡレベルでＳＯ
ＤとＦｃを結合させ、大腸菌または動物細胞などで発現
させれば、ＳＯＤとＦｃの融合タンパクを得ることがで
きる。このＳＯＤとＦｃの融合タンパクが本発明で述べ
るＳＯＤとＦｃ断片の複合体の特徴をもつことは容易に
推測される。
【００１８】
【実施例】以下実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説
明する。 参考例１ （１）Ｆｃ断片の精製 ヒトＩｇＧ９００ｍｇを含む０．０２Ｍ のナトリウム
リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）９０ｍｌに、１．８ｍｌの
１００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液、４．５ｍｌの０．２５Ｍ
Ｌ−システイン・ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）、９ｍｌ
の１ｍｇ／ｍｌパパイン溶液を順次添加し３７℃で１時
間反応を行った。反応終了後、反応液をプロテインＡ−
セファロースカラム（ファルマシア社製）に通し蒸留水
で溶出してくる画分を集めた。集めた画分を限外濾過で
濃縮後、セファデックス Ｇ１５０（ｆｉｎｅ）カラ
ム（ファルマシア社製）に通し分子量約５万のピークを
集め、１．５ｍｇ／ｍｌのＦｃ断片２０ｍｌを得た。こ
のＦｃ断片をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で解
析した結果、１つのバンドとして認められた。
明する。 参考例１ （１）Ｆｃ断片の精製 ヒトＩｇＧ９００ｍｇを含む０．０２Ｍ のナトリウム
リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）９０ｍｌに、１．８ｍｌの
１００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液、４．５ｍｌの０．２５Ｍ
Ｌ−システイン・ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）、９ｍｌ
の１ｍｇ／ｍｌパパイン溶液を順次添加し３７℃で１時
間反応を行った。反応終了後、反応液をプロテインＡ−
セファロースカラム（ファルマシア社製）に通し蒸留水
で溶出してくる画分を集めた。集めた画分を限外濾過で
濃縮後、セファデックス Ｇ１５０（ｆｉｎｅ）カラ
ム（ファルマシア社製）に通し分子量約５万のピークを
集め、１．５ｍｇ／ｍｌのＦｃ断片２０ｍｌを得た。こ
のＦｃ断片をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で解
析した結果、１つのバンドとして認められた。
【００１９】（２）Ｆｃ断片のジスルフィド結合の還元
Ｆｃ断片５４ｍｇを含む０．１４５Ｍ ＮａＣｌ−０．
１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下ＰＢＳと略す
）４．５ｍｌに最終濃度が５０ｍＭになるように２−メ
ルカプトエタノールを加え、３７℃で１時間反応を行っ
た。反応終了後、１ｍＭ ＥＤＴＡと０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌを含むナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（以
下Ｐ−Ｂｕｆｆｅｒと略す）で平衡化したセファデック
ス Ｇ２５（ファルマシア社製）に通し、２−メルカ
プトエタノールを除き、ジスルフィド結合が還元された
Ｆｃ断片を得た。このＦｃ断片の溶液に０．１Ｍ Ｔｒ
