JPH04311385A - ハイブリドーマの製造法 - Google Patents
ハイブリドーマの製造法Info
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- JPH04311385A JPH04311385A JP3077518A JP7751891A JPH04311385A JP H04311385 A JPH04311385 A JP H04311385A JP 3077518 A JP3077518 A JP 3077518A JP 7751891 A JP7751891 A JP 7751891A JP H04311385 A JPH04311385 A JP H04311385A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N2510/02—Cells for production
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＩｇＭクラスのモノク
ローナル抗体を生産するハイブリドーマを、ＩｇＧクラ
スのモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマにク
ラススイッチさせることを特徴とするハイブリドーマの
製造法に関する。当該ハイブリドーマから生産されるＩ
ｇＧクラスのモノクローナル抗体は、ＩｇＭクラスのモ
ノクローナル抗体と比べて、種々の疾病の治療により広
く利用できる。
ローナル抗体を生産するハイブリドーマを、ＩｇＧクラ
スのモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマにク
ラススイッチさせることを特徴とするハイブリドーマの
製造法に関する。当該ハイブリドーマから生産されるＩ
ｇＧクラスのモノクローナル抗体は、ＩｇＭクラスのモ
ノクローナル抗体と比べて、種々の疾病の治療により広
く利用できる。
【０００２】
【従来の技術】抗体のクラスには、ＩｇＡ、ＩｇＭ、Ｉ
ｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＥがあり、さらにＩｇＧはマウ
スの場合、Ｇ１ 、Ｇ２ａ、Ｇ２ｂ、Ｇ３ （ヒトでは
Ｇ１ 、Ｇ２ 、Ｇ３ 、Ｇ４ ）の４つのサブクラス
に分れる。動物に抗原を免疫した場合、得られる抗体は
ほとんどＩｇＭかＩｇＧに属する。ＩｇＧが分子量およ
そ１６万で２量体構造を有し、比較的扱いやすい分子で
あるのに比べ、ＩｇＭは分子量がおよそ９０万という大
きな分子であり、Ｊ鎖でつながれた複雑な５量体構造を
有している。このため、精製が困難であること、凝集を
起こしやすく保存が難しいこと、蛋白分解酵素による部
分分解で失活しやすくＦａｂを作製することが難しいこ
と、抗癌剤や毒素などを化学結合させる等の化学修飾を
すると結合活性を失うことが多い等の欠点を有している
〔モノクローナル抗体：原理と実技、Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉ
ｎｇ著、アカデッミクプレス刊、１９８６年〕。また、
癌に対する治療効果において、ＩｇＧクラスのモノクロ
ーナル抗体とＩｇＭクラスのモノクローナル抗体のどち
らが優れているかについては、Ｉ．Ｄ．Ｂｅｒｎｓｔｅ
ｉｎ 等がリンパ球のＴｈｙ−１ 抗原に対するＩｇＧ
クラスとＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を用いて詳
細に検討している〔モノクローナル抗体、Ｒ．Ｈ．Ｋｅ
ｎｎｅｔ， Ｔ．Ｊ．ＭｃＫｅａｒｎ および Ｋ．Ｂ
．Ｂｅｃｈｔｏｌ編集、プレナムプレス刊、１９８０年
、２７５ 〜２９１ 頁〕。それによると、Ｔｈｙ−１
抗原陽性リンパ球に対し同じ強さの反応性を有するＩ
ｇＧクラスとＩｇＭクラスのモノクローナル抗体の抗腫
瘍効果において、ｉｎ ｖｉｔｒｏの補体依存性抗腫瘍
効果はＩｇＭモノクローナル抗体が優れていたにもかか
わらず、担癌マウスを用いて調べたｉｎ ｖｉｖｏ の
抗腫瘍効果は、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体が有
意な抗腫瘍効果を示したのに対し、ＩｇＭクラスのモノ
クローナル抗体は抗腫瘍効果を示さなかった。さらに、
マウスにアイソトープで標識したモノクローナル抗体を
投与して血中半減期を調べたところ、ＩｇＧクラスのモ
ノクローナル抗体に比べ、ＩｇＭクラスのモノクローナ
ル抗体は血中半減期が非常に短いことが明らかとなった
。このような実験事実は、ヒトの臨床に使われるモノク
ローナル抗体がＩｇＧクラスでなければならないことを
示している。
ｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＥがあり、さらにＩｇＧはマウ
スの場合、Ｇ１ 、Ｇ２ａ、Ｇ２ｂ、Ｇ３ （ヒトでは
Ｇ１ 、Ｇ２ 、Ｇ３ 、Ｇ４ ）の４つのサブクラス
に分れる。動物に抗原を免疫した場合、得られる抗体は
ほとんどＩｇＭかＩｇＧに属する。ＩｇＧが分子量およ
そ１６万で２量体構造を有し、比較的扱いやすい分子で
あるのに比べ、ＩｇＭは分子量がおよそ９０万という大
きな分子であり、Ｊ鎖でつながれた複雑な５量体構造を
有している。このため、精製が困難であること、凝集を
起こしやすく保存が難しいこと、蛋白分解酵素による部
分分解で失活しやすくＦａｂを作製することが難しいこ
と、抗癌剤や毒素などを化学結合させる等の化学修飾を
すると結合活性を失うことが多い等の欠点を有している
〔モノクローナル抗体：原理と実技、Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉ
ｎｇ著、アカデッミクプレス刊、１９８６年〕。また、
癌に対する治療効果において、ＩｇＧクラスのモノクロ
ーナル抗体とＩｇＭクラスのモノクローナル抗体のどち
らが優れているかについては、Ｉ．Ｄ．Ｂｅｒｎｓｔｅ
ｉｎ 等がリンパ球のＴｈｙ−１ 抗原に対するＩｇＧ
クラスとＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を用いて詳
細に検討している〔モノクローナル抗体、Ｒ．Ｈ．Ｋｅ
ｎｎｅｔ， Ｔ．Ｊ．ＭｃＫｅａｒｎ および Ｋ．Ｂ
．Ｂｅｃｈｔｏｌ編集、プレナムプレス刊、１９８０年
、２７５ 〜２９１ 頁〕。それによると、Ｔｈｙ−１
抗原陽性リンパ球に対し同じ強さの反応性を有するＩ
ｇＧクラスとＩｇＭクラスのモノクローナル抗体の抗腫
瘍効果において、ｉｎ ｖｉｔｒｏの補体依存性抗腫瘍
効果はＩｇＭモノクローナル抗体が優れていたにもかか
わらず、担癌マウスを用いて調べたｉｎ ｖｉｖｏ の
抗腫瘍効果は、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体が有
意な抗腫瘍効果を示したのに対し、ＩｇＭクラスのモノ
クローナル抗体は抗腫瘍効果を示さなかった。さらに、
マウスにアイソトープで標識したモノクローナル抗体を
投与して血中半減期を調べたところ、ＩｇＧクラスのモ
ノクローナル抗体に比べ、ＩｇＭクラスのモノクローナ
ル抗体は血中半減期が非常に短いことが明らかとなった
。このような実験事実は、ヒトの臨床に使われるモノク
ローナル抗体がＩｇＧクラスでなければならないことを
示している。
【０００３】糖脂質は、細胞膜の重要な構成成分であり
、細胞の癌化により量的、質的に変化することが知られ
ている〔キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．
）４５， ２４０５（１９８５）〕。このような糖脂
質に対するモノクローナル抗体を作製することは、癌の
治療や診断に有用であると考えられ、実際にその効果が
癌患者に投与されて検討されている〔ガングリオシド・
アンド・キャンサー、Ｈ．Ｆ．Ｏｅｔｔｇｅｎ 編、Ｖ
ＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ刊、１９８９年〕。しかし
、糖脂質等のように、Ｔ細胞非依存性の抗原に対するモ
ノクローナル抗体を作製する場合、多くの場合ＩｇＭク
ラスのモノクローナル抗体ができやすく、ＩｇＧクラス
のモノクローナル抗体はできにくいという問題点がある
〔ハイブリドーマ作製方法 Ａ．Ｈ．Ｂａｒｔａｌ
， Ｙ．Ｈｉｒｓｈａｕｔ 編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅ
ｓｓ刊、１９８７年〕。シアル酸をもつ糖脂質であるガ
ングリオシドの一種であるＧＭ２ は、正常細胞には極
微量にしか存在しないが、肺小細胞癌、メラノーマ、神
経芽細胞腫などの癌細胞では多量に存在するため、ＧＭ
２ に対するモノクローナル抗体は、これらの癌の治療
に有効であると考えられている〔ランセット（Ｌａｎｃ
ｅｔ）４８， ６１５４（１９８８）〕。しかし、現在
までに報告されているＧＭ２ に対するモノクローナル
抗体は全て、ＩｇＭクラスである〔キャンサー・リサー
チ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ）４６， ４１１６（１
９８６）、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ） ７９， ７６２９ （１９８２
）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）
４８， ６１５４（１９８８）、ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）２６４， １２１２２（１９８９）〕。
、細胞の癌化により量的、質的に変化することが知られ
ている〔キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．
）４５， ２４０５（１９８５）〕。このような糖脂
質に対するモノクローナル抗体を作製することは、癌の
治療や診断に有用であると考えられ、実際にその効果が
癌患者に投与されて検討されている〔ガングリオシド・
アンド・キャンサー、Ｈ．Ｆ．Ｏｅｔｔｇｅｎ 編、Ｖ
ＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ刊、１９８９年〕。しかし
、糖脂質等のように、Ｔ細胞非依存性の抗原に対するモ
ノクローナル抗体を作製する場合、多くの場合ＩｇＭク
ラスのモノクローナル抗体ができやすく、ＩｇＧクラス
のモノクローナル抗体はできにくいという問題点がある
〔ハイブリドーマ作製方法 Ａ．Ｈ．Ｂａｒｔａｌ
， Ｙ．Ｈｉｒｓｈａｕｔ 編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅ
