JPH0698029B2 - 獣乳の品質検査と乳獣の健康診断とを同時に行う方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は獣乳の品質検査と乳獣の健康診断とを同時に行
う方法に係り、殊にその簡便な方法に係る。

（従来の技術） 乳獣の健康診断は動物母体及び幼獣を保護する上で、更
には搾乳により良質な乳汁を入手する上で極めて重要で
ある。

この健康診断における検査の１つとして血中又は尿中に
おけるケトン体の定量がある。即ち、泌乳量の増加に伴
なう血中の糖不足による炭水化物の代謝不全が生起する
と肝臓における脂肪酸の酸化が活発となり、その結果ア
セトン、アセト酢酸、β−ヒドロキシ酪酸等のケトン体
が組織及び血液中に過剰蓄積され、又尿中に排泄され
る。所謂「ケトーシス」の状態となり、従って血液や尿
中のケトン体の定量は家畜においてケトーシスの有無を
判定する一応の指針となり得るからである。

家畜に関して従来行われて来たケトン体の定量は、専
ら、血液又は尿、殊に一般的には尿を検体とし且つこの
検体中のアセトン酢酸量を調べることにより行われて来
た。

（発明が解決しようとする問題点） 上記従来技術による家畜のケトーシス診断用の尿中又は
血液中のアセト酢酸の定量法としては、ヒトのケトン体
測定用の試験片を用いて実施されるのが通例である。こ
の試験片は試験紙部分にニトロプリシッド・ナトリウム
・グリシン・アルカリ緩衝剤を浸み込ませたものであ
り、アセト酢酸に対する感度は５〜10mg/dlである。

この従来技術方法における定量対象であるアセト酢酸は
安定性の極めて低い物質であり、従って検体を放置すれ
ば当該検体中のアセト酢酸は容易にアセトンに変じ揮発
放散してしまう点に問題がある。即ち、ケトーシスの診
断に用いる検体は新鮮なものが要求され、例えば尿を対
象とする場合には尿道カテーテルを用いて膀胱内の尿を
導尿する必要があり、この導尿は獣医師等の特殊技術取
得者に頼らざるを得ず、しかも導尿が不注意に行われる
場合には尿道炎、膀胱炎等の感染症をもたらす可能性が
あるのである。農業共済に加入している乳牛につき獣医
師が導尿を行った場合には、導尿に対する技術料が当該
獣医師に支払われることになっているが、その技術料に
見合う報酬はほとんど支払われず、このためにケトーシ
ス診断用の検体としての新鮮尿を得るための尿が行われ
ることは極めて少なく、一般排尿の際に畜主に採取させ
て検査に供されているのが実情であり、このことは検査
結果の信頼性を低下させるのみならず、畜主への負担も
大なることを意味している。

尚、ケトーシス状態にあることを知らずに搾乳した獣乳
例えば、牛乳について、これを出荷のために検査場に運
搬し、アルコール試験、酸度試験等の等級試験に供した
場合には、当該牛乳は品質等級が低いものと判定される
可能性がある。この判定が下された時点で、当該牛乳の
搾乳された乳牛を特定することは困難と云うよりも不可
能であり、従って従来の実質が良好なもの仮定すれば全
乳牛について健康診断を実施して健康状態が不良の乳牛
を特定し、適切な処置を講じねばならない。

従って、このような事態の発生を未然に防止するために
は、乳汁の品質を或る程度先ず確認した上で本格的搾乳
を行うことが必要であり、そのための簡便な検査法が切
望されている。

尚、乳牛の場合にケトーシスが及ぼす影響としては、上
記の乳汁の品質低下に基く乳価への影響以外に更に重大
な事柄として泌乳能力の低下がある。即ちケトーシスは
分娩１週間後から３ケ月後程度迄に多発し泌乳能力が低
下するので、ケトーシスの状態に依存するが、生産乳量
が25％低下したとの報告もなされている程である。更に
ケトーシスの多発時期と次回種付けの時期とが重なり合
い、ケトーシス状態の場合には繁殖障害を生起する場合
が多い。従って、ケトーシスが酪農経営に及ぼす影響
は、甚だ大きいのである。