ｉｓ・ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液（ｐＨ
８．２）（以下Ｔ−Ｂｕｆｆｅｒと略す）で０．２ｍＭ
になるように溶解した５，５′−ジチオビス（２−ニト
ロ安息香酸）（以下ＤＴＮＢと略す）を等量加え、室温
で２０分放置し発色させた後、４１２ｎｍの吸光度を測
定し、チオール基のモル濃度を求めた。その結果、Ｆｃ
１分子当たりにチオール基が２．７９個であった。理論
的にはＦｃ１分子当たりにペプチド鎖間ジスルフィド結
合が４個あるはずであり、以上に述べた反応条件では、
そのうち２．７９個分が還元されたということになる。
Ｆｃ断片５４ｍｇを含む０．１４５Ｍ ＮａＣｌ−０．
１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下ＰＢＳと略す
）４．５ｍｌに最終濃度が５０ｍＭになるように２−メ
ルカプトエタノールを加え、３７℃で１時間反応を行っ
た。反応終了後、１ｍＭ ＥＤＴＡと０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌを含むナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（以
下Ｐ−Ｂｕｆｆｅｒと略す）で平衡化したセファデック
ス Ｇ２５（ファルマシア社製）に通し、２−メルカ
プトエタノールを除き、ジスルフィド結合が還元された
Ｆｃ断片を得た。このＦｃ断片の溶液に０．１Ｍ Ｔｒ
ｉｓ・ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液（ｐＨ
８．２）（以下Ｔ−Ｂｕｆｆｅｒと略す）で０．２ｍＭ
になるように溶解した５，５′−ジチオビス（２−ニト
ロ安息香酸）（以下ＤＴＮＢと略す）を等量加え、室温
で２０分放置し発色させた後、４１２ｎｍの吸光度を測
定し、チオール基のモル濃度を求めた。その結果、Ｆｃ
１分子当たりにチオール基が２．７９個であった。理論
的にはＦｃ１分子当たりにペプチド鎖間ジスルフィド結
合が４個あるはずであり、以上に述べた反応条件では、
そのうち２．７９個分が還元されたということになる。
【００２０】参考例２
（１）ＳＯＤとＳＭＢＵの結合
ウシ赤血球由来のＣｕ・Ｚｎ−ＳＯＤ３５ｍｇを含むＰ
−Ｂｕｆｆｅｒ５ｍｌに、０．１Ｍ の濃度でエタノー
ルに溶解したＮ−エチルマレイミド３０μｌを添加し、
室温で３０分反応を行い、遊離チオール基をブロックし
た。その後Ｐ−Ｂｕｆｆｅｒで平衡化したセファデック
ス Ｇ２５に通し、未反応のＮ−エチルマレイミドを
除き、４．９ｍｇ／ｍｌの濃度でＰ−Ｂｕｆｆｅｒに溶
解したＳＯＤ溶液５．２ｍｌ回収した。次に、ジメチル
ホルムアミドに２２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したＳＭ
ＢＵを、ＳＭＢＵとＳＯＤのモル比が１０：１になるよ
うに添加し、室温で１時間反応を行った。その後Ｐ−Ｂ
ｕｆｆｅｒで平衡化したセファデックス Ｇ２５を通
し未反応のＳＭＢＵを除き、５．６ｍｇ／ｍｌの濃度で
Ｐ−Ｂｕｆｆｅｒに溶解したＳＯＤとＳＭＢＵの結合体
６ｍｌを回収した。
−Ｂｕｆｆｅｒ５ｍｌに、０．１Ｍ の濃度でエタノー
ルに溶解したＮ−エチルマレイミド３０μｌを添加し、
室温で３０分反応を行い、遊離チオール基をブロックし
た。その後Ｐ−Ｂｕｆｆｅｒで平衡化したセファデック
ス Ｇ２５に通し、未反応のＮ−エチルマレイミドを
除き、４．９ｍｇ／ｍｌの濃度でＰ−Ｂｕｆｆｅｒに溶
解したＳＯＤ溶液５．２ｍｌ回収した。次に、ジメチル
ホルムアミドに２２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したＳＭ
