JPH04267888A - エンドセリンの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、種々のヒト疾病の臨床
診断に適用できるエンドセリンの定量法および該方法に
利用可能なモノクローナル抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】エンドセリンは、２１個のアミノ酸残基
よりなる生理活性ペプチドで、血管内皮細胞から産生さ
れ、強い血管収縮作用をもつことが知られている〔ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３３２　，　４１１　−４１
５（１９８８）　〕。エンドセリンの定量法には、１種
類のポリクローナル抗体を用いるラジオイムノアッセイ
による定量法〔バイオケミカルアンド　　バイオフィジ
カル　　リサーチ　　コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．）
，１６２　，　３４０　−３４６（１９８９）　〕と第
一抗体にマウスモノクローナル抗体、第二抗体にウサギ
ポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ定量法が報告
されている〔ジャーナル　　イムノロジカル　　メソッ
ド（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ），１１
８　，　２４５　−２５０（１９８９）　〕。

【０００３】抗エンドセリンモノクローナル抗体として
は、武田薬品工業（株）（ＥＰ−３１１００Ａ１　）、
ヤマサ醤油（株）（ＷＯ　８９１１０９９，　略称：Ｍ
ＣＡ　ＥＴ−０１，　ＭＣＡ　ＥＴ−０２）　などの抗
体が既に知られている。また、マウス抗エンドセリンモ
ノクローナル抗体ＫＭ５６５については、第６３回日本
薬理学会総会　（１９９０年３月２５〜２８日）　で本
出願人により発表されている〔ジャパニーズ・ジャーナ
ル・オブ・ファーマコロジィー（Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ），　
ｖｏｌ　５２，　ｓｕｐｐｌ　１，　ｐ２０２　（１９
９０）〕。しかし、これらの抗体を第一、第二抗体とし
てエンドセリンのサンドイッチ定量法に利用するという
報告はない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従来の技術の１種類の
ポリクローナル抗体を用いるラジオイムノアッセイによ
る定量法や第二抗体にポリクローナル抗体を用いるサン
ドイッチ定量法では、ポリクローナル抗体のロットの違
いにより、定量性にバラツキがでるという問題がある。 本発明の目的は、モノクローナル抗体を用い、定量性に
バラツキのないエンドセリンのサンドイッチ定量法を提
供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、固相化
した抗エンドセリンモノクローナル抗体（第一抗体）に
検体中のエンドセリン抗原を結合させ、ついで無標識も
しくは標識物質で標識された抗エンドセリンモノクロー
ナル抗体（第二抗体）を該結合したエンドセリン抗原と
結合させ、無標識の抗エンドセリンモノクローナル抗体
を用いる場合は、さらに標識物質で標識された抗イムノ
グロブリン抗体（第三抗体）を該結合した無標識の抗エ
ンドセリンモノクローナル抗体と結合させ、結合した標
識物質の量を測定することにより検体中のエンドセリン
抗原量を定量する方法を提供することができる。

【０００６】本発明の定量法では、第二抗体として無標
識もしくは標識物質で標識された抗エンドセリンモノク
ローナル抗体のいずれでも用いることができるが、より
感度よくエンドセリンを定量する場合には無標識の抗エ
ンドセリンモノクローナル抗体を用いる方が好適である
。以下、本発明について詳細に説明する。

【０００７】まず、エンドセリンとキャリヤー蛋白の複
合体または、エンドセリンの一部のペプチドとキャリヤ
ー蛋白の複合体を免疫したマウスの脾細胞とマウス骨髄
腫細胞株とを融合させてハイブリドーマを作製し、エン
ドセリンに反応し、キャリヤー蛋白と反応しないモノク
ローナル抗体を生産するハイブリドーマを選択する。該
ハイブリドーマを培地中で培養するか、マウスに投与し
て該マウスを腹水癌化し、該培養液または腹水よりいく
つかのマウスモノクローナル抗体を採取する。ついで、
エンドセリンとキャリヤー蛋白の複合体または、エンド
セリンの一部のペプチドとキャリヤー蛋白の複合体を免
疫したラットの脾細胞とマウス骨髄腫細胞株とを融合さ
せてハイブリドーマを作製し、先に得られたマウスモノ
クローナル抗体とエンドセリンをサンドイッチのように
はさみ込んで結合することのできるモノクローナル抗体
を生産するハイブリドーマを選択する。該ハイブリドー
マを培地中で培養するか、マウスに投与して該マウスを
腹水癌化し、該培養液または腹水よりいくつかのラット
モノクローナル抗体を採取する。このようにして得られ
たいくつかのマウスモノクローナル抗体といくつかのラ
ットモノクローナル抗体をそれぞれ第一、第二抗体とし
、サンドイッチ定量法を検討し、第一抗体と第二抗体の
組み合わせを選択する。

