JPH04293484A - 酵素の保存方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、トリプトファン合成酵
素の保存方法に関するものであり、さらに詳しくは、ト
リプトファン合成酵素を、簡便に且つ安定に保存する方
法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】トリプトファン合成酵素［トリプトファ
ンシンターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２０）］は、メソ
ッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第５巻、８０１〜８０７頁（
１９６２年）、アドバンシズ・イン・エンザイモロジー
（Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第
４９巻、１２７〜１８６頁（１９７９年）等の文献に記
載されているように、Ｌ−トリプトファンまたはＬ−ト
リプトファン誘導体を製造する際に使用される産業上有
用な酵素である。その作用は、インドール、５−ヒドロ
キシインドール、５−アミノインドール、５−メチルイ
ンドール等のインドール類と、システイン、シスチン、
Ｓ−メチルシステイン、Ｌ−セリン等のアミノ酸のいず
れか一つ以上との反応を触媒することにより、Ｌ−トリ
プトファンまたはＬ−トリプトファン誘導体を合成させ
ることである。一般に、酵素のもつ活性を安定に維持し
ながら保存する方法としては、ロバート・ケー・スコー
プス（Ｒｏｂｅｒｔ　Ｋ．　Ｓｃｏｐｅｓ）著、「蛋白
質精製法−理論と実際（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａ
ｃｔｉｃｅ）」シュプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）刊（１９８２年）等に記載
されている下記の方法等が用いられている。 ■　　蛋白質の変性を防ぐ：低温（−８０℃〜４℃）で
保存する。 ■　　蛋白質構造の崩壊を防ぐ：補酵素の添加、ＥＤＴ
Ａのような錯体形成試薬の添加、β−メルカプトエタノ
ール、ジチオスレイトールおよびジチオエリスリトール
等のＳＨ基含有試薬の添加、あるいは著しく希薄な酵素
液に他の蛋白質を高濃度で添加する。 ■　　蛋白質分解酵素による攻撃を防ぐ：フェニルメチ
ルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ペプスタチンＡ
等を添加する。 ■　　その他：グリセロール、糖、糖アルコール、硫酸
アンモニウムを添加する。 大腸菌の生産したトリプトファン合成酵素を保存する方
法としては、例えば低温で処理を行うとともに、酵素を
精製する際の緩衝液にβ−メルカプトエタノール、ＥＤ
ＴＡ、ピリドキサール−５′−リン酸、ＰＭＳＦ、ジチ
オスレイトール等を加えることが挙げられる（イー・ダ
ブリュ・マイルズ（Ｅ．Ｗ．Ｍｉｌｅｓ）ら、メソッズ
・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１４２巻、３９８〜４１４頁
（１９８７年））。これらは、いずれも公知の方法また
はそれらを組み合わせたものである。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、低温処
理、上記のような添加剤を用いることは、コストがかか
るために大量処理には不適であり、トリプトファン合成
酵素を工業的に保存するためには問題が多い。本発明は
、上記のような従来の課題を解決し、トリプトファン合
成酵素を簡便に且つ安定に保存する方法を提供すること
を目的とするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意検討
の結果、上記のような課題を解決することができた。す
なわち、本発明は、大腸菌の生産したトリプトファン合
成酵素を保存する方法において、該合成酵素を含有する
液がアルブミンおよびリン酸塩を含有することを特徴と
する、トリプトファン合成酵素の保存方法を提供するも
のである。

【０００５】以下に、本発明をさらに詳細に説明する。 トリプトファン合成酵素を生産する大腸菌の培養方法は
、一般的な方法でよく、特に制限するものではない。 つまり、培地としては、通常の微生物の培養に用いられ
るものと同様の炭素源、無機塩等を含む天然または合成
培地を使用することができる。例えば、炭素源としては
、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロー
ス、糖蜜等の種々の炭水化物が使用でき、また、窒素源
としては、トリプトン、酵母エキス、コーン・スチープ
・リカー、カゼイン加水分解物等の天然有機窒素源を使
用することができる。天然有機窒素源の多くは、窒素源
とともに炭素源にもなりうる。無機塩としては、例えば
リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マ
グネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシ
ウム、塩化マンガン等を使用することができる。また、
培地には微生物の生育に有用な他の栄養素、例えばビタ
ミン類、アミノ酸塩等を添加してもよい。本発明で使用
する大腸菌は野生型であってもよいが、とくにトリプト
ファン合成酵素を産生するための構造遺伝子を含むプラ
スミドで形質転換されたエシエリヒア・コリがさらに好
ましい。そのような菌としては、エシエリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ−１２　ＹＫ２
００１（ＦＥＲＭ　Ｐ−７１３９）、同Ｋ−１２　ＹＫ
２００４（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１７３２）、同Ｋ−１２　
ＹＫ２００９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３２４４）、同Ｋ−１
２　ＹＫ２０１４（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３２４５）、同Ｋ
−１２　ＹＫ２０１７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２８０４）を
挙げることができる。

