JPH04320678A - シュードモナス属微生物の培養方法 - Google Patents
シュードモナス属微生物の培養方法Info
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- JPH04320678A JPH04320678A JP8859791A JP8859791A JPH04320678A JP H04320678 A JPH04320678 A JP H04320678A JP 8859791 A JP8859791 A JP 8859791A JP 8859791 A JP8859791 A JP 8859791A JP H04320678 A JPH04320678 A JP H04320678A
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- JP
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- culture
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- genus pseudomonas
- aspartate
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はシュードモナス属に属し
、Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物
の培養方法に関するものであり、さらに詳しくは、該酵
素活性の高い菌体を高収量で培養取得する方法に関する
ものである。 【０００２】 【従来の技術】Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素（Ｅ
Ｃ ４．１．１．１２）は、Ｌ−アスパラギン酸の４位
のカルボキシル基を脱炭酸して、Ｌ−アラニンを生成す
る酵素であり、Ｌ−アラニンの製造のために産業上有用
なものである。該酵素を含有する微生物の培養法として
は、培地中に乳酸、ピルビン酸を添加する方法（特公昭
６０−１９９９７号公報）、培地中にＬ−グルタミン酸
を添加する方法（特公昭５３−２７３５５号公報）等が
提案されている。さらに、本発明者らも、フマル酸を主
炭素源とする培地で培養した菌体を用いて、Ｌ−アラニ
ンを製造する方法を提案した（特開平２−２４２６９０
号公報）。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の方法は、添加する有機酸、アミノ酸が高価であったり
、得られる菌体の収量が十分でない等の欠点があり、工
業上使用する方法としては不満足なものであった。本発
明は、上記した課題を解決し、高いＬ−アスパラギン酸
β−脱炭酸酵素を含有するシュードモナス属に属する微
生物を高収量で培養取得する方法の提供を目的としてな
されたものである。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意検討を行った結果、該微生物の培養の
後期において、培地に鉄化合物を添加することにより、
その課題が解決されることを見いだし、本発明を完成し
た。かくして本発明によれば、シュードモナス属に属し
、Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物
を培養する方法において、培養の後期に鉄化合物を添加
することを特徴とするシュードモナス属微生物の培養方
法が提供される。 【０００５】本発明に使用する微生物としては、シュー
ドモナス属に属し、Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素
を含有するものであれば特に限定されないが、例えば、
シュードモナス・ダクネー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｄａｃｕｎｈａｅ）ＩＡＭ １１５２、同ＡＴＣＣ２１
１９２、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＩＡＭ １５０６、同ＡＴＣＣ
２１８１２、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ
３０８１、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＩＡＭ １０
５４等が挙げられる。 【０００６】Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有
する微生物菌体の調製に使用される培地の炭素源として
は、通常一般に使用されるものでよいが、例えばフマル
酸、コハク酸、アスパラギン酸などを挙げることができ
、中でもフマル酸が特に好ましい。培地の窒素源として
は、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム
、硝酸アンモニウム、尿素などの無機塩を単独または混
合して用いることができる。培地の無機塩としては、リ
ン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグ
ネシウムなどが用いられる。この他に、菌の生育に必要
であれば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンス
ティープリカー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素
を培地に添加してもよい。 【０００７】Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有
する微生物菌体の培養は、通気撹拌、振盪などの好気的
条件下で行い、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２
８〜３２℃である。培養中のｐＨは５〜１０、好ましく
は７〜８付近である。培養開始時の培地中の炭素源の濃
度は、０．０５〜１０重量％であり、例えばフマル酸を
使用する場合、その濃度は好ましくは０．１〜５重量％
、より好ましくは０．５〜２重量％である。培養時間は
８時間〜４日間、好ましくは１０時間〜２日間である。 【０００８】本発明の培養法において重要なことは、培
養の後期に鉄化合物を添加することである。添加される
鉄化合物としては、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、塩化第一
鉄、塩化第二鉄及びこれらの水和物など、通常培地成分
として使用される鉄の塩であればいかなるものでも用い
ることができる。鉄化合物の添加濃度は、鉄分として０
．００００１〜０．１重量％、好ましくは０．００１〜
０．０１重量％を一度に、または数回に分けて、逐次あ
るいは連続的に総量が上記濃度範囲となるように添加す
ることができる。 【０００９】添加時期となる培養後期とは、対数増殖期
の後期以降を意味し、見かけ上菌体増殖の停止する安定
期に入った後に加えることが最も好ましい。この時期に
鉄化合物を添加する理由は、菌体の生育に必須な微量元
素である鉄化合物は、同時にＬ−アスパラギン酸β−脱
炭酸酵素活性を抑制する作用を有する。従って、培養の
後期以前に鉄化合物を添加すると菌体収量は良好だが比
活性が低いため、総活性の低下をきたす。このため後期
に添加することにより活性の低下を防ぎかつ菌体収量を
増す効果が期待できる。 【００１０】培養終了後、遠心分離により集菌し、該菌
体のＬ−アスパラギン酸脱炭酸酵素活性を下記の方法で
測定した。培養液１００ｍｌから集菌した菌体全量を反
応液（アスパラギン酸１５００ｍＭ，ピリドキサル５’
−リン酸０．０４ｍＭ，ピルビン酸ナトリウム５ｍＭ，
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート０．１容
量％及びアンモニア０．６Ｍ含有；ｐＨ４．８）２００
ｍｌに懸濁し、３０℃にて１時間振とうした後の生成ア
ラニン量をシリカゲル薄層クロマトグラフィーまたは高
速液体クロマトグラフィーにて測定することにより求め
た。なお、活性はブロス１ｍｌ当たり１時間に生成する
Ｌ−アラニン量（μｍｏｌｅ）で示した。 【００１１】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。 【実施例】［実施例１］培地（フマル酸ナトリウム０．
５％、フマル酸アンモニウム１．０％、酵母エキス０．
５％、リン酸二水素カリウム０．０５％、ＭｇＳＯ４・
７Ｈ２Ｏ０．０５％含有；ｐＨ７．０）１００ｍｌを５
００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で、２０分
滅菌した後、シュードモナス・ダクネー（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓｄａｃｕｎｈａｅ）ＡＴＣＣ２１１９２を一
白金耳植菌し、３０℃にて１日間振盪培養を行った（前
培養）。 【００１２】次に、上記と同じ培地１ｌを２ｌ容通気撹
拌槽に仕込み、１２０℃で２０分間滅菌した後、前培養
物液２０ｍｌを添加して、回転数１０００ｒｐｍ、通気
量１ｖｖｍ、温度３０℃、ｐＨ７．３にて培養を行い、
途中２０ｗ／ｖ％フマル酸アンモニウム（ｐＨ７．０）
を１．２％ずつ３回添加し、約１８時間培養した。途中
１５時間後、見かけのＯＤ６００ｎｍの濁度上昇が認め
られなくなった後、塩化第二鉄・６水塩を０．００１ｗ
／ｖ％濃度添加し、そのまま３時間培養を継続した。培
養終了後、培養液１００ｍｌから遠心分離した集菌体を
０．９ｗ／ｖ％食塩水で洗浄後、菌体全量を用いて、前
記の方法でＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を測
定した。 なお、比較例１として実施例１と同量の塩
化第二鉄・６水塩を対数増殖期（培養開始後約１０時間
）に添加した実験を、比較例２として塩化第二鉄を添加
しなかった実験を各々行った。結果を第１表にまとめた
。 【００１３】 【表１】
第１表
実験区
Ｌ−アス
パラギン酸β−脱炭酸酵素活性
（μｍｏｌｅ／ｍｌブロス／ｈｒ） 実施例
１
１，５００ 比較例１
７００ 比較例２
１，１００ 【０
０１４】 【発明の効果】本発明によれば、Ｌ−アスパラギン酸β
−脱炭酸酵素活性を有するシュードモナス属に属する微
生物を高収量で得ることができる。
、Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物
の培養方法に関するものであり、さらに詳しくは、該酵
素活性の高い菌体を高収量で培養取得する方法に関する