【０００８】以下に本発明で用いられるモノクローナル
抗体の製造法を説明する。 （１）　動物の免疫と抗体産生細胞の調製３〜２０週令
のマウスまたは、ラットに抗原（エンドセリンとキャリ
ヤー蛋白の複合体またはエンドセリンの一部のペプチド
とキャリヤー蛋白の複合体）を免疫して、その動物の脾
、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を調製する。免疫
の方法は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に
、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジ
ュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄ
ｊｕｖａｎｔ）または、水酸化アルミニウムゲルと百日
咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与する。これらの
投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに５〜１０回
行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、そ
の血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免
疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊　１９７６　年
〕などで調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が
十分な抗体価を示したマウスまたはラットを脾細胞の供
給源として提供する。脾細胞と骨髄腫細胞の融合に供す
るにあたって、抗原物質の最終投与後３〜７日目に免疫
したマウスまたはラットより脾臓細胞を摘出し、脾細胞
を調製する。脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細
断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ
、５分）　した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球
を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄して融合用脾細胞とし
て提供する。

【０００９】（２）　骨髄腫細胞の調製骨髄腫細胞とし
ては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえ
ば、８−アザグアニン耐性マウス（Ｂａｌｂ／ｃ由来）
骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）
〔カレント・トピックス・イン・ミクロバイオロジィ・
アンド・イムノロジィー１（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉ
ｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ−１　）　，ヨーロピアン・ジャーナ
ル・オブ・イムノロジィ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ．　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）６　，　５１１　−５１９（１９
７６）　〕、ＳＰ２　／０　−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２７６　　，　２６９−
２７０　（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３　−Ａｇ８６５
３　　（６５３）　〔ジャーナル・オブ・イムノロジィ
（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）１２３　　，１５４８
−１５５０（１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３　−Ａｇ８（
Ｘ６３）〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２５６　，　
４９５−４９７（１９７５）　〕などが用いられる。こ
れらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１
６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）　、２−メルカ
プトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ジェンタマイシン
（１０　μｇ　／ｍｌ）　および牛胎児血清（ＦＣＳ）
（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地
という。）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ　／
ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４
日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の
細胞数を確保する。

【００１０】（３）　細胞融合 （１）　で免疫した抗体産生細胞と（２）　で得られた
骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリ
ウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７
．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄
し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：
１になるよう混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５
　分）　した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほ
ぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングラ
イコール−１，０００（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、Ｍ
ＥＭ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混
液０．２〜１ｍｌ／１０３抗体産生細胞を加え、１〜２
分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ
培地を加えて全量が５０ｍｌになるようにする。遠心分
離（９００ｒｐｍ、５分）　後、上清を捨て、ゆるやか
に細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出
しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサ
ンチン（１０−４Ｍ）、チミジン（１．５×１０−５Ｍ
）およびアミノプテリン（４×１０−７Ｍ）を加えた培
地〕１００ｍｌ中に懸濁する。この懸濁液を９６穴培養
用プレートに１００μｌ　／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２
　インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する
。培養後、培養上清の一部をとり酵素免疫測定法などに
より、抗原に対する抗体価を測定し、エンドセリンに特
異的に反応し、キャリヤー蛋白のみとは、反応しないも
のを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニング
を２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地から
アミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を
使用する〕、エンドセリンに対し強く反応するモノクロ
ーナル抗体を安定して産生するものを抗エンドセリンモ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する
。

【００１１】（４）　モノクローナル抗体の調製プリス
タン処理〔２，６，１０，１４　−テトラメチルペンタ
デカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）　０．５　ｍｌ　を腹腔内
投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスに
、（３）　で得られた抗エンドセリンモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ細胞２×１０６　〜５×１０７　
細胞／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリド
ーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠
心分離（３，０００ｒｐｍ、５分）　して固形分を除去
後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩析し、ＰＢＳに
塩化ナトリウムを加えた液で透析し、ＤＥＡＥ−セファ
ロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいは、セルロ
ファインＧＳＬ２０００（生化学工業社製）のカラムに
通塔し、ＩｇＧあるいは、ＩｇＭ画分を集め、精製モノ
クローナル抗体とする。抗体のサブクラスの決定は、マ
ウスモノクローナル抗体タイピングキット（ザイメット
社製）あるいはラットモノクローナル抗体タイピング抗
体（ノルディックイムノロジー社製）を用いて行う。蛋
白量の定量は、ローリー法および２８０ｎｍでの吸光度
より算出する。

