JPH043199B2

JPH043199B2 -

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Publication number: JPH043199B2
Application number: JP58251883A
Authority: JP
Priority date: 1983-12-28
Filing date: 1983-12-28
Publication date: 1992-01-22
Also published as: ATE41787T1; US4622296A; DE3477494D1; EP0149853A3; EP0149853B1; EP0149853A2; JPS60141299A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、脱水素酵素の活性度測定法に関す
る。更に詳しくは、NAD（ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド）又はNADP（ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸）を補酵素とし、
テトラゾリウム塩を発色剤とする脱水素酵素の活
性度測定法に於て、酵素反応停止剤として、デシ
ル硫酸又はその塩、ラウリル硫酸又はその塩、及
びラウリルベンゼンスルホン酸又はその塩から成
る群より選ばれた１種又は２種以上の化合物を用
いる、脱水素酵素の活性度測定法に関する。 NAD又はNADPを水素受容体とする脱水素酵
素、例えば乳酸脱水素酵素（以下、LDHと略称
する。）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グ
リセリン−３−リン酸脱水素酵素、α−ヒドロキ
シ酪酸脱水素酵素（以下、α−HBDと略称す
る。）、3α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素
（以下、3α−HSDと略称する。）など、の活性を
測定するには、夫々の基質と脱水素酵素との酵素
反応により生成するNADH（還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド）又はNADPH（還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸）の340nmに於ける吸光度の増加を測定する
UV法や、生成したNADH又はNADPHにより、
電子伝達体又はジアホラーゼの助けをかりて、テ
トラゾリウム塩を還元し、生成するホルマザン色
素の色を比色する可視比色法等が用いられてい
る。この可視比色法の原理をLDHの活性度の測定
の場合を例にとつて示せば、であり、これらの反応は定量的且つ特異的に進行
するから、生成するホルマザンの色濃度を定量す
ることによつて、LDHの活性度を測定すること
ができる。 UV法は、通常、一定時間内の340nmの吸収の
増加率を測定する方法、いわゆるレート法として
用いられており、また、可視比色法は、一定時間
酵素反応を行なつた後、酵素反応停止剤を加えて
反応を停止させ、その間に生成したNADHに相
当する色素量を比色定量する方法が用いられてい
る。本発明は後者の方法に係るものである。現在用いられている反応停止法としては、液性
を強酸性として酵素反応を停止させる方法が最も
一般的である。酸性化剤としては、通常無機酸、例えば塩酸な
どが用いられている。しかし、この方法では生成
したホルマザン（又はジホルマザン）色素が光に
より褪色し易く、溶解度が低いため、ホルマザン
の種類によつては析出して濁りや沈澱を生ずるこ
とがあり、試験管やキユベツトに染着して誤差の
原因になつたり、更に検体として乳ビ血清を用い
た場合には、濁りのため検体盲検が大となり、検
体盲検をとらない日常検査では誤差の原因となる
ことがあるなど種々の欠点があり、これらの改良