ＢＵを、ＳＭＢＵとＳＯＤのモル比が１０：１になるよ
うに添加し、室温で１時間反応を行った。その後Ｐ−Ｂ
ｕｆｆｅｒで平衡化したセファデックス Ｇ２５を通
し未反応のＳＭＢＵを除き、５．６ｍｇ／ｍｌの濃度で
Ｐ−Ｂｕｆｆｅｒに溶解したＳＯＤとＳＭＢＵの結合体
６ｍｌを回収した。
【００２１】ＳＭＢＵは両末端に活性基をもつ架橋剤で
、１つはアミノ基ともう１つはチオール基と反応するこ
とができる。つまり、ＳＯＤのアミノ基に結合したＳＭ
ＢＵは、チオール基と反応しうる活性基をもっているこ
とになる。そこで、適当に希釈した２−メルカプトエタ
ノールのチオール基とＳＯＤに結合したＳＭＢＵの活性
基を反応させ、２−メルカプトエタノールのチオール基
の減少を定量すればＳＯＤ１分子当たりに結合したＳＭ
ＢＵ分子の数を求めることができる。ＳＯＤとＳＭＢＵ
の結合体を含む溶液と０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭＥＤ
ＴＡを含む緩衝液（ｐＨ５．５）（以下Ｎ−Ｂｕｆｆｅ
ｒと略す）で適当に希釈した２−メルカプトエタノール
を混合し、室温で２０分反応させた。その後、Ｔ−Ｂｕ
ｆｆｅｒに０．２ｍＭになるように溶解したＤＴＮＢを
加え、室温で２０分放置し発色させた後、４１２ｎｍの
吸光度を測定し、チオール基のモル濃度を求めた。以上
のように定量した結果、ＳＯＤ１分子当たりＳＭＢＵ分
子の数は３個であった。
、１つはアミノ基ともう１つはチオール基と反応するこ
とができる。つまり、ＳＯＤのアミノ基に結合したＳＭ
ＢＵは、チオール基と反応しうる活性基をもっているこ
とになる。そこで、適当に希釈した２−メルカプトエタ
ノールのチオール基とＳＯＤに結合したＳＭＢＵの活性
基を反応させ、２−メルカプトエタノールのチオール基
の減少を定量すればＳＯＤ１分子当たりに結合したＳＭ
ＢＵ分子の数を求めることができる。ＳＯＤとＳＭＢＵ
の結合体を含む溶液と０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭＥＤ
ＴＡを含む緩衝液（ｐＨ５．５）（以下Ｎ−Ｂｕｆｆｅ
ｒと略す）で適当に希釈した２−メルカプトエタノール
を混合し、室温で２０分反応させた。その後、Ｔ−Ｂｕ
ｆｆｅｒに０．２ｍＭになるように溶解したＤＴＮＢを
加え、室温で２０分放置し発色させた後、４１２ｎｍの
吸光度を測定し、チオール基のモル濃度を求めた。以上
のように定量した結果、ＳＯＤ１分子当たりＳＭＢＵ分
子の数は３個であった。
【００２２】（２）ＳＯＤとＢＭＨの結合ウシ赤血球由
来のＣｕ・Ｚｎ−ＳＯＤ２０ｍｇを含むＰ−Ｂｕｆｆｅ
ｒ２ｍｌに最終濃度が０．１Ｍ になるように２−メル
カプトエタノールを添加し、３７℃で１時間反応を行っ
た。その後Ｐ−Ｂｕｆｆｅｒで平衡化したセファデック
ス Ｇ２５に通し２−メルカプトエタノールを除き、
５．５ｍｇ／ｍｌの濃度でＰ−Ｂｕｆｆｅｒに溶解した
ＳＯＤ溶液を３ｍｌ回収した。このＳＯＤ溶液のチオー
ル基を参考例１（２）と同様にＤＴＮＢを用いて定量す
るとＳＯＤ１分子当たり１．２７個であった。
来のＣｕ・Ｚｎ−ＳＯＤ２０ｍｇを含むＰ−Ｂｕｆｆｅ
ｒ２ｍｌに最終濃度が０．１Ｍ になるように２−メル
カプトエタノールを添加し、３７℃で１時間反応を行っ
た。その後Ｐ−Ｂｕｆｆｅｒで平衡化したセファデック
ス Ｇ２５に通し２−メルカプトエタノールを除き、
５．５ｍｇ／ｍｌの濃度でＰ−Ｂｕｆｆｅｒに溶解した
ＳＯＤ溶液を３ｍｌ回収した。このＳＯＤ溶液のチオー
ル基を参考例１（２）と同様にＤＴＮＢを用いて定量す
るとＳＯＤ１分子当たり１．２７個であった。
【００２３】次に、ジメチルホルムアミドに９．２ｍｇ
／ｍｌの濃度で溶解したビスマレイミドヘキサン（以下