ものである。 【０００２】 【従来の技術】Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素（Ｅ
Ｃ ４．１．１．１２）は、Ｌ−アスパラギン酸の４位
のカルボキシル基を脱炭酸して、Ｌ−アラニンを生成す
る酵素であり、Ｌ−アラニンの製造のために産業上有用
なものである。該酵素を含有する微生物の培養法として
は、培地中に乳酸、ピルビン酸を添加する方法（特公昭
６０−１９９９７号公報）、培地中にＬ−グルタミン酸
を添加する方法（特公昭５３−２７３５５号公報）等が
提案されている。さらに、本発明者らも、フマル酸を主
炭素源とする培地で培養した菌体を用いて、Ｌ−アラニ
ンを製造する方法を提案した（特開平２−２４２６９０
号公報）。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の方法は、添加する有機酸、アミノ酸が高価であったり
、得られる菌体の収量が十分でない等の欠点があり、工
業上使用する方法としては不満足なものであった。本発
明は、上記した課題を解決し、高いＬ−アスパラギン酸
β−脱炭酸酵素を含有するシュードモナス属に属する微
生物を高収量で培養取得する方法の提供を目的としてな
されたものである。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意検討を行った結果、該微生物の培養の
後期において、培地に鉄化合物を添加することにより、
その課題が解決されることを見いだし、本発明を完成し
た。かくして本発明によれば、シュードモナス属に属し
、Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物
を培養する方法において、培養の後期に鉄化合物を添加
することを特徴とするシュードモナス属微生物の培養方
法が提供される。 【０００５】本発明に使用する微生物としては、シュー
ドモナス属に属し、Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素
を含有するものであれば特に限定されないが、例えば、
シュードモナス・ダクネー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｄａｃｕｎｈａｅ）ＩＡＭ １１５２、同ＡＴＣＣ２１
１９２、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＩＡＭ １５０６、同ＡＴＣＣ
２１８１２、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ
３０８１、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＩＡＭ １０
５４等が挙げられる。 【０００６】Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有
する微生物菌体の調製に使用される培地の炭素源として
は、通常一般に使用されるものでよいが、例えばフマル
酸、コハク酸、アスパラギン酸などを挙げることができ
、中でもフマル酸が特に好ましい。培地の窒素源として
は、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム
、硝酸アンモニウム、尿素などの無機塩を単独または混
合して用いることができる。培地の無機塩としては、リ
ン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグ
ネシウムなどが用いられる。この他に、菌の生育に必要
であれば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンス
ティープリカー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素
を培地に添加してもよい。 【０００７】Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有
する微生物菌体の培養は、通気撹拌、振盪などの好気的
条件下で行い、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２
８〜３２℃である。培養中のｐＨは５〜１０、好ましく
は７〜８付近である。培養開始時の培地中の炭素源の濃
度は、０．０５〜１０重量％であり、例えばフマル酸を
使用する場合、その濃度は好ましくは０．１〜５重量％
、より好ましくは０．５〜２重量％である。培養時間は
８時間〜４日間、好ましくは１０時間〜２日間である。 【０００８】本発明の培養法において重要なことは、培
養の後期に鉄化合物を添加することである。添加される
鉄化合物としては、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、塩化第一
鉄、塩化第二鉄及びこれらの水和物など、通常培地成分
として使用される鉄の塩であればいかなるものでも用い
ることができる。鉄化合物の添加濃度は、鉄分として０
．００００１〜０．１重量％、好ましくは０．００１〜
０．０１重量％を一度に、または数回に分けて、逐次あ
るいは連続的に総量が上記濃度範囲となるように添加す
ることができる。 【０００９】添加時期となる培養後期とは、対数増殖期