が要望されていた。本発明者らは、先に、この染着防止の技術に関
して、テトラゾリウム塩溶液にゼラチンを共存さ
せることにより、テトラゾリウム塩類が還元され
て生成する色素であるホルマザン化合物による染
色を防止することができることを見出し、特許出
願している。（特願昭58−089714号）しかしながら、上記発明に於ても、反応停止剤
としては、塩酸などの酸性停止液を用いているの
で、ゼラチンが徐々に加水分解してくるため、長
期保存の点からはけつして満足のいくものではな
かつた。本発明者らは、これら従来法の欠点を更に改良
すべく鋭意研究の結果、反応停止剤として塩酸等
の無機酸の代りに、デシル硫酸又はその塩、ラウ
リル硫酸又はその塩、及びラウリルベンゼンスル
ホン酸又はその塩から成る群より選ばれた１種又
は２種以上の化合物を用いることにより、これら
の欠点が解消できることを見出し、本発明を完成
するに至つた。即ち、本発明は、NAD又はNADP、テトラゾ
リウム塩の共存下で、基質と脱水素酵素とを一定
時間反応させた後、デシル硫酸又はその塩、ラウ
リル硫酸又はその塩、及びラウリルベンゼンスル
ホン酸又はその塩から成る群より選ばれた１種又
は２種以上の化合物を含む反応停止液を加えて、
酵素反応を停止させることを特徴とする。脱水素
酵素活性度並びに基質の定量法の発明である。本発明の方法によれば、脱水素酵素反応の至適
PH範囲内でも酵素反応は完全に停止し、生成して
くるホルマザン又はジホルマザン色素の析出防
止、染着防止に効果が認められるのみならず、驚
くべきことに、呈色安定性の向上、呈色増強など
の点にも大きな効果が認められる。本発明の反応停止剤は、基質に脱水素酵素が作
用することによつて起こる脱水素酵素反応を停止
させることは勿論のこと、同時に、還元型補酵素
が、電子伝達体又はジアホラーゼの共存下でテト
ラゾリウム塩を還元する反応をも完全に阻害す
る。即ち、例えば、NADH又はNADPHと１−
Methoxy−PMS又はジアホラーゼを含む緩衝液
に、ニトロテトラゾリウムブルー（Nitro−TB）
を加えると直ちに還元されて紫色のホルマザンを
生じるが、あらかじめラウリル硫酸ナトリウムを
含む緩衝液に、Nitro−TBを加えた場合には全
く発色は認められない。尚、この場合、Nitro−
TBを加えないでNADH又はNADPHの340nmに
於ける吸光度を経時的に追跡すると、いずれの場
合も吸光度は経時的に減少し、NADH又は
NADPHの分解が観察される。このことは、ラ
ウリル硫酸ナトリウムが、NADH又はNADPH
によるNitro−TBの還元反応は阻害するが、
NADH又はNADPHの自己分解には関与しない
ことを示している。即ち、本発明に係る反応停止剤は、脱水素酵素
反応を停止させるのみならず、電子伝達体又はジ
アホラーゼによるテトラゾリウム塩への電子の伝
達をも阻止してテトラゾリウム塩の還元反応を停
止させるが、NAD（又はNADP）NADH（又は
NADPH）の反応には殆ど関与しない。従つて、継続的な還元型補酵素の生成反応に於
て、電子伝達体又はジアホラーゼの存在下に、テ
トラゾリウム塩を用いて一定時間内に於ける還元
型補酵素の生成量を求めんとする場合には、本発
明に係る反応停止剤を用いれば、効果的にその目
的を達成し得る。即ち、本発明に係る反応停止剤
を用いた場合には、還元型補酵素の生成反応は継
続的に進行しているにも拘わらず、テトラゾリウ
ム塩の還元反応（テトラゾリウム塩→ホルマザ
ン）のみが完壁に阻止されて、それ以上発色は進
行しなくなるので、その呈色を比色定量すること
により、上記目的が容易に且つ効果的に達せられ
る。本発明の反応停止剤であるデシル硫酸又はその
塩、ラウリル硫酸又はその塩、及びラウリルベン
ゼンスルホン酸又はその塩の最終呈色液中の濃度
は、1.5ｍ mole／以上であれば充分その機能
を発揮するが、通常３〜100ｍ mole／が好ま
しく用いられる。また、本発明の方法に於ては、反応停止液が中
性付近の液性で使用できるため、反応停止液にも
ゼラチンを添加できるので尚一層の利点となる。