【００１２】（５）　サンドイッチ定量法に使用できる
モノクローナル抗体の選択 （４）　で精製したマウス抗エンドセリンモノクローナ
ル抗体あるいは精製したラット抗エンドセリンモノクロ
ーナル抗体１〜５０μｇ／ｍｌを１０〜１００μｌ／穴
ずつ９６穴プレートに分注し、４℃で一晩放置して、第
一抗体としてプレートコートする。次いで、牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）溶液などで、ブロッキングする。そこ
に、１０ｐｇ〜１００ｎｇ／ｍｌ濃度のエンドセリン溶
液を５０〜１００μｌ入れ、室温で２時間または４℃で
一晩反応させる。ＰＢＳまたは０．０５％　Ｔｗｅｅｎ
−２０を含むＰＢＳ溶液（ＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎ）でよ
く洗浄した後、（３）　に記載の方法で得られるマウス
抗エンドセリンモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマの培養上清あるいはラット抗エンドセリンモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清　（
第一抗体がマウス抗体の場合はラット由来、第一抗体が
ラット抗体の場合は、マウス由来のハイブリドーマの培
養上清）を第二抗体として５０〜１００μｌ／穴ずつ分
注し、室温で２時間または、４℃で一晩反応させる。第
二抗体が無標識の場合はさらにＰＢＳ又は、ＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎ　でよく洗浄した後、第三抗体として第二抗体
がマウス由来のときは、酵素標識抗マウスイムノグロブ
リン抗体を、第二抗体がラットのときは、酵素標識抗ラ
ットイムノグロブリン抗体を室温で２時間反応させる。 ＰＢＳ又は、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　よく洗浄した後、適
当な基質液を用い発色させ、吸光度を測定する。この結
果より、感度良くエンドセリンを検出できるマウス抗エ
ンドセリンモノクローナル抗体とラット抗エンドセリン
モノクローナル抗体の組み合わせを選択する。

【００１３】前記したような方法で選択される抗体エン
ドセリンモノクローナル抗体の具体例としては、ハイブ
リドーマ細胞株ＫＭ５６５が生産するマウス抗エンドセ
リンモノクローナル抗体ＫＭ５６５およびハイブリドー
マ細胞株ＫＭ７１４が生産するラット抗エンドセリンモ
ノクローナル抗体ＫＭ７１４をあげることができる。ハ
イブリドーマ細胞株ＫＭ５６５およびハイブリドーマ細
胞株ＫＭ７１４はそれぞれ平成３年２月５日付でブダペ
スト条約に基づき工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研条寄第３２６４号（ＦＥＲＭ　ＢＰ　−３２６４）
　および第３２６５号（ＦＥＲＭ　ＢＰ　−３２６５）
　として寄託されている。

【００１４】抗体の標識物質としては、酵素、ビオチン
、化学発光物質または放射線発光物質などをあげること
ができる。標識は例えば酵素としてペルオキシダーゼ、
ウレアーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクト
シダーゼなどを用い、過ヨウ素酸架橋法〔ジャーナル・
オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリ
ー（Ｊ．　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．
）　２２　，　１０８４　〜１０９１（１９７１）〕、
ビオチンを用いる方法〔ジャーナル・オブ・ヒストケミ
ストリー・アンド・サイトケミストリー（Ｊ．　Ｈｉｓ
ｔｏｃｈｅｍ．　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．）　２７　，　１
１３１　〜１１３９（１９７９）〕など公知の方法にし
たがっておこなうことができる。

