【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はシュードモナス属に属し
、Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物
の培養方法に関するものであり、さらに詳しくは、該酵
素活性の高い菌体を高収量で培養取得する方法に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素（Ｅ
Ｃ ４．１．１．１２）は、Ｌ−アスパラギン酸の４位
のカルボキシル基を脱炭酸して、Ｌ−アラニンを生成す
る酵素であり、Ｌ−アラニンの製造のために産業上有用
なものである。該酵素を含有する微生物の培養法として
は、培地中に乳酸、ピルビン酸を添加する方法（特公昭
６０−１９９９７号公報）、培地中にＬ−グルタミン酸
を添加する方法（特公昭５３−２７３５５号公報）等が
提案されている。さらに、本発明者らも、フマル酸を主
炭素源とする培地で培養した菌体を用いて、Ｌ−アラニ
ンを製造する方法を提案した（特開平２−２４２６９０
号公報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の方法は、添加する有機酸、アミノ酸が高価であったり
、得られる菌体の収量が十分でない等の欠点があり、工
業上使用する方法としては不満足なものであった。本発
明は、上記した課題を解決し、高いＬ−アスパラギン酸
β−脱炭酸酵素を含有するシュードモナス属に属する微
生物を高収量で培養取得する方法の提供を目的としてな
されたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意検討を行った結果、該微生物の培養の
後期において、培地に鉄化合物を添加することにより、
その課題が解決されることを見いだし、本発明を完成し
た。かくして本発明によれば、シュードモナス属に属し
、Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物
を培養する方法において、培養の後期に鉄化合物を添加
することを特徴とするシュードモナス属微生物の培養方
法が提供される。
【０００５】本発明に使用する微生物としては、シュー
ドモナス属に属し、Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素
を含有するものであれば特に限定されないが、例えば、
シュードモナス・ダクネー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｄａｃｕｎｈａｅ）ＩＡＭ １１５２、同ＡＴＣＣ２１
１９２、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＩＡＭ １５０６、同ＡＴＣＣ
２１８１２、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ
３０８１、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＩＡＭ １０
５４等が挙げられる。
【０００６】Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有
する微生物菌体の調製に使用される培地の炭素源として
は、通常一般に使用されるものでよいが、例えばフマル
酸、コハク酸、アスパラギン酸などを挙げることができ
、中でもフマル酸が特に好ましい。培地の窒素源として
は、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム
、硝酸アンモニウム、尿素などの無機塩を単独または混
合して用いることができる。培地の無機塩としては、リ
ン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグ
ネシウムなどが用いられる。この他に、菌の生育に必要
であれば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンス
ティープリカー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素
を培地に添加してもよい。
【０００７】Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有
する微生物菌体の培養は、通気撹拌、振盪などの好気的
条件下で行い、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２
８〜３２℃である。培養中のｐＨは５〜１０、好ましく
は７〜８付近である。培養開始時の培地中の炭素源の濃
度は、０．０５〜１０重量％であり、例えばフマル酸を
使用する場合、その濃度は好ましくは０．１〜５重量％
、より好ましくは０．５〜２重量％である。培養時間は
８時間〜４日間、好ましくは１０時間〜２日間である。
【０００８】本発明の培養法において重要なことは、培
養の後期に鉄化合物を添加することである。添加される
鉄化合物としては、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、塩化第一
鉄、塩化第二鉄及びこれらの水和物など、通常培地成分
として使用される鉄の塩であればいかなるものでも用い
ることができる。鉄化合物の添加濃度は、鉄分として０
．００００１〜０．１重量％、好ましくは０．００１〜
０．０１重量％を一度に、または数回に分けて、逐次あ
るいは連続的に総量が上記濃度範囲となるように添加す
ることができる。
【０００９】添加時期となる培養後期とは、対数増殖期
の後期以降を意味し、見かけ上菌体増殖の停止する安定
期に入った後に加えることが最も好ましい。この時期に
鉄化合物を添加する理由は、菌体の生育に必須な微量元
素である鉄化合物は、同時にＬ−アスパラギン酸β−脱
炭酸酵素活性を抑制する作用を有する。従って、培養の
後期以前に鉄化合物を添加すると菌体収量は良好だが比
活性が低いため、総活性の低下をきたす。このため後期
に添加することにより活性の低下を防ぎかつ菌体収量を
増す効果が期待できる。
【００１０】培養終了後、遠心分離により集菌し、該菌
体のＬ−アスパラギン酸脱炭酸酵素活性を下記の方法で
測定した。培養液１００ｍｌから集菌した菌体全量を反
応液（アスパラギン酸１５００ｍＭ，ピリドキサル５’
−リン酸０．０４ｍＭ，ピルビン酸ナトリウム５ｍＭ，
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート０．１容
量％及びアンモニア０．６Ｍ含有；ｐＨ４．８）２００
ｍｌに懸濁し、３０℃にて１時間振とうした後の生成ア
ラニン量をシリカゲル薄層クロマトグラフィーまたは高
速液体クロマトグラフィーにて測定することにより求め
た。なお、活性はブロス１ｍｌ当たり１時間に生成する
Ｌ−アラニン量（μｍｏｌｅ）で示した。
【００１１】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。
【実施例】［実施例１］培地（フマル酸ナトリウム０．
５％、フマル酸アンモニウム１．０％、酵母エキス０．
５％、リン酸二水素カリウム０．０５％、ＭｇＳＯ４・
７Ｈ２Ｏ０．０５％含有；ｐＨ７．０）１００ｍｌを５
００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で、２０分
滅菌した後、シュードモナス・ダクネー（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓｄａｃｕｎｈａｅ）ＡＴＣＣ２１１９２を一
白金耳植菌し、３０℃にて１日間振盪培養を行った（前
培養）。
【００１２】次に、上記と同じ培地１ｌを２ｌ容通気撹
拌槽に仕込み、１２０℃で２０分間滅菌した後、前培養
物液２０ｍｌを添加して、回転数１０００ｒｐｍ、通気
量１ｖｖｍ、温度３０℃、ｐＨ７．３にて培養を行い、
途中２０ｗ／ｖ％フマル酸アンモニウム（ｐＨ７．０）
を１．２％ずつ３回添加し、約１８時間培養した。途中
１５時間後、見かけのＯＤ６００ｎｍの濁度上昇が認め
られなくなった後、塩化第二鉄・６水塩を０．００１ｗ
／ｖ％濃度添加し、そのまま３時間培養を継続した。培
養終了後、培養液１００ｍｌから遠心分離した集菌体を
０．９ｗ／ｖ％食塩水で洗浄後、菌体全量を用いて、前
記の方法でＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を測
定した。 なお、比較例１として実施例１と同量の塩