（問題点を解決するための手段及び作用） 本発明によれば、上記の問題点は、基本的には、検体と
して採取が比較的容易な乳汁を採用し且つ定量すべきケ
トン体として安定性の高いβ−ヒドロキシ酪酸を対象と
することにより達成される。

本発明方法は、検体中のβ−ヒドロキシ酪酸をニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド（NAD）の存在下にβ−
ヒドロキシ酪酸脱水素酵素により脱水素してアセト酪酸
に変じ、この場合に生成する還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（NADH）により電子伝達体を介しテ
トラゾリウム塩を還元させて有色のホルマザンを生成さ
せ、その呈色度から検体中におけるβ−ヒドロキシ酪酸
を定量する原理に基くものである。

この測定原理に基き本発明を実施しようとする場合に、
試薬として使用されるβ−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、
NAD、電子伝達体及びテトラゾリウム塩は混合溶液とな
し吸収性担体に含浸させるか支持体に塗布した上で乾燥
させて固相の一体化組成物即ち検査試験片となしておく
ことができ、一方乳汁については特別な前処理を施すこ
となしに用いることができる。従って、上記の検査試験
片に乳汁を滴下させれば（１滴で充分である）直ちに反
応が開始され、この反応は数分（３分間程度）で完了す
るので、余剰検体を拭取り、検査試験片における発色の
程度（色調）を、予め、作成しておいた標準比色表（既
知の各種濃度のβ−ヒドロキシ酪酸を検体として上記と
同様の発色試験を行い各検査試験片が示す呈色色調をま
とめたもの）と肉眼で比較対比すれば検体中のβ−ヒド
ロキシ酪酸を定量することができ、この定量結果から検
体としての乳汁を搾乳した乳獣がケトーシス状態にある
か否かを判断することができる。即ち、本発明方法によ
る検査は極めて簡便であり、検査結果の判断即ち健常状
態であるか否かの診断に熟練を必要とせず、しかも検査
−診断の所要時間が極めて短時間であるために酪農家の
前記要望をも満たすことができる。

次に試験について説明する。

β−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素としては、β−ヒドロキ
シ酪酸を酸化してアセト酢酸となし得るものであれば何
れでも用いることができ、例えば、ロドシュードモナス
スフェロイド（Rhodopseudomonas spheroides）やシュ
ードモナスレモイグネ（Pseudomonas lemoignei）等の
細菌を起原とするもの、牛の心臓や豚の肝臓等の動物組
織から抽出したものなどを挙げることができる。

NADは水素原子受容作用を有する補酵素であり、肝臓、
腎臓等の動物組織や酵母等から抽出精製したものを用い
ることができる。

電子伝達体は生成したNADHの水素供与作用を活性化する
ために用いられるものであり、この機能を有するならば
何れであっても差支えがなく、例えばフラビン酵素の一
種であるジアホラーゼや、塩化９−ジメチルアミノベン
ゾーα−フェナゾキソニウム（通称：メルドラブル
ー）、Ｎ−メチルフェナゾニウムメトサルフェート（略
称;PMS）、硫酸メチル１−メトキシ−５−メチルフェナ
ジウム（略称:1−メトキシPMS）等を挙げることがで
き、これらの内で１−メトキシPMSを用いるのが安定性
とコストの面から有利である。