即ち、従来の酸性停止液を用いた場合はゼラチン
が徐々に加水分解してくるため、長期の保存がで
きなかつたが、本発明に係る停止液、即ち、デシ
ル硫酸又はその塩、ラウリル硫酸又はその塩、及
びラウリルベンゼンスルホン酸又はその塩から成
る群より選ばれた１種又は２種以上用いた場合は
ゼラチンの分解は無く、従つて、本発明の方法に
於て、酵素反応液にゼラチンを加えた場合には、
更にホルマザン又はジホルマザン色素の析出防止
効果及び染着防止効果を増すことができるので、
優れた実施態様となる。尚、この場合の反応停止
液の液性はPH６〜９が好ましい。本発明に於て、特に効果的なゼラチンは、その
平均分子量が、20000〜150000であるようなゼラ
チンであるが、特にこれに限定されるものではな
く、いずれのものでもよい。ゼラチンは通常溶液中に存在させる。溶液中で
効果的なゼラチン濃度は、通常、0.1〜0.7重量／
容量％、好ましくは0.2〜0.5重量／容量％であ
る。本発明は、NAD又はNADPを補酵素として、
基質に脱水素酵素を作用させて生成するNADH
又はNADPHにより、電子伝達体の存在下で、
テトラゾリウム塩類が還元されてホルマザン化合
物が生成する反応を利用する種々の定量方法に適
用することができる。典型的一例としては、基質又は脱水素酵素が体
液成分であるような、被検試料中の基質又は脱水
素酵素を定量する方法が挙げられる。この基質の一例としては、乳酸、α−ヒドロキ
シ酪酸、コレステロール、胆汁酸、グリセリン、
グリセリン−３−リン酸、グルコース−６−リン
酸、アルデヒド又はアセトアルデヒド等が挙げら
れ、脱水素酵素の一例としては、乳酸脱水素酵素
（LDH）、α−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（α−
HBD）、コレステロール脱水素酵素、3α−ヒド
ロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（3α−
HSD）、グリセリン−３−リン酸脱水素酵素、グ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素、アルデヒド脱
水素酵素又はホルムアルデヒド脱水素酵素等が挙
げられる。電子伝達体又はジアホラーゼは、通常、還元型
補酵素によつてテトラゾリウム塩が還元されてホ
ルマザン化合物が生成する反応に、用いられる。そのような電子伝達体の例としては、フエナジ
ンメトサルフエート（PMS）、１−メトキシフエ
ナジンメトサルフエート（１−Methoxy PMS）
又は９−ジメチルアミノベンゾ−α−フエナゾキ
ソニウムクロライド（メルドラブルー）等が挙げ
られる。本発明に用いるテトラゾリウム化合物として
は、例えば、３−（Ｐ−ヨウドフエニル）−２−
（Ｐ−ニトロフエニル）−５−フエニル−2H テ
トラゾリウムクロライド（INT）、３−（４，
５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフ
エニル−2H テトラゾリウムブロマイド
（MTT）、３，3′−（４，4′−ビフエニレン）−ビ
ス（２，５−ジフエニル−2H テトラゾリウム
クロライド（Neo−TB）、３，3′−（３，3′−
ジメトキシ−４，4′−ビフエニレン）−ビス〔２
−（Ｐ−ニトロフエニル）−５−フエニル−2H
テトラゾリウムクロライド〕（Nitro−TB）、
３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエニ
レン）−ビス（２，５−ジフエニル−2H テトラ
ゾリウムクロライド）（TB）、３，3′−（３，
3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエニレン）−ビス
〔２，５−ビス（Ｐ−ニトロフエニル−2H テト
ラゾリウムクロライド〕（TNTB）等自体公知
のテトラゾリウム塩をのいずれにてもよく、ま
た、最近新しく開発された水溶性テトラゾリウム