【００１５】たとえばビオチン標識の方法は次の通りで
ある。精製した１ｍｌのモノクローナル抗体１ｍｇ／ｍ
ｌを０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ３　−０．５Ｍ　ＮａＣｌ（
ｐＨ８．０）１リットル中で４℃で一晩透析した後、Ｎ
−Ｎ´−ジメチルホルムアミドに溶かした１００μｌの
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドビオチン（シグマ社製）
１ｍｇ／ｍｌを加え、室温で４時間反応させる。ついで
、反応液をＰＢＳ−０．５Ｍ　ＮａＣｌ　１リットル中
で、４℃一晩透析する。このとき、ＰＢＳ−０．５Ｍ　
ＮａＣｌ１リットルを３回新しいものと交換する。透析
が終了した反応液のタンパク量を測定し、ビオチン標識
モノクローナル抗体として用いる。

【００１６】つぎに選択された第一抗体および第二抗体
を用いるエンドセリンの定量法を説明する。精製したマ
ウス抗エンドセリンモノクローナル抗体１〜５０μｇ／
ｍｌあるいは精製したラット抗エンドセリンモノクロー
ナル抗体１〜５０μｇ／ｍｌを１０〜１００　μｌ／穴
ずつ分注し、４℃で一晩放置して、第一抗体としてプレ
ートコートする。ついで、ＢＳＡ溶液などでブロッキン
グする。 そこに、エンドセリンを含む検体溶液５０〜１００μｌ
　を入れ、室温で２時間あるいは、４℃で一晩反応させ
る。ＰＢＳまたは、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　でよく洗浄し
た後、無標識もしくは標識物質で標識したマウス抗エン
ドセリンモノクローナル抗体あるいは、ラット抗エンド
セリンモノクローナル抗体１〜５０μｇ　／ｍｌ（第一
抗体がマウス抗体の場合はラット由来、第一抗体がラッ
ト抗体の場合はマウス由来の抗エンドセリンモノクロー
ナル抗体）を第二抗体として５０〜１００μｌ／穴ずつ
分注し、室温で２時間または、４℃で一晩反応させる。 第二抗体として無標識の抗体を用いるときは、さらにＰ
ＢＳまたはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　でよく洗浄した後、第
三抗体として第二抗体がマウスのときは、標識物質で標
識した抗マウスイムノグロブリン抗体を、第二抗体がラ
ットのときは、同様に標識した抗ラットイムノグロブリ
ン抗体を室温で２時間反応させＰＢＳまたはＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎ　でよく洗浄する。

【００１７】以上のように、穴に結合した標識物質が酵
素、化学発光物、放射線化合物などのときは、その活性
を測定する。標識物質がビオチンのときは、アビジン−
酵素複合体やアビジン−ビオチン−酵素複合体をさらに
反応させ、その酵素活性を測定する。検体と同時に、適
当に希釈したエンドセリンのスタンダード溶液を定量す
ることにより、標準直線を描き、それを基に検体中のエ
ンドセリン量を算出する。

【００１８】以下に本発明の実施例、比較例および参考
例を示す。

【００１９】

【実施例】実施例１ （１）　動物の免疫と抗体産生細胞の調製ラットの免疫 エンドセリンＣ末８残基ペプチド（以下、ＲＥＴ８と略
す）をヘモシアニンキーホール　　リンペット（Ｈｅｍ
ｏｃｙａｎｉｎ　　Ｋｅｙｈｏｌｅ　　Ｌｉｎｐｅｔ　
；　以下ＫＬＨと略す）〔カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏ
ｃｈｅｍ）社製〕をキャリヤー蛋白としてｍ−マレイミ
ド−ベンゾイル−Ｎ−ハイドロキシサクシル（ｍ−ｍａ
ｌｅｎｉｍｉｄｏ−ｂｅｎｚｏｙｌ　−Ｎ−ｈｙｄｒｏ
ｘｙ　ｓｕｃｃｉｌ、以下ＭＢＳと略す）（ナカライテ
スク社製）と反応させた後セファデックスＧ２５　カラ
ムで精製したＫＬＨ−ＭＢＳと１：５で混合し、公知の
方法〔セル（Ｃｅｌｌ），　２８　，　４７７−４８７
，　（１９８２）　〕で複合体を作り、ＰＢＳで透析し
て抗原とした。ラットに５０μｇ　のＲＥＴ８−ＫＬＨ
複合体（以下ＲＥＴ８−ＫＬＨ　と略す）をアルミニウ
ムゲル２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所
製）１×１０９　細胞／ラットとともに投与し、２週間
後５０μｇ　のＲＥＴ８−ＫＬＨを１週間に１回、計６
回投与した。眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価
を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示
したラットから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。脾臓
をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセット
でほぐし、遠心分離（１２００　ｒｐｍ　、　５分）し
た後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（
ｐＨ７．６５）　で１〜２分間処理し赤血球を除去し、
ＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。