テトラゾリウム塩としてはモノテトラゾリウム塩やジテ
トラゾリウム塩等があり、モノテトラゾリウム塩の代表
例としては塩化３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ
−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム（略
称:INT）及び臭化３−（4,5−ジメチル−２−チアゾリ
ル）−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウム（略称:MT
T）等が挙げることができ、ジテトラゾリウム塩の代表
例としては3,3′−（3,3′−ジメトキシ−4,4′−ビフ
ェニリレン）−ビス（2,5−ジフェニル−2H−テトラゾ
リウムクロライド）（通称:TB）及び3,3′−（3,3′−
ジメトキシ−4,4′−ビフェニリレン）−ビス［２−
（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル2H−テトラゾリ
ウム］（通称：ニトロ−TB）等が挙げることができ、こ
れらの内で水溶性が良好で比較的安定な点からニトロ−
TBを用いるのが有利である。

これらの試薬を溶解させる溶液としては緩衝液を用いる
ことができ、この緩衝液としては酵素反応及び呈色反応
に至的なpH条件（７〜10）をもたらすものであれば種類
を問わず、燐酸緩衝液、硼酸緩衝液、トリス緩衝液、グ
ッド緩衝液等を用いることができる。尚、更に他の添加
剤例えば安定化剤としての血清アルブミン等を必要に応
じ添加することもできる。

尚、試薬の混合溶液から検査用試験片を作成するための
吸収性担体として例えば濾紙を用いることができる。試
薬の混合溶液に適宜のバインダ例えばゼラチンを添加
し、これをポリエステルフィルム等の支持体に厚みが一
定となるように塗布し乾燥させて試験片となすこともで
きる。勿論、これら試験片の作成に際して、先ず大寸法
のものを作成し、次いで所定寸法（例えば５×5mm）に
裁断して個々の試験に供することができる。

（実施例等） 次に、参考試験例、実施例につき本発明を具体的に説明
する。

参考試験例１ （反応時間と吸光度変化との関係及び検量線） 0.1M−トリスヒドロキシアミノメタン−塩酸緩衝液（pH
8.5）100mlに、β−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（シュー
ドモナスレモイグネ起原、比活性10U/mg）10mg、NAD33m
g、１−メトキシPMS3mg及びニトロ−TB17mgを溶解させ
て反応液を調製した。

この反応液を3ml宛採取して各試験管に入れ、各濃度の
β−ヒドロキシ酪酸標準液（０、２、４、６、８及び10
ミリモル／）20μを各試験管内に添加し、37℃に保
ち、0.5、１、２、３、４、５分間の反応時間における
吸光度を比色計を用い520nmの単色光で測定した結果は
第１図のグラフに示される通りであり、β−ヒドロシキ
酪酸の濃度とは無関係に約４分間で反応は終点に達する
ことが判明した。

従って、４分後の各標準液に対応する吸光度［但し、０
ミリモル／に関する吸光度（0.263）をブランク値と
して差引いたもの］と標準液の濃度との関係をプロット
した処、第２図のグラフに示される通りの結果が得られ
た。このグラフは両者が極めて直線的な比例関係を有
し、検量線として使用し得るものであることを意味して
いる。

参考試験例２ （標準比色表の作成） 0.1M硼酸−硝酸砂緩衝液（pH8.0）10mlに、NAD10mg、１
−メトキシPMS1mg、ニトロ−TB20mg、安定化剤としての
牛血清アルブミン及び参考試験例１で用いたと同様なβ
−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素50Uを溶解させた溶液に濾
紙を浸漬し、次いでこの濾紙を室温で風乾させた。

この濾紙を5mm角に裁断し、５×70mmの細長ポリ塩化ビ
ニルフィルムの先端に両面テープで貼合せ検査試験片を
得た。

一方、各種濃度の標準β−ヒドロキシ酪酸溶液（０、3
0、50、80、100、130、150、180、200、230及び250μmo
l/）を調製し、上記検査試験片の濾紙部分に１滴宛滴
下させ、３分間放置して反応させるとβ−ヒドロキシ酪
酸が存在すれば発色し、その色調は濃度に依存して変化
するので、これを標準比色表する。