ＢＭＨと略す）をＢＭＨとＳＯＤのモル比が１０：１に
なるように添加し、室温で１時間反応を行った。その後
Ｐ−Ｂｕｆｆｅｒで平衡化したセファデックス Ｇ２
５に通し、未反応のＢＭＨを除き、３．４ｍｇ／ｍｌの
濃度でＰ−Ｂｕｆｆｅｒに溶解したＳＯＤとＢＭＨの結
合体を４ｍｌ回収した。
／ｍｌの濃度で溶解したビスマレイミドヘキサン（以下
ＢＭＨと略す）をＢＭＨとＳＯＤのモル比が１０：１に
なるように添加し、室温で１時間反応を行った。その後
Ｐ−Ｂｕｆｆｅｒで平衡化したセファデックス Ｇ２
５に通し、未反応のＢＭＨを除き、３．４ｍｇ／ｍｌの
濃度でＰ−Ｂｕｆｆｅｒに溶解したＳＯＤとＢＭＨの結
合体を４ｍｌ回収した。
【００２４】実施例１（ＳＭＢＵを架橋剤としたＳＯＤ
とＦｃ断片の複合体の作成） 参考例１（２）で得られたジスルフィド結合を還元され
たＦｃ断片３５ｍｇを含むＰ−Ｂｕｆｆｅｒ５．３ｍｌ
と、参考例２（１）で得られたＳＯＤとＳＭＢＵの結合
体３０ｍｇを含むＰ−Ｂｕｆｆｅｒ５．３ｍｌを混合し
、４℃で一晩反応を行った。反応後ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で反応液を還元条件下で解析する
とＳＯＤのサブユニット１つ当たり１個のＦｃ鎖が結合
したものとＳＯＤのサブユニット１つ当たり２個のＦｃ
鎖が結合したもののバンドが観察された（図１）。
とＦｃ断片の複合体の作成） 参考例１（２）で得られたジスルフィド結合を還元され
たＦｃ断片３５ｍｇを含むＰ−Ｂｕｆｆｅｒ５．３ｍｌ
と、参考例２（１）で得られたＳＯＤとＳＭＢＵの結合
体３０ｍｇを含むＰ−Ｂｕｆｆｅｒ５．３ｍｌを混合し
、４℃で一晩反応を行った。反応後ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で反応液を還元条件下で解析する
とＳＯＤのサブユニット１つ当たり１個のＦｃ鎖が結合
したものとＳＯＤのサブユニット１つ当たり２個のＦｃ
鎖が結合したもののバンドが観察された（図１）。
【００２５】次に、反応液をＰＢＳで平衡化したセファ
デックス Ｇ１５０（ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）１６０ｍ
ｌのカラムに通し、溶出液を２．７５ｍｌずつ６０画分
集め、各画分の２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）、Ｆｃ
量、ＳＯＤ活性を測定した（図２）。Ｆｃ量の測定は酵
素免疫測定法で、ＳＯＤ活性の測定は大柳の亜硝酸法〔
蛋白質 核酸 酵素 Ｖｏｌ．３３ Ｎｏ．１６
（１９８８）２９０６〕に従って行った。２４〜２７画
分と２８〜３１画分を集め、それぞれＣｘ．１、Ｃｘ．
２とした。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よる解析の結果、Ｃｘ．１はＳＯＤ１分子に２個以上の
Ｆｃ断片が結合したもので、Ｃｘ．２はＳＯＤ１分子に
１個のＦｃ断片が結合したものであることが確認された
（図１）。ＳＯＤとＦｃ断片の複合体のＳＯＤ活性保持
率を測定したところ９０％以上であった。
デックス Ｇ１５０（ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）１６０ｍ
ｌのカラムに通し、溶出液を２．７５ｍｌずつ６０画分
集め、各画分の２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）、Ｆｃ
量、ＳＯＤ活性を測定した（図２）。Ｆｃ量の測定は酵
素免疫測定法で、ＳＯＤ活性の測定は大柳の亜硝酸法〔
蛋白質 核酸 酵素 Ｖｏｌ．３３ Ｎｏ．１６
（１９８８）２９０６〕に従って行った。２４〜２７画