化第二鉄・６水塩を対数増殖期（培養開始後約１０時間
）に添加した実験を、比較例２として塩化第二鉄を添加
しなかった実験を各々行った。結果を第１表にまとめた
。
【００１３】
【表１】
第１表
実験区
Ｌ−アス
パラギン酸β−脱炭酸酵素活性
（μｍｏｌｅ／ｍｌブロス／ｈｒ） 実施例
１
１，５００ 比較例１
７００ 比較例２
１，１００ 【０
０１４】
【発明の効果】本発明によれば、Ｌ−アスパラギン酸β
−脱炭酸酵素活性を有するシュードモナス属に属する微
生物を高収量で得ることができる。Detailed Description of the Invention [0001] The present invention relates to a method for culturing a microorganism belonging to the genus Pseudomonas and containing L-aspartate β-decarboxylase. The present invention relates to a method for culturing and obtaining microbial cells with high enzyme activity in high yield. [Prior Art] L-aspartate β-decarboxylase (E
C 4.1.1.12) is an enzyme that decarboxylates the carboxyl group at the 4-position of L-aspartic acid to produce L-alanine, and is industrially useful for the production of L-alanine. It is. Methods for culturing microorganisms containing the enzyme include a method of adding lactic acid and pyruvic acid to the medium (Japanese Patent Publication No. 19997-1982), and a method of adding L-glutamic acid to the medium (Japanese Patent Publication No. 27355-1982). Public bulletins) etc. have been proposed. Furthermore, the present inventors also proposed a method for producing L-alanine using bacterial cells cultured in a medium containing fumaric acid as the main carbon source (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-242690).
Publication No.). [0003] However, these methods have drawbacks such as the organic acids and amino acids added are expensive and the yield of the obtained bacterial cells is not sufficient, making it difficult to use them industrially. The method was unsatisfactory. The present invention has been made with the aim of solving the above-mentioned problems and providing a method for culturing and obtaining a high yield of microorganisms belonging to the genus Pseudomonas containing a high amount of L-aspartate β-decarboxylase. [Means for Solving the Problems] As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors found that by adding an iron compound to the medium in the latter stage of culturing the microorganism,
The inventors have found that this problem can be solved and have completed the present invention. Thus, according to the present invention, a method for culturing a microorganism belonging to the genus Pseudomonas and containing L-aspartate β-decarboxylase is characterized in that an iron compound is added in the latter stage of the culture. A method is provided. The microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as it belongs to the genus Pseudomonas and contains L-aspartate β-decarboxylase, but for example,
Pseudomonas dacne
IAM 1152, ATCC 21
192, Pseudomonas putida
as putida) IAM 1506, same ATCC
21812, Pseudomonas fluorescens (Ps
eudomonas fluorescens) IFO
3081, Pseudomonas aeruginosa (Pse
udomonasaeruginosa) IAM 10
54 etc. are mentioned. [0006] As a carbon source for the culture medium used for preparing microbial cells containing L-aspartate β-decarboxylase, commonly used carbon sources may be used, such as fumaric acid, succinic acid, and aspartic acid. Among them, fumaric acid is particularly preferred. As a nitrogen source for the culture medium, inorganic salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, urea, etc. can be used alone or in combination. As the inorganic salt of the medium, potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate, etc. are used. In addition, nutrients such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acids, and various vitamins may be added to the medium if necessary for the growth of the bacteria. [0007] The microbial cells containing L-aspartate β-decarboxylase are cultured under aerobic conditions such as aeration and shaking, and the culture temperature is 20 to 40°C, preferably 20°C.