ｓｓ刊、１９８７年〕。シアル酸をもつ糖脂質であるガ
ングリオシドの一種であるＧＭ２ は、正常細胞には極
微量にしか存在しないが、肺小細胞癌、メラノーマ、神
経芽細胞腫などの癌細胞では多量に存在するため、ＧＭ
２ に対するモノクローナル抗体は、これらの癌の治療
に有効であると考えられている〔ランセット（Ｌａｎｃ
ｅｔ）４８， ６１５４（１９８８）〕。しかし、現在
までに報告されているＧＭ２ に対するモノクローナル
抗体は全て、ＩｇＭクラスである〔キャンサー・リサー
チ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ）４６， ４１１６（１
９８６）、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ） ７９， ７６２９ （１９８２
）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）
４８， ６１５４（１９８８）、ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）２６４， １２１２２（１９８９）〕。
【０００４】以上のように、治療にはＩｇＧクラスのモ
ノクローナル抗体を使うことが重要であるという観点か
ら、最初にＩｇＭクラスのモノクローナル抗体が作成で
きた場合においても、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗
体を作成しなおすことが多い。しかしながら、前述した
ように糖脂質に対するモノクローナル抗体等のようにＩ
ｇＧクラスのモノクローナル抗体を作成することが困難
な場合は、ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を生産す
るハイブリドーマをＩｇＧクラスのモノクローナル抗体
を生産するようにクラススイッチさせることが必要とな
る。
ノクローナル抗体を使うことが重要であるという観点か
ら、最初にＩｇＭクラスのモノクローナル抗体が作成で
きた場合においても、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗
体を作成しなおすことが多い。しかしながら、前述した
ように糖脂質に対するモノクローナル抗体等のようにＩ
ｇＧクラスのモノクローナル抗体を作成することが困難
な場合は、ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を生産す
るハイブリドーマをＩｇＧクラスのモノクローナル抗体
を生産するようにクラススイッチさせることが必要とな
る。
【０００５】ハイブリドーマのクラススイッチについて
は、ＩｇＧクラスのサブタイプ（マウスの場合はＩｇＧ
１， ＩｇＧ２ａ， ＩｇＧ２ｂ， ＩｇＧ３）の間
でスイッチさせた報告は多いが、ＩｇＭからＩｇＧへの
クラススイッチについては、以下の２つの抗原について
の報告があるだけである。（１） フォスフォリルコリ
ンを抗原とするモノクローナル抗体の例で、ＩｇＭクラ
スのモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマをア
ガロースまたは９６ウェルプレート中でクローニングし
て、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を生産するハイ
ブリドーマへ自然にクラススイッチしたものを選択した
〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ） １３， ６１４
（１９８３）、ジャーナル・オブ・イミュノロジカル
・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）
７４， ３０７ （１９８４）、ジャーナル・オブ・イ
ミュノロジー （Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ） １４０
， ２６７５ （１９８８）〕。（２） 大腸菌由来の
リポサッカライドを抗原とする例で、ＩｇＭクラスのモ
ノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを９６ウェ
ルプレート中でクローニングして、ＩｇＧクラスのモノ
クローナル抗体を生産するハイブリドーマへ自然にクラ
ススイッチしたものを選択した〔ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・イミュノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．） １７， ４１３ （１９８７）、ヨーロピア
ン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．） １９， １３１ （１９８９）〕
。
は、ＩｇＧクラスのサブタイプ（マウスの場合はＩｇＧ
１， ＩｇＧ２ａ， ＩｇＧ２ｂ， ＩｇＧ３）の間
でスイッチさせた報告は多いが、ＩｇＭからＩｇＧへの
クラススイッチについては、以下の２つの抗原について
の報告があるだけである。（１） フォスフォリルコリ
ンを抗原とするモノクローナル抗体の例で、ＩｇＭクラ
スのモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマをア
ガロースまたは９６ウェルプレート中でクローニングし
て、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を生産するハイ
ブリドーマへ自然にクラススイッチしたものを選択した
〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ） １３， ６１４
（１９８３）、ジャーナル・オブ・イミュノロジカル
・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）
７４， ３０７ （１９８４）、ジャーナル・オブ・イ
ミュノロジー （Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ） １４０
， ２６７５ （１９８８）〕。（２） 大腸菌由来の
リポサッカライドを抗原とする例で、ＩｇＭクラスのモ
ノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを９６ウェ
ルプレート中でクローニングして、ＩｇＧクラスのモノ
クローナル抗体を生産するハイブリドーマへ自然にクラ
ススイッチしたものを選択した〔ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・イミュノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．） １７， ４１３ （１９８７）、ヨーロピア
ン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．） １９， １３１ （１９８９）〕
。
【０００６】しかしながら、これらの報告における方法
は、ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を生産するハイ
ブリドーマをＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を生産
するハイブリドーマに積極的にクラススイッチさせたも
のではなく、もともと自然にクラススイッチしたものを
クローニングにより選択しているにすぎない。従って、
この方法は、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を作成
しやすい抗原の場合には適用できるが、前述したような
ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を作成することが困
難な糖脂質抗原等の場合には適用することはできない。
は、ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を生産するハイ
ブリドーマをＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を生産
するハイブリドーマに積極的にクラススイッチさせたも
のではなく、もともと自然にクラススイッチしたものを
クローニングにより選択しているにすぎない。従って、
この方法は、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を作成
しやすい抗原の場合には適用できるが、前述したような
ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を作成することが困
難な糖脂質抗原等の場合には適用することはできない。
【０００７】また、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ等は、フォスフォ
リルコリンに対するＩｇＭクラスのモノクローナル抗体
を生産するリンホーマＢ細胞のクラススイッチがいかな
る処理で高率に起きるかを検討した〔インターナショナ
ル・イミュノロジー（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．） ３
， ９５， １９９１〕。すなわち、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ
等は、リンホーマＢ細胞をインターロイキン４、インタ
ーロイキン５、インターロイキン６、インターフェロン
ガンマー、ＴＧＦ ベーター、ヒドロキシウレア、コレ
ラトキシン、または非精製の抗原であるヒツジ赤血球の
存在下で培養することを試みた。その結果、ＴＧＦベー
ターを用いた場合は、ＩｇＭクラスからＩｇＡクラスへ
のクラススイッチが高率に起き、インターロイキン４と
コレラトキシンを用いた場合でもＩｇＭクラスからＩｇ
Ａクラスへのクラススイッチが増加することが判明した
。一方、ＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチは、イン
ターロイキン４、ＴＧＦ ベーター、コレラトキシンの
処理で若干効果がある傾向が認められたが、十分な量の
ＩｇＧクラスのイミュノグロブリンの生産が認められず
、統計学的にも無処理群との間で有意差がなかった。こ
のように、ハイブリドーマよりもクラススイッチを起こ
しやすいと考えられるリンホーマＢ細胞でもＩｇＭから
ＩｇＧへのクラススイッチを高率に起こすような方法は
今までに報告されていない。
