JPH04320679A - Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼを生産する微生物、微生物学的に生産されたｌ‐カルニチン‐アミダーゼ、その取得方法およびｌ‐カルニチンへのｄｌ‐および／またはカルニチンアミドの酵素的変換方法 - Google Patents
Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼを生産する微生物、微生物学的に生産されたｌ‐カルニチン‐アミダーゼ、その取得方法およびｌ‐カルニチンへのｄｌ‐および／またはカルニチンアミドの酵素的変換方法Info
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- JPH04320679A JPH04320679A JP4041353A JP4135392A JPH04320679A JP H04320679 A JPH04320679 A JP H04320679A JP 4041353 A JP4041353 A JP 4041353A JP 4135392 A JP4135392 A JP 4135392A JP H04320679 A JPH04320679 A JP H04320679A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、寄託番号ＤＭＳ ６
２３０を有する微生物に関する。
２３０を有する微生物に関する。
【０００２】更に、本発明は、以下の性質：ａ）反応性
：このＬ‐カルニチン‐アミダーゼが、Ｌ‐カルニチン
アミドをＬ‐カルニチンおよびアンモニアへ加水分解す
る反応性、ｂ）基質特異性：このＬ‐カルニチン‐アミ
ダーゼが、Ｄ‐カルニチンアミド、脂肪族または芳香族
カルボン酸アミド、アミノ酸アミドおよびジペプチドア
ミドを加水分解しない基質特異性、ｃ）誘導物質：この
Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼが、誘導可能な酵素であり
、かつＬ‐カルニチンアミド、Ｌ‐カルニチン、γ‐ブ
チロベタインおよびデヒドロカルニチンによって誘導さ
れる誘導物質、ｄ）ｐＨ‐最適値：最適なｐＨ範囲がｐ
Ｈ７．０〜９．５の間にあるｐＨ‐最適値、ｅ）ｐＨ‐
安定性：このＬ‐カルニチン‐アミダーゼが、良好なｐ
Ｈ‐安定性をｐＨ５．０〜９．５の間のｐＨ範囲内で示
すｐＨ‐安定性、ｆ）酵素阻害物質：Ｚｎ２＋Ｃｕ２＋
Ｈｇ２＋およびＡｇ２＋、更にｐ‐ヒドロキシメルクリ
安息香酸塩、フェニルメタンスルホニルフルオリドおよ
びジニトロジチオ安息香酸１ミリモルの濃度ですでに阻
害的に作用する酵素阻害物質、ｇ）分子量：この分子量
が約１３００００である分子量、ｈ）下部単位：このＬ
‐カルニチン‐アミダーゼが、それぞれ約６５０００の
分子量を有する２つの同定下部単位から成る下部単位、
ｉ）等電点：この等電点がｐＨ４．２である等電点、ｊ
）アミノ酸配列：第１の４８ Ｎ末端アミノ酸が次の
ものである：
：このＬ‐カルニチン‐アミダーゼが、Ｌ‐カルニチン
アミドをＬ‐カルニチンおよびアンモニアへ加水分解す
る反応性、ｂ）基質特異性：このＬ‐カルニチン‐アミ
ダーゼが、Ｄ‐カルニチンアミド、脂肪族または芳香族
カルボン酸アミド、アミノ酸アミドおよびジペプチドア
ミドを加水分解しない基質特異性、ｃ）誘導物質：この
Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼが、誘導可能な酵素であり
、かつＬ‐カルニチンアミド、Ｌ‐カルニチン、γ‐ブ
チロベタインおよびデヒドロカルニチンによって誘導さ
れる誘導物質、ｄ）ｐＨ‐最適値：最適なｐＨ範囲がｐ
Ｈ７．０〜９．５の間にあるｐＨ‐最適値、ｅ）ｐＨ‐
安定性：このＬ‐カルニチン‐アミダーゼが、良好なｐ
Ｈ‐安定性をｐＨ５．０〜９．５の間のｐＨ範囲内で示
すｐＨ‐安定性、ｆ）酵素阻害物質：Ｚｎ２＋Ｃｕ２＋
Ｈｇ２＋およびＡｇ２＋、更にｐ‐ヒドロキシメルクリ
安息香酸塩、フェニルメタンスルホニルフルオリドおよ
びジニトロジチオ安息香酸１ミリモルの濃度ですでに阻
害的に作用する酵素阻害物質、ｇ）分子量：この分子量
が約１３００００である分子量、ｈ）下部単位：このＬ
‐カルニチン‐アミダーゼが、それぞれ約６５０００の
分子量を有する２つの同定下部単位から成る下部単位、
ｉ）等電点：この等電点がｐＨ４．２である等電点、ｊ
）アミノ酸配列：第１の４８ Ｎ末端アミノ酸が次の
ものである：
【０００３】
【外２】
【０００４】を有することを特徴とするような微生物学
的に得られたＬ‐カルニチン‐アミダーゼに関する。
的に得られたＬ‐カルニチン‐アミダーゼに関する。
【０００５】その上、本発明は、菌株ＤＳＭ ６２３
０を、鉱酸塩、上記の誘導物質の１つ並びに炭素および
窒素の源を含有する水性培養基中で２０℃〜３０℃の温
度および６．５〜８．５の間の出発‐ｐＨ‐値で好気的
に培養し、細胞物質を分離し、かつ細胞から酵素を単離
することを特徴とするような前記Ｌ‐カルニチン‐アミ
ダーゼの取得方法に関する。
０を、鉱酸塩、上記の誘導物質の１つ並びに炭素および
窒素の源を含有する水性培養基中で２０℃〜３０℃の温
度および６．５〜８．５の間の出発‐ｐＨ‐値で好気的
に培養し、細胞物質を分離し、かつ細胞から酵素を単離
することを特徴とするような前記Ｌ‐カルニチン‐アミ
ダーゼの取得方法に関する。
【０００６】最後に、本発明は、ＤＳＭ ６２３０の
微生物またはこれから得られるＬ‐カルニチン‐アミダ
ーゼを使用することを特徴とする、Ｌ‐カルニチンへの
ＤＬ‐および／またはカルニチンアミドの酵素的変換方
法に関する。
微生物またはこれから得られるＬ‐カルニチン‐アミダ
ーゼを使用することを特徴とする、Ｌ‐カルニチンへの
ＤＬ‐および／またはカルニチンアミドの酵素的変換方
法に関する。
【０００７】
【従来の技術】微生物菌株ＤＳＭ ６２３０は、１９
９０年１０月１日に、ドイッチェン ザンムルング
フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェ
ルクルトゥーレン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｓａｍｍｌ
ｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ
ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ
）に寄託された。この菌株は、長さ１．５〜２．５μｍ
および幅０．５〜０．７μｍを有する桿状体で成長し、
グラム反応を示さず、ＫＯＨ３％またはアミノペプチダ
ーゼ（Ｃｅｒｎｙ）によって、溶解を生じる。この菌株
は、胞子を形成せず、酸化酵素およびカタラーゼを含有
している。この菌株は、嫌気性ではなく、好気性で３７
℃で成長するが、４１℃およびｐＨ５．６では成長せず
、該菌株は、Ｍａｃ‐Ｃｏｎｋｅｙ‐Ａｇａｒ上では成
長するが、ＳＳ‐ＡｇａｒまたはＣｅｔｒｉｍｉｄ‐Ａ
ｇａｒ上では成長しない。 この菌株は、拡散しないかまたは拡散する、螢光を発す
る色素並びにピオシアニンを含有していない。この菌株
は、ＯＦ‐試験の際に、グルコースから好気性または嫌
気性の酸を形成せず、かつグルコースからガスを発生し
ない。ＡＳＳ‐試験の際に、この菌株はグルコースおよ
びキシロースから酸を形成するが、しかしフルクトース
からは酸を形成しない。この菌株は、ＡＤＨ、ＯＤＣ、
ＬＤＣ、ＯＮＰＧ、ＶＰおよびインドールを形成しない
。この菌株は、ＮＯ３をＮＯ２へ還元せず、脱窒素作用
を生じない。この菌株は、フェニルアラニンデスアミナ
ーゼを形成し、蔗糖からレバンを形成せず、レシチナー
ゼおよびウレアーゼを形成しない。
９０年１０月１日に、ドイッチェン ザンムルング
フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェ
ルクルトゥーレン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｓａｍｍｌ
ｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ
ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ
）に寄託された。この菌株は、長さ１．５〜２．５μｍ
および幅０．５〜０．７μｍを有する桿状体で成長し、
グラム反応を示さず、ＫＯＨ３％またはアミノペプチダ
ーゼ（Ｃｅｒｎｙ）によって、溶解を生じる。この菌株
は、胞子を形成せず、酸化酵素およびカタラーゼを含有
している。この菌株は、嫌気性ではなく、好気性で３７
℃で成長するが、４１℃およびｐＨ５．６では成長せず
、該菌株は、Ｍａｃ‐Ｃｏｎｋｅｙ‐Ａｇａｒ上では成
長するが、ＳＳ‐ＡｇａｒまたはＣｅｔｒｉｍｉｄ‐Ａ
ｇａｒ上では成長しない。 この菌株は、拡散しないかまたは拡散する、螢光を発す
る色素並びにピオシアニンを含有していない。この菌株
は、ＯＦ‐試験の際に、グルコースから好気性または嫌