の後期以降を意味し、見かけ上菌体増殖の停止する安定
期に入った後に加えることが最も好ましい。この時期に
鉄化合物を添加する理由は、菌体の生育に必須な微量元
素である鉄化合物は、同時にＬ−アスパラギン酸β−脱
炭酸酵素活性を抑制する作用を有する。従って、培養の
後期以前に鉄化合物を添加すると菌体収量は良好だが比
活性が低いため、総活性の低下をきたす。このため後期
に添加することにより活性の低下を防ぎかつ菌体収量を
増す効果が期待できる。 【００１０】培養終了後、遠心分離により集菌し、該菌
体のＬ−アスパラギン酸脱炭酸酵素活性を下記の方法で
測定した。培養液１００ｍｌから集菌した菌体全量を反
応液（アスパラギン酸１５００ｍＭ，ピリドキサル５’
−リン酸０．０４ｍＭ，ピルビン酸ナトリウム５ｍＭ，
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート０．１容
量％及びアンモニア０．６Ｍ含有；ｐＨ４．８）２００
ｍｌに懸濁し、３０℃にて１時間振とうした後の生成ア
ラニン量をシリカゲル薄層クロマトグラフィーまたは高
速液体クロマトグラフィーにて測定することにより求め
た。なお、活性はブロス１ｍｌ当たり１時間に生成する
Ｌ−アラニン量（μｍｏｌｅ）で示した。 【００１１】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。 【実施例】［実施例１］培地（フマル酸ナトリウム０．
５％、フマル酸アンモニウム１．０％、酵母エキス０．
５％、リン酸二水素カリウム０．０５％、ＭｇＳＯ４・
７Ｈ２Ｏ０．０５％含有；ｐＨ７．０）１００ｍｌを５
００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で、２０分
滅菌した後、シュードモナス・ダクネー（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓｄａｃｕｎｈａｅ）ＡＴＣＣ２１１９２を一
白金耳植菌し、３０℃にて１日間振盪培養を行った（前
培養）。 【００１２】次に、上記と同じ培地１ｌを２ｌ容通気撹
拌槽に仕込み、１２０℃で２０分間滅菌した後、前培養
物液２０ｍｌを添加して、回転数１０００ｒｐｍ、通気
量１ｖｖｍ、温度３０℃、ｐＨ７．３にて培養を行い、
途中２０ｗ／ｖ％フマル酸アンモニウム（ｐＨ７．０）
を１．２％ずつ３回添加し、約１８時間培養した。途中
１５時間後、見かけのＯＤ６００ｎｍの濁度上昇が認め
られなくなった後、塩化第二鉄・６水塩を０．００１ｗ
／ｖ％濃度添加し、そのまま３時間培養を継続した。培
養終了後、培養液１００ｍｌから遠心分離した集菌体を
０．９ｗ／ｖ％食塩水で洗浄後、菌体全量を用いて、前
記の方法でＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を測
定した。 なお、比較例１として実施例１と同量の塩
化第二鉄・６水塩を対数増殖期（培養開始後約１０時間
）に添加した実験を、比較例２として塩化第二鉄を添加
しなかった実験を各々行った。結果を第１表にまとめた
。 【００１３】 【表１】
第１表
実験区
Ｌ−アス
パラギン酸β−脱炭酸酵素活性
（μｍｏｌｅ／ｍｌブロス／ｈｒ） 実施例
１
１，５００ 比較例１
７００ 比較例２
１，１００ 【０
０１４】 【発明の効果】本発明によれば、Ｌ−アスパラギン酸β
−脱炭酸酵素活性を有するシュードモナス属に属する微
生物を高収量で得ることができる。
Claims (1)
- 【請求項１】シュードモナス属に属し、Ｌ−アスパラギ
ン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物を培養する方法に
おいて、培養の後期に鉄化合物を添加することを特徴と
するシュードモナス属微生物の培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8859791A JPH04320678A (ja) | 1991-04-19 | 1991-04-19 | シュードモナス属微生物の培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8859791A JPH04320678A (ja) | 1991-04-19 | 1991-04-19 | シュードモナス属微生物の培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04320678A true JPH04320678A (ja) | 1992-11-11 |
Family
ID=13947239
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8859791A Pending JPH04320678A (ja) | 1991-04-19 | 1991-04-19 | シュードモナス属微生物の培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04320678A (ja) |
-
1991
- 1991-04-19 JP JP8859791A patent/JPH04320678A/ja active Pending
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