【００２０】酵素免疫測定法 ９６穴のＥＩＡ用プレート〔グライナー（Ｇｒｅｉｎｅ
ｒ）　社製〕に抗原１〜５０μｇ　／ｍｌを１０〜１０
０μｌ／穴ずつ分注し、４℃で一晩放置して抗原をプレ
ートにコートした。次いで、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶
液（ＢＳＡ−ＰＢＳ）を１００〜２００μｌ／穴分注し
、室温１〜２時間または、４℃で１〜２晩放置して、プ
レート上に残った蛋白質との結合残基をブロック（ブロ
ッキング）した。その後、ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、ＰＢ
Ｓでよく洗浄した後、第一抗体として、ＢＳＡ−ＰＢＳ
で希釈した試料（マウス血清、ラット血清、ハイブリド
ーマ培養上清、精製モノクローナル抗体）を２０〜１０
０μｌ／穴分注し、室温で２〜３時間または、４℃で一
晩放置した。ＰＢＳまたは、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　で、
よく洗浄した後、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識
抗マウスイムノグロブリン抗体〔ダコ（ＤＡＫＯ）社製
〕、またはペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブ
リン抗体〔ダコ（ＤＡＫＯ）社製〕を５０〜１００μｌ
／穴分注し、室温で２時間放置した。ＰＢＳでよく洗浄
した後、ＡＢＴＳ基質液〔２，２′−アジノビス（３−
エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニ
ウム５５０ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２
）１リットルに溶かした溶液に、使用直前に過酸化水素
１μｌ／ｍｌを加えた溶液〕を用い発色させ、ＯＤ４１
５ｎｍ　の吸光度を測定した。

【００２１】（２）　マウス骨髄腫細胞の調製８−アザ
グアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を正常培地
で培養し、細胞融合時に２×１０７　以上の細胞を確保
し、細胞融合に親株として供した。

【００２２】（３）　サンドイッチ定量法に使用できる
モノクローナル抗体の選択 実施例１（１）　で得られたラット脾細胞と実施例１（
２）　で得られた骨髄腫細胞とを　１０：１になるよう
混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分）　した後
、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌
しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１，
０００　（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍ
ｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液０．２
〜１ｍｌ／１０３　ラット脾細胞を加え、１〜２分間毎
にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を
加えて全量が５０ｍｌになるようにする。遠心分離　　
（９００ｒｐｍ　、５分）　後、上清を捨て、ゆるやか
に細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出
しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地１００ｍｌ中に懸濁し
た。この懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／
穴ずつ分注し、５％ＣＯ２　インキュベーター中、３７
℃で１０〜１４日間ＣＯ２　５％下で培養した。この培
養上清を以下に示すアッセイ方法で調べ、活性が陽性な
穴を選び、さらＨＴ培地と正常培地に変え、２回クロー
ニングを繰り返して、サンドイッチ定量法に使用できる
ラットモノクローナル抗体ＫＭ７１４を生産するハイブ
リドーマ株ＫＭ７１４を確立した。ラットモノクローナ
ル抗体タイピングキット（ザイメット社製）を用いて、
酵素免疫測定法によりラットモノクローナル抗体ＫＭ７
１４のクラスをＩｇＭと決定した。

【００２３】アッセイ方法 参考例（４）　で得られた抗体ＫＭ５６５　　１０μｇ
／ｍｌを５０μｌ／穴ずつ９６穴プレート〔グライナー
（Ｇｒｅｉｎｅｒ）　社製〕に分注し、４℃で一晩放置
して、第一抗体としてプレートコートした。ＰＢＳで４
回洗浄し、次いで、１％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキング
した。そこに、１０ｎｇ／ｍｌ濃度にＢＳＡ−ＰＢＳで
希釈したエンドセリン溶液を５０μｌ　入れ、４℃で一
晩反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　で６回洗浄した後
、上記で得られた培養上清を第二抗体として５０μｌ／
穴ずつ分注し、室温で２時間反応させた。次いでＰＢＳ
−Ｔｗｅｅｎ　で６回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標
識抗ラットイムノグロブリン抗体を室温で１〜２時間反
応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　で６回洗浄した後、Ａ
ＢＴＳ基質液を用い発色させ、ＯＤ４１５ｎｍ　の吸光
度を測定した。