気性の酸を形成せず、かつグルコースからガスを発生し
ない。ＡＳＳ‐試験の際に、この菌株はグルコースおよ
びキシロースから酸を形成するが、しかしフルクトース
からは酸を形成しない。この菌株は、ＡＤＨ、ＯＤＣ、
ＬＤＣ、ＯＮＰＧ、ＶＰおよびインドールを形成しない
。この菌株は、ＮＯ３をＮＯ２へ還元せず、脱窒素作用
を生じない。この菌株は、フェニルアラニンデスアミナ
ーゼを形成し、蔗糖からレバンを形成せず、レシチナー
ゼおよびウレアーゼを形成しない。
【０００８】この菌株は、澱粉、ゼラチン、カゼイン、
ＤＮＡ、トゥイーン ８０またはエスクリンを加水分
解せず、チロシンを分解しない。基質として、この菌株
は、酢酸塩、リンゴ酸塩、酢酸フェニルおよびフルクト
ースを使用するが、しかし、アジピン酸塩、クエン酸塩
、グリコール酸塩、乳酸塩、レブリン酸塩、マロン酸塩
、スベリン酸塩、Ｌ‐アラビノース、グルコース、マン
ノース、麦芽糖、キシロース、マンニトール、グルコン
酸塩、２‐ケトグルコン酸塩、Ｎ‐アセチルグルコサミ
ン、Ｌ‐セリン、Ｌ‐ヒスチジンおよびヒドロキシ酪酸
塩を使用しない。主要キノン成分はユビキノン １０
である。
ＤＮＡ、トゥイーン ８０またはエスクリンを加水分
解せず、チロシンを分解しない。基質として、この菌株
は、酢酸塩、リンゴ酸塩、酢酸フェニルおよびフルクト
ースを使用するが、しかし、アジピン酸塩、クエン酸塩
、グリコール酸塩、乳酸塩、レブリン酸塩、マロン酸塩
、スベリン酸塩、Ｌ‐アラビノース、グルコース、マン
ノース、麦芽糖、キシロース、マンニトール、グルコン
酸塩、２‐ケトグルコン酸塩、Ｎ‐アセチルグルコサミ
ン、Ｌ‐セリン、Ｌ‐ヒスチジンおよびヒドロキシ酪酸
塩を使用しない。主要キノン成分はユビキノン １０
である。
【０００９】微生物菌株ＤＭＳ ６２３０は、今日ま
でに記載された種に明確に分類されていない。しかし、
その細胞の脂肪酸型およびキノン成分に基づいて、前記
の細菌は紅色細菌のα‐亜族に分類されていて、従って
、例えばアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）およびスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎ
ａｓ）種に類似している。プソイドモナス種の本物の菌
株には、キノン組成および細胞の脂肪酸に基づいて、明
確な線引きを行うことができる。
でに記載された種に明確に分類されていない。しかし、
その細胞の脂肪酸型およびキノン成分に基づいて、前記
の細菌は紅色細菌のα‐亜族に分類されていて、従って
、例えばアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）およびスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎ
ａｓ）種に類似している。プソイドモナス種の本物の菌
株には、キノン組成および細胞の脂肪酸に基づいて、明
確な線引きを行うことができる。
【００１０】最も重要な形態学的、生理学的および生化
学的性質は、以下の表中にまとめられている：
学的性質は、以下の表中にまとめられている：
【００１
１】
１】
【表１】
【００１２】Ｌ‐カルニチン（３‐ヒドロキシ‐４‐ト
リメチルアミノブチレート）は、カルニチンの、専ら生
理学的に作用する形である。これは動物界において偏在
的に拡がっており、かつまた植物においても検出されて
いる。Ｄ‐カルニチンは、これまでなお動物組織中には
検出されていなかった。Ｌ‐カルニチンは、長鎖で活性
化した脂肪酸を、ミトコンドリア内膜を介してミトコン
ドリアマトリックス中へ移送し、ここで脂肪酸のβ‐酸
化が行われる。短鎖の脂肪酸は、ミトコンドリア内膜を
自由に通過できる。従って、カルニチンの不足は、長鎖
の脂肪酸を損なうものである。カルニチンの不足現象は
、Ｌ‐カルニチンを用いる補充療法によって処置される
。必要なＬ‐カルニチン量は、常に提供されているわけ
ではないので、しばしばラセミ体のＤＬ‐カルニチンが
投与されていた。ＤＬ‐カルニチンは、欧州では食欲促
進剤として、運動選手の栄養補給のための添加剤として
、心臓病および脂肪過多症の処置のために使用されてい
た。しかしながら最近では、専らＬ‐カルニチンを投与
するというのが傾向である。それというのも、Ｄ‐カル
ニチンがカルニチンを結合した酵素の競合的阻害剤であ
り、その結果望ましくない副作用を引き起こし得ること
が確認されたからである。
リメチルアミノブチレート）は、カルニチンの、専ら生
理学的に作用する形である。これは動物界において偏在
的に拡がっており、かつまた植物においても検出されて
いる。Ｄ‐カルニチンは、これまでなお動物組織中には
検出されていなかった。Ｌ‐カルニチンは、長鎖で活性
化した脂肪酸を、ミトコンドリア内膜を介してミトコン
ドリアマトリックス中へ移送し、ここで脂肪酸のβ‐酸
化が行われる。短鎖の脂肪酸は、ミトコンドリア内膜を
自由に通過できる。従って、カルニチンの不足は、長鎖
の脂肪酸を損なうものである。カルニチンの不足現象は
、Ｌ‐カルニチンを用いる補充療法によって処置される
。必要なＬ‐カルニチン量は、常に提供されているわけ
ではないので、しばしばラセミ体のＤＬ‐カルニチンが
投与されていた。ＤＬ‐カルニチンは、欧州では食欲促
進剤として、運動選手の栄養補給のための添加剤として
、心臓病および脂肪過多症の処置のために使用されてい
た。しかしながら最近では、専らＬ‐カルニチンを投与
するというのが傾向である。それというのも、Ｄ‐カル
ニチンがカルニチンを結合した酵素の競合的阻害剤であ
り、その結果望ましくない副作用を引き起こし得ること
が確認されたからである。
【００１３】筋肉中にＬ‐カルニチンが発見されて以来
、動物性物質からＬ‐カルニチンは費用のかかる単離方
法および精製方法で取得される。１９５０年代には、多
工程の化学合成が行われていたが、しかしこれらはすべ
て、ＤＬ‐カルニチンを生じるものである。Ｌ‐異性体
の単離のために、今日まで、光学的に活性の酸の使用下
での分別結晶によるラセミ分割に基づく方法が使用され
ている。また、Ｌ‐カルニチンを得るための多数の生化
学的方法が記載されている：例えば、γ‐ブチロベタイ
ンのヒドロキシル化、３‐デヒドロカルニチンの還元、
クロトノベタインの変換、エステラーゼを用いたＤＬ‐
Ｏ‐アシルカルニチンの加水分解またはＤＬ‐カルニチ
ンニトリルの加水分解。工業的な使用のためには、これ
ら全ての方法が欠点を有している。それというのも、出
発物質が高価であるか、使用すべき酵素が不安定である
か、不十分な立体選択性または活量を提供するか、もし
くは高価な補酵素の使用が必要だからである。
、動物性物質からＬ‐カルニチンは費用のかかる単離方
法および精製方法で取得される。１９５０年代には、多
工程の化学合成が行われていたが、しかしこれらはすべ
て、ＤＬ‐カルニチンを生じるものである。Ｌ‐異性体
の単離のために、今日まで、光学的に活性の酸の使用下
での分別結晶によるラセミ分割に基づく方法が使用され
ている。また、Ｌ‐カルニチンを得るための多数の生化
学的方法が記載されている：例えば、γ‐ブチロベタイ
ンのヒドロキシル化、３‐デヒドロカルニチンの還元、
クロトノベタインの変換、エステラーゼを用いたＤＬ‐
Ｏ‐アシルカルニチンの加水分解またはＤＬ‐カルニチ
ンニトリルの加水分解。工業的な使用のためには、これ
ら全ての方法が欠点を有している。それというのも、出
発物質が高価であるか、使用すべき酵素が不安定である
か、不十分な立体選択性または活量を提供するか、もし
くは高価な補酵素の使用が必要だからである。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明には、前記の課
題が課された。
題が課された。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明には、ＤＬ‐およ
び／またはＬ‐カルニチンアミドからのＬ‐カルニチン
の取得が記載されている。ＤＬ‐カルニチンアミドは、
安定性の化合物であり、これは相対的に安価で十分にエ
ピクロルヒドリンから得ることができる。
び／またはＬ‐カルニチンアミドからのＬ‐カルニチン
の取得が記載されている。ＤＬ‐カルニチンアミドは、
安定性の化合物であり、これは相対的に安価で十分にエ
ピクロルヒドリンから得ることができる。
【００１６】カルニチンアミド‐加水分解酵素の作用下
でのＤＬ‐および／またはＬ‐カルニチンアミドの加水
分解が記載されているような刊行物がある（ドイツ連邦
共和国特許出願公開第３７２８３２１号明細書）。この
酵素は、種類名が割り当てられていないようなプソイド
モナス種によって生産される。これら全てのプソイドモ
ナス種は、２つのカルニチンアミド‐加水分解酵素、酵
素の基質がＬ‐カルニチンアミドであるようなＬ‐特異
性の酵素およびＤ‐カルニチンアミドを変換するような
Ｄ‐特異性の酵素を提供する。この２つの酵素の作用の
割合は、それぞれ菌株および成長条件に応じて著しく変
動することができる。Ｌ‐カルニチンアミド‐加水分解