リルコリンに対するＩｇＭクラスのモノクローナル抗体
を生産するリンホーマＢ細胞のクラススイッチがいかな
る処理で高率に起きるかを検討した〔インターナショナ
ル・イミュノロジー（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．） ３
， ９５， １９９１〕。すなわち、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ
等は、リンホーマＢ細胞をインターロイキン４、インタ
ーロイキン５、インターロイキン６、インターフェロン
ガンマー、ＴＧＦ ベーター、ヒドロキシウレア、コレ
ラトキシン、または非精製の抗原であるヒツジ赤血球の
存在下で培養することを試みた。その結果、ＴＧＦベー
ターを用いた場合は、ＩｇＭクラスからＩｇＡクラスへ
のクラススイッチが高率に起き、インターロイキン４と
コレラトキシンを用いた場合でもＩｇＭクラスからＩｇ
Ａクラスへのクラススイッチが増加することが判明した
。一方、ＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチは、イン
ターロイキン４、ＴＧＦ ベーター、コレラトキシンの
処理で若干効果がある傾向が認められたが、十分な量の
ＩｇＧクラスのイミュノグロブリンの生産が認められず
、統計学的にも無処理群との間で有意差がなかった。こ
のように、ハイブリドーマよりもクラススイッチを起こ
しやすいと考えられるリンホーマＢ細胞でもＩｇＭから
ＩｇＧへのクラススイッチを高率に起こすような方法は
今までに報告されていない。
【０００８】ハイブリドーマは数万分の一個から数百億
分の一個の確率で、自然にクラススイッチしたモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマに変わると言われ
ている〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロ
ジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．） １７，４１３
（１９８７）〕。クラススイッチしたモノクローナル
抗体を採取する方法としては、このように自然に変化し
たハイブリドーマを無変化の大集団のハイブリドーマの
中から選択し、それのみを増殖させることが必要となる
。選択方法としてはアガロース培地や９６ウェルプレー
トを用いてハイブリドーマをクローニングし、変化した
ハイブリドーマを一個一個探していくシブ選択法〔ジャ
ーナル・オブ・イミュノロジー （Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．） １３１， ８７７ （１９８３）〕、およびフロ
ーサイトメトリーを用いて変化したハイブリドーマを数
百から数千個の単位で分取する方法が知られている〔ジ
ャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ） ５２， １ （１９
８２）〕。しかしながら、いずれの方法もハイブリドー
マが自然に変化する確率自体が低いので、とくに変化す
る確率が低いと考えられるＩｇＭクラスからＩｇＧクラ
スへのクラススイッチの場合に用いることは難しい。従
って、この方法を糖脂質等のＩｇＧクラスのモノクロー
ナル抗体を得るのが困難な抗原の場合に適用することは
できない。
分の一個の確率で、自然にクラススイッチしたモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマに変わると言われ
ている〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロ
ジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．） １７，４１３
（１９８７）〕。クラススイッチしたモノクローナル
抗体を採取する方法としては、このように自然に変化し
たハイブリドーマを無変化の大集団のハイブリドーマの
中から選択し、それのみを増殖させることが必要となる
。選択方法としてはアガロース培地や９６ウェルプレー
トを用いてハイブリドーマをクローニングし、変化した
ハイブリドーマを一個一個探していくシブ選択法〔ジャ
ーナル・オブ・イミュノロジー （Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．） １３１， ８７７ （１９８３）〕、およびフロ
ーサイトメトリーを用いて変化したハイブリドーマを数
百から数千個の単位で分取する方法が知られている〔ジ
ャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ） ５２， １ （１９
８２）〕。しかしながら、いずれの方法もハイブリドー
マが自然に変化する確率自体が低いので、とくに変化す
る確率が低いと考えられるＩｇＭクラスからＩｇＧクラ
スへのクラススイッチの場合に用いることは難しい。従
って、この方法を糖脂質等のＩｇＧクラスのモノクロー
ナル抗体を得るのが困難な抗原の場合に適用することは
できない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、糖脂
質等のＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を得ることが
困難な抗原に対するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体
を生産するハイブリドーマを得る方法を提供することに
ある。
質等のＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を得ることが
困難な抗原に対するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体
を生産するハイブリドーマを得る方法を提供することに
ある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＩｇＭクラス
に属するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ
を、当該抗体と反応する抗原、および胸腺細胞存在下に
培養することを特徴とするＩｇＧクラスのモノクローナ
ル抗体を生産するハイブリドーマの製造法に関する。
に属するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ
を、当該抗体と反応する抗原、および胸腺細胞存在下に
培養することを特徴とするＩｇＧクラスのモノクローナ
ル抗体を生産するハイブリドーマの製造法に関する。
【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。（１）ハ
イブリドーマの抗原刺激ＩｇＭクラスに属するモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマ１×１０４ 〜１
×１０６ 個／ｍｌを胸腺細胞存在下に培養する。Ｉｇ
Ｍクラスに属するモノクローナル抗体を生産するハイブ
リドーマとしては、例えば、ガングリオシドＧＭ２ 、
シアリルＬｅＸ 、ＬｅＸ 、ＬｅＹ 等の糖脂質に対
するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ等が
あげられる。糖脂質を抗原とするモノクローナル抗体を
生産するハイブリドーマとしては、例えば、ガングリオ
シドＧＭ２ と反応するモノクローナル抗体を生産する
ラットハイブリドーマＫＭ−６０２、ＫＭ−６０３、Ｋ
Ｍ−６０４、ＫＭ−６０５およびＫＭ−６０６、マウス
ハイブリドーマＫＭ−５３１、ＫＭ−６９３、ＫＭ−６
９４、ＫＭ−６９５、ＫＭ−６９６およびＫＭ−６９７
等があげられる。 ハイブリドーマＫＭ−５３１、ＫＭ−６０３は、それぞ
れ平成元年９月１４日、平成元年１０月３１日付けで、
ＫＭ−６９６およびＫＭ−６９７は、平成３年４月２日
付けで、工業技術院微生物工業技術研究所にそれぞれ、
ＦＥＲＭ ＢＰ−２５９７、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６３６
、ＦＥＲＭ ＢＰ−３３３７、ＦＥＲＭ ＢＰ−３３３
８として寄託されている。胸腺細胞としては、例えば、
マウス由来の胸腺細胞があげられ、１×１０６ 〜１×
１０８ 個／ｍｌ用いる。ハイブリドーマを胸腺細胞存
在下に培養する際、当該ハイブリドーマが生産する抗体
と反応する抗原を培養液に加えて抗原刺激を行なう。抗
原の濃度は１０〜１×１０３ ｎｇ／ｍｌであり、一回
の抗原刺激に必要な培養時間は５日間から７日間である
。抗原は、リポソームに封入して培養液に加えるのが好
ましい。リポソームは、ジパルミトイルフォスファチジ
ルコリン、ジパルミトイルフォスファチジリックアシド
等のリン脂質およびコレステロールを用いて作製するが
、リン脂質およびコレステロールは数種を組み合わせて
用いるのが好ましい。また、リピッドＡなどのマイトジ
ェンを加えて作製すると抗原刺激はより効果的になる。 抗原刺激は、通常一回では不十分であり、６〜１０回程
度必要である。
イブリドーマの抗原刺激ＩｇＭクラスに属するモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマ１×１０４ 〜１
×１０６ 個／ｍｌを胸腺細胞存在下に培養する。Ｉｇ
Ｍクラスに属するモノクローナル抗体を生産するハイブ
リドーマとしては、例えば、ガングリオシドＧＭ２ 、
シアリルＬｅＸ 、ＬｅＸ 、ＬｅＹ 等の糖脂質に対
するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ等が
あげられる。糖脂質を抗原とするモノクローナル抗体を
生産するハイブリドーマとしては、例えば、ガングリオ
シドＧＭ２ と反応するモノクローナル抗体を生産する
ラットハイブリドーマＫＭ−６０２、ＫＭ−６０３、Ｋ
Ｍ−６０４、ＫＭ−６０５およびＫＭ−６０６、マウス
ハイブリドーマＫＭ−５３１、ＫＭ−６９３、ＫＭ−６
９４、ＫＭ−６９５、ＫＭ−６９６およびＫＭ−６９７
等があげられる。 ハイブリドーマＫＭ−５３１、ＫＭ−６０３は、それぞ
れ平成元年９月１４日、平成元年１０月３１日付けで、
ＫＭ−６９６およびＫＭ−６９７は、平成３年４月２日
付けで、工業技術院微生物工業技術研究所にそれぞれ、
ＦＥＲＭ ＢＰ−２５９７、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６３６
、ＦＥＲＭ ＢＰ−３３３７、ＦＥＲＭ ＢＰ−３３３