【００２４】（４）　モノクローナル抗体ＫＭ７１４の
精製プリスタン処理した８週令ヌード雌マウスに（３）
　で得られたハイブリドーマ株ＫＭ７１４を５〜１０×
１０６　細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜２１
日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまっ
たマウスから、腹水を採取（１〜８ｍｌ／匹）し、遠心
分離（３，０００ｒｐｍ、５分）して固形分を除去した
。５０％硫酸アンモニウムにて塩析し、塩化ナトリウム
０．５Ｍを添加したＰＢＳで透析後、セルロファインＧ
ＳＬ２０００（生化学工業社製）（ベットボリューム７
５０ｍｌ）のカラムに流速１５ｍｌ／時で通塔しＩｇＭ
画分を集め、精製モノクローナル抗体とした。

【００２５】（５）　サンドイッチ定量法によるエンド
セリンの高感度定量法 参考例により得られたマウス抗エンドセリンモノクロー
ナル抗体ＫＭ５６５と実施例１（４）　により得られた
ラット抗エンドセリンモノクローナル抗体ＫＭ７１４を
用いエンドセリンの定量を以下のとおりにおこなった。

【００２６】マウス抗エンドセリンモノクローナル抗体
ＫＭ５６５　　１０μｇ／ｍｌを５０μｌ／穴ずつ９６
穴プレートに分注し、４℃で一晩放置して、第一抗体と
してプレートコートした。ＰＢＳで４回洗浄し、ついで
、１％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした。そこにＢＳ
Ａ−ＰＢＳで希釈した０〜５０ｎｇ／ｍｌのエンドセリ
ン溶液を５０μｌ入れ、４℃で一晩反応させた。ＰＢＳ
−Ｔｗｅｅｎ　で６回洗浄した後、第二抗体として無標
識ラット抗エンドセリンモノクローナル抗体ＫＭ７１４
または以下に示す方法で作製したビオチン化標識ラット
抗エンドセリンモノクローナル抗体ＫＭ７１４　　１０
μｇ／ｍｌを５０μｌ／穴ずつ分注し、室温で２時間反
応させた。その後、第二抗体として無標識抗体ＫＭ７１
４を用いた場合は、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　で６回洗浄し
た後ビオチン化抗ラットイムノグロブリン抗体〔カルタ
グ（ＣＡＬＴＡＧ）社製〕を室温で１時間反応させた。 ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　で６回洗浄した後、アビジン−ペ
ルオキシダーゼ〔ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）社製〕を室
温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　で６回洗
浄した後、ＡＢＴＳ基質溶液を用い発色させ、ＯＤ４１
５ｎｍ　の吸光度を測定した。また第二抗体としてビオ
チン化標識抗体ＫＭ７１４を用いた場合は、ＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎ　で６回洗浄した後、アビジン−ペルオキシダ
ーゼ〔ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）社製〕を室温で１時間
反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　で６回洗浄した後、
ＡＢＴＳ基質溶液を用い発色させ、ＯＤ４１５ｎｍ　の
吸光度を測定した。その結果、エンドセリンを高感度（
＞１３ｐｇ／ｍｌ）に測定できた。結果を図１および図
２に示す。

【００２７】比較例１ 既存モノクローナル抗体との比較 既存モノクローナル抗体として、エンドセリンのＮ末を
認識するモノクローナル抗体ＭＣＡ　　ＥＴ−０１（ヤ
マサ醤油社製）とエンドセリンのＣ末を認識するモノク
ローナル抗体ＭＣＡ　　ＥＴ−０２（ヤマサ醤油社製）
を用い、エンドセリンを定量した。方法は、前述の実施
例１（５）　の方法に準じて行った。即ち、第一抗体と
してＫＭ５６５またはＭＣＡ　　ＥＴ−０１をプレート
にコートし、ブロッキング後希釈したエンドセリン溶液
を反応させた。次いで、第二抗体として、ビオチン標識
ＫＭ７１４　またはビオチン標識ＭＣＡ　　ＥＴ−０２
を反応させた。最後に、アビジン−ペルオキシダーゼを
反応させ、基質液を用いて発色させた。結果を第１表に
示す。