酵素だけが詳細に記載されている。
でのＤＬ‐および／またはＬ‐カルニチンアミドの加水
分解が記載されているような刊行物がある（ドイツ連邦
共和国特許出願公開第３７２８３２１号明細書）。この
酵素は、種類名が割り当てられていないようなプソイド
モナス種によって生産される。これら全てのプソイドモ
ナス種は、２つのカルニチンアミド‐加水分解酵素、酵
素の基質がＬ‐カルニチンアミドであるようなＬ‐特異
性の酵素およびＤ‐カルニチンアミドを変換するような
Ｄ‐特異性の酵素を提供する。この２つの酵素の作用の
割合は、それぞれ菌株および成長条件に応じて著しく変
動することができる。Ｌ‐カルニチンアミド‐加水分解
酵素だけが詳細に記載されている。
【００１７】以下の表中に、このＬ‐カルニチンアミド
‐加水分解酵素の性質が、本明細書に記載されたＬ‐カ
ルニチンアミダーゼの性質と対比されている。
‐加水分解酵素の性質が、本明細書に記載されたＬ‐カ
ルニチンアミダーゼの性質と対比されている。
【００１８】
【表２】
【００１９】この２つの酵素は、誘導可能性、誘導物質
、基質スペクトル、銀イオン（１ミリモル）および鉄イ
オン（１０ミリモル）による酵素阻害並びに２‐メルカ
プトエタノールによる不足している酵素阻害に関して相
互に等しさを示している。記載された他の性質の場合、
一致点が存在しない。遅くとも分子量の比較の際には、
Ｌ‐カルニチンアミド‐加水分解酵素および本明細書に
記載されたＬ‐カルニチンアミダーゼは、２つの完全に
異なった酵素であることが明白になる。
、基質スペクトル、銀イオン（１ミリモル）および鉄イ
オン（１０ミリモル）による酵素阻害並びに２‐メルカ
プトエタノールによる不足している酵素阻害に関して相
互に等しさを示している。記載された他の性質の場合、
一致点が存在しない。遅くとも分子量の比較の際には、
Ｌ‐カルニチンアミド‐加水分解酵素および本明細書に
記載されたＬ‐カルニチンアミダーゼは、２つの完全に
異なった酵素であることが明白になる。
【００２０】本発明は、以下の実施例によって、更に詳
説される：
説される：
【００２１】
【実施例】例 １：カルニチン‐アミダーゼによる試
験大規模なスクリーニングにおいて、全部で２６７箇所
からの土壌試料、海水試料および浄化装置の廃水施設（
Ｋｌａｅｒｗｅｒｋｓｐｒｏｂｅｎ）の試料を検査した
。 直接的平板培養および濃縮培養、完全培地および最小培
地、最小培地および付加的炭素源並びに誘導物質および
／または炭素源および／または窒素源としての種々の酸
アミドを用いて作業した。更に、試料を、０．９％の食
塩水を用いて懸濁させるかもしくは希釈し、４〜６時間
振って十分に混合するかもしくは洗浄した。この後、懸
濁液を低速回転で短時間遠心分離し、固体成分を沈殿さ
せた。上澄み液のアリコートを、適当な希釈後に固体培
地を有する平板上で平らに伸ばすか、または液体培地２
０ｍｌを有する１００ｍｌの三角フラスコ中に装入した
。平板を３〜７日間で孵卵器中で培養し、この平板から
個々の生物集団を単離し、かつ純粋培養した。
験大規模なスクリーニングにおいて、全部で２６７箇所
からの土壌試料、海水試料および浄化装置の廃水施設（
Ｋｌａｅｒｗｅｒｋｓｐｒｏｂｅｎ）の試料を検査した
。 直接的平板培養および濃縮培養、完全培地および最小培
地、最小培地および付加的炭素源並びに誘導物質および
／または炭素源および／または窒素源としての種々の酸
アミドを用いて作業した。更に、試料を、０．９％の食
塩水を用いて懸濁させるかもしくは希釈し、４〜６時間
振って十分に混合するかもしくは洗浄した。この後、懸
濁液を低速回転で短時間遠心分離し、固体成分を沈殿さ
せた。上澄み液のアリコートを、適当な希釈後に固体培
地を有する平板上で平らに伸ばすか、または液体培地２
０ｍｌを有する１００ｍｌの三角フラスコ中に装入した
。平板を３〜７日間で孵卵器中で培養し、この平板から
個々の生物集団を単離し、かつ純粋培養した。
【００２２】この培養液を、円形振動器中で３０℃およ
び１２０ｒｐｍで３〜７日間培養した。この時間の後に
、アリコートを培養液から取出し、このアリコートと一
緒に、同一条件下で培養された新しい培養液２０ｍｌを
接種した。この方法を約５回繰返してから、培養液の試
料を、適当な希釈後に固体培地を有する平板上で平らに
伸ばした。この平板を３〜７日間、３０℃で孵卵器中で
培養してから、この平板から個々の生物集団を単離し、
純粋培養した。
び１２０ｒｐｍで３〜７日間培養した。この時間の後に
、アリコートを培養液から取出し、このアリコートと一
緒に、同一条件下で培養された新しい培養液２０ｍｌを
接種した。この方法を約５回繰返してから、培養液の試
料を、適当な希釈後に固体培地を有する平板上で平らに
伸ばした。この平板を３〜７日間、３０℃で孵卵器中で
培養してから、この平板から個々の生物集団を単離し、
純粋培養した。
【００２３】
培地の組成：
最小培地： Ｋ２ＨＰＯ４
２．５０ｇ
ＫＨ２ＰＯ４
１．９５ｇ
ＮａＣｌ
１．００ｇ
ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ ０
．０５ｇ ＭｇＳ
Ｏ４×７Ｈ２Ｏ ０．３０ｇ
酵母抽出液
０．０５ｇ
ＤＬ‐カルニチンアミド
５．００ｇ
痕跡塩溶液 ０
．８０ｍｌ
蒸留水で１．０ｌに増量した、
ｐＨ７．２
寒天 １．８％を有する平板 痕
跡塩溶液： Ｈ３ＢＯ３
７５．０ｍｇ
ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ
５０．０ｍｇ
ＺｎＣｌ２
１８７．５ｍｇ
ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ
５０．０ｍｇ
ＦｅＣｌ３×６Ｈ２Ｏ ６２５．
０ｍｇ （ＮＨ４
）８Ｍｏ７Ｏ２４×Ｈ２Ｏ ２５．０ｍｇ
ＣｏＳＯ４×７Ｈ２Ｏ
３７．５ｍｇ
蒸留水で
０．２ｌに増量した、 最小培地 ＋ 付加的な
炭素源： 最小培
地 ＋ グリセ
リン ２．５
０ｍｌ および／
またはリンゴ酸 ２．５０ｇ 最小培
地 ＋ 付加的な酸アミド：
ＤＬ‐カルニチンアミド２．５ｇを有
する 最小培地
＋ アセトアミドもしくは
プロピオンアミド
２．５０ｇ 完全培地： 最小培
地 ＋ カゼイ
ン ０．
５０ｇ ペプトン
０．５
０ｇ 肉のエキス
０．５０ｇ
麦芽エキス
０．５０ｇ
グリセリン
０．５０ｇＣａＣｌ
２、ＭｇＳＯ４、ＤＬ‐カルニチンアミド、アセトアミ
ドおよびプロピオンアミドを、培養液にオートクレーブ
処理後に無菌条件下で添加した。
２．５０ｇ
ＫＨ２ＰＯ４
１．９５ｇ
ＮａＣｌ
１．００ｇ
ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ ０
．０５ｇ ＭｇＳ
Ｏ４×７Ｈ２Ｏ ０．３０ｇ
酵母抽出液
０．０５ｇ
ＤＬ‐カルニチンアミド
５．００ｇ
痕跡塩溶液 ０
．８０ｍｌ
蒸留水で１．０ｌに増量した、
ｐＨ７．２
寒天 １．８％を有する平板 痕
跡塩溶液： Ｈ３ＢＯ３
７５．０ｍｇ
ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ
５０．０ｍｇ
ＺｎＣｌ２
１８７．５ｍｇ
ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ
５０．０ｍｇ
ＦｅＣｌ３×６Ｈ２Ｏ ６２５．
０ｍｇ （ＮＨ４
）８Ｍｏ７Ｏ２４×Ｈ２Ｏ ２５．０ｍｇ
ＣｏＳＯ４×７Ｈ２Ｏ
３７．５ｍｇ
蒸留水で
０．２ｌに増量した、 最小培地 ＋ 付加的な
炭素源： 最小培
地 ＋ グリセ
リン ２．５
０ｍｌ および／
またはリンゴ酸 ２．５０ｇ 最小培
地 ＋ 付加的な酸アミド：
ＤＬ‐カルニチンアミド２．５ｇを有
する 最小培地
＋ アセトアミドもしくは
プロピオンアミド
２．５０ｇ 完全培地： 最小培
地 ＋ カゼイ
ン ０．
５０ｇ ペプトン
０．５
０ｇ 肉のエキス
０．５０ｇ
麦芽エキス
０．５０ｇ
グリセリン
０．５０ｇＣａＣｌ
２、ＭｇＳＯ４、ＤＬ‐カルニチンアミド、アセトアミ
ドおよびプロピオンアミドを、培養液にオートクレーブ
処理後に無菌条件下で添加した。
【００２４】スクリーニングに亘って、１３６７の菌株
を単離した。これらの菌株を、それぞれ飽和培地２０ｍ
ｌを含有した１００ｍｌの三角フラスコ中に装入し、円
形振動器中３０℃および１２０ｒｐｍで培養した。細胞
成長の表示として、光学的密度を６６０ｎｍで採用した
。
を単離した。これらの菌株を、それぞれ飽和培地２０ｍ
ｌを含有した１００ｍｌの三角フラスコ中に装入し、円
形振動器中３０℃および１２０ｒｐｍで培養した。細胞
成長の表示として、光学的密度を６６０ｎｍで採用した
。
【００２５】３日後に振動フラスコの内容物を遠心分離
し（冷却遠心分離器中で１０分間、１００００ｒｐｍ）
、沈殿した細胞を、ｐＨ７．５の燐酸カリウム緩衝剤１
００ミリモル中で収容した（約２０％の微生物懸濁液が
得られた）。
し（冷却遠心分離器中で１０分間、１００００ｒｐｍ）
、沈殿した細胞を、ｐＨ７．５の燐酸カリウム緩衝剤１
００ミリモル中で収容した（約２０％の微生物懸濁液が