８として寄託されている。胸腺細胞としては、例えば、
マウス由来の胸腺細胞があげられ、１×１０６ 〜１×
１０８ 個／ｍｌ用いる。ハイブリドーマを胸腺細胞存
在下に培養する際、当該ハイブリドーマが生産する抗体
と反応する抗原を培養液に加えて抗原刺激を行なう。抗
原の濃度は１０〜１×１０３ ｎｇ／ｍｌであり、一回
の抗原刺激に必要な培養時間は５日間から７日間である
。抗原は、リポソームに封入して培養液に加えるのが好
ましい。リポソームは、ジパルミトイルフォスファチジ
ルコリン、ジパルミトイルフォスファチジリックアシド
等のリン脂質およびコレステロールを用いて作製するが
、リン脂質およびコレステロールは数種を組み合わせて
用いるのが好ましい。また、リピッドＡなどのマイトジ
ェンを加えて作製すると抗原刺激はより効果的になる。 抗原刺激は、通常一回では不十分であり、６〜１０回程
度必要である。
【００１２】（２）クラススイッチしたハイブリドーマ
の分取（１）で抗原刺激したハイブリドーマから、Ｉｇ
Ｇクラスのモノクローナル抗体を生産するハイブリドー
マを分取する。分取は、アガロース培地や９６ウェルプ
レートを用いてハイブリドーマをクローニングし、変化
したハイブリドーマを一個一個探していくシブ選択法〔
ジャーナル・オブ・イミュノロジー （Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．） １３１， ８７７ （１９８３）〕、および
フローサイトメトリーを用いて変化したハイブリドーマ
を数百から数千個の単位で分取する方法〔ジャーナル・
オブ・イミュノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ） ５２， １ （１９８２）〕に
よって行うが、効率的に分取するには、フローサイトメ
トリーによる方法が好ましい。以下、フローサイトメト
リーによる分取法について説明する。
の分取（１）で抗原刺激したハイブリドーマから、Ｉｇ
Ｇクラスのモノクローナル抗体を生産するハイブリドー
マを分取する。分取は、アガロース培地や９６ウェルプ
レートを用いてハイブリドーマをクローニングし、変化
したハイブリドーマを一個一個探していくシブ選択法〔
ジャーナル・オブ・イミュノロジー （Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．） １３１， ８７７ （１９８３）〕、および
フローサイトメトリーを用いて変化したハイブリドーマ
を数百から数千個の単位で分取する方法〔ジャーナル・
オブ・イミュノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ） ５２， １ （１９８２）〕に
よって行うが、効率的に分取するには、フローサイトメ
トリーによる方法が好ましい。以下、フローサイトメト
リーによる分取法について説明する。
【００１３】フローサイトメトリーによる分取を行うた
めには、クラススイッチさせるハイブリドーマの細胞表
面に、分泌するモノクローナル抗体と同一のクラスに属
し、同一の結合特異性を有するイミュノグロブリン分子
を持っていることが必要である。そこで、抗原刺激をす
る前に、細胞表面のイミュノグロブリン分子の有無をＦ
ＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙ
ａｎａｔｅ）等の蛍光色素を標識した抗ＩｇＭ抗体（以
下、ＦＩＴＣ−ａｎｔｉ−ＩｇＭと略記する。）を用い
て調べる。すなわち、ハイブリドーマにＦＩＴＣ−ａｎ
ｔｉ−ＩｇＭを反応させ、蛍光顕微鏡による観察やフロ
ーサイトメトリーによる解析により、細胞表面の蛍光強
度を測定し、十分な数のＩｇＭクラスのイミュノグロブ
リン分子を細胞表面に持つハイブリドーマを選択する。
めには、クラススイッチさせるハイブリドーマの細胞表
面に、分泌するモノクローナル抗体と同一のクラスに属
し、同一の結合特異性を有するイミュノグロブリン分子
を持っていることが必要である。そこで、抗原刺激をす
る前に、細胞表面のイミュノグロブリン分子の有無をＦ
ＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙ
ａｎａｔｅ）等の蛍光色素を標識した抗ＩｇＭ抗体（以
下、ＦＩＴＣ−ａｎｔｉ−ＩｇＭと略記する。）を用い
て調べる。すなわち、ハイブリドーマにＦＩＴＣ−ａｎ
ｔｉ−ＩｇＭを反応させ、蛍光顕微鏡による観察やフロ
ーサイトメトリーによる解析により、細胞表面の蛍光強
度を測定し、十分な数のＩｇＭクラスのイミュノグロブ
リン分子を細胞表面に持つハイブリドーマを選択する。
【００１４】（１）の抗原刺激終了後、一千万から一億
個のハイブリドーマに蛍光色素を標識した抗ＩｇＧ抗体
（以下、ＦＩＴＣ−ａｎｔｉ−ＩｇＧと略記する。）ま
たは蛍光色素を標識したプロテインＡ（以下、ＦＩＴＣ
−ｐｒｏｔｅｉｎ Ａと略記する。）または蛍光色素
を標識したプロテインＧ（以下、ＦＩＴＣ−ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｇと略記する。）を反応させる。反応後、ハイ
ブリドーマをフローサイトメトリーにかけ、レーザー光
をあてることにより蛍光強度の測定を行なう。蛍光強度
の強いハイブリドーマにプラスまたはマイナスの電荷を
与え、偏向板の間にハイブリドーマを高速で流すことに
より電荷を持ったハイブリドーマだけを選択的に分取す
る。抗原刺激の回数が不足している場合は、蛍光強度の
強いハイブリドーマはほとんど検知できないが、横軸に
蛍光強度、縦軸に細胞数をプロットして得られる分布曲
線上で蛍光強度の強い方にずれている細胞集団（全体の
ハイブリドーマ数の数パーセントに相当する。）を分取
し、再び抗原で刺激し、フローサイトメトリーにかける
。抗原刺激の回数が増すに従って、蛍光強度の強い細胞
集団が明確に出現し、分布曲線は二つの山（ピーク）に
なるので、この段階に達したら蛍光強度の強い方のピー
クの細胞集団を分取する。
個のハイブリドーマに蛍光色素を標識した抗ＩｇＧ抗体
（以下、ＦＩＴＣ−ａｎｔｉ−ＩｇＧと略記する。）ま
たは蛍光色素を標識したプロテインＡ（以下、ＦＩＴＣ
−ｐｒｏｔｅｉｎ Ａと略記する。）または蛍光色素
を標識したプロテインＧ（以下、ＦＩＴＣ−ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｇと略記する。）を反応させる。反応後、ハイ
ブリドーマをフローサイトメトリーにかけ、レーザー光
をあてることにより蛍光強度の測定を行なう。蛍光強度
の強いハイブリドーマにプラスまたはマイナスの電荷を
与え、偏向板の間にハイブリドーマを高速で流すことに
より電荷を持ったハイブリドーマだけを選択的に分取す
る。抗原刺激の回数が不足している場合は、蛍光強度の
強いハイブリドーマはほとんど検知できないが、横軸に
蛍光強度、縦軸に細胞数をプロットして得られる分布曲
線上で蛍光強度の強い方にずれている細胞集団（全体の
ハイブリドーマ数の数パーセントに相当する。）を分取
し、再び抗原で刺激し、フローサイトメトリーにかける
。抗原刺激の回数が増すに従って、蛍光強度の強い細胞
集団が明確に出現し、分布曲線は二つの山（ピーク）に
なるので、この段階に達したら蛍光強度の強い方のピー
クの細胞集団を分取する。
【００１５】（３）クローニング（２）で得られた蛍光
強度の強いハイブリドーマを適当な細胞濃度に希釈して
、９６ウェルプレートに分注して培養する。この時の細
胞希釈濃度は９６ウェルプレートの一ウェルに一細胞ま
たは、二ウェルに一細胞になるようにするのが好ましい
（限界希釈法によるクローニング）。また、胸腺細胞１
×１０４ 〜１×１０７ 個／ｍｌを加えて培養すると
培養効率がよい。１〜２週間の培養後に培養上清の一部
をとり、酵素免疫測定法等によりＩｇＧクラスのモノク
ローナル抗体が生産されているウェルとＩｇＭクラスの
モノクローナル抗体が生産されているウェルの割合を調
べる。ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体が生産されて
いるウェルがある場合は、ＩｇＧクラスのモノクローナ
ル抗体が生産されているウェルのハイブリドーマをもう
一度、限界希釈法でクローニングする。このようにして
、ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体が生産されている
ウェルがなくなり、９０％以上のウェルにＩｇＧクラス
のモノクローナル抗体の生産が認められるようになるま
で、限界希釈法によるクローニングを繰り返す。最終的
にＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を最もよく生産し
ているウェルをクラススイッチしたハイブリドーマとし
て選択する。ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を生産
するハイブリドーマにクラススイッチしたハイブリドー
マとしては、例えば、ＫＭ−７５０、ＫＭ−７９６等の
ガングリオシドＧＭ２ に対するモノクローナル抗体を
生産するハイブリドーマ等があげられる。ハイブリドー
マＫＭ−７５０およびＫＭ−７９６は平成３年４月２日
付けで工業技術院微生物工業技術研究所にそれぞれＦＥ
ＲＭ ＢＰ−３３３９、ＦＥＲＭ ＢＰ−３３４０とし
て寄託されている。
強度の強いハイブリドーマを適当な細胞濃度に希釈して
、９６ウェルプレートに分注して培養する。この時の細
胞希釈濃度は９６ウェルプレートの一ウェルに一細胞ま
たは、二ウェルに一細胞になるようにするのが好ましい
（限界希釈法によるクローニング）。また、胸腺細胞１
×１０４ 〜１×１０７ 個／ｍｌを加えて培養すると
培養効率がよい。１〜２週間の培養後に培養上清の一部
をとり、酵素免疫測定法等によりＩｇＧクラスのモノク
ローナル抗体が生産されているウェルとＩｇＭクラスの
モノクローナル抗体が生産されているウェルの割合を調
べる。ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体が生産されて
いるウェルがある場合は、ＩｇＧクラスのモノクローナ
ル抗体が生産されているウェルのハイブリドーマをもう
一度、限界希釈法でクローニングする。このようにして
、ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体が生産されている
ウェルがなくなり、９０％以上のウェルにＩｇＧクラス
のモノクローナル抗体の生産が認められるようになるま
で、限界希釈法によるクローニングを繰り返す。最終的
にＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を最もよく生産し