実施例 臨床検査を行った乳牛の内で正常と判断された乳牛10頭
（No.1〜10）と軽度のケトーシスと診断された乳牛３頭
（No.11〜13）と重度のケトーシスと診断された乳牛２
頭（No.14〜15）を実験動物とした。各実験動物から搾
乳した乳汁を検体とし、参考試験例２で得た検査試験片
の濾紙部分に検体乳汁１滴を滴下し、３分間放置し、そ
の後過剰の乳汁を脱脂綿で拭き取り、呈色色調を参考試
験例２で得た標準比較色表と肉眼で照合した結果は下記
表に示される通りであった。

この表に示される結果から乳汁中のβ−ヒドロキシ酪酸
濃度が約180μmol/程度を基準として、乳牛に関して
ケトーシス状態か否かを診断し得ることが判る。

実施例２ 無作為的に乳牛を選んで搾乳して得た各乳汁を検体とし
て実施例１と同様にして直ちに検査を実施した。

この検査を通じて選ばれたβ−ヒドロキシ酪酸濃度が18
0μmol/未満の乳汁10例並びに300μmol/以上の乳汁
３例についてアルコール試験（熱安定性検査）及び酸度
試験（鮮度判定法）を常法により実施し、乳汁の等級判
定を行った処、前者は全て１等級と判定されたに対し、
後者は全て２等級と判定された。

このことは本発明方法が乳汁の品質に関する１つの判断
法として有用であることを示している。

（発明の効果） 本発明方法によれば、検体が採取の比較的容易な乳汁で
あり、しかも僅か１滴を必要とするに過ぎず、しかも検
査に必要な各種試薬は一体化せしめられ、吸収担体に含
浸させた後に又は支持体に塗布した後に乾燥させた所謂
試験片となしておくことができ、このような試験片を用
いれば検査及び診断を如何なる場所でも特別は試験機器
を必要とせずに極めて短時間、例えば５分以内で簡便に
実施できる。

従って、先ず予備的に少量搾乳して検査を行ない、当該
乳獣が健常状態であること、即ちケトーシスの状態では
ないことを確認した上で本格的搾乳を実施することがで
きるので、常に良質の獣乳を市場に供給し得ると謂う効
果を本発明はもたらす。

更に、従来、乳獣がケトーシスの状態が否かを診断する
ためには検体である血液又は尿の採取を含め獣医師等を
必要とし且つ時間を要していたために、健康診断は年１
回等の定期診断によらざるを得なかったが、本発明方法
は極めて容易且つ簡便であるので随時実施することがで
き、従って乳獣を良好な健康管理下におくことが可能と
なり、ケトーシスの早期診断やその早期治療が可能にな
ると謂う副次的効果をもたらす。

【図面の簡単な説明】

第１図は試薬混合液である反応液に各種濃度のβ−ヒド
ロキシ酪酸溶液を添加して反応させた場合の反応時間と
吸光度との関係を示すグラフ、第２図は反応時間を４分
間に設定した場合のβ−ヒドロキシ酪酸濃度と吸光度と
の関係を示すグラフである。

フロントページの続き (72)発明者 古川 英司 愛知県名古屋市東区新出来２丁目９―41

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】獣乳を検体とし、この検体中のβ−ヒドロ
   キシ酪酸をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存
   在下にβ−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素により脱水素して
   アセト酢酸に変じ、この場合に生成する還元型ニコチン
   アミドアデニンジヌクレオチドにより電子伝達体を介し
   テトラゾリウム塩を還元させて有色のホルマザンを生成
   させ、その呈色度を、標準比色表に照合して検体中のβ
   −ヒドロキシ酪酸を定量することにより、獣乳の品質検
   査と乳獣の健康診断とを同時に行う方法。
2. 【請求項２】試薬としてのβ−ヒドロキシ酪酸脱水素酵
   素と、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドと、電子
   伝達体と、テトラゾリウム塩とが乾燥状態で担体に支持
   された試験片となされており、この試験片に検体として
   の獣乳を滴下して反応させ発色させて比色定量を行うこ
   とを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の方法。