得られた）。
【００２６】この懸濁液中の微生物を、常法で分解しな
ければならない（例えば、微細なガラス玉を用いた振動
または超音波処理）。この後、細胞粉砕を、ガラス玉（
直径０．３ｍｍ；細胞懸濁液１ｍｌ当りに玉２ｇ）を用
いた湿式粉砕によって行った。冷却遠心分離器中の遠心
分離処理（５分間、１２０００ｒｐｍ）によって、ガラ
ス玉および粗い細胞の残骸を、遠心分離した。清澄な上
澄み液を、粗抽出液と呼称し、別の試験に使用した。
ければならない（例えば、微細なガラス玉を用いた振動
または超音波処理）。この後、細胞粉砕を、ガラス玉（
直径０．３ｍｍ；細胞懸濁液１ｍｌ当りに玉２ｇ）を用
いた湿式粉砕によって行った。冷却遠心分離器中の遠心
分離処理（５分間、１２０００ｒｐｍ）によって、ガラ
ス玉および粗い細胞の残骸を、遠心分離した。清澄な上
澄み液を、粗抽出液と呼称し、別の試験に使用した。
【００２７】蛋白質濃度の測定をブラッドフォード（Ｂ
ｒａｄｆｏｒｄ）の方法によって実施した。
ｒａｄｆｏｒｄ）の方法によって実施した。
【００２８】カルニチンへのカルニチンアミドの変換の
際に、カルニチンおよびアンモニアを同じモル比で形成
した。
際に、カルニチンおよびアンモニアを同じモル比で形成
した。
【００２９】
【化１】
【００３０】従って、酵素活量の測定の項目は次の通り
である： ‐カルニチンアミドの減少の測定 ‐形成されたカルニチンの測定 ‐形成されたアンモニアの測定 活量試験のための配合物は次のものを含んでいる：燐酸
カリウム緩衝液０．１モル、ｐＨ７．５
４００μｌ燐酸カリウム緩衝液０．１モル、
ｐＨ７．５中の基質 ５０μｌ酵素溶液（粗
抽出液）
５０μｌ基質として次のも
のを使用した： 試験の際のＤＬ‐カルニチンアミド最終濃度
１００ミリモル試験の際のＤ‐カルニチ
ンアミド最終濃度 ５
０ミリモル試験の際のＬ‐カルニチンアミド最終濃度
５０ミリモル酵素試験
を、１．５ｍｌのエッペンドルフ容器（Ｅｐｐｅｎｄｏ
ｒｆｇｅｆａｅｓｓｅｎ）中３０℃の温度で実施した。 反応を酵素溶液の添加によって開始し、酸を加えること
によって停止させた。沈殿した蛋白質を遠心分離し（エ
ッペンドルフ遠心分離器Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｚｅｎｔｒ
ｉｆｕｇｅ ５分間１２５００ｒｐｍ）、上澄み液を
検査した。盲試験値の測定のために、常に基質および酵
素溶液の盲試験試料が同時進行する。
である： ‐カルニチンアミドの減少の測定 ‐形成されたカルニチンの測定 ‐形成されたアンモニアの測定 活量試験のための配合物は次のものを含んでいる：燐酸
カリウム緩衝液０．１モル、ｐＨ７．５
４００μｌ燐酸カリウム緩衝液０．１モル、
ｐＨ７．５中の基質 ５０μｌ酵素溶液（粗
抽出液）
５０μｌ基質として次のも
のを使用した： 試験の際のＤＬ‐カルニチンアミド最終濃度
１００ミリモル試験の際のＤ‐カルニチ
ンアミド最終濃度 ５
０ミリモル試験の際のＬ‐カルニチンアミド最終濃度
５０ミリモル酵素試験
を、１．５ｍｌのエッペンドルフ容器（Ｅｐｐｅｎｄｏ
ｒｆｇｅｆａｅｓｓｅｎ）中３０℃の温度で実施した。 反応を酵素溶液の添加によって開始し、酸を加えること
によって停止させた。沈殿した蛋白質を遠心分離し（エ
ッペンドルフ遠心分離器Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｚｅｎｔｒ
ｉｆｕｇｅ ５分間１２５００ｒｐｍ）、上澄み液を
検査した。盲試験値の測定のために、常に基質および酵
素溶液の盲試験試料が同時進行する。
【００３１】酵素単位の定義は、１ｍＵ＝１分当りに変
換した基質１ｎモルである。
換した基質１ｎモルである。
【００３２】カルニチンおよびカルニチンアミドの検出
は、薄層クロマトグラフィにより行うことができる。吸
着体として、Ｍｅｒｃｋ社のシリカゲル板を使用し、こ
の上に検査すべき液体をそれぞれ３μｌ塗布した。カル
ニチンおよびカルニチンアミドを、沃素蒸気と一緒に検
出した。
は、薄層クロマトグラフィにより行うことができる。吸
着体として、Ｍｅｒｃｋ社のシリカゲル板を使用し、こ
の上に検査すべき液体をそれぞれ３μｌ塗布した。カル
ニチンおよびカルニチンアミドを、沃素蒸気と一緒に検
出した。
【００３３】流展剤の組成およびＲＦ‐値は、以下の表
により確認することができる。
により確認することができる。
【００３４】
経過剤
基質
ＲＦ‐値クロロホルム／メタノール／水／
カルニチン ０．４４蟻
酸濃厚液／アンモニア濃厚液 カルニチ
ンアミド ０．５１５０／５５／１０／５／
７．５ クロロホルム／メタノール／水／ カルニチ
ン ０．３５蟻酸濃厚液／
カルニ
チンアミド ０．４５５０／５０／１７．２
５／０．４２５ カルニチンおよびカルニチンアミドをＨＰＬＣにより測
定することができる系： ‐固定相： ＮＨ３‐カラム‐
カラム番号：ＢＫ ３／８８‐カラムの内径：
５ｍｍ ‐温度： ４５℃‐可動相
Ａ： クロマトグラフィ用のアセト
ニトリル ６７０ｍｌ‐可動相Ｂ：
（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ０．０５モル ３３０
ｍｌ‐流量： 毎分０．７ｍｌ
‐波長： ２０５ｎｍ‐注
入容量： ２０μｌＬ‐カルニチン
は、酵素的にカルニチン‐アセチルトランスフェラーゼ
と一緒に測定することができる。アンモニアを、１つに
は光度測定的にインドフェノールとして、もう１つには
酵素的にグルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いて測定し
た。
基質
ＲＦ‐値クロロホルム／メタノール／水／
カルニチン ０．４４蟻
酸濃厚液／アンモニア濃厚液 カルニチ
ンアミド ０．５１５０／５５／１０／５／
７．５ クロロホルム／メタノール／水／ カルニチ
ン ０．３５蟻酸濃厚液／
カルニ
チンアミド ０．４５５０／５０／１７．２
５／０．４２５ カルニチンおよびカルニチンアミドをＨＰＬＣにより測
定することができる系： ‐固定相： ＮＨ３‐カラム‐
カラム番号：ＢＫ ３／８８‐カラムの内径：
５ｍｍ ‐温度： ４５℃‐可動相
Ａ： クロマトグラフィ用のアセト
ニトリル ６７０ｍｌ‐可動相Ｂ：
（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ０．０５モル ３３０
ｍｌ‐流量： 毎分０．７ｍｌ
‐波長： ２０５ｎｍ‐注
入容量： ２０μｌＬ‐カルニチン
は、酵素的にカルニチン‐アセチルトランスフェラーゼ
と一緒に測定することができる。アンモニアを、１つに
は光度測定的にインドフェノールとして、もう１つには
酵素的にグルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いて測定し
た。
【００３５】１３６７から単離された菌株は、アミダー
ゼ活量６５を有している。酵素活量は、統一されたｍＵ
から複数のＵに達する。活性菌株から１つの菌株を選択
し、この菌株を、ドイッチェン ザンムルング フ
ォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルク
ルトゥーレン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｓａｍｍｌｕｎ
ｇ ｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎ
ｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）（ＤＳＭ）で測定さ
せた。
ゼ活量６５を有している。酵素活量は、統一されたｍＵ
から複数のＵに達する。活性菌株から１つの菌株を選択
し、この菌株を、ドイッチェン ザンムルング フ
ォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルク
ルトゥーレン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｓａｍｍｌｕｎ
ｇ ｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎ
ｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）（ＤＳＭ）で測定さ
せた。
【００３６】この菌株の粗抽出液を、エナンチオマー純
粋のＤ‐カルニチンアミドおよびＬ‐カルニチンアミド
を用いて試験した： 活量（ｍＵ／ｍｌ） 活量（ｍ
Ｕ／ｍｇ） Ｌ‐アミダーゼ活量Ｄ‐アミド
Ｌ‐アミド Ｄ‐アミド Ｌ‐アミド
（％） ０
８６２４ ０ １９６
０ １００例 ２：アミダー
ゼ活量のより詳細な試験粗抽出液を、あらためてＤ‐カ
ルニチンアミドおよびＬ‐カルニチンアミド上で試験し
、酵素試験を１０分後（試験配合物中のＬ‐カルニチン
アミドは、なお十分に存在している）および５時間後（
Ｌ‐カルニチンアミドは、十分にまたは完全に反応して
いた）停止させた。Ｌ‐アミダーゼ活量は、全アミダー
ゼ活量に対して、１０分後に１００％であり、５時間後