分と２８〜３１画分を集め、それぞれＣｘ．１、Ｃｘ．
２とした。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よる解析の結果、Ｃｘ．１はＳＯＤ１分子に２個以上の
Ｆｃ断片が結合したもので、Ｃｘ．２はＳＯＤ１分子に
１個のＦｃ断片が結合したものであることが確認された
（図１）。ＳＯＤとＦｃ断片の複合体のＳＯＤ活性保持
率を測定したところ９０％以上であった。
【００２６】実施例２（ＢＭＨを架橋剤としたＳＯＤと
Ｆｃ断片の複合体の作成） 参考例１（２）で得られたジスルフィド結合を還元され
たＦｃ断片１５ｍｇを含むＰ−Ｂｕｆｆｅｒ４ｍｌと、
参考例２（２）で得られたＳＯＤとＢＭＨの結合体１２
ｍｇを含むＰ−Ｂｕｆｆｅｒを混合し４℃で一晩反応を
行った。反応後ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で反応液を還元条件下で解析するとＳＯＤのサブユニ
ット１つ当たり１個のＦｃ鎖が結合したもののバンドが
観察された（図３）。
Ｆｃ断片の複合体の作成） 参考例１（２）で得られたジスルフィド結合を還元され
たＦｃ断片１５ｍｇを含むＰ−Ｂｕｆｆｅｒ４ｍｌと、
参考例２（２）で得られたＳＯＤとＢＭＨの結合体１２
ｍｇを含むＰ−Ｂｕｆｆｅｒを混合し４℃で一晩反応を
行った。反応後ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で反応液を還元条件下で解析するとＳＯＤのサブユニ
ット１つ当たり１個のＦｃ鎖が結合したもののバンドが
観察された（図３）。
【００２７】次に、反応液をＰＢＳで平衡化したセファ
デックス Ｇ１５０（ｆｉｎｅ）１６０ｍｌのカラム
に通し、溶出液を２．７５ｍｌずつ６０画分集め、実施
例１同様に各画分の２８０ｎｍの吸光度、Ｆｃ量、ＳＯ
Ｄ活性を測定した（図４）。２７画分をピークとしたＳ
ＯＤとＦｃ断片の複合体が観察された。
デックス Ｇ１５０（ｆｉｎｅ）１６０ｍｌのカラム
に通し、溶出液を２．７５ｍｌずつ６０画分集め、実施
例１同様に各画分の２８０ｎｍの吸光度、Ｆｃ量、ＳＯ
Ｄ活性を測定した（図４）。２７画分をピークとしたＳ
ＯＤとＦｃ断片の複合体が観察された。
【００２８】実施例３（ＳＯＤとＦｃ断片の複合体の血
中半減期の測定） 実施例１で得られたＣｘ．１とＣｘ．２について、マウ
スにおける血中半減期を測定した。ＩＣＲマウス（オス
）３匹にＳＯＤとＦｃ断片の複合体を、ＳＯＤの蛋白質
量として０．１ｍｇ静脈注射し、その後Ｃｘ．２につい
ては直後、１５分、３０分、１時間、６時間、１日、２
日、３日後に、Ｃｘ．１については直後、３０分、２時
間、５時間、１日、３日後に、採血を行った。対照とし
て、未修飾ウシＳＯＤや未修飾ウシＳＯＤとＦｃ断片の
単なる混合物についても同様に血中半減期の測定を行っ
た。これらについては、ＳＯＤの蛋白質量として０．１
ｍｇ静脈注射後、直後、５分、１０分、２０分、４０分
後に採血を行った。採血後、血漿を分離し、血漿中のＳ
ＯＤ活性を実施例１と同様に測定した。静脈注射直後の
ＳＯＤ活性を１００％としたときのＳＯＤ活性の血中で
の減衰を示したグラフが図５である。
中半減期の測定） 実施例１で得られたＣｘ．１とＣｘ．２について、マウ
スにおける血中半減期を測定した。ＩＣＲマウス（オス
）３匹にＳＯＤとＦｃ断片の複合体を、ＳＯＤの蛋白質
量として０．１ｍｇ静脈注射し、その後Ｃｘ．２につい
ては直後、１５分、３０分、１時間、６時間、１日、２
日、３日後に、Ｃｘ．１については直後、３０分、２時
間、５時間、１日、３日後に、採血を行った。対照とし
て、未修飾ウシＳＯＤや未修飾ウシＳＯＤとＦｃ断片の
単なる混合物についても同様に血中半減期の測定を行っ