ているウェルをクラススイッチしたハイブリドーマとし
て選択する。ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を生産
するハイブリドーマにクラススイッチしたハイブリドー
マとしては、例えば、ＫＭ−７５０、ＫＭ−７９６等の
ガングリオシドＧＭ２ に対するモノクローナル抗体を
生産するハイブリドーマ等があげられる。ハイブリドー
マＫＭ−７５０およびＫＭ−７９６は平成３年４月２日
付けで工業技術院微生物工業技術研究所にそれぞれＦＥ
ＲＭ ＢＰ−３３３９、ＦＥＲＭ ＢＰ−３３４０とし
て寄託されている。
【００１６】（４）モノクローナル抗体の調製（３）で
選択したクラススイッチしたハイブリドーマをローラー
ボトルやスピンナー等を用いて２〜７日間培養した後、
遠心分離して培養上清を集める。これをプロテインＡカ
ラムやプロテインＧカラムに通塔後、吸着したＩｇＧク
ラスのモノクローナル抗体を溶出し、精製モノクローナ
ル抗体とする。得られるモノクロ−ナル抗体としては、
例えば、ハイブリドーマＫＭ−７５０、ＫＭ−７９６よ
りそれぞれ生産されるガングリオシドＧＭ２ に対する
モノクローナル抗体ＫＭ−７５０、ＫＭ−７９６等があ
げられる。得られるモノクローナル抗体がＩｇＧクラス
であることをＳＤＳ電気泳動等で調べる。また、プリス
タン〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン
（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）〕０．５ｍｌ を腹腔内投与し、
３日から２週間飼育したマウスに、ハイブリドーマを腹
腔内投与して得られる腹水からも同様に、プロテインＡ
カラムやプロテインＧカラムを用いて精製抗体を調製で
きる。モノクローナル抗体のサブクラスは、サブクラス
タイピングキットを用いた酵素免疫測定法や免疫沈降を
利用したオクタロニー法で決定する。蛋白量の決定は、
ローリー法や２８０ｎｍ の吸光度より算出する。
選択したクラススイッチしたハイブリドーマをローラー
ボトルやスピンナー等を用いて２〜７日間培養した後、
遠心分離して培養上清を集める。これをプロテインＡカ
ラムやプロテインＧカラムに通塔後、吸着したＩｇＧク
ラスのモノクローナル抗体を溶出し、精製モノクローナ
ル抗体とする。得られるモノクロ−ナル抗体としては、
例えば、ハイブリドーマＫＭ−７５０、ＫＭ−７９６よ
りそれぞれ生産されるガングリオシドＧＭ２ に対する
モノクローナル抗体ＫＭ−７５０、ＫＭ−７９６等があ
げられる。得られるモノクローナル抗体がＩｇＧクラス
であることをＳＤＳ電気泳動等で調べる。また、プリス
タン〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン
（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）〕０．５ｍｌ を腹腔内投与し、
３日から２週間飼育したマウスに、ハイブリドーマを腹
腔内投与して得られる腹水からも同様に、プロテインＡ
カラムやプロテインＧカラムを用いて精製抗体を調製で
きる。モノクローナル抗体のサブクラスは、サブクラス
タイピングキットを用いた酵素免疫測定法や免疫沈降を
利用したオクタロニー法で決定する。蛋白量の決定は、
ローリー法や２８０ｎｍ の吸光度より算出する。
【００１７】（５）モノクローナル抗体の活性と反応特
異性の検討モノクローナル抗体の活性と反応特異性は、
酵素免疫測定法やラジオイミュノアッセイ法 （抗体実
験マニュアル、 Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ， Ｄ．Ｌａｎｅ
編、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ刊、１９８８年） を用いて測定する。
異性の検討モノクローナル抗体の活性と反応特異性は、
酵素免疫測定法やラジオイミュノアッセイ法 （抗体実
験マニュアル、 Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ， Ｄ．Ｌａｎｅ
編、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ刊、１９８８年） を用いて測定する。
【００１８】以下に本発明の実施例を示す。
【００１９】
【実施例】（１）ハイブリドーマの選択ガングリオシド
ＧＭ２ と反応するＩｇＭクラスのモノクローナル抗体
を生産するラットハイブリドーマＫＭ−６０２，ＫＭ−
６０３，ＫＭ−６０４，ＫＭ−６０５およびＫＭ−６０
６およびマウスハイブリドーマＫＭ−５３１， ＫＭ−
６９３， ＫＭ−６９４， ＫＭ−６９５， ＫＭ−６
９６およびＫＭ−６９７について、細胞表面のイミュノ
グロブリンの存在の有無を調べた。すなわち、ハイブリ
ドーマ約百万個に、２００ μｌ のＦＩＴＣ−ａｎｔ
ｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（０．５ｍｇ／ｍｌ
，フナコシ社製）の３２倍希釈液またはＦＩＴＣ−ａｎ
ｔｉ−ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＤＡＫＯ社製）２０
０倍希釈液を加え、４ ℃で３０分間反応させた。反応
後、ハイブリドーマを、冷やしたＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ， ｐＨ７．
２） で２回洗浄後、約６ｍｌ のＰＢＳ に懸濁し、
フローサイトメトリー（ＦＣＳ−１，日本分光社製）を
用いて蛍光強度を測定した。その結果、ハイブリドーマ
ＫＭ−６０２， ＫＭ−６０３， ＫＭ−６０４， Ｋ
Ｍ−６０５， ＫＭ−６０６には、細胞表面にイミュノ
グロブリンはＩｇＭクラス、ＩｇＧクラスとも認められ
なかった。ハイブリドーマＫＭ−５３１， ＫＭ−６９
３， ＫＭ−６９４， ＫＭ−６９５， ＫＭ−６９６
， ＫＭ−６９７には、細胞表面にフローサイトメトリ
ーによる分取を行なうのに十分な数のＩｇＭクラスのイ
ミュノグロブリンが認められた。しかし、これらのハイ
ブリドーマには、細胞表面にＦＩＴＣ−ａｎｔｉ ｍｏ
ｕｓｅ γ ｃｈａｉｎ（フナコシ社製）と反応するよ
うなＩｇＧクラスのイミュノグロブリンは全く認められ
なかった。細胞表面にイミュノグロブリンのあったハイ
ブリドーマのなかから、抗原に対する反応性が強く、か
つ抗原特異性も高いＫＭ−６９６とＫＭ−６９７を選択
し、以後の実験に供した。ハイブリドーマＫＭ−６９６
から生産されるモノクローナル抗体ＫＭ−６９６はＮ−
アセチルＧＭ２ と特異的に反応し、Ｎ−アセチルＧＭ
３ 、Ｎ−グリコリルＧＭ３ 、Ｎ−グリコリルＧＭ２
、ＧＭ１ 、ＧＤ１ 、ＧＤ２ 、ＧＤ３ 、ＧＤ１
ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ等のガングリオシド
に対しては反応しなかった。ハイブリドーマＫＭ−６９
７から生産されるモノクローナル抗体ＫＭ−６９７はＮ
−アセチルＧＭ２ およびＮ−グリコリルＧＭ２ と特
異的に反応し、Ｎ−アセチルＧＭ３ 、Ｎ−グリコリル
ＧＭ３ 、ＧＭ１ 、ＧＤ１ 、ＧＤ２ 、ＧＤ３ 、
ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ等のガングリ
オシドに対しては反応しなかった。
ＧＭ２ と反応するＩｇＭクラスのモノクローナル抗体
を生産するラットハイブリドーマＫＭ−６０２，ＫＭ−
６０３，ＫＭ−６０４，ＫＭ−６０５およびＫＭ−６０
６およびマウスハイブリドーマＫＭ−５３１， ＫＭ−
６９３， ＫＭ−６９４， ＫＭ−６９５， ＫＭ−６
９６およびＫＭ−６９７について、細胞表面のイミュノ
グロブリンの存在の有無を調べた。すなわち、ハイブリ
ドーマ約百万個に、２００ μｌ のＦＩＴＣ−ａｎｔ
ｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（０．５ｍｇ／ｍｌ
，フナコシ社製）の３２倍希釈液またはＦＩＴＣ−ａｎ
ｔｉ−ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＤＡＫＯ社製）２０
０倍希釈液を加え、４ ℃で３０分間反応させた。反応
後、ハイブリドーマを、冷やしたＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ， ｐＨ７．
２） で２回洗浄後、約６ｍｌ のＰＢＳ に懸濁し、
フローサイトメトリー（ＦＣＳ−１，日本分光社製）を
用いて蛍光強度を測定した。その結果、ハイブリドーマ
ＫＭ−６０２， ＫＭ−６０３， ＫＭ−６０４， Ｋ
Ｍ−６０５， ＫＭ−６０６には、細胞表面にイミュノ
グロブリンはＩｇＭクラス、ＩｇＧクラスとも認められ
なかった。ハイブリドーマＫＭ−５３１， ＫＭ−６９
３， ＫＭ−６９４， ＫＭ−６９５， ＫＭ−６９６
， ＫＭ−６９７には、細胞表面にフローサイトメトリ
ーによる分取を行なうのに十分な数のＩｇＭクラスのイ
ミュノグロブリンが認められた。しかし、これらのハイ
ブリドーマには、細胞表面にＦＩＴＣ−ａｎｔｉ ｍｏ
ｕｓｅ γ ｃｈａｉｎ（フナコシ社製）と反応するよ
うなＩｇＧクラスのイミュノグロブリンは全く認められ
なかった。細胞表面にイミュノグロブリンのあったハイ
ブリドーマのなかから、抗原に対する反応性が強く、か
つ抗原特異性も高いＫＭ−６９６とＫＭ−６９７を選択
し、以後の実験に供した。ハイブリドーマＫＭ−６９６
から生産されるモノクローナル抗体ＫＭ−６９６はＮ−
アセチルＧＭ２ と特異的に反応し、Ｎ−アセチルＧＭ
３ 、Ｎ−グリコリルＧＭ３ 、Ｎ−グリコリルＧＭ２
、ＧＭ１ 、ＧＤ１ 、ＧＤ２ 、ＧＤ３ 、ＧＤ１
ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ等のガングリオシド
に対しては反応しなかった。ハイブリドーマＫＭ−６９
７から生産されるモノクローナル抗体ＫＭ−６９７はＮ
−アセチルＧＭ２ およびＮ−グリコリルＧＭ２ と特
異的に反応し、Ｎ−アセチルＧＭ３ 、Ｎ−グリコリル
ＧＭ３ 、ＧＭ１ 、ＧＤ１ 、ＧＤ２ 、ＧＤ３ 、
ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ等のガングリ
オシドに対しては反応しなかった。
【００２０】（２）ハイブリドーマの抗原刺激とフロー
サイトメトリーによる分取まず、ＧＭ２ 封入リポソー
ムを以下の方法で作製した。０．５ μｍｏｌ ジパル
ミトイルフォスファチジルコリン（シグマ社製）、０．