には依然として９９％を上廻っていた。この試験は、菌
株ＤＳＭ ６２３０の粗抽出液が、５時間のインキュ
ベーション時間の後であっても、測定可能なＤ‐カルニ
チンをほとんど形成しないことを示している。これによ
れば、前記菌株は、高い酵素活量とともにアミダーゼ反
応の著しく高い選択性を示している。
粋のＤ‐カルニチンアミドおよびＬ‐カルニチンアミド
を用いて試験した： 活量（ｍＵ／ｍｌ） 活量（ｍ
Ｕ／ｍｇ） Ｌ‐アミダーゼ活量Ｄ‐アミド
Ｌ‐アミド Ｄ‐アミド Ｌ‐アミド
（％） ０
８６２４ ０ １９６
０ １００例 ２：アミダー
ゼ活量のより詳細な試験粗抽出液を、あらためてＤ‐カ
ルニチンアミドおよびＬ‐カルニチンアミド上で試験し
、酵素試験を１０分後（試験配合物中のＬ‐カルニチン
アミドは、なお十分に存在している）および５時間後（
Ｌ‐カルニチンアミドは、十分にまたは完全に反応して
いた）停止させた。Ｌ‐アミダーゼ活量は、全アミダー
ゼ活量に対して、１０分後に１００％であり、５時間後
には依然として９９％を上廻っていた。この試験は、菌
株ＤＳＭ ６２３０の粗抽出液が、５時間のインキュ
ベーション時間の後であっても、測定可能なＤ‐カルニ
チンをほとんど形成しないことを示している。これによ
れば、前記菌株は、高い酵素活量とともにアミダーゼ反
応の著しく高い選択性を示している。
【００３７】例 ３：Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼの
誘導のための試験 この試験において、種々の物質を、その誘導作用につい
て検査した。同時に前記化合物上での成長を追跡した。 培地として、試験すべき物質のそれぞれ５ｇ／ｌを添加
しておいた酵母抽出液０．５ｇ／ｌの代わりに１．０ｇ
／ｌを有する最小培地を使用した。誘導物質を有してい
ない培養生物集団は、酵母抽出液５ｇ／ｌを含有する。 全ての試験を、３０℃および１２０ｒｐｍで３６時間、
円形振動機中で温めておいた振動培養生物集団２０ｍｌ
を用いて実施した。この培養生物集団を、菌株ＤＳＭ
６２３０の初期培養生物集団１％で接種した。酵素試
験のために、Ｌ‐カルニチンアミドを基質として使用し
た。
誘導のための試験 この試験において、種々の物質を、その誘導作用につい
て検査した。同時に前記化合物上での成長を追跡した。 培地として、試験すべき物質のそれぞれ５ｇ／ｌを添加
しておいた酵母抽出液０．５ｇ／ｌの代わりに１．０ｇ
／ｌを有する最小培地を使用した。誘導物質を有してい
ない培養生物集団は、酵母抽出液５ｇ／ｌを含有する。 全ての試験を、３０℃および１２０ｒｐｍで３６時間、
円形振動機中で温めておいた振動培養生物集団２０ｍｌ
を用いて実施した。この培養生物集団を、菌株ＤＳＭ
６２３０の初期培養生物集団１％で接種した。酵素試
験のために、Ｌ‐カルニチンアミドを基質として使用し
た。
【００３８】この試験の結果を以下の表に示す： 誘
導物質 ＯＤ６６
０ 活量 活量 ｍ
Ｕ／ｍｇ
（ｍＵ／ｍｌ）
（ｍＵ／ｍｇ） （％）Ｌ‐カルニチンア
ミド ３．５ ８５３０
１７０６ １００ なし
２．８ １２９
３９ ２Ｄ‐カルニチン
アミド ０．８ ４９７
１６６ １０ＤＬ‐カルニチンアミ
ド ２．７ ８８６７ １６７
３ ９８ＤＬ‐カルニチン
２．５ ５７７３ １２５５
７４γ‐ブチロベタイン
０．７ ９６３ ５６６
３３デヒドロカルニチン ０．
８ ８３７ ２７９
１６グリシンベタイン ２．９
１８３ ３３
２Ｄ‐カルニチンニトリル ０．８
２０６ ９０
５Ｌ‐カルニチンニトリル ０．８
１８３ ６５ ４Ｄ
Ｌ‐カルニチンニトリル ０．８ ２
２１ ８８ ５Ｄ‐ロイ
シンアミド ０．８ １
７０ ８１ ５Ｌ‐ロイ
シンアミド ２．５
３４ ９ ＜１Ｌ‐プ
ロリンアミド １．０
２５０ ５４ ３Ｌ‐フ
ェニルアラニンアミド ０．６ １７２
７２ ４Ｌ‐バリンアミ
ド ０．９ ３
２ １２ ＜１グリシンアミ
ド １．０ １
８０ ４３ ３アセトア
ミド １．０
０ ０
０プロピオンアミド １．１
１２９ ２９
２ブチルアミド
０．９ ５４ １８
１イソブチルアミド
１．１ １９３ ４１
２乳酸アミド
０．８ ５５
２８ ２アクリルアミド
０．８ １７０
１３６ ８メタクリルアミド
０．８ ２３７
７６ ４ベンズアミド
０．３
０ ０ ０ニコチン
アミド ０．７
５５ ２８ ２こ
の試験は、Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼが誘導可能な酵
素であることを明確に示している。誘導物質は次のもの
である：Ｌ‐カルニチンアミド、Ｌ‐カルニチン、γ‐
ブチロベタインおよびデヒドロカルニチン。試験をした
誘導物質の最良のものはＬ‐カルニチンアミドである。
導物質 ＯＤ６６
０ 活量 活量 ｍ
Ｕ／ｍｇ
（ｍＵ／ｍｌ）
（ｍＵ／ｍｇ） （％）Ｌ‐カルニチンア
ミド ３．５ ８５３０
１７０６ １００ なし
２．８ １２９
３９ ２Ｄ‐カルニチン
アミド ０．８ ４９７
１６６ １０ＤＬ‐カルニチンアミ
ド ２．７ ８８６７ １６７
３ ９８ＤＬ‐カルニチン
２．５ ５７７３ １２５５
７４γ‐ブチロベタイン
０．７ ９６３ ５６６
３３デヒドロカルニチン ０．
８ ８３７ ２７９
１６グリシンベタイン ２．９
１８３ ３３
２Ｄ‐カルニチンニトリル ０．８
２０６ ９０
５Ｌ‐カルニチンニトリル ０．８
１８３ ６５ ４Ｄ
Ｌ‐カルニチンニトリル ０．８ ２
２１ ８８ ５Ｄ‐ロイ
シンアミド ０．８ １
７０ ８１ ５Ｌ‐ロイ
シンアミド ２．５
３４ ９ ＜１Ｌ‐プ
ロリンアミド １．０
２５０ ５４ ３Ｌ‐フ
ェニルアラニンアミド ０．６ １７２
７２ ４Ｌ‐バリンアミ
ド ０．９ ３
２ １２ ＜１グリシンアミ
ド １．０ １
８０ ４３ ３アセトア
ミド １．０
０ ０
０プロピオンアミド １．１
１２９ ２９
２ブチルアミド
０．９ ５４ １８
１イソブチルアミド
１．１ １９３ ４１
２乳酸アミド
０．８ ５５
２８ ２アクリルアミド
０．８ １７０
１３６ ８メタクリルアミド
０．８ ２３７
７６ ４ベンズアミド
０．３
０ ０ ０ニコチン
アミド ０．７
５５ ２８ ２こ
の試験は、Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼが誘導可能な酵
素であることを明確に示している。誘導物質は次のもの
である：Ｌ‐カルニチンアミド、Ｌ‐カルニチン、γ‐
ブチロベタインおよびデヒドロカルニチン。試験をした
誘導物質の最良のものはＬ‐カルニチンアミドである。
【００３９】菌株は、Ｌ‐ロイシンアミド、Ｌ‐カルニ
チンアミド、ＤＬ‐カルニチンアミド、ＤＬ‐カルニチ
ンおよびグリシンベタイン上で良好な成長を示している
。Ｌ‐ロイシンアミドおよびグリシンベタインは、専ら
良好な成長基質であるにすぎず、Ｌ‐カルニチン‐アミ
ダーゼは、これらによって誘導されない。これとは異な
り、γ‐ブチロベタインおよびデヒドロカルニチンは、
酵素を誘導するが、しかし物質交換することができない
かまたは物質交換するのが著しく困難である。
チンアミド、ＤＬ‐カルニチンアミド、ＤＬ‐カルニチ
ンおよびグリシンベタイン上で良好な成長を示している
。Ｌ‐ロイシンアミドおよびグリシンベタインは、専ら
良好な成長基質であるにすぎず、Ｌ‐カルニチン‐アミ
ダーゼは、これらによって誘導されない。これとは異な
り、γ‐ブチロベタインおよびデヒドロカルニチンは、
酵素を誘導するが、しかし物質交換することができない
かまたは物質交換するのが著しく困難である。
【００４０】例 ４：最適な誘導物質濃度の測定もう
１つの試験において、Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼの誘
導を、培養生物集団培地中のＤＬ‐カルニチンアミドの
種々の濃度で検査した。同時に、細菌の成長を、前記カ
ルニチンアミド濃度で追跡した。培養生物集団条件は、
例３の場合に相応した。
１つの試験において、Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼの誘
導を、培養生物集団培地中のＤＬ‐カルニチンアミドの
種々の濃度で検査した。同時に、細菌の成長を、前記カ
ルニチンアミド濃度で追跡した。培養生物集団条件は、
例３の場合に相応した。
【００４１】この試験の結果を以下の表に示す： Ｄ
Ｌ‐カルニチンアミド濃度 ＯＤ６６０
アミダーゼ活量 （ｇ／ｌ）
（Ｕ
／ｍｌ） ０．５
１．１ ０．７
１．０
１．３ ２．４
２．０ １．
７ ６．１ ３．０
２．０
７．３ ５．０
２．８
８．９ ７．５
４．０ １０．６
１０．０
３．９ ８．６ １５．０
３．７
７．３ ２０．０
３．６
７．１ ２５．０
３．５ ６．７こ
の試験は、最適なＤＬ‐カルニチンアミド濃度が、細菌
の成長のため並びにまたアミダーゼ活量のためにも、上
記培養生物集団条件下で７．４ｇ／ｌであることを示し
ている。
Ｌ‐カルニチンアミド濃度 ＯＤ６６０
アミダーゼ活量 （ｇ／ｌ）
（Ｕ
／ｍｌ） ０．５
１．１ ０．７
１．０
１．３ ２．４