た。これらについては、ＳＯＤの蛋白質量として０．１
ｍｇ静脈注射後、直後、５分、１０分、２０分、４０分
後に採血を行った。採血後、血漿を分離し、血漿中のＳ
ＯＤ活性を実施例１と同様に測定した。静脈注射直後の
ＳＯＤ活性を１００％としたときのＳＯＤ活性の血中で
の減衰を示したグラフが図５である。
【００２９】図５中、曲線〔ＳＯＤ−（Ｆｃ）ｘ 〕は
Ｃｘ．１のＳＯＤ活性の減衰を、曲線（ＳＯＤ−Ｆｃ）
はＣｘ．２のＳＯＤ活性の減衰を、曲線ＳＯＤは未修飾
のＳＯＤの活性の減衰を、曲線（ＳＯＤ＋Ｆｃ）はＳＯ
ＤとＦｃ断片の単なる混合物のＳＯＤ活性の減衰を示す
。 これらの試料の血中半減期をＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｍａ
ｒｑｕａｒｄｔ ｍｅｔｈｏｄにより計算したものを
表１に示す。
Ｃｘ．１のＳＯＤ活性の減衰を、曲線（ＳＯＤ−Ｆｃ）
はＣｘ．２のＳＯＤ活性の減衰を、曲線ＳＯＤは未修飾
のＳＯＤの活性の減衰を、曲線（ＳＯＤ＋Ｆｃ）はＳＯ
ＤとＦｃ断片の単なる混合物のＳＯＤ活性の減衰を示す
。 これらの試料の血中半減期をＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｍａ
ｒｑｕａｒｄｔ ｍｅｔｈｏｄにより計算したものを
表１に示す。
【００３０】
【表１】
以上の結果から、ＳＯＤとＦｃ断片の複合体は血中
半減期が未修飾ウシＳＯＤと比較して９０〜１３０倍に
増加していることがわかる。
半減期が未修飾ウシＳＯＤと比較して９０〜１３０倍に
増加していることがわかる。
【００３１】実施例４（マウスパラコート中毒を用いた
ＳＯＤとＦｃ断片の複合体の薬理活性）パラコートは体
内に入るとパラコートカチオンラジカルとなり、これが
Ｏ２と反応してスーパーオキシド（Ｏ２ − ）を生じ
る。パラコートをマウスの腹腔内に投与すると、このＯ
２ − が組織細胞を破壊し、血中のグルタミン酸−オ
キサロ酢酸トランスアミナーゼ（以下ＧＯＴと略す）の
活性が通常の５〜１０倍上昇することが知られている。 そこでＳＯＤとＦｃ断片の複合体の血中投与により、こ
のパラコートによる血中ＧＯＴ活性の上昇が抑制される
かについて実験を行った。薬理活性を評価する試料とし
て、実施例１で得られたＣｘ．１とＣｘ．２を混合した
ものを用いた。
ＳＯＤとＦｃ断片の複合体の薬理活性）パラコートは体
内に入るとパラコートカチオンラジカルとなり、これが
Ｏ２と反応してスーパーオキシド（Ｏ２ − ）を生じ
る。パラコートをマウスの腹腔内に投与すると、このＯ
２ − が組織細胞を破壊し、血中のグルタミン酸−オ
キサロ酢酸トランスアミナーゼ（以下ＧＯＴと略す）の
活性が通常の５〜１０倍上昇することが知られている。 そこでＳＯＤとＦｃ断片の複合体の血中投与により、こ
のパラコートによる血中ＧＯＴ活性の上昇が抑制される
かについて実験を行った。薬理活性を評価する試料とし
て、実施例１で得られたＣｘ．１とＣｘ．２を混合した
ものを用いた。
【００３２】ＩＣＲマウス（オス）６匹にＳＯＤとＦｃ
断片の複合体を、ＳＯＤの蛋白質量として５ｍｇ／ｋｇ
静脈注射し、１５分後にパラコート（和光純薬社製）を
１００ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与し、その直後、２時間、４
時間、６時間後に尾から採血を行った。採血後血漿を分
離し、血漿中のＧＯＴ活性を自動分析装置により測定し
た。対照として、ＳＯＤとＦｃ断片の複合体の代わりに
ＰＢＳを０．１ｍｌ静脈注射し、１５分後にパラコート
を同量投与する群も作成した。結果を図６に示す。図６
から、ＳＯＤとＦｃ断片の複合体の投与群は対照群と比
べると明らかに血中ＧＯＴ活性の上昇を抑制しているこ
