JPH04320689A - 宿主ベクター系 - Google Patents
宿主ベクター系Info
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- JPH04320689A JPH04320689A JP17908991A JP17908991A JPH04320689A JP H04320689 A JPH04320689 A JP H04320689A JP 17908991 A JP17908991 A JP 17908991A JP 17908991 A JP17908991 A JP 17908991A JP H04320689 A JPH04320689 A JP H04320689A
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、プラスミドｐＢＲ３２
２、ｐＢＲ３２５またはｐＢＲ３２８をベクターとして
用い、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細
菌を宿主として用いる宿主ベクター系に関するものであ
り、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５またはｐＢ
Ｒ３２８で形質転換され、プロリン要求性変異株である
、イネ褐状病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｖｅｎ
ａｅ）に関する。本発明の宿主ベクター系および新規細
菌は、シュードモナス属細菌を用いた有用物質生産菌の
作出等の微生物工業分野への利用や、バイオコントロー
ル微生物の作出等の農業分野への利用が期待される。
２、ｐＢＲ３２５またはｐＢＲ３２８をベクターとして
用い、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細
菌を宿主として用いる宿主ベクター系に関するものであ
り、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５またはｐＢ
Ｒ３２８で形質転換され、プロリン要求性変異株である
、イネ褐状病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｖｅｎ
ａｅ）に関する。本発明の宿主ベクター系および新規細
菌は、シュードモナス属細菌を用いた有用物質生産菌の
作出等の微生物工業分野への利用や、バイオコントロー
ル微生物の作出等の農業分野への利用が期待される。
【０００２】
【従来の技術】シュードモナス属細菌の遺伝子発現機構
を明らかする手段として、遺伝子組換え技術による該細
菌からの遺伝子の単離が行われている。その方法として
は下記の２つの手段が一般的に採用されている。■大腸
菌の宿主ベクター系を用いてクローニングを行なう。■
シュードモナス属の宿主ベクター系を用いてクローニン
グを行なう。しかしながら、■の方法については、シュ
ードモナス属細菌由来の遺伝子の大腸菌における発現は
一般に効率が低いという難点がある。■の方法について
は、形質転換効率が低い上、菌種によっては発現が不十
分のとが多い。
を明らかする手段として、遺伝子組換え技術による該細
菌からの遺伝子の単離が行われている。その方法として
は下記の２つの手段が一般的に採用されている。■大腸
菌の宿主ベクター系を用いてクローニングを行なう。■
シュードモナス属の宿主ベクター系を用いてクローニン
グを行なう。しかしながら、■の方法については、シュ
ードモナス属細菌由来の遺伝子の大腸菌における発現は
一般に効率が低いという難点がある。■の方法について
は、形質転換効率が低い上、菌種によっては発現が不十
分のとが多い。
【０００３】一方、大腸菌の宿主ベクター系のベクター
として開発されてきたｐＢＲ系プラスミド（ｐＢＲ３２
２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２８等）は、クローニング
用ベクターとして極めて優れた利点を有する。しかしな
がら、これらのプラスミドはシュードモナス属菌内では
複製できず、ベクターとして利用され得なかった。
として開発されてきたｐＢＲ系プラスミド（ｐＢＲ３２
２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２８等）は、クローニング
用ベクターとして極めて優れた利点を有する。しかしな
がら、これらのプラスミドはシュードモナス属菌内では
複製できず、ベクターとして利用され得なかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、イネか
ら分離されたイネ褐状病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａ
ｖｅｎａｅ）が、ｐＢＲ系プラスミドにより形質転換複
製され、かつ、大腸菌の系と同程度に極めて効率よく形
質転換され得ること、さらには、該細菌より選抜された
プロリン要求性株が、より一層効率よくｐＢＲ系プラス
ミドにより形質転換されうることを見出し、本発明を完
成した。本発明により、シュードモナス属細菌、とくに
イネ褐状病菌の遺伝子のクローニングを極めて簡便に行
なうことができる。
ら分離されたイネ褐状病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａ
ｖｅｎａｅ）が、ｐＢＲ系プラスミドにより形質転換複