０５μｍｏｌ ジパルミトイルフォスファチジリックア
シド（シグマ社製）、０．５ μｍｏｌ コレステロー
ル（ナカライテスク社製）、２．５ μｇ リピッドＡ
（フナコシ社製）および２．０ μｇ ガングリオシド
ＧＭ２（ベーリンガー・マンハイム社製）をクロロホル
ムに溶解した後、減圧下に溶媒を留去し薄膜を作製した
。これに、０．５ｍｌ のＰＢＳ を加え、５０〜６０
℃で加熱した後、ミキサーを用いて攪拌し、１０分間の
超音波処理を行ない、ＧＭ２ 封入リポソームを作製し
た。
サイトメトリーによる分取まず、ＧＭ２ 封入リポソー
ムを以下の方法で作製した。０．５ μｍｏｌ ジパル
ミトイルフォスファチジルコリン（シグマ社製）、０．
０５μｍｏｌ ジパルミトイルフォスファチジリックア
シド（シグマ社製）、０．５ μｍｏｌ コレステロー
ル（ナカライテスク社製）、２．５ μｇ リピッドＡ
（フナコシ社製）および２．０ μｇ ガングリオシド
ＧＭ２（ベーリンガー・マンハイム社製）をクロロホル
ムに溶解した後、減圧下に溶媒を留去し薄膜を作製した
。これに、０．５ｍｌ のＰＢＳ を加え、５０〜６０
℃で加熱した後、ミキサーを用いて攪拌し、１０分間の
超音波処理を行ない、ＧＭ２ 封入リポソームを作製し
た。
【００２１】次に、抗原刺激をしていないそれぞれ２
〜３ 千万個のハイブリドーマＫＭ−６９６とＫＭ−６
９７に２００ μｌ のＦＩＴＣ−ａｎｔｉ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ａ（５ｍｇ／ｍｌ，ベーリンガー・マンハイム
社製）の２０倍希釈液を４ ℃で３０分間反応させた。 反応後、ハイブリドーマを冷やしたＰＢＳ で２回洗浄
後、６ｍｌ のＰＢＳ に懸濁してフローサイトメトリ
ーに供した。
〜３ 千万個のハイブリドーマＫＭ−６９６とＫＭ−６
９７に２００ μｌ のＦＩＴＣ−ａｎｔｉ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ａ（５ｍｇ／ｍｌ，ベーリンガー・マンハイム
社製）の２０倍希釈液を４ ℃で３０分間反応させた。 反応後、ハイブリドーマを冷やしたＰＢＳ で２回洗浄
後、６ｍｌ のＰＢＳ に懸濁してフローサイトメトリ
ーに供した。
【００２２】フローサイトメトリーにおいて、蛍光強度
の強いハイブリドーマの集団は検知できなかったが、横
軸に蛍光強度、縦軸に細胞数をプロットして得られる分
布曲線上で蛍光強度の強い方にずれている数十万個の細
胞集団を分取した。分取したハイブリドーマをそれぞれ
数十万個、２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）を用い
、マウス胸腺細胞（３ 〜４ 週令マウス胸腺細胞全体
の５０分の１ 程度の細胞数）存在下で１０％牛胎児血
清（ＣＳＬ 社製）を含む１〜１．５ｍｌ ＲＰＭＩ１
６４０培地（日水製薬社製）中で培養した。その際、Ｇ
Ｍ２ 封入リポソームをＧＭ２ の最終濃度が５００
ｎｇ／ｍｌになるように加えて抗原刺激を行なった。対
照として、抗原刺激をせずに培養を行ない、ＦＩＴＣ−
ａｎｔｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａと反応させ、再びフロー
サイトメトリーに供する操作をそれぞれのハイブリドー
マについて１５回繰り返した。この抗原刺激を行わない
培養では、ＦＩＴＣ−ａｎｔｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａに
反応して蛍光強度が増す細胞集団は出現しなかった。
の強いハイブリドーマの集団は検知できなかったが、横
軸に蛍光強度、縦軸に細胞数をプロットして得られる分
布曲線上で蛍光強度の強い方にずれている数十万個の細
胞集団を分取した。分取したハイブリドーマをそれぞれ
数十万個、２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）を用い
、マウス胸腺細胞（３ 〜４ 週令マウス胸腺細胞全体
の５０分の１ 程度の細胞数）存在下で１０％牛胎児血
清（ＣＳＬ 社製）を含む１〜１．５ｍｌ ＲＰＭＩ１
６４０培地（日水製薬社製）中で培養した。その際、Ｇ
Ｍ２ 封入リポソームをＧＭ２ の最終濃度が５００
ｎｇ／ｍｌになるように加えて抗原刺激を行なった。対
照として、抗原刺激をせずに培養を行ない、ＦＩＴＣ−
ａｎｔｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａと反応させ、再びフロー
サイトメトリーに供する操作をそれぞれのハイブリドー
マについて１５回繰り返した。この抗原刺激を行わない
培養では、ＦＩＴＣ−ａｎｔｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａに
反応して蛍光強度が増す細胞集団は出現しなかった。
【００２３】ＧＭ２ 封入リポソーム存在下での抗原刺
激のための培養は、３７℃、５％ＣＯ２ 存在下で６〜
７日間行なった。抗原刺激後、ハイブリドーマが２〜３
千万個まで増加したら、ＦＩＴＣ−ａｎｔｉ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ａと反応させ、ＰＢＳ で洗浄後、６ｍｌ の
ＰＢＳ に懸濁してフローサイトメトリーに供し、蛍光
強度の強い側にずれている数十万個の細胞集団を分取し
た。抗原刺激の培養とフローサイトメトリーによる分取
を３回繰り返した後、抗原刺激を行わない培養とフロー
サイトメトリーによる分取とをハイブリドーマＫＭ−６
９６については２回、ハイブリドーマＫＭ−６９７につ
いては３回繰り返した。さらにそれぞれについて、再び
、抗原刺激を行う培養とフローサイトメトリーによる分
取とを２回繰り返したところ、ハイブリドーマＫＭ−６
９６、ハイブリドーマＫＭ−６９７ともＦＩＴＣ−ａｎ
ｔｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａに反応し、蛍光強度が増加し
た細胞集団が出現した。これらの細胞集団をフローサイ
トメトリーで分取し、もう一度抗原刺激を行って培養し
たところ、ハイブリドーマＫＭ−６９６、ハイブリドー
マＫＭ−６９７ともＦＩＴＣ−ａｎｔｉ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ａに反応し、強い蛍光強度をもつ細胞集団のみにな
った。図１に、ハイブリドーマＫＭ−６９７のフローサ
イトメトリーによる測定パターンを示す。
激のための培養は、３７℃、５％ＣＯ２ 存在下で６〜
７日間行なった。抗原刺激後、ハイブリドーマが２〜３
千万個まで増加したら、ＦＩＴＣ−ａｎｔｉ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ａと反応させ、ＰＢＳ で洗浄後、６ｍｌ の
ＰＢＳ に懸濁してフローサイトメトリーに供し、蛍光
強度の強い側にずれている数十万個の細胞集団を分取し
た。抗原刺激の培養とフローサイトメトリーによる分取
を３回繰り返した後、抗原刺激を行わない培養とフロー
サイトメトリーによる分取とをハイブリドーマＫＭ−６
９６については２回、ハイブリドーマＫＭ−６９７につ
いては３回繰り返した。さらにそれぞれについて、再び
、抗原刺激を行う培養とフローサイトメトリーによる分
取とを２回繰り返したところ、ハイブリドーマＫＭ−６
９６、ハイブリドーマＫＭ−６９７ともＦＩＴＣ−ａｎ
ｔｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａに反応し、蛍光強度が増加し
た細胞集団が出現した。これらの細胞集団をフローサイ
トメトリーで分取し、もう一度抗原刺激を行って培養し
たところ、ハイブリドーマＫＭ−６９６、ハイブリドー
マＫＭ−６９７ともＦＩＴＣ−ａｎｔｉ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ａに反応し、強い蛍光強度をもつ細胞集団のみにな
った。図１に、ハイブリドーマＫＭ−６９７のフローサ
イトメトリーによる測定パターンを示す。
【００２４】（３）クローニングＦＩＴＣ−ａｎｔｉ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａに反応し、強い蛍光強度をもつハイ
ブリドーマＫＭ−６９６、ハイブリドーマＫＭ−６９７
の細胞集団をそれぞれ培養し続けると、再び、ＦＩＴＣ
−ａｎｔｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａには反応しない細胞集
団が出現し増加してきた。そこで、ＦＩＴＣ−ａｎｔｉ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａに反応し、強い蛍光強度をもつ細
胞集団のクローニングを行なった。まず、一ウェルに一
細胞または、二ウェルに一細胞になるように細胞を希釈
して、９６ウェルプレートに分注し、約百万個の胸腺細
胞を加えて培養した。約１０日間の培養後、培養上清の
一部をとり、以下に示す酵素免疫測定法でＩｇＧクラス
のモノクローナル抗体が生産されているウェルとＩｇＭ
クラスのモノクローナル抗体が生産されているウェルの
割合を調べた。１回目のクローニングでは、ＩｇＭクラ
スのモノクローナル抗体が生産されているウェルがあっ
たため、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体が生産され
ているウェルのハイブリドーマをもう一度、限界希釈法
でクローニングした。２回目のクローニングでは、Ｉｇ
Ｍクラスのモノクローナル抗体が生産されているウェル
がなくなり、９０％以上のウェルにＩｇＧクラスのモノ
クローナル抗体の生産が認められるようになった。最終
的にそれぞれＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を最も
よく生産しているウェルを選択し、ハイブリドーマＫＭ
−６９７からクラススイッチしたものとしてハイブリド
ーマＫＭ−７５０を、ハイブリドーマＫＭ−６９６から
クラススイッチしたものとしてＫＭ−７９６をそれぞれ
得た。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａに反応し、強い蛍光強度をもつハイ
ブリドーマＫＭ−６９６、ハイブリドーマＫＭ−６９７
の細胞集団をそれぞれ培養し続けると、再び、ＦＩＴＣ
−ａｎｔｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａには反応しない細胞集