２．０ １．
７ ６．１ ３．０
２．０
７．３ ５．０
２．８
８．９ ７．５
４．０ １０．６
１０．０
３．９ ８．６ １５．０
３．７
７．３ ２０．０
３．６
７．１ ２５．０
３．５ ６．７こ
の試験は、最適なＤＬ‐カルニチンアミド濃度が、細菌
の成長のため並びにまたアミダーゼ活量のためにも、上
記培養生物集団条件下で７．４ｇ／ｌであることを示し
ている。
【００４２】例 ５：８ｌの規模のＬ‐カルニチン‐
アミダーゼ発酵 次の装備を備えたバイオリアクタを使用した：‐撹拌機 ‐回転数調整機 ‐熱センサを備えた温度制御回路 ‐給気および排気のための殺菌フィルタ‐排気冷却器 ‐ｐＨ‐電極 ‐消泡プローブ ‐酸‐、アルカリ液および消泡剤貯蔵容器‐酸素電極 作業容量は８ｌ、発酵培地のｐＨ値は７．２および発酵
温度は３０℃であった。この培地は、酵母抽出液１ｇ／
ｌおよびＤＬ‐カルニチンアミド７．５ｇ／ｌを有する
最小培地（例１を見よ）であった。殺菌の後に、発酵槽
を、１２０ｒｐｍおよび３０℃で２４時間円形振動器中
で培養しておいた菌株ＤＳＭ ６２３０の初期培養生
物集団２００ｍｌで接種した。
アミダーゼ発酵 次の装備を備えたバイオリアクタを使用した：‐撹拌機 ‐回転数調整機 ‐熱センサを備えた温度制御回路 ‐給気および排気のための殺菌フィルタ‐排気冷却器 ‐ｐＨ‐電極 ‐消泡プローブ ‐酸‐、アルカリ液および消泡剤貯蔵容器‐酸素電極 作業容量は８ｌ、発酵培地のｐＨ値は７．２および発酵
温度は３０℃であった。この培地は、酵母抽出液１ｇ／
ｌおよびＤＬ‐カルニチンアミド７．５ｇ／ｌを有する
最小培地（例１を見よ）であった。殺菌の後に、発酵槽
を、１２０ｒｐｍおよび３０℃で２４時間円形振動器中
で培養しておいた菌株ＤＳＭ ６２３０の初期培養生
物集団２００ｍｌで接種した。
【００４３】１７時間後に、発酵を終えた。培養液のＯ
Ｄ６６０は、この時点で３．２であった。湿った細胞６
３ｇを得ることができた。燐酸カリウム緩衝液ｐＨ７．
５ １００ｍモルを用いて２０％の細胞懸濁液を得た
（最終容量３１５ｍｌ）。細胞を、ガラス玉（直径０．
３ｍｍ）を用いた湿式粉砕によって粉砕した。粗抽出液
１ｍｌ当りの容量活量は、９５９０ｍＵであり、固有の
活量は、１３１４ｍＵであった。これにより、発酵媒体
８ｌから、Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼ３０２１単位を
得ることができた。粗抽出液中では、Ｄ‐カルニチン‐
アミダーゼ活量を計測することができなかった。
Ｄ６６０は、この時点で３．２であった。湿った細胞６
３ｇを得ることができた。燐酸カリウム緩衝液ｐＨ７．
５ １００ｍモルを用いて２０％の細胞懸濁液を得た
（最終容量３１５ｍｌ）。細胞を、ガラス玉（直径０．
３ｍｍ）を用いた湿式粉砕によって粉砕した。粗抽出液
１ｍｌ当りの容量活量は、９５９０ｍＵであり、固有の
活量は、１３１４ｍＵであった。これにより、発酵媒体
８ｌから、Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼ３０２１単位を
得ることができた。粗抽出液中では、Ｄ‐カルニチン‐
アミダーゼ活量を計測することができなかった。
【００４４】例 ６：Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼの
精製 Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼを、粗抽出液からヌクレイ
ン酸の沈殿後にポリエチレンイミン（０．１％）と一緒
に２つのイオン交換体（メルク社（ＦｉｒｍａＭｅｒｃ
ｋ）のフラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）ＥＭＤＴＭ
ＡＥ‐６５０（Ｓ）およびファルマツィア社（Ｆｉｒｍ
ａ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のモノＱ（Ｍｏｎｏ‐Ｑ）
）を介して完全な純粋にまで精製することができた。固
有の活量は、粗抽出液中で、蛋白質１ｍｇ当り１．３１
Ｕであり、かつモノＱ精製された酵素１ｍｇ当り３２８
Ｕであった。従って、酵素の増菌ファクターは２５０で
あった。
精製 Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼを、粗抽出液からヌクレイ
ン酸の沈殿後にポリエチレンイミン（０．１％）と一緒
に２つのイオン交換体（メルク社（ＦｉｒｍａＭｅｒｃ
ｋ）のフラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）ＥＭＤＴＭ
ＡＥ‐６５０（Ｓ）およびファルマツィア社（Ｆｉｒｍ
ａ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のモノＱ（Ｍｏｎｏ‐Ｑ）
）を介して完全な純粋にまで精製することができた。固
有の活量は、粗抽出液中で、蛋白質１ｍｇ当り１．３１
Ｕであり、かつモノＱ精製された酵素１ｍｇ当り３２８
Ｕであった。従って、酵素の増菌ファクターは２５０で
あった。
【００４５】例 ７：等電点の測定
Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼの等電点の測定を、ファル
マシア・ファスト‐システム メソッド１００（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｐｈａｓｔ‐Ｓｙｓｔｅｍ Ｍｅ
ｔｈｏｄｅ １００）により実施した。等電点は、ｐ
Ｈ４．２である。
マシア・ファスト‐システム メソッド１００（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｐｈａｓｔ‐Ｓｙｓｔｅｍ Ｍｅ
ｔｈｏｄｅ １００）により実施した。等電点は、ｐ
Ｈ４．２である。
【００４６】例 ８：分子量の測定および下部単位の
数の測定 天然酵素の分子量を、セファクリルＳ‐２００ＨＲでの
ゲル濾過によって測定した。ＦＰＬＣ‐Ｓｙｓｔｅｍに
接続されたカラム（１．６×６９．６ｃｍ）を毎分１ｍ
ｌの流量を用いて運転した。較正蛋白質としてチトクロ
ムＣ、ミオグロビン（鯨）、ミオグロビン（馬）、カル
ボキシアンヒドラーゼＢ、オバルブミン、ＢＳＡ、Ｒ‐
オキシニリラーゼ（黍）、アルドラーゼ（単量体）およ
びアルドラーゼ（二量体）（飼兎の筋肉）を使用した。 Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼの分子量は、１２５０００
±５０００である。ナトリウムドデシルスルフェート（
ＳＤＳ）の存在下のゲル電気泳動中で、変性した酵素の
６５７００の分子量を測定した。これによれば、アミダ
ーゼは、２つの同一の下部単位からなる。較正蛋白質と
して、非還元α２‐マクログロブリン（馬）および還元
α２‐マクログロブリン（馬）、ホスホリラーゼｂ（飼
兎の筋肉）、ＢＳＡ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（
牛の肝臓）、乳酸デヒドロゲナーゼ（豚の肝臓）および
大豆からなるトリプシン阻害物質を使用した。
数の測定 天然酵素の分子量を、セファクリルＳ‐２００ＨＲでの
ゲル濾過によって測定した。ＦＰＬＣ‐Ｓｙｓｔｅｍに
接続されたカラム（１．６×６９．６ｃｍ）を毎分１ｍ
ｌの流量を用いて運転した。較正蛋白質としてチトクロ
ムＣ、ミオグロビン（鯨）、ミオグロビン（馬）、カル
ボキシアンヒドラーゼＢ、オバルブミン、ＢＳＡ、Ｒ‐
オキシニリラーゼ（黍）、アルドラーゼ（単量体）およ
びアルドラーゼ（二量体）（飼兎の筋肉）を使用した。 Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼの分子量は、１２５０００
±５０００である。ナトリウムドデシルスルフェート（
ＳＤＳ）の存在下のゲル電気泳動中で、変性した酵素の
６５７００の分子量を測定した。これによれば、アミダ
ーゼは、２つの同一の下部単位からなる。較正蛋白質と
して、非還元α２‐マクログロブリン（馬）および還元
α２‐マクログロブリン（馬）、ホスホリラーゼｂ（飼
兎の筋肉）、ＢＳＡ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（
牛の肝臓）、乳酸デヒドロゲナーゼ（豚の肝臓）および
大豆からなるトリプシン阻害物質を使用した。
【００４７】例 ９：Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼの
ｐＨ依存性 ａ）ｐＨ値の反応速度の依存性 ｐＨ最適値の測定のために、酵素試験を種々のｐＨ値で
実施した。この際、以下の緩衝液を使用した：ｐＨ３〜
ｐＨ６．５のクエン酸、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５の燐酸
カリウム、ｐＨ８．５〜ｐＨ９．５のトリス／ＨＣｌお
よびｐＨ９．５〜ｐＨ１１の重炭酸塩。予め、基質を相
応するｐＨ値に調節した。