塩である。２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−
（０−カルボキシフエニル）−５〔Ｐ−｛ヒドロキ
シ・ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）｝フ
エニル〕−2Hテトラゾリウムクロライド等も同
様に用い得ることはいうまでもない。次に本発明の方法を実施するための具体例とし
て、血清中の乳酸脱水素酵素（LDH）の活性度
測定の場合について記す。 DL−乳酸リチウム0.1mole／、NAD0.2％、
ジアホラーゼ 200unit／dl、ニトロテトラゾリ
ウムブルー（NO₂−TB）0.02％を含む0.1Mトリ
ス−塩酸緩衝液（PH8.3）ご予め37℃に予備加温
し、血清0.05mlに対し0.5mlを加え、37℃恒温槽
中正確に10分間加温反応せしめた後、0.3％ラウ
リル硫酸ナトリウム水溶液5.0mlを加えて混和し、
試薬盲検を対照として560nmに於ける吸光度を測
定し、別に標準血清（LDH活性値既知）を用い
て同一操作を行なつて得た検量線と対比して、血
清中のLDH活性値を求める。0.3％ラウリル硫酸
ナトリウム水溶液の代りに、従来法の0.1N塩酸
５mlを用いたときは、吸光度定量用ガラスセルは
数十検体の測定で染着が認められるが、本発明の
ラウリル硫酸塩を用いた試液では、殆んど染着は
認められず、また、呈色度及び呈色安定性に於て
も、本発明の効果が認められる。上記と同じ方法により、乳ビ血清について測定
したときの検体盲検値を第１表に示す。

【表】＊）SDS：ラウリル硫酸ナトリウム上記表より明らかなように、本発明の方法によ
れば、乳ビ血清の検体盲検値は従来法の２／３〜
１／３に抑えることができる。また、本発明の反応停止剤が、電子伝達体又は
ジアホラーゼによるテトラゾリウム塩への電子の
伝達を阻止して、テトラゾリウム塩の還元反応を
停止させることを確認した実験例を以下に示す。実験例ニトロテトラゾリウムブルー（Nitro−TB）
0.02％、ジアホラーゼ 150U／dl又は１−
Methoxy−PMS0.002％、トリトンＸ−100 0.05
％、ラウリル硫酸ナトリウム 0.5％を含む0.1M
トリス−塩酸緩衝液（PH7.5）３mlに、1mM、
2mMのNADH水溶液 0.05mlを加え、37℃恒温
槽中に10分間加温反応させた後、試薬盲検を対照
として560nmに於ける吸光度を測定した。また、上記反応試薬中からラウリル硫酸ナトリ
ウムを除いた試薬を用い、上記と同じ方法により
反応、発色させて、同様に吸光度を測定した。両
者の比較を第２表に示す。

【表】第２表より明らかなように、本発明に係る反応
停止剤を用いた場合には、NADH又はNADPH
が電子伝達体又はジアホラーゼの助けをかりてテ
トラゾリウム塩を還元する反応をも、完全に停止
させ得ることがわかる。本発明は、NAD又はNADPを補酵素とし、テ
トラゾリウム塩を発色剤とする脱水素酵素の活性
度測定及び、それによる基質の定量に於て、反応
停止剤として、デシル硫酸又はその塩、ラウリル
硫酸又はその塩、及びラウリルベンゼンスルホン
酸又はその塩から成る群より選ばれた１種又は２
種以上の化合物を用いることにより、テトラゾリ
ウム塩類が還元されて生成する色素であるホルマ
ザン化合物の析出停止、染着防止、呈色安定性の
向上及び呈色増強等の憂れた効果が得られる点に
特徴を有する発明であり、斯業に貢献する所、極
めて大なるものがある。以下に本発明の係る実施例を述べるが、本発明
はこれらに限定されるものではない。実施例１血清中のα−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性度
測定法 α−ヒドロキシ酪酸リチウム 0.15mole／、
NAD ２ｇ／、PMS 30mg／、Nitro−TB
0.8ｇ／の濃度になるように、0.1Mトリス−塩