団が出現し増加してきた。そこで、ＦＩＴＣ−ａｎｔｉ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａに反応し、強い蛍光強度をもつ細
胞集団のクローニングを行なった。まず、一ウェルに一
細胞または、二ウェルに一細胞になるように細胞を希釈
して、９６ウェルプレートに分注し、約百万個の胸腺細
胞を加えて培養した。約１０日間の培養後、培養上清の
一部をとり、以下に示す酵素免疫測定法でＩｇＧクラス
のモノクローナル抗体が生産されているウェルとＩｇＭ
クラスのモノクローナル抗体が生産されているウェルの
割合を調べた。１回目のクローニングでは、ＩｇＭクラ
スのモノクローナル抗体が生産されているウェルがあっ
たため、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体が生産され
ているウェルのハイブリドーマをもう一度、限界希釈法
でクローニングした。２回目のクローニングでは、Ｉｇ
Ｍクラスのモノクローナル抗体が生産されているウェル
がなくなり、９０％以上のウェルにＩｇＧクラスのモノ
クローナル抗体の生産が認められるようになった。最終
的にそれぞれＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を最も
よく生産しているウェルを選択し、ハイブリドーマＫＭ
−６９７からクラススイッチしたものとしてハイブリド
ーマＫＭ−７５０を、ハイブリドーマＫＭ−６９６から
クラススイッチしたものとしてＫＭ−７９６をそれぞれ
得た。
【００２５】酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ 法）２ｎｇ
のＧＭ２ （ベーリンガー・マンハイム社製）またはそ
の他のガングリオシドを５ｎｇのフォスファチジルコリ
ン（シグマ社製）と２．５ｎｇ のコレステロール（シ
グマ社製）とを含む２μｌ のエタノール溶液に溶解し
た。この溶液２０μｌ またはこの溶液の希釈液２０μ
ｌ を９６ウェルマイクロタイタープレート（グライナ
ー社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、風乾後、１％Ｂ
ＳＡ を含むＰＢＳ でブロッキングを行なった。ここ
にハイブリドーマの培養上清または精製したモノクロー
ナル抗体５０〜１００ μｌ を加え、一晩、４℃で反
応させた。反応後、各ウェルをＰＢＳ で洗浄後、ペル
オキシダーゼ標識抗マウスガンマ鎖抗体（フナコシ社製
）またはペルオキシダーゼ標識プロテインＡ（フナコシ
社製） を５０〜１００ μｌ を加え、１〜２時間、
室温で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質溶液
〔２，２ ’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリ
ン−６−スルホン酸） 二アンモニウム５５０ｍｇ を
０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２） に溶解し、使
用直前に過酸化水素１μｌ ／ｍｌを加えた溶液〕を５
０〜１００ μｌ を加えて発色させ、ＯＤ４１５ を
測定した。
のＧＭ２ （ベーリンガー・マンハイム社製）またはそ
の他のガングリオシドを５ｎｇのフォスファチジルコリ
ン（シグマ社製）と２．５ｎｇ のコレステロール（シ
グマ社製）とを含む２μｌ のエタノール溶液に溶解し
た。この溶液２０μｌ またはこの溶液の希釈液２０μ
ｌ を９６ウェルマイクロタイタープレート（グライナ
ー社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、風乾後、１％Ｂ
ＳＡ を含むＰＢＳ でブロッキングを行なった。ここ
にハイブリドーマの培養上清または精製したモノクロー
ナル抗体５０〜１００ μｌ を加え、一晩、４℃で反
応させた。反応後、各ウェルをＰＢＳ で洗浄後、ペル
オキシダーゼ標識抗マウスガンマ鎖抗体（フナコシ社製
）またはペルオキシダーゼ標識プロテインＡ（フナコシ
社製） を５０〜１００ μｌ を加え、１〜２時間、
室温で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質溶液
〔２，２ ’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリ
ン−６−スルホン酸） 二アンモニウム５５０ｍｇ を
０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２） に溶解し、使
用直前に過酸化水素１μｌ ／ｍｌを加えた溶液〕を５
０〜１００ μｌ を加えて発色させ、ＯＤ４１５ を
測定した。
【００２６】（４）モノクローナル抗体の調製ハイブリ
ドーマＫＭ−７５０とハイブリドーマＫＭ−７９６を１
〜２リットルのスピンナー培養装置を用いて３日間培養
し、大量に培養上清を集めた。これをプロテインＡ−セ
ファロース４Ｂカラム（ファルマシア社製）に通塔後、
吸着したＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を０．１Ｍ
クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）で溶出した。溶出液をＰ
ＢＳ で透析し、これを精製モノクローナル抗体とした
。精製したモノクローナル抗体がＩｇＧクラスであるこ
とをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した
。ゲルには、４ 〜１５％グラジエントゲル（第一化学
社製）を用いた。図２に、ＫＭ−７５０のＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。モノクローナ
ル抗体のサブクラスは、マウスサブクラスタイピングキ
ット（ザイメット社製）を用いた酵素免疫測定法により
、ハイブリドーマＫＭ−７５０より生産されるモノクロ
ーナル抗体ＫＭ−７５０、ハイブリドーマＫＭ−７９６
より生産されるモノクローナル抗体ＫＭ−７９６ともＩ
ｇＧ３ と決定した。 蛋白量は、ＢＣＡ 試薬（ピアス社製）を用いて測定し
た。
ドーマＫＭ−７５０とハイブリドーマＫＭ−７９６を１
〜２リットルのスピンナー培養装置を用いて３日間培養
し、大量に培養上清を集めた。これをプロテインＡ−セ
ファロース４Ｂカラム（ファルマシア社製）に通塔後、
吸着したＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を０．１Ｍ
クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）で溶出した。溶出液をＰ
ＢＳ で透析し、これを精製モノクローナル抗体とした
。精製したモノクローナル抗体がＩｇＧクラスであるこ
とをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した
。ゲルには、４ 〜１５％グラジエントゲル（第一化学
社製）を用いた。図２に、ＫＭ−７５０のＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。モノクローナ
ル抗体のサブクラスは、マウスサブクラスタイピングキ
ット（ザイメット社製）を用いた酵素免疫測定法により
、ハイブリドーマＫＭ−７５０より生産されるモノクロ
ーナル抗体ＫＭ−７５０、ハイブリドーマＫＭ−７９６
より生産されるモノクローナル抗体ＫＭ−７９６ともＩ
ｇＧ３ と決定した。 蛋白量は、ＢＣＡ 試薬（ピアス社製）を用いて測定し
た。
【００２７】（５）モノクローナル抗体の活性測定段階
希釈（０．０５〜２５μｇ ／ｍｌ） した精製モノク
ローナル抗体の２０ｐｍｏｌ／ウェルＧＭ２ に対する
反応性をＥＬＩＳＡ 法で測定した。対照として、サケ
成長ホルモンに対するモノクローナル抗体ＫＭ−７３７
（ＩｇＧ３ クラス）のＧＭ２ に対する反応性も測定
した。図３に示したように、モノクローナル抗体ＫＭ−
７５０、モノクローナル抗体ＫＭ−７９６とも抗体濃度
に依存してＧＭ２ に対する高い結合性が認められたが
、モノクローナル抗体ＫＭ−７３７には、ＧＭ２ に対
する結合性は認められなかった。
希釈（０．０５〜２５μｇ ／ｍｌ） した精製モノク
ローナル抗体の２０ｐｍｏｌ／ウェルＧＭ２ に対する
反応性をＥＬＩＳＡ 法で測定した。対照として、サケ
成長ホルモンに対するモノクローナル抗体ＫＭ−７３７
（ＩｇＧ３ クラス）のＧＭ２ に対する反応性も測定
した。図３に示したように、モノクローナル抗体ＫＭ−
７５０、モノクローナル抗体ＫＭ−７９６とも抗体濃度
に依存してＧＭ２ に対する高い結合性が認められたが
、モノクローナル抗体ＫＭ−７３７には、ＧＭ２ に対
する結合性は認められなかった。
【００２８】次に、段階希釈（０．０４〜２０ｐｍｏｌ
／ウェル）したＧＭ２ に対する、１０μｇ ／ｍｌの
精製モノクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ 法で測
定した。対照として、モノクローナル抗体ＫＭ−７３７
の反応性も測定した。図４に示したように、モノクロー
ナル抗体ＫＭ−７５０、モノクローナル抗体ＫＭ−７９
６とも抗原濃度に依存してＧＭ２ に対する高い結合活
性が認められたが、モノクローナル抗体ＫＭ−７３７に
は、ＧＭ２ に対する結合性は認められなかった。
／ウェル）したＧＭ２ に対する、１０μｇ ／ｍｌの
精製モノクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ 法で測
定した。対照として、モノクローナル抗体ＫＭ−７３７
の反応性も測定した。図４に示したように、モノクロー
ナル抗体ＫＭ−７５０、モノクローナル抗体ＫＭ−７９
６とも抗原濃度に依存してＧＭ２ に対する高い結合活
性が認められたが、モノクローナル抗体ＫＭ−７３７に
は、ＧＭ２ に対する結合性は認められなかった。
【００２９】（６）反応特異性の検討ガングリオシドＧ
Ｍ１ 、Ｎ−アセチルＧＭ２ （ベーリンガー・マンハ
イム社製）、Ｎ−グリコリルＧＭ２ 、Ｎ−アセチルＧ
Ｍ３ 、Ｎ−グリコリルＧＭ３ 、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ
（ヤトロン社製）、ＧＤ２ 、ＧＤ３ （ヤトロン社製
）、ＧＴ１ｂ（フナコシ社製）およびＧＱ１ｂ（ヤトロ
ン社製）に対する、モノクローナル抗体ＫＭ−７５０と
ＫＭ−７９６の反応性をＥＬＩＳＡ 法で測定した。Ｇ
Ｍ１ とＧＤ１ａはウシ脳より、Ｎ−グリコリルＧＭ２
とＮ−グリコリルＧＭ３ はマウス肝臓より、Ｎ−ア
セチルＧＭ３ はイヌ赤血球より、ＧＤ２ は培養細胞