The temperature is 8-32°C. The pH during culturing is around 5-10, preferably around 7-8. The concentration of the carbon source in the medium at the start of culture is 0.05 to 10% by weight; for example, when fumaric acid is used, the concentration is preferably 0.1 to 5% by weight.
, more preferably 0.5 to 2% by weight. The culture time is 8 hours to 4 days, preferably 10 hours to 2 days. [0008] What is important in the culture method of the present invention is to add an iron compound in the latter stage of the culture. The iron compounds to be added include any iron salts that are normally used as culture medium components, such as ferrous sulfate, ferric sulfate, ferrous chloride, ferric chloride, and their hydrates. It can also be used. The concentration of iron compounds added is 0 as iron content.
．． 00001-0.1% by weight, preferably 0.001-0.001% by weight
0.01% by weight can be added all at once or in several portions, sequentially or continuously so that the total amount falls within the above concentration range. [0009] The late stage of culture, which is the time of addition, means the stage after the late logarithmic growth phase, and it is most preferable to add after entering the stable phase in which cell growth apparently stops. The reason why iron compounds are added at this time is that iron compounds, which are trace elements essential for the growth of bacterial cells, also have the effect of suppressing L-aspartate β-decarboxylase activity. Therefore, if an iron compound is added before the late stage of culture, the bacterial cell yield will be good, but the specific activity will be low, resulting in a decrease in the total activity. Therefore, by adding it at a later stage, it can be expected to prevent the activity from decreasing and increase the bacterial cell yield. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, and the L-aspartate decarboxylase activity of the cells was measured by the following method. The total amount of bacteria collected from 100 ml of culture solution was added to the reaction solution (aspartic acid 1500 mM, pyridoxal 5'
- 0.04mM phosphoric acid, 5mM sodium pyruvate,
Contains 0.1% by volume of polyoxyethylene sorbitan monolaurate and 0.6M ammonia; pH 4.8) 200
ml and shaken at 30°C for 1 hour, the amount of alanine produced was determined by measuring using silica gel thin layer chromatography or high performance liquid chromatography. Note that the activity was expressed as the amount of L-alanine (μmole) produced per 1 ml of broth in 1 hour. [0011] The present invention will be explained in more detail below with reference to Examples. [Example] [Example 1] Medium (sodium fumarate 0.
5%, ammonium fumarate 1.0%, yeast extract 0.
5%, potassium dihydrogen phosphate 0.05%, MgSO4.
7H2O containing 0.05%; pH 7.0) 100ml
After dispensing into 00ml Erlenmeyer flasks and sterilizing them at 120°C for 20 minutes, Pseudomonas dacne (Pseudomonas
Monas dacunhae) ATCC 21192 was inoculated in one platinum loop, and cultured with shaking at 30° C. for 1 day (preculture). Next, 1 liter of the same medium as above was placed in a 2 liter aeration stirring tank, and after sterilization at 120°C for 20 minutes, 20ml of the pre-culture solution was added, and the temperature was 30°C at a rotation speed of 1000 rpm, aeration rate of 1 vvm, and a temperature of 30° C. , cultured at pH 7.3,
20w/v% ammonium fumarate (pH 7.0)
was added three times at 1.2% each and cultured for about 18 hours. After 15 hours during the process, after no apparent increase in turbidity at OD600nm was observed, 0.001w of ferric chloride hexahydrate was added.
/v% concentration was added, and the culture was continued for 3 hours. After completion of the culture, the collected cells were centrifuged from 100 ml of the culture solution and washed with 0.9 w/v% saline, and the L-aspartate β-decarboxylase activity was measured by the method described above using the entire amount of the cells. did. Comparative Example 1 was an experiment in which the same amount of ferric chloride hexahydrate as in Example 1 was added during the logarithmic growth phase (approximately 10 hours after the start of culture), and Comparative Example 2 was an experiment in which ferric chloride was added. We each conducted experiments that were not available. The results are summarized in Table 1. [Table 1]
Table 1
Experimental area
L-aspartate β-decarboxylase activity
(μmole/ml broth/hr) Example 1
1,500 Comparative example 1
700 Comparative example 2
1,100 0
Effects of the Invention According to the present invention, L-aspartic acid β
- Microorganisms belonging to the genus Pseudomonas having decarboxylase activity can be obtained in high yield.