とがわかる。Ｆｃ断片を結合していないＳＯＤについて
も同様の実験を行ったが、血中ＧＯＴ活性の上昇を抑制
する効果は見られなかった。
断片の複合体を、ＳＯＤの蛋白質量として５ｍｇ／ｋｇ
静脈注射し、１５分後にパラコート（和光純薬社製）を
１００ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与し、その直後、２時間、４
時間、６時間後に尾から採血を行った。採血後血漿を分
離し、血漿中のＧＯＴ活性を自動分析装置により測定し
た。対照として、ＳＯＤとＦｃ断片の複合体の代わりに
ＰＢＳを０．１ｍｌ静脈注射し、１５分後にパラコート
を同量投与する群も作成した。結果を図６に示す。図６
から、ＳＯＤとＦｃ断片の複合体の投与群は対照群と比
べると明らかに血中ＧＯＴ活性の上昇を抑制しているこ
とがわかる。Ｆｃ断片を結合していないＳＯＤについて
も同様の実験を行ったが、血中ＧＯＴ活性の上昇を抑制
する効果は見られなかった。
【００３３】
【発明の効果】本発明によれば、血中で長い半減期を有
し、生体内の酸素分子から発生したＯ２ − による生
体組織障害の治療に有効で、かつ安全性に優れたＳＯＤ
を提供することができる。
し、生体内の酸素分子から発生したＯ２ − による生
体組織障害の治療に有効で、かつ安全性に優れたＳＯＤ
を提供することができる。
【図１】実施例１において、ＳＭＢＵを架橋剤としてＳ
ＯＤとＦｃ断片を反応させたときの反応液、Ｃｘ．１お
よびＣｘ．２の還元条件下でのＳＤＳ−アクリルアミド
ゲル電気泳動像である。
ＯＤとＦｃ断片を反応させたときの反応液、Ｃｘ．１お
よびＣｘ．２の還元条件下でのＳＤＳ−アクリルアミド
ゲル電気泳動像である。
【図２】実施例１においてＳＭＢＵを架橋剤としてＳＯ
ＤとＦｃ断片を反応させたときの反応液をセファデック
スＧ１５０でゲル濾過して得られた各画分の２８０ｎｍ
の吸光度、Ｆｃ濃度、ＳＯＤ活性を示す図である。
ＤとＦｃ断片を反応させたときの反応液をセファデック
スＧ１５０でゲル濾過して得られた各画分の２８０ｎｍ
の吸光度、Ｆｃ濃度、ＳＯＤ活性を示す図である。
【図３】実施例２においてＢＭＨを架橋剤としてＳＯＤ
とＦｃ断片を反応させたときの反応液の還元条件下での
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動像である。
とＦｃ断片を反応させたときの反応液の還元条件下での
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動像である。
【図４】実施例２においてＢＭＨを架橋剤としてＳＯＤ
とＦｃ断片を反応させたときの反応液をセファデックス
Ｇ１５０でゲル濾過して得られた各画分の２８０ｎｍの
吸光度、Ｆｃ濃度、ＳＯＤ活性を示す図である。
とＦｃ断片を反応させたときの反応液をセファデックス
Ｇ１５０でゲル濾過して得られた各画分の２８０ｎｍの
吸光度、Ｆｃ濃度、ＳＯＤ活性を示す図である。
【図５】実施例３で得られたＳＯＤとＦｃ断片の複合体
のマウスにおける血中消失曲線である。
のマウスにおける血中消失曲線である。
【図６】実施例４で得られたマウスパラコート中毒にお
ける血中ＧＯＴ活性の上昇のＳＯＤとＦｃ断片の複合体
による抑制を示す図である。
ける血中ＧＯＴ活性の上昇のＳＯＤとＦｃ断片の複合体
による抑制を示す図である。
Claims (5)
- 【請求項１】 スーパーオキシドジスムターゼと免疫
グロブリンのＦｃ断片との複合体。 - 【請求項２】 スーパーオキシドジスムターゼが銅・
亜鉛型である請求項１記載の複合体。 - 【請求項３】 スーパーオキシドジスムターゼのアミ
ノ基を、架橋剤Ｘを介して、チオール基を遊離させた免