ｐＨ依存性 ａ）ｐＨ値の反応速度の依存性 ｐＨ最適値の測定のために、酵素試験を種々のｐＨ値で
実施した。この際、以下の緩衝液を使用した：ｐＨ３〜
ｐＨ６．５のクエン酸、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５の燐酸
カリウム、ｐＨ８．５〜ｐＨ９．５のトリス／ＨＣｌお
よびｐＨ９．５〜ｐＨ１１の重炭酸塩。予め、基質を相
応するｐＨ値に調節した。
【００４８】酵素活量は、ｐＨ４．５〜１１であった。
良好な変換を、ｐＨ７〜ｐＨ９．５の範囲内で達成した
。最高の反応速度を、ｐＨ８．５の際にトリス／ＨＣｌ
緩衝液中で達成した。
。最高の反応速度を、ｐＨ８．５の際にトリス／ＨＣｌ
緩衝液中で達成した。
【００４９】ｂ）酵素安定性へのｐＨ値の影響ｐＨ値に
依存する酵素安定性の測定のために、酵素溶液を、種々
異なったのｐＨ値の種々の緩衝液を用いて１０倍に希釈
し（ａを見よ）、かつ３０℃で３０分間インキュベート
した。その後、前記配合物を、冷却後（氷上で２分）、
５分間１３０００ｒｐｍで遠心分離した。この上澄み液
のそれぞれ５０μｌを、酵素溶液として常法の酵素試験
で使用したが、しかしながらこの場合、この酵素試験を
、燐酸カリウム緩衝液２００ミリモル中で実施した。こ
の酵素は、良好な安定性をｐＨ５．０〜ｐＨ９．５の範
囲内で示した。最良の安定性をｐＨ７．５〜ｐＨ８．５
の間で達成した。
依存する酵素安定性の測定のために、酵素溶液を、種々
異なったのｐＨ値の種々の緩衝液を用いて１０倍に希釈
し（ａを見よ）、かつ３０℃で３０分間インキュベート
した。その後、前記配合物を、冷却後（氷上で２分）、
５分間１３０００ｒｐｍで遠心分離した。この上澄み液
のそれぞれ５０μｌを、酵素溶液として常法の酵素試験
で使用したが、しかしながらこの場合、この酵素試験を
、燐酸カリウム緩衝液２００ミリモル中で実施した。こ
の酵素は、良好な安定性をｐＨ５．０〜ｐＨ９．５の範
囲内で示した。最良の安定性をｐＨ７．５〜ｐＨ８．５
の間で達成した。
【００５０】例 １０：Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼ
活量への添加剤の影響 酵素活量への種々の添加剤の影響を検査するために、前
記添加剤を、基質なしの試験配合物に、それぞれ１ミリ
モルおよび１０ミリモルの最終濃度で添加した。まず、
反応配合物を４５分間３０℃でインキュベートし、その
後に反応を基質溶液の添加によって開始させた。
活量への添加剤の影響 酵素活量への種々の添加剤の影響を検査するために、前
記添加剤を、基質なしの試験配合物に、それぞれ１ミリ
モルおよび１０ミリモルの最終濃度で添加した。まず、
反応配合物を４５分間３０℃でインキュベートし、その
後に反応を基質溶液の添加によって開始させた。
【００５１】この試験の結果を以下の表に示す：添加剤
酵素活量（％）
１ｍモル １０ｍモルなし
１００２価および
３価の陽イオン： ＭｇＣｌ２
９６
８８ＣａＣｌ２
１０３
９０ＢａＣｌ２
１０２
１０５ＭｎＣｌ２
８９
７６ＺｎＣｌ２
６ 不定Ｆｅ
Ｃｌ２
８６
５７ＦｅＣｌ３
８７
４６ＣｏＣｌ２
９０
７６ＮｉＣｌ２
８０
７９ＣｕＣｌ２
７０ ５４複合
結合剤： チトリプレックスＩＩＩ（ＥＤＴＡ） ＴｉｔｒｉｐｌｅｘＩＩＩ
９３ ７３フェナ
ントロリン Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎ ８
９ ８２ジエチル
マロン酸
９２ ６８ＮａＮ
３
８５
８２還元試薬： ２‐メルカプトエタノール １０
０ １０１還元グルタ
チオン ９
７ ７２エチルマ
レインイミド １００
９９ジチオトレイ
トール（ＤＤＴ） ９４
１０１ジチオエリトリトール（Ｄ
ＴＥ） ９８
９９ＳＨ‐分類試薬： パラ‐ヒドロキシメルクリ安息香酸塩（ｐＯＨＭＢ）
５１
不定ヨードアセテート
９７
７２ＨｇＣｌ２
＜ １
不定ＡｇＮＯ３
６５
不定ＫＣＮ
８５ ８８
ＰＬＰ‐酵素の阻害剤： シクロセリン
９６
９７プロテアーゼの阻害剤： 臭化ネオスチグミン
１００ ９４パ
ラ‐アミノベンズアミジンジヒドロクロリド（ｐＡＢＡ
）
８８ ９９フェ
ニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）
２３
２Ｎａ‐トシル‐Ｌ‐リシル‐クロルメタン
ヒドロクロリド（ＴＬＣＫ）
８４
７３ジニトロジチオジ安息香酸
３４
不定α‐ケトイソカプロン酸
９２
９０ＮａＦ
８８
７８アセトアルデヒド
８３
８１既に１ミリモルの濃度で、２
価の金属イオンのＺｎ２＋Ｃｕ２＋、ＳＨ‐分類試薬の
Ｈｇ２＋、Ａｇ２＋並びにｐ‐ヒドロキシメルクリ安息
香酸塩、更にプロテアーゼの阻害剤のフェニルメタンス
ルホニルフルオリドおよびジニトロジチオジ安息香酸が
、明らかに阻害的に作用している。 １０ミリモルの濃度の場合、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋Ｆｅ３
＋、Ｃｏ２＋、ＥＤＴＡ、ジエチルマロン酸、低減グル
タチオン、ヨードアセテート、ＴＬＣＫおよびＮａＦは
、酵素活量の減少を生ずる。
酵素活量（％）
１ｍモル １０ｍモルなし
１００２価および
３価の陽イオン： ＭｇＣｌ２
９６
８８ＣａＣｌ２
１０３
９０ＢａＣｌ２
１０２
１０５ＭｎＣｌ２
８９
７６ＺｎＣｌ２
６ 不定Ｆｅ
Ｃｌ２
８６
５７ＦｅＣｌ３
８７
４６ＣｏＣｌ２
９０
７６ＮｉＣｌ２
８０
７９ＣｕＣｌ２
７０ ５４複合
結合剤： チトリプレックスＩＩＩ（ＥＤＴＡ） ＴｉｔｒｉｐｌｅｘＩＩＩ
９３ ７３フェナ
ントロリン Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎ ８
９ ８２ジエチル
マロン酸
９２ ６８ＮａＮ
３
８５
８２還元試薬： ２‐メルカプトエタノール １０
０ １０１還元グルタ
チオン ９
７ ７２エチルマ
レインイミド １００
９９ジチオトレイ
トール（ＤＤＴ） ９４
１０１ジチオエリトリトール（Ｄ
ＴＥ） ９８
９９ＳＨ‐分類試薬： パラ‐ヒドロキシメルクリ安息香酸塩（ｐＯＨＭＢ）
５１
不定ヨードアセテート
９７
７２ＨｇＣｌ２
＜ １
不定ＡｇＮＯ３
６５
不定ＫＣＮ
８５ ８８
ＰＬＰ‐酵素の阻害剤： シクロセリン
９６
９７プロテアーゼの阻害剤： 臭化ネオスチグミン
１００ ９４パ
ラ‐アミノベンズアミジンジヒドロクロリド（ｐＡＢＡ
）
８８ ９９フェ
ニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）
２３
２Ｎａ‐トシル‐Ｌ‐リシル‐クロルメタン
ヒドロクロリド（ＴＬＣＫ）
８４
７３ジニトロジチオジ安息香酸
３４
不定α‐ケトイソカプロン酸
９２
９０ＮａＦ
８８
７８アセトアルデヒド
８３
８１既に１ミリモルの濃度で、２
価の金属イオンのＺｎ２＋Ｃｕ２＋、ＳＨ‐分類試薬の
Ｈｇ２＋、Ａｇ２＋並びにｐ‐ヒドロキシメルクリ安息
香酸塩、更にプロテアーゼの阻害剤のフェニルメタンス
ルホニルフルオリドおよびジニトロジチオジ安息香酸が
、明らかに阻害的に作用している。 １０ミリモルの濃度の場合、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋Ｆｅ３
＋、Ｃｏ２＋、ＥＤＴＡ、ジエチルマロン酸、低減グル
タチオン、ヨードアセテート、ＴＬＣＫおよびＮａＦは
、酵素活量の減少を生ずる。
【００５２】例 １１：Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼ
の基質スペクトル 酵素試験を、３０℃で燐酸カリウム緩衝剤ｐＨ８ １
００ミリモル中で実施した。基質濃度は５０ミリモルで
あった。
の基質スペクトル 酵素試験を、３０℃で燐酸カリウム緩衝剤ｐＨ８ １
００ミリモル中で実施した。基質濃度は５０ミリモルで
あった。
【００５３】この試験の結果を以下の表に示す：基質
相対的な活量
基質 相対的な活
量
（％）
（％） Ｌ‐カルニチンア
ミド １００ アミノ酸アミド：Ｄ‐カル
ニチンアミド ０ Ｌ‐Ｐｒｏ‐
ＮＨ２ ０Ｄ‐カルニ
チンニトリル ０ Ｌ‐Ｓｅｒ‐ＮＨ
２ ０Ｌ‐カルニチン
ニトリル ０ Ｌ‐Ｔｈｒ‐ＮＨ２
０アセトアミド
０ Ｄ‐Ｐｈｅ‐Ｎ
Ｈ２ ０プロピオンア
ミド ０ Ｌ‐Ｐｈｅ‐
ＮＨ２ ０ブチルアミ
ド ０ Ｌ‐Ｔ
ｙｒ‐ＮＨ２ ０イソ
酪酸アミド ０ Ｌ
‐Ｔｒｐ‐ＮＨ２ ０
乳酸アミド ０
Ｌ‐Ａｒｇ‐ＮＨ２
０アクリルアミド
０ Ｌ‐Ａｒｇ‐ＮＨ２
０メタクリルアミド
０ Ｌ‐Ｈｉｓ‐ＮＨ２
０ベンズアミド
０ Ｌ‐Ａｓｎ‐ＮＨ２
０
Ｌ‐Ｍｅｔ‐
ＮＨ２ ０アミノ酸ア
ミド： Ｇｌｙ‐ＮＨ２ ０
ジペプチドアミド：Ｌ‐Ｖａｌ‐ＮＨ２
０ Ｌ‐Ｖａｌ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐ＮＨ
２ ０Ｄ‐Ｌｅｕ‐ＮＨ２
０ Ｌ‐Ａｓｐ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐ＮＨ２
０Ｌ‐Ｌｅｕ‐ＮＨ２ ０
Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐ＮＨ２ ０Ｌ‐Ｉｌ
ｅ‐ＮＨ２ ０ Ｌ‐Ｔｙ
ｒ‐Ｇｌｙ‐ＮＨ２ ０Ｌ‐Ａｌａ‐Ｎ
Ｈ２ ０ Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ
‐ＮＨ２ ０Ｌ‐カルニチン‐
アミダーゼは、極めて高い基質特異性に顕著である。Ｌ
‐カルニチンアミドを除いて、試験したどのアミドも変
換されなかった。薄層クロマトグラフィによる試験は、
このアミダーゼが、試験したジペプチドへの蛋白質加水
分解活量すらも有していないことを示していた。
相対的な活量
基質 相対的な活
量
（％）
（％） Ｌ‐カルニチンア
ミド １００ アミノ酸アミド：Ｄ‐カル
ニチンアミド ０ Ｌ‐Ｐｒｏ‐
ＮＨ２ ０Ｄ‐カルニ
チンニトリル ０ Ｌ‐Ｓｅｒ‐ＮＨ
２ ０Ｌ‐カルニチン
ニトリル ０ Ｌ‐Ｔｈｒ‐ＮＨ２
０アセトアミド
０ Ｄ‐Ｐｈｅ‐Ｎ
Ｈ２ ０プロピオンア
ミド ０ Ｌ‐Ｐｈｅ‐
ＮＨ２ ０ブチルアミ
ド ０ Ｌ‐Ｔ
ｙｒ‐ＮＨ２ ０イソ
酪酸アミド ０ Ｌ
‐Ｔｒｐ‐ＮＨ２ ０
乳酸アミド ０
Ｌ‐Ａｒｇ‐ＮＨ２
０アクリルアミド
０ Ｌ‐Ａｒｇ‐ＮＨ２
０メタクリルアミド
０ Ｌ‐Ｈｉｓ‐ＮＨ２
０ベンズアミド
０ Ｌ‐Ａｓｎ‐ＮＨ２
０
Ｌ‐Ｍｅｔ‐
ＮＨ２ ０アミノ酸ア
ミド： Ｇｌｙ‐ＮＨ２ ０
ジペプチドアミド：Ｌ‐Ｖａｌ‐ＮＨ２
０ Ｌ‐Ｖａｌ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐ＮＨ
２ ０Ｄ‐Ｌｅｕ‐ＮＨ２
０ Ｌ‐Ａｓｐ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐ＮＨ２
０Ｌ‐Ｌｅｕ‐ＮＨ２ ０
Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐ＮＨ２ ０Ｌ‐Ｉｌ
ｅ‐ＮＨ２ ０ Ｌ‐Ｔｙ
ｒ‐Ｇｌｙ‐ＮＨ２ ０Ｌ‐Ａｌａ‐Ｎ
Ｈ２ ０ Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ
‐ＮＨ２ ０Ｌ‐カルニチン‐
アミダーゼは、極めて高い基質特異性に顕著である。Ｌ
‐カルニチンアミドを除いて、試験したどのアミドも変
換されなかった。薄層クロマトグラフィによる試験は、
このアミダーゼが、試験したジペプチドへの蛋白質加水
分解活量すらも有していないことを示していた。
【００５４】例 １２：Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼ
のアミノ酸配列 第１の４８ Ｎ末端アミノ酸のアミノ酸配列を蛋白質
シークエネーター上で測定した。そのために、モノＱ精
製されかつ限外濾過によって濃厚にされた酵素を、燐酸
カリウム緩衝液ｐＨ７．５ １０ミリモル中に溶解し
、この溶液を供給した。アミノ酸配列は以下の通りであ
る：
のアミノ酸配列 第１の４８ Ｎ末端アミノ酸のアミノ酸配列を蛋白質
シークエネーター上で測定した。そのために、モノＱ精
製されかつ限外濾過によって濃厚にされた酵素を、燐酸
カリウム緩衝液ｐＨ７．５ １０ミリモル中に溶解し
、この溶液を供給した。アミノ酸配列は以下の通りであ
る：
【００５５】
【外３】
【００５６】例 １３：全細胞との変換全細胞との変
換を、菌株ＤＳＭ ６２３０の２０％の細胞懸濁液を
用いて、常法の酵素試験を実施することによって試験し
た。結果：Ｌ‐カルニチンアミドを、同一濃度の分解し
た細胞懸濁液によるよりも６４％高い活量を有する全細
胞によって変換した。Ｄ‐カルニチンアミドは未変換の
ままであった。従って、Ｌ‐カルニチンへのＬ‐カルニ
チンアミドの変換もまた、固定された微生物によって、
極めて良好に実施できるということが予想される。微生
物を変性していない重合体への埋設による微生物の固定
化は、当業者に公知の方法により行われる。 適当な微生物固定化は、アルギネートまたはキトサンを
基礎とする固定化である。
換を、菌株ＤＳＭ ６２３０の２０％の細胞懸濁液を
用いて、常法の酵素試験を実施することによって試験し
た。結果：Ｌ‐カルニチンアミドを、同一濃度の分解し
た細胞懸濁液によるよりも６４％高い活量を有する全細
胞によって変換した。Ｄ‐カルニチンアミドは未変換の
ままであった。従って、Ｌ‐カルニチンへのＬ‐カルニ
チンアミドの変換もまた、固定された微生物によって、
極めて良好に実施できるということが予想される。微生
物を変性していない重合体への埋設による微生物の固定
化は、当業者に公知の方法により行われる。 適当な微生物固定化は、アルギネートまたはキトサンを
基礎とする固定化である。
Claims (4)
- 【請求項１】 寄託番号ＤＭＳ ６２３０を有する
微生物。 - 【請求項２】 微生物学的に得られたＬ‐カルニチン
‐アミダーゼにおいて、次の性質： ａ）反応性：このＬ‐カルニチン‐アミダーゼが、Ｌ‐
カルニチンアミドをＬ‐カルニチンおよびアンモニアへ
加水分解する反応性、ｂ）基質特異性：このＬ‐カルニ
チン‐アミダーゼが、Ｄ‐カルニチンアミド、脂肪族ま
たは芳香族カルボン酸アミド、アミノ酸アミドおよびジ
ペプチドアミドを加水分解しない基質特異性、ｃ）誘導
物質：このＬ‐カルニチン‐アミダーゼが、誘導可能な
酵素であり、かつＬ‐カルニチンアミド、Ｌ‐カルニチ
ン、γ‐ブチロベタインおよびデヒドロカルニチンによ
って誘導される誘導物質、ｄ）ｐＨ‐最適値：最適なｐ
Ｈ範囲がｐＨ７．０〜９．５の間にあるｐＨ‐最適値、
ｅ）ｐＨ‐安定性：このＬ‐カルニチン‐アミダーゼが
、良好なｐＨ‐安定性をｐＨ５．０〜９．５の間のｐＨ
範囲内で示すｐＨ‐安定性、ｆ）酵素阻害物質：Ｚｎ２
＋Ｃｕ２＋Ｈｇ２＋およびＡｇ２＋、更にｐ‐ヒドロキ
シメルクリ安息香酸塩、フェニルメタンスルホニルフル
オリドおよびジニトロジチオ安息香酸１ミリモルの濃度
ですでに阻害的に作用する酵素阻害物質、ｇ）分子量：
この分子量が約１３００００である分子量、ｈ）下部単
位：このＬ‐カルニチン‐アミダーゼが、それぞれ約６
５０００の分子量を有する２つの同定下部単位から成る
下部単位、ｉ）等電点：この等電点がｐＨ４．２である
等電点、ｊ）アミノ酸配列：第１の４８ Ｎ末端アミ
ノ酸が次のものである： 【外１】 を有することを特徴とする、Ｌ‐カルニチン‐アミダー
ゼ。 - 【請求項３】 請求項２記載のＬ‐カルニチン‐アミ
ダーゼを取得する方法において、菌株ＤＳＭ ６２３
０を、鉱酸塩、上記の誘導物質の１つ並びに炭素および
窒素の源を含有する水性培養基中で２０℃〜３０℃の温
度および６．５〜８．５の間の出発‐ｐＨ‐値で好気性
に培養し、細胞物質を分離し、かつ細胞から酵素を単離
することを特徴とする、請求項２に記載のＬ‐カルニチ
ン‐アミダーゼの獲得方法。 - 【請求項４】 Ｌ‐カルニチンへのＤＬ‐および／ま
たはカルニチンアミドの酵素的変換方法において、請求
項１に記載の微生物または請求項２に記載のＬ‐カルニ
チン‐アミダーゼを使用することを特徴とする、Ｌ‐カ
ルニチンへのＤＬ‐および／またはカルニチンアミドの
酵素的変換方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4106375.9 | 1991-02-28 | ||
| DE4106375A DE4106375A1 (de) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | Eine l-carnitin-amidase produzierender mikroorganismus, l-carnitin-amidase, verfahren zu deren gewinnung und deren verwendung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04320679A true JPH04320679A (ja) | 1992-11-11 |
Family
ID=6426142
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4041353A Pending JPH04320679A (ja) | 1991-02-28 | 1992-02-27 | Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼを生産する微生物、微生物学的に生産されたｌ‐カルニチン‐アミダーゼ、その取得方法およびｌ‐カルニチンへのｄｌ‐および／またはカルニチンアミドの酵素的変換方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5238838A (ja) |
| EP (1) | EP0501292A1 (ja) |
| JP (1) | JPH04320679A (ja) |
| DE (1) | DE4106375A1 (ja) |
Cited By (1)
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