製され、かつ、大腸菌の系と同程度に極めて効率よく形
質転換され得ること、さらには、該細菌より選抜された
プロリン要求性株が、より一層効率よくｐＢＲ系プラス
ミドにより形質転換されうることを見出し、本発明を完
成した。本発明により、シュードモナス属細菌、とくに
イネ褐状病菌の遺伝子のクローニングを極めて簡便に行
なうことができる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、■
プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５またはｐＢＲ３
２８をベクターとして用い、■シュードモナス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌を宿主として用いる、宿主ベ
クター系に関するものであり、プラスミドｐＢＲ３２２
、ｐＢＲ３２５またはｐＢＲ３２８で形質転換され、プ
ロリン要求性変異株である、イネ褐状病菌（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ａｖｅｎａｅ）に関するものである。
プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５またはｐＢＲ３
２８をベクターとして用い、■シュードモナス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌を宿主として用いる、宿主ベ
クター系に関するものであり、プラスミドｐＢＲ３２２
、ｐＢＲ３２５またはｐＢＲ３２８で形質転換され、プ
ロリン要求性変異株である、イネ褐状病菌（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ａｖｅｎａｅ）に関するものである。
【０００６】本発明の、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５ま
たはｐＢＲ３２８で形質転換され、プロリン要求性変異
株であるイネ褐状病菌は、以下のように製造される。イ
ネ褐状病菌Ｋ１株からの、プロリン要求性変異株の作出
は以下のように行なう。対数増殖期の細菌〔Ｋ１（ＭＡ
ＦＦ０３−０１７５２）株〕を、１００μｇ／ｍｌの濃
度のニトロソグアニジンで３７℃、３０分間処理後、一
夜培養する。それらの細菌を平板培養してコロニーを形
成させる。個々のコロニーを最小培地および最小培地に
カザミノ酸とトリプトファンを加えた培地で培養し、後
者でのみ増殖するアミノ酸変異株を選抜する。それらの
菌株をさらに最小培地および最小培地にプロリンを添加
した培地にて培養し、後者でのみ増殖する株を選抜する
ことにより、プロリン要求性変異株を得ることができる
。本発明において得られてプロリン要求性株は、Ｐｒ４
７株と命名した。
たはｐＢＲ３２８で形質転換され、プロリン要求性変異
株であるイネ褐状病菌は、以下のように製造される。イ
ネ褐状病菌Ｋ１株からの、プロリン要求性変異株の作出
は以下のように行なう。対数増殖期の細菌〔Ｋ１（ＭＡ
ＦＦ０３−０１７５２）株〕を、１００μｇ／ｍｌの濃
度のニトロソグアニジンで３７℃、３０分間処理後、一
夜培養する。それらの細菌を平板培養してコロニーを形
成させる。個々のコロニーを最小培地および最小培地に
カザミノ酸とトリプトファンを加えた培地で培養し、後
者でのみ増殖するアミノ酸変異株を選抜する。それらの
菌株をさらに最小培地および最小培地にプロリンを添加
した培地にて培養し、後者でのみ増殖する株を選抜する
ことにより、プロリン要求性変異株を得ることができる
。本発明において得られてプロリン要求性株は、Ｐｒ４
７株と命名した。
【０００７】本発明にて用いられたＫ１株は、財団法人
醗酵研究所（大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号
、ＴＥＬ：０６−３０２−７２８１）に寄託されており
、受入番号は「ＩＦＯ１５１１３」である。また、Ｐｒ
４７株も上記の財団法人醗酵研究所に寄託されており、
受入番号は「ＩＦＯ１５１１４号」である。いずれの菌
も本発明の実施のために分譲されうる。
醗酵研究所（大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号
、ＴＥＬ：０６−３０２−７２８１）に寄託されており
、受入番号は「ＩＦＯ１５１１３」である。また、Ｐｒ
４７株も上記の財団法人醗酵研究所に寄託されており、
受入番号は「ＩＦＯ１５１１４号」である。いずれの菌
も本発明の実施のために分譲されうる。
【０００８】Ｋ１（ＮＲ８２０１）株の細菌学的性状に
ついては、詳しく調べられており、それらの結果から、
イネ褐状病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｖｅｎａ
ｅ）と同定されている（土屋ら、農業環境技術研究所３
８号、１９８３年）。また、Ｐｒ４７株は、細菌学的性
状はＫ１株と同様であるが、プロリン要求性である点だ
けが異なる。さらにＫ１株、Ｐｒ４７株のいずれも、細
菌の培養に通常用いられるＬＢ培地、ジャガイモ半合成
培地等の一般的な増殖用培地でよく増殖できる。
ついては、詳しく調べられており、それらの結果から、
イネ褐状病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｖｅｎａ
ｅ）と同定されている（土屋ら、農業環境技術研究所３
８号、１９８３年）。また、Ｐｒ４７株は、細菌学的性