【０００６】さらに、トリプトファン合成酵素生産菌の
もつトリプトファン合成酵素を産生するための構造遺伝
子が、少なくともｔｒｐＡ、ｔｒｐＢおよびこれらの両
遺伝子を発現させるプロモーター機能を有するＤＮＡ断
片、並びにこのプロモーター機能をトリプトファンリプ
レッサーにより発現調節しうるオペレーター機能をもつ
ＤＮＡ断片を有するような酵素生産菌である場合には、
培地にはトリプトファンリプレッサーによる抑制を解除
するために、インドールアクリル酸またはその塩を添加
することができる。また、トリプトファン合成酵素を産
生するための構造遺伝子が、トリプトファナーゼオペロ
ン中のプロモーターおよびこのプロモーターを制御しう
る調節遺伝子を含むＤＮＡ断片で発現制御を受けるよう
な酵素生産菌である場合には、培地にはトリプトファナ
ーゼプロモーターからの転写を誘導させるために、Ｌ−
またはＤＬ−トリプトファンを添加することができる。 いずれの場合においても、上記したとおり適切な誘導物
質の添加により、トリプトファン合成酵素の産出量を著
しく向上させることができる。

【０００７】インドールアクリル酸またはその塩、ある
いはＬ−またはＤＬ−トリプトファンは、培養の当初に
添加してもよく、または培養の途中で添加してもよい。 途中で添加する場合には、遅くとも微生物の対数増殖期
の末期までに添加することが好ましい。添加は一回に行
ってもよく、あるいは複数回に分けて断続的あるいは連
続的に行うこともできる。インドールアクリル酸の塩と
しては、例えばインドールアクリル酸ナトリウムのよう
なインドールアクリル酸のアルカリ金属塩等が挙げられ
る。インドールアクリル酸またはその塩の添加量は、厳
密には制限されるものではないが、一般には培地に対し
少なくとも２５μｇ／ｍｌの最終濃度になるように添加
することができ、好ましくは８０〜４００μｇ／ｍｌの
範囲、さらに好ましくは１００〜２００μｇ／ｍｌの範
囲の最終濃度となるように添加するのがよい。ここで「
最終濃度」とは、培養終了時までに培地に添加したイン
ドールアクリル酸またはその塩の添加量の合計の全液量
に対する割合である。培地中に添加するＬ−またはＤＬ
−トリプトファンの濃度は厳密に制限されるものではな
いが、好ましくは０．０５〜２％（Ｗ／Ｖ）さらに好ま
しくは０．１〜０．５％（Ｗ／Ｖ）の濃度がよい。

【０００８】さらに本発明方法において、トリプトファ
ン合成酵素を抽出する場合においては、炭素源の少なく
とも一部としてグルコースを使用することが好ましく、
その使用量は一般に、インドールアクリル酸またはその
塩を添加する場合には、それらに対して１０〜６００倍
モル、好ましくは５０〜４００倍モル、さらに好ましく
は１００〜３００倍モルの範囲が適当である。Ｌ−また
はＤＬ−トリプトファンを添加する場合には、グルコー
スをその濃度が０．０１〜０．３％（Ｗ／Ｖ）、好まし
くは０．０１〜０．２５％（Ｗ／Ｖ）、さらに好ましく
は０．０３〜０．２％（Ｗ／Ｖ）の範囲内に維持される
ように、連続的または間欠的に該培地に添加しつつ行う
のが適当である。培養時間はトリプトファン合成酵素生
産菌の種類、培養条件等により異なるが、インドールア
クリル酸またはその塩あるいはＬ−またはＤＬ−トリプ
トファンを培養の当初に添加して培養を行う場合にも、
あるいはインドールアクリル酸またはその塩あるいはＬ
−またはＤＬ−トリプトファンを培養の途中で添加して
培養する場合にも、通常約１〜１２０時間程度の培養時
間でよい。また、培養温度は、通常約２０〜５０℃の範
囲がよく、培地のｐＨは一般に５〜９の範囲、好ましく
は約６〜８の範囲に調節するのが好適である。さらに、
培養は振盪または通気撹拌等の好気的条件下に行うのが
好ましい。培養した菌体から、トリプトファン合成酵素
を含有する菌体抽出液を調製する方法としては、機械的
破壊、超音波破壊等の公知の方法が挙げられるが、先に
我々の提案したグラム陰性菌の培養途中および／または
培養終了後に、該菌をグリシンと接触させることにより
、酵素を菌体外に溶出させることを特徴とする、酵素の
分離方法（特願平２−２４６１６４号）が工業的に大量
処理に向く方法として好適に用いることができる。