酸緩衝液（PH8.5）に溶解し、基質液とする。また、0.3％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を
調整し、これを反応停止剤とする。血清 0.05mlをとり、予め37℃にした基質液
0.5mlを加え、37℃恒温槽中で正確に20分間加温
した後、反応停止剤5.0mlを加えて混和し、試薬
盲検を対照として波長560nmの吸光度を測定す
る。別に標準血清（α−HBD活性値既知）を用い
て、同一操作を行なつて得た検量線と対比して、
血清中のα−HBD活性値を求める。比較例１実施例１と同一の基質液を使用し、反応停止剤
として0.1N塩酸を用いた以外は、実施例１と全
く同じ方法により血清中のα−HBD活性度を測
定する。実施例１と比較例１の結果を第２表に示す。

【表】第２表により明らかなように、本発明に係る反
応停止剤を用いた場合は、酵素反応は完全に停止
し、３時間後も呈色度は変化しない。また、比較
例１に比べて呈色度は４〜５％高く、試験管への
染着も認められない。実施例２血清中のα−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性度
測定法基質液及び血清試料は実施例１と同じものを用
い、反応停止剤は0.3％デシル硫酸ナリウム水溶
液を用いる。実施例１に従つて、血清中のα−HBD活性度
を測定し、実施例１と同様の結果を得た。実施例３血清中のLDH活性度測定法 DL−乳酸リチウム 0.1mole／、NAD0.2
％、ジアホラーゼ200unit／dl、Nitro−TB0.02
％、ゼラチン0.1％の濃度になるように0.1Mトリ
ス−塩酸緩衝液（PH8.3）に溶解し、基質液とす
る。また、ラウリル硫酸ナトリウム0.3％、ゼラチ
ン0.2％を含む水溶液を調製し、反応停止剤とす
る。血清 0.05mlをとり、予め37℃にした基質液
0.5mlを加え、37℃恒温槽中で正確に10分間加温
反応せしめた後、反応停止剤5.0mlを加えて混和
し、試薬盲検を対照として波長560nmの吸光度を
測定する。別に標準血清（LDH活性値既知）を用いて、
同一操作を行なつて得た検量線と対比して、血清
中のLDH活性値を求める。比較例２実施例１と同一の基質液を使用し、反応停止剤
として、ゼラチン0.2％を含む0.1N塩酸を用いた
以外は、実施例３と全く同一の方法により血清中
のLDH活性度を測定する。実施例３と比較例２の結果を第３表に示す。

【表】第３表から明らかなように、実施例３は比較例
２に比し、呈色度に於て４〜５％の向上を示し、
呈色安定性は実施例３が３時間後も全く吸光度の
変化を示さないのに対し、比較例２では４〜５％
の呈色低下が認められる。しかし、試験管への染
着は、ゼラチン添加の効果により、実施例３、比
較例２とも24時間後も全く認められない。しか
し、実施例３及び比較例２の反応停止剤を、それ
ぞれ室温で１ヶ月保存したものを使用したとき、
比較例２ではゼラチンの加水分解が生じ、最終呈
色を３日間放置した場合染着が認められたが、実
施例３の反応停止剤では、全く認められなかつ
た。実施例４血清中のLDH活性度測定法 DL−乳酸リチウム 0.1mole／、NAD0.2
％、ジアホラーゼ200unit／dl、INT0.025％の濃
度になるように0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH
8.3）に溶解し、基質液とする。ラウリル硫酸ナトリウム１％を含む0.1Mトリ
ス−塩酸緩衝液（PH8.3）を調製し、反応停止液
とする。実施例３に従つて、血清中のLDH活性度を測
定する。但し、測定波長は500nmとする。比較例３実施例４と同一の基質液を使用し、反応停止剤
として0.1N塩酸を用いる以外は実施例４と全く
同一方法により血清中のLDH活性度を測定する。但し、測定波長は492nmとする。実施例４と比較例３の結果を第４表に示す。

【表】第４表から明らかなように、実施例４は比較例
３に対し、呈色度に於て６〜７％の向上を示し、
呈色安定性については、比較例３が３時間で５〜