【００２８】ＫＭ５６５とＫＭ７１４の組み合わせが最
も定量性良く、次いでＭＣＡ　　ＥＴ−０１とＫＭ７１
４の組み合わせ、ＭＣＡ　　ＥＴ−０１とＭＣＡ　　Ｅ
Ｔ−０２の組み合わせの順であった。ＫＭ５６５とＭＣ
Ａ　　ＥＴ−０２の組み合わせでは、エンドセリンの定
量はできなかった。以上のことは、ＫＭ５６５は同じエ
ンドセリンＮ−末側を認識すると思われるＭＣＡ　　Ｅ
Ｔ−０１よりも反応性に優れ、ＫＭ７１４は同じエンド
セリンＣ−末側を認識すると思われるＭＣＡ　　ＥＴ−
０２よりも反応性に優れていることを示している。

【００２９】

【表１】

【００３０】参考例　　マウス抗エンドセリンモノクロ
ーナル抗体ＫＭ５６５の精製 （１）　動物の免疫と抗体産生細胞の調製マウスの免疫 エンドセリン〔ペプチドインスティテュート　　インク
（Ｐｅｐｔｉｄｅ　　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　　　Ｉｎｃ
）社製〕とキャリヤー蛋白のサイログロブリン〔シグマ
（ＳＩＧＭＡ）　社製、以下　　Ｔｈｙ　と略す）〕を
１：５の割合で混合し、０．１Ｍ酢酸アンモニウム存在
下で、０．０２Ｍグルタールアルデヒドを用いて公知の
方法（プロシーディング　　オブ　　ソサエティー　　
オブ　　エクスペリメンタル　　バイオロジカル　　メ
ディシン（Ｐｒｏｃ．　Ｓｏｃ．　Ｅｘｐ．　Ｂｉｏｌ
．　Ｍｅｄ．），　１４８　　，　７８４−７８９（１
９７５）　〕により、複合体を作り、ＰＢＳで透析して
抗原とした。また、ＫＬＨ〔カルビオケム（Ｃａｌｂｉ
ｏｃｈｅｍ）　社製〕をキャリヤー蛋白とする場合は、
エンドセリンをＭＢＳ（ナカライテスク社製）と反応さ
せた後セファデックスＧ２５カラムで精製したＫＬＨ−
ＭＢＳと１：５で混合し、公知の方法〔セル（Ｃｅｌｌ
），　２８　，　４７７−４８７（１９８２）　〕で複
合体を作り、ＰＢＳで透析して抗原とした。Ｂａｌｂ／
ｃ　マウスに、５０μｇのエンドセリン−サイログロブ
リン複合体（以下ＥＴ−Ｔｈｙと略す）または、エンド
セリン−ＫＬＨ複合体（以下ＥＴ−ＫＬＨと略す）をア
ルミニウムゲル２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血
清研究所製）１×１０９　細胞／マウスとともに投与し
、２週間後５０μｇのＥＴ−Ｔｈｙまたは、ＥＴ−ＫＬ
Ｈを１週間に１回、計６回投与した。眼底静脈叢より採
血し、その血清抗体価を実施例１に示す酵素免疫測定法
で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日
後に脾臓を摘出した。脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製
）中で裁断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２０
０ｒｐｍ　、　５分）　した後、上清を捨て、トリス−
塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）　で１〜２分
間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、細
胞融合に用いた。

【００３１】（２）　マウス骨髄腫細胞の調製８−アザ
グアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を正常培地
で培養し、細胞融合時に２×１０７　以上の細胞を確保
し、細胞融合に親株として供した。

【００３２】（３）　ハイブリドーマの作製参考例（１
）　で得られたマウス脾細胞と参考例（２）　で得られ
た骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、
細胞数が、マウス脾細胞：骨髄腫細胞＝１０：１になる
よう混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分）　し
た後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、
攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−
１，０００　（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ培地
２ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液０
．２〜１ｍｌ／１０３　マウス脾細胞を加え、１〜２分
間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培
地を加えて全量が５０ｍｌになるようにする。遠心分離
　　（９００ｒｐｍ、５分）　後、上清を捨て、ゆるや
かに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹
出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地１００ｍｌ中に懸濁
した。この懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ
／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２　インキュベーター中、３
７℃で１０〜１４日間ＣＯ２　５％下で培養した。得ら
れた培養上清のエンドセリンに対する抗体価の測定をし
て、活性が陽性な穴を選び、さらにＨＴ培地と正常培地
に変え、２回クローニングを繰り返して、前記の酵素免
疫測定法により、エンドセリンに特異的に反応するハイ
ブリドーマを選択した。最終的に、エンドセリン、ＥＴ
−ＫＬＨ、ＥＴ−Ｔｈｙに反応し、ＫＬＨ、Ｔｈｙとは
反応しないマウス抗エンドセリンモノクローナル抗体Ｋ
Ｍ５６５を生産するハイブリドーマ株ＫＭ５６５を確立
した。マウスモノクローナル抗体タイピングキット〔ザ
イメット（ＺＹＭＥＤ　）社製〕を用いて、酵素免疫測
定法によりマウスモノクローナル抗体ＫＭ５６５のサブ
クラスをＩｇＧ１　と決定した。