【０００９】菌体抽出液から、粗酵素液を調製する方法
としては、塩析、イオン交換ゲル濾過等の各種クロマト
グラフィー等の公知の方法を用いることができるが、先
に我々の提案した、菌体抽出液を少なくとも硫酸アンモ
ニウムの存在下、加熱処理することを特徴とするトリプ
トファン合成酵素の分画法（特願平２−４１１０３７）
が工業的に大量処理に向く方法として好適に用いること
ができる。

【００１０】トリプトファン合成酵素含有水溶液の形態
としてはとくに制限はないが、上記の方法で培養した菌
体懸濁液、大腸菌の菌体抽出液、菌体抽出液を何らかの
方法で粗精製して比活性を向上させた粗酵素抽出液を用
いることができる。トリプトファン合成酵素含有水溶液
に添加するアルブミンは、とくに制限はないが、ウシ血
清アルブミン、鶏卵アルブミン等が好適である。添加す
る量としては、トリプトファン合成酵素含有水溶液１ｌ
あたり通常１〜５０ｇ、好ましくは３〜２０ｇがよい。

【００１１】リン酸塩としては、とくに限定するもので
はないが、通常リン酸緩衝液の成分として用いられる、
リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リ
ン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム等が好適で
ある。添加濃度としては、ウシ血清アルブミンを添加し
たトリプトファン合成酵素含有水溶液に対して、通常１
０〜４００ｍＭ、好ましくは３０〜２００ｍＭの濃度と
なるように添加するのがよい。このトリプトファン合成
酵素含有水溶液のｐＨは、４〜９、好ましくは６〜８．
５、保存温度は、４〜４５℃、好ましくは４〜３７℃で
行うのがよい。保存時に、トリプトファン合成酵素が要
求する補酵素（ビタミンＢ６）であるピリドキサール−
５′−リン酸、該酵素の反応基質の１つであるＬ−また
はＤＬ−セリン等を必要あらば添加することもできる。

【００１２】

【実施例】以下、実施例により本発明を説明する。 参考例１ 下記表１に示す組成の培地１００ｍｌを、５００ｍｌ容
三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間加熱滅菌し
たものに、アンピシリンおよびグルコースをそれぞれ終
濃度５０μｇ／ｍｌおよび１％（Ｗ／Ｖ）となるように
添加し、これにエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ−１２　ＹＫ２０１４（ＦＥＲＭ
　ＢＰ−３２４５）を１白金耳植菌し、３７℃で２４時
間振盪培養した。

【００１３】

【表１】

【００１４】続いて、下記表２の培地１．５ｌを、３ｌ
容ジャーファーメンター容器に入れ、さらにグルコース
およびＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏがそれぞれ終濃度１％（Ｗ
／Ｖ）および５０ｍｇ／ｌとなるように添加し、これに
上記の培養によって得られた培養物３０ｍｌを接種し、
通気撹拌培養により、３７℃、通気量１ｖｖｍ、回転１
０００ｒｐｍ、ｐＨ７．２（２８％アンモニア水で調整
）に調節しながら培養を行った。培養液の濁度（ＯＤ６
６０ｎｍ）が１０前後に達したところで、ＭｇＳＯ４・
７Ｈ２ＯおよびＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏをそれぞれ終濃度
４００ｍｇ／ｌおよび１００ｍｇ／ｌとなるように添加
するとともに、インドールアクリル酸を終濃度８０ｍｇ
／ｌとなるように添加した。また、培養液中の溶存酸素
濃度を溶存酸素電極にて測定し、グルコース濃度がゼロ
になり、培養液の溶存酸素値が上昇を始めた時点で、グ
ルコースを１％となるように添加した。

【００１５】

【表２】

【００１６】濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）が３０前後に達し
たところで、グリシン３０ｇを１００ｍｌの水に溶解し
、さらに濾過除菌したものを培養液に添加し、さらに培
養を続けた。培養開始後２０時間で培養を終了させ、培
養槽より培養液を抜き出した。培養液より遠心分離によ
り菌体を除去した上清液（菌体抽出液）について、ヤノ
フスキー（Ｙａｎｏｆｓｋｙ）の方法でトリプトファン
合成酵素活性を測定した。すなわちメソッズ・イン・エ
ンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ）第５巻、７９４〜７９６頁（１９６２年）ア
カデミック・プレス刊（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）
に記載されている方法によって測定した。活性は３７℃
で１時間あたりに１μモルのインドールをＬ−トリプト
ファンに変換しうる酵素量を１ユニット（Ｕ）と定義す
る。該抽出液の活性は１２００ユニット／ｍｌ菌体抽出
液であった。