７％呈色低下を示しているのに対し、実施例４で
は全く低下していない。また、INTはNitro−
TBに比べて染着性が弱いので、本実験に於ては
染着は認めなかつた。尚、実施例４と比較例３で測定波長が異なるの
は、この２例のそれぞれの極長波長で測定してい
るためであり、ラウリル硫酸ナトリウムの添加に
より、極大吸収波長がシフトしたためである。実施例５血清中のLDH活性度測定法基質液及び血清試料は実施例４と同じものを用
い、反応停止剤はラウリルベンゼンスルホン酸ナ
トリウム１％を含む0.1Mトリス−塩酸緩衝液
（PH8.0）を用いる。実施例３に従つて、血清中のLDH活性度を測
定し、実施例４と同様な結果を得た。実施例６ラウリル硫酸ナトリウムのホルマザンの安定化
効果３種のテトラゾリウム塩を一定量のNADH、
１−Methoxy PMSを還元し、ホルマザン（又は
ジホルマザン）を生成させた後、ラウリル硫酸ナ
トリウムを加えた場合と加えなかつた場合で、同
一PHに於て色素に対する安定化効果を調べた。テトラゾリウム塩はNitro−TB、INT、Neo
−TBを用い、それぞれ0.5ｍmole／の濃度に
0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.3）に溶解し、
Nitro−TB、INT溶液にはトリトンＸ−100を
0.02％、Neo−TB溶液には0.1％を添加したもの
を発色試液とした。 NADH 2.6ｍmole／を50μとり、発色試液
２mlを加え、１−Methoxy PMS 1.5mg／dlを
含む0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）を１ml加
える。37℃恒温槽中で10分間加温した後、ラウリ
ル硫酸ナトリウム 52ｍmole／を含む0.1Mト
リス−塩酸緩衝液（PH8.0）２ml、又は0.1Mトリ
ス−塩酸緩衝液（PH8.0）のみ２mlを加え、試薬
盲検を対照として、それぞれの極大吸収波長で吸
光度を測定後、更に37℃恒温槽中で２時間加温
後、吸光度を測定する。

【表】度
増色率〓

Claims

【特許請求の範囲】１ NAD（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド）又はNADP（ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸）を補酵素とし、テトラゾリウム
塩を発色剤とする脱水素酵素の活性度測定法に於
て、酵素反応停止剤として、デシル硫酸又はその
塩、ラウリル硫酸又はその塩、及びラウリルベン
ゼンスルホン酸又はその塩から成る群より選ばれ
た１種又は２種以上の化合物を用いることを特徴
とする、脱水素酵素の活性度測定法。２ NAD又はNADPを補酵素とし、テトラゾリ
ウム塩を発色剤とする脱水素酵素の活性度測定法
に於て、酵素反応停止剤として、デシル硫酸又は
その塩、ラウリル硫酸又はその塩、及びラウリル
ベンゼンスルホン酸又はその塩から成る群より選
ばれた１種又は２種以上の化合物を用い、これと
併用してゼラチンを用いることを特徴とする、特
許請求の範囲第１項記載の脱水素酵素の活性度測
定法。３基質に特異的に作用する脱水素酵素を用い、
NAD又はNADPを補酵素とし、テトラゾリウム
塩を発色剤とする基質の定量法に於て、酵素反応
停止剤として、デシル硫酸又はその塩、ラウリル
硫酸又はその塩、及びラウリルベンゼンスルホン
酸又はその塩から成る群より選ばれた１種又は２
種以上の化合物を用いることを特徴とする、基質
の定量法。４基質に特異的に作用する脱水素酵素を用い、
NAD又はNADPを補酵素とし、テトラゾリウム
塩を発色剤とする基質の定量法に於て、酵素反応
停止剤として、デシル硫酸又はその塩、ラウリル
硫酸又はその塩、及びラウリルベンゼンスルホン
酸又はその塩から成る群より選ばれた１種又は２
種以上の化合物を用い、これと併用してゼラチン
を用いることを特徴とする、特許請求の範囲第３
項記載の基質の定量法。