疫グロブリンのＦｃ断片と反応させて生じる〔ここで架
橋剤Ｘは、Ｒ１ −Ａ−Ｒ２ （ここで、Ｒ１ はアミ
ノ基に反応する１価の活性基で、Ｒ２ はチオール基に
反応する１価の活性基であり、Ａは２価の有機基を示す
。）を表す。〕、請求項１記載の複合体。 - 【請求項４】 チオール基を遊離させたスーパーオキ
シドジスムターゼを、架橋剤Ｙを介して、チオール基を
遊離させた免疫グロブリンのＦｃ断片と反応させて生じ
る〔ここで架橋剤Ｙは、Ｒ３ −Ｂ−Ｒ４ （ここでＲ
３ 、Ｒ４ はチオール基に反応する活性基であり、Ｂ
は２価の有機基を示す。）を表す。〕、請求項１記載の
複合体。 - 【請求項５】 Ｒ１ が下記式（Ｉ）【化１】 で表される基で、Ｒ２ 、Ｒ３ およびＲ４ が下記式
（ＩＩ）【化２】 で表される基である請求項３または４記載の複合体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3080381A JPH04293482A (ja) | 1991-03-20 | 1991-03-20 | スーパーオキシドジスムターゼとＦｃの複合体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3080381A JPH04293482A (ja) | 1991-03-20 | 1991-03-20 | スーパーオキシドジスムターゼとＦｃの複合体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04293482A true JPH04293482A (ja) | 1992-10-19 |
Family
ID=13716708
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3080381A Withdrawn JPH04293482A (ja) | 1991-03-20 | 1991-03-20 | スーパーオキシドジスムターゼとＦｃの複合体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04293482A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008534676A (ja) * | 2005-04-08 | 2008-08-28 | ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド | 非ペプチド性重合体で改質された免疫グロブリンＦｃ断片およびこれを含む薬学的組成物 |
-
1991
- 1991-03-20 JP JP3080381A patent/JPH04293482A/ja not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008534676A (ja) * | 2005-04-08 | 2008-08-28 | ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド | 非ペプチド性重合体で改質された免疫グロブリンＦｃ断片およびこれを含む薬学的組成物 |
| US8124094B2 (en) | 2005-04-08 | 2012-02-28 | Hanmi Holdings Co., Ltd. | Immunoglobulin Fc fragment modified by non-peptide polymer and pharmaceutical composition comprising the same |
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