【００１７】参考例２ 参考例１の表１に示す培地１００ｍｌに、Ｌ−トリプト
ファンを終濃度０．０５％（Ｗ／Ｖ）添加したものを、
５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃、１５分
間滅菌処理したものに５０％（Ｗ／Ｖ）グルコース溶液
（１２０℃、１５分間殺菌）を無菌的に１ｍｌ添加後、
エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）Ｋ−１２ＹＫ２０１７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２８０４
）を植菌し、３７℃、２４時間振盪培養した。続いて、
参考例１の表２の培地１．５ｌに、Ｌ−トリプトファン
の濃度が１ｇ／ｌとなるように添加し、これを３ｌ容ジ
ャーファーメンター容器に入れ、さらにグルコースおよ
びＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏがそれぞれ終濃度０．１％（Ｗ
／Ｖ）および５０ｍｇ／ｌとなるように添加し、これに
上記の培養によって得られた培養物３０ｍｌを接種し、
通気撹拌培養により、３７℃、通気量１ｖｖｍ、回転１
０００ｒｐｍ、ｐＨを７．２（２８％アンモニア水で調
整）に調節しながら２０時間培養した。なお、グルコー
ス濃度が、濃度上限の０．１％（Ｗ／Ｖ）を越えないよ
うに、且つ０．０１％（Ｗ／Ｖ）の下限を下回らないよ
うに、経時的に培養液中のグルコース濃度を測定しなが
ら、５０％（Ｗ／Ｖ）の加熱滅菌済グルコース水溶液を
無菌的に連続添加した。また、ＯＤ６６０１５前後でＭ
ｇＳＯ４・７Ｈ２ＯおよびＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏをそれ
ぞれ終濃度４００ｍｇ／ｌおよび１００ｍｇ／ｌとなる
ように追添加した。培養終了後、菌体を遠心分離により
回収し、これをグリシンを２０ｇ／ｌの濃度で含有する
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に、菌濃
度が培養終了時と同じになるように懸濁した。この懸濁
液を、別の３ｌ容ジャーファーメンターに移し、３７℃
、２４時間、無通気、回転４００ｒｐｍで撹拌し、トリ
プトファン合成酵素を抽出した。抽出終了後、遠心分離
により菌体を除去した上清液（菌体抽出液）について、
参考例１と同じ方法で活性を測定したところ、この菌体
抽出液の活性は、１４００ユニット／ｍｌ菌体抽出液で
あった。

【００１８】実施例１ 参考例１で調製した菌体抽出液の２ｍｌを５０ｍｌ容三
角フラスコに入れ、ＮａＣｌおよびピリドキサール−５
′−リン酸がそれぞれ０．５ｇ／ｌおよび１０ｍｇ／ｌ
の濃度となるように水に溶解し、ｐＨを７．８とした溶
液（希釈液）８ｍｌで希釈し、ウシ血清アルブミンを５
ｇ／ｌの濃度となるように添加した。この溶液に、リン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を１００ｍＭの濃度と
なるように添加した。 これを３７℃で９０時間放置した後、参考例１と同じ方
法で活性を測定した。さらにリン酸カリウムもウシ血清
アルブミンも添加しなかったもの（無添加）を同様に調
製し、活性を測定した。その結果を表３に示す。なお、
各数値は、保存開始時の活性（対照）を１００とした相
対値で示した。

【００１９】

【表３】

【００２０】実施例２ 参考例２で調製した菌体抽出液の２ｍｌを５０ｍｌ容三
角フラスコに入れ、実施例１の希釈液８ｍｌで希釈した
。この溶液に、ウシ血清アルブミンを５ｇ／ｌの濃度お
よびリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を１００ｍＭ
の濃度となるように添加したもの、ウシ血清アルブミン
もリン酸カリウムも添加しなかったもの（無添加）を調
製した。これを３７℃で９０時間放置した後、参考例１
と同じ方法で活性を測定した。その結果を表４に示す。 なお、各数値は、保存開始時の活性（対照）を１００と
した相対値で示した。

【００２１】

【表４】

【００２２】実施例３ 参考例２で調製したグリシンを添加する前の菌体１ｇを
、表５に示すように、ウシ血清アルブミンおよびリン酸
カリウムを添加または無添加の実施例１の希釈液２０ｍ
ｌに懸濁し、３７℃で９０時間保存した。この液につい
て、ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）社製超音波破砕器を
用いて菌体抽出液を調製し、参考例１と同様な方法で活
性を測定した。その結果を表５に示す。なお、各数値は
、保存開始時の活性（対照）を１００とした相対値で示
した。

【００２３】

【表５】

【００２４】

【発明の効果】本発明によって、トリプトファン合成酵
素を含有する水溶液を、従来酵素保存には不適と考えら
れていた３７℃という高温においても簡便に且つ安定に
保存することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　大腸菌の生産したトリプトファン合成
   酵素を保存する方法において、該合成酵素を含有する液
   がアルブミンおよびリン酸塩を含有することを特徴とす
   る、トリプトファン合成酵素の保存方法。