【００３３】（４）　マウス抗エンドセリンモノクロー
ナル抗体ＫＭ５６５の精製 プリスタン処理した８週令ヌード雌マウスに参考例（３
）　で得られたハイブリドーマ株ＫＭ５６５を５〜１０
×１０６　細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜２
１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたま
ったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍｌ／匹）し、遠
心分離（３，０００ｒｐｍ、５分）　して固形分を除去
後、５０％硫酸アンモニウムと４０％硫酸アンモニウム
で２回塩析し、０．０４Ｍリン酸緩衝液、０．０３Ｍ　
　ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）　で透析した。その後、ＤＥ
ＡＥセファロース〔ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）　社
製，ＤＥ５２〕に通塔し、溶出させＩｇＧ画分を集め、
精製モノクローナル抗体とした。

【００３４】

【発明の効果】本発明によれば、血清、尿などの検体中
のエンドセリン量を高感度に測定でき、種々のヒト疾病
の臨床診断に適用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例で得られたマウス抗エンドセリンモノク
ローナル抗体ＫＭ５６５と実施例１で得られたラット抗
エンドセリンモノクローナル抗体ＫＭ７１４（無標識）
との組み合わせによるサンドイッチ定量法により測定し
た標準直線を示す。

【図２】参考例で得られたマウス抗エンドセリンモノク
ローナル抗体ＫＭ５６５と実施例１で得られたビオチン
化標識ラット抗エンドセリンモノクローナル抗体ＫＭ７
１４との組み合わせによるサンドイッチ定量法により測
定した標準直線を示す。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　固相化した抗エンドセリンモノクロー
   ナル抗体に検体中のエンドセリン抗原を結合させ、つい
   で無標識もしくは標識物質で標識された抗エンドセリン
   モノクローナル抗体を該結合したエンドセリン抗原と結
   合させ、無標識の抗エンドセリンモノクローナル抗体を
   用いる場合は、さらに標識物質で標識された抗イムノグ
   ロブリン抗体を該結合した無標識の抗エンドセリンモノ
   クローナル抗体と結合させ、結合した標識物質の量を測
   定することを特徴とするエンドセリンの定量法。
2. 【請求項２】　　固相化した抗エンドセリンモノクロー
   ナル抗体が、マウス抗エンドセリンモノクローナル抗体
   ＫＭ５６５である請求項１記載のエンドセリンの定量法
   。
3. 【請求項３】　　無標識もしくは標識物質で標識された
   抗エンドセリンモノクローナル抗体が、ラット抗エンド
   セリンモノクローナル抗体ＫＭ７１４である請求項１記
   載のエンドセリンの定量法。
4. 【請求項４】　　固相化したマウス抗エンドセリンモノ
   クローナル抗体に検体中のエンドセリン抗原を結合させ
   、ついで無標識のラット抗エンドセリンモノクローナル
   抗体ＫＭ７１４を該結合したエンドセリン抗原と結合さ
   せ、さらに標識物質で標識されたラット抗イムノグロブ
   リン抗体を該結合したラット抗エンドセリンモノクロー
   ナル抗体ＫＭ７１４と結合させ、結合した標識物質の量
   を測定することを特徴とするエンドセリンの定量法。
5. 【請求項５】　　マウス抗エンドセリンモノクローナル
   抗体が、マウス抗エンドセリンモノクローナル抗体ＫＭ
   ５６５である請求項１記載のエンドセリンの定量法。
6. 【請求項６】　　ラット抗エンドセリンモノクローナル
   抗体ＫＭ７１４。
7. 【請求項７】　　ハイブリドーマ細胞株ＫＭ７１４（Ｆ
   ＥＲＭ　ＢＰ　−３２６５　）。