株ＩＭＲ３２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１２７）よりそれぞれ
公知の方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２６３， １
０９１５ （１９８８）〕に準じて精製した。結果を第
１表に示す。第１表に示したように、ＫＭ−７５０はＮ
−アセチルＧＭ２ とＮ−グリコリルＧＭ２ のみに反
応し、他のガングリオシドには反応しなかった。これは
、クラススイッチする前のモノクローナル抗体ＫＭ−６
９７と同じ反応特異性であり、ＩｇＧにクラススイッチ
した後も反応特異性が変わらないことを示している。ま
た、ＫＭ−７９６はＮ−アセチルＧＭ２ のみに反応し
、他のガングリオシドには反応しなかった。これは、ク
ラススイッチする前のモノクローナル抗体ＫＭ−６９６
と同じ反応特異性であり、ＫＭ−７９６についてもＩｇ
Ｇにクラススイッチした後も反応特異性は変わらなかっ
た。
Ｍ１ 、Ｎ−アセチルＧＭ２ （ベーリンガー・マンハ
イム社製）、Ｎ−グリコリルＧＭ２ 、Ｎ−アセチルＧ
Ｍ３ 、Ｎ−グリコリルＧＭ３ 、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ
（ヤトロン社製）、ＧＤ２ 、ＧＤ３ （ヤトロン社製
）、ＧＴ１ｂ（フナコシ社製）およびＧＱ１ｂ（ヤトロ
ン社製）に対する、モノクローナル抗体ＫＭ−７５０と
ＫＭ−７９６の反応性をＥＬＩＳＡ 法で測定した。Ｇ
Ｍ１ とＧＤ１ａはウシ脳より、Ｎ−グリコリルＧＭ２
とＮ−グリコリルＧＭ３ はマウス肝臓より、Ｎ−ア
セチルＧＭ３ はイヌ赤血球より、ＧＤ２ は培養細胞
株ＩＭＲ３２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１２７）よりそれぞれ
公知の方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２６３， １
０９１５ （１９８８）〕に準じて精製した。結果を第
１表に示す。第１表に示したように、ＫＭ−７５０はＮ
−アセチルＧＭ２ とＮ−グリコリルＧＭ２ のみに反
応し、他のガングリオシドには反応しなかった。これは
、クラススイッチする前のモノクローナル抗体ＫＭ−６
９７と同じ反応特異性であり、ＩｇＧにクラススイッチ
した後も反応特異性が変わらないことを示している。ま
た、ＫＭ−７９６はＮ−アセチルＧＭ２ のみに反応し
、他のガングリオシドには反応しなかった。これは、ク
ラススイッチする前のモノクローナル抗体ＫＭ−６９６
と同じ反応特異性であり、ＫＭ−７９６についてもＩｇ
Ｇにクラススイッチした後も反応特異性は変わらなかっ
た。
【００３０】
【表１】
【００３１】
【発明の効果】本発明により、ＩｇＭクラスのモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマを、ＩｇＧクラス
のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマにクラ
ススイッチさせることを特徴とするハイブリドーマの製
造法が提供される。当該ハイブリドーマから生産される
ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体は、種々の疾病の治
療に広く利用することができる。
ーナル抗体を生産するハイブリドーマを、ＩｇＧクラス
のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマにクラ
ススイッチさせることを特徴とするハイブリドーマの製
造法が提供される。当該ハイブリドーマから生産される
ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体は、種々の疾病の治
療に広く利用することができる。
【図１】ハイブリドーマＫＭ−６９７にＦＩＴＣ−ａｎ
ｔｉ ＰｒｏｔｅｉｎＡを反応させ、フローサイトメト
リーで蛍光強度を測定した図である。縦軸が細胞数、横
軸が蛍光強度を表し、実線がＦＩＴＣ−ａｎｔｉ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎＡを反応させたハイブリドーマのパターン、
点線がＦＩＴＣ−ａｎｔｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを反応
させないハイブリドーマのパターンをそれぞれ示す。Ａ
は抗原刺激をしていないハイブリドーマＫＭ−６９７の
パターンを、Ｂは５回の抗原刺激をしたハイブリドーマ
ＫＭ−６９７のパターンを、Ｃは６回の抗原刺激をした
ハイブリドーマＫＭ−６９７のパターンをそれぞれ示す
。
ｔｉ ＰｒｏｔｅｉｎＡを反応させ、フローサイトメト
リーで蛍光強度を測定した図である。縦軸が細胞数、横
軸が蛍光強度を表し、実線がＦＩＴＣ−ａｎｔｉ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎＡを反応させたハイブリドーマのパターン、
点線がＦＩＴＣ−ａｎｔｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを反応
させないハイブリドーマのパターンをそれぞれ示す。Ａ
は抗原刺激をしていないハイブリドーマＫＭ−６９７の
パターンを、Ｂは５回の抗原刺激をしたハイブリドーマ
ＫＭ−６９７のパターンを、Ｃは６回の抗原刺激をした
ハイブリドーマＫＭ−６９７のパターンをそれぞれ示す
。
【図２】精製したモノクローナル抗体ＫＭ−７５０のＳ
ＤＳポリアクリルアミド電気泳動（４〜１５グラジエン
トゲルを使用）のパターンを表した図である。左より、
分子量マーカー、ＩｇＧのスタンダード、ＩｇＭのスタ
ンダード、モノクローナル抗体ＫＭ−７５０の泳動パタ
ーンをそれぞれ示す。Ａは還元条件で電気泳動を行った
図であり、Ｂは非還元条件で電気泳動を行った図である
。
ＤＳポリアクリルアミド電気泳動（４〜１５グラジエン
トゲルを使用）のパターンを表した図である。左より、
分子量マーカー、ＩｇＧのスタンダード、ＩｇＭのスタ
ンダード、モノクローナル抗体ＫＭ−７５０の泳動パタ
ーンをそれぞれ示す。Ａは還元条件で電気泳動を行った
図であり、Ｂは非還元条件で電気泳動を行った図である
。
【図３】段階希釈（０．０５〜２５μｇ ／ｍｌ） し
た精製モノクローナル抗体の２０ｐｍｏｌ／ウェルのＧ
Ｍ２ に対する反応性を示した図である。□がＫＭ−７
５０、○がＫＭ−７９６、△がＫＭ−７３７の反応性を
それぞれ示す。
た精製モノクローナル抗体の２０ｐｍｏｌ／ウェルのＧ
Ｍ２ に対する反応性を示した図である。□がＫＭ−７
５０、○がＫＭ−７９６、△がＫＭ−７３７の反応性を
それぞれ示す。
【図４】段階希釈（０．０４〜２０ｐｍｏｌ／ウェル）
したＧＭ２に対する１０μｇ ／ｍｌの精製モノクロー
ナル抗体の反応性を示した図である。□がＫＭ−７５０
、○がＫＭ−７９６、△がＫＭ−７３７の反応性をそれ
ぞれ示す。
したＧＭ２に対する１０μｇ ／ｍｌの精製モノクロー
ナル抗体の反応性を示した図である。□がＫＭ−７５０
、○がＫＭ−７９６、△がＫＭ−７３７の反応性をそれ
ぞれ示す。
Claims (11)
- 【請求項１】 ＩｇＭクラスに属するモノクローナル
抗体を生産するハイブリドーマを、当該抗体と反応する
抗原、および胸腺細胞存在下に培養することを特徴とす
るＩｇＧクラスに属するモノクローナル抗体を生産する
ハイブリドーマの製造法。 - 【請求項２】 ＩｇＭクラスに属するモノクローナル
抗体を生産するハイブリドーマが、Ｎ−アセチルＧＭ２
および／またはＮ−グリコリルＧＭ２ と反応するモ
ノクローナル抗体を生産するハイブリドーマである請求
項１記載の製造法。 - 【請求項３】 ＩｇＭクラスに属するモノクローナル
抗体を生産するハイブリドーマが、ハイブリドーマＫＭ
−５３１、ＫＭ−６９３、ＫＭ−６９４、ＫＭ−６９５
、ＫＭ−６９６およびＫＭ−６９７から選ばれる請求項
１記載の製造法。 - 【請求項４】 請求項１記載の方法により得られる、
ＩｇＧクラスに属し、かつＮ−アセチルＧＭ２ と反応
するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。 - 【請求項５】 請求項１記載の方法により得られる、
ＩｇＧクラスに属し、かつＮ−アセチルＧＭ２ と反応
するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマＫＭ
−７９６。 - 【請求項６】 請求項１記載の方法により得られる、
ＩｇＧクラスに属し、かつＮ−アセチルＧＭ２ および
Ｎ−グリコリルＧＭ２ と反応するモノクローナル抗体
を生産するハイブリドーマ。 - 【請求項７】 請求項１記載の方法により得られる、
ＩｇＧクラスに属し、かつＮ−アセチルＧＭ２ および
Ｎ−グリコリルＧＭ２ と反応するモノクローナル抗体
を生産するハイブリドーマＫＭ−７５０。 - 【請求項８】 ＩｇＧクラスに属し、かつＮ−アセチ
ルＧＭ２ と反応するモノクローナル抗体。 - 【請求項９】 ＩｇＧクラスに属し、かつＮ−アセチ
ルＧＭ２ と反応するモノクローナル抗体ＫＭ−７９６
。 - 【請求項１０】 ＩｇＧクラスに属し、かつＮ−アセ
チルＧＭ２ およびＮ−グリコリルＧＭ２ と反応する
モノクローナル抗体。 - 【請求項１１】 ＩｇＧクラスに属し、かつＮ−アセ
チルＧＭ２ およびＮ−グリコリルＧＭ２ と反応する
モノクローナル抗体ＫＭ−７５０。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07751891A JP3150991B2 (ja) | 1991-04-10 | 1991-04-10 | ハイブリドーマの製造法 |
| CA 2065681 CA2065681A1 (en) | 1991-04-10 | 1992-04-09 | Method of producing hybridomas |
| EP92106282A EP0508472B1 (en) | 1991-04-10 | 1992-04-10 | Method of producing hybridomas |
| DE1992633122 DE69233122T2 (de) | 1991-04-10 | 1992-04-10 | Verfahren zur Herstellung von Hybridomen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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