状はＫ１株と同様であるが、プロリン要求性である点だ
けが異なる。さらにＫ１株、Ｐｒ４７株のいずれも、細
菌の培養に通常用いられるＬＢ培地、ジャガイモ半合成
培地等の一般的な増殖用培地でよく増殖できる。
【０００９】本発明の宿主ベクター系は以下のように製
造される。Ｈａｎａｈａｎの方法〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，Ｖｏｌ．１６６，ｐｐ．５５７−５８０，（１９
８３）］に従って、形質転換のための感受性菌を調整す
る。２ｘＴＹ培地（バクトトリプトン１６ｇ、イースト
エクストラクト１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、蒸留水１
ｌ）で培養し、０．３−０．４ＯＤ（６６０ｎｍ）に達
した細菌を遠心機で集菌し、ＲＦ１溶液に置換して４℃
にて１．５−２．０時間静置する。
造される。Ｈａｎａｈａｎの方法〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，Ｖｏｌ．１６６，ｐｐ．５５７−５８０，（１９
８３）］に従って、形質転換のための感受性菌を調整す
る。２ｘＴＹ培地（バクトトリプトン１６ｇ、イースト
エクストラクト１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、蒸留水１
ｌ）で培養し、０．３−０．４ＯＤ（６６０ｎｍ）に達
した細菌を遠心機で集菌し、ＲＦ１溶液に置換して４℃
にて１．５−２．０時間静置する。
【００１０】ＲＦ１溶液の組成は以下のとおりである。
ＲＦ１溶液
１００ｍＭ ＲｂＣｌ
５０ｍＭ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ
３０ｍＭ Ｋ−Ａｃｅｔａｔｅ
１０ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ
１５％（ｗ／ｖ）Ｇｌｙｃｅｒｏｌ
最終 ｐＨ５．８０
さらに、ＲＦ２溶液に１５〜３０分置き、マイクロチュ
ーブに５０〜１００μｌずつ分注した細菌をドライアイ
ス・エタノール中で急速に凍結し、−８０℃で保存する
。 ＲＦ２溶液の組成は以下のとおりである。 ＲＦ２溶液 １０ｍＭ ＭＯＰＳ １０ｍＭ ＲｂＣｌ ７５ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １５％（ｗ／ｖ）Ｇｌｙｃｅｒｏｌ 最終 ｐＨ６．８
ーブに５０〜１００μｌずつ分注した細菌をドライアイ
ス・エタノール中で急速に凍結し、−８０℃で保存する
。 ＲＦ２溶液の組成は以下のとおりである。 ＲＦ２溶液 １０ｍＭ ＭＯＰＳ １０ｍＭ ＲｂＣｌ ７５ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １５％（ｗ／ｖ）Ｇｌｙｃｅｒｏｌ 最終 ｐＨ６．８
【００１１】形質転換の方法も上記Ｈａｎａｈａｎの方
法に準じて行える。すなわち、５０μｌの感受性菌に２
０ｎｇのプラスミドを添加して氷中で１時間静置する。 ４２℃で９０秒加温し、再び数分間氷中に戻した試料を
３５℃で３時間培養する。これらの試料を抗生物質を添
加した選択培地で培養し、形成されたコロニー数で形質
転換の効率を測定できる。
法に準じて行える。すなわち、５０μｌの感受性菌に２
０ｎｇのプラスミドを添加して氷中で１時間静置する。 ４２℃で９０秒加温し、再び数分間氷中に戻した試料を
３５℃で３時間培養する。これらの試料を抗生物質を添
加した選択培地で培養し、形成されたコロニー数で形質
転換の効率を測定できる。
【００１２】
【作用】プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５または
ｐＢＲ３２８を用いて、Ｋ１株またはＰｒ４７株につい
て、プラスミド１μｇ当たり１０４−５個の高率にて形
質転換し組換え体を作ることが可能になる。
ｐＢＲ３２８を用いて、Ｋ１株またはＰｒ４７株につい
て、プラスミド１μｇ当たり１０４−５個の高率にて形
質転換し組換え体を作ることが可能になる。
【００１３】
【実施例】以下に、実施例により本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれに限定されない。 〔実施例１〕プラスミドによる形質転換Ｋ１株とＰｒ４
７株の感受性株（５０μｌ）に２０ｎｇのＰＢＲ３２２
株および対照区として蒸留水を数μｌ加え、十分混合し
た後、氷中に１時間静置した。４２℃で１分間静置し、
再び氷中に数分間置いた後、ＳＯＣ培地（バクトトリプ
トン２０ｇ、イーストエクストラクト５ｇ、塩化ナトリ
ウム０．５ｇ、２０ｍＭブドウ糖、２０ｍＭ 硫酸マ
グネシウム、蒸留水１ｌ）にて３５℃３時間培養後、テ
トラサイクリン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ平板培地
にて、３５℃一夜培養する。形成されたコロニー数を測
定し、プラスミド１μ当たりのコロニー数に換算して形
質転換効率を算出した。表−１に５反復の平均値を示し
た。ｐＢＲ３２５およびｐＢＲ３２８の場合、クロラム
フェニコール（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で培養
した。これらの結果から、Ｋ１株はｐＢＲ３２２、ｐＢ
Ｒ３２５およびｐＢＲ３２８を高率に形質転換した。さ
らにＰｒ４７株はＫ１株に比べその高率が約１０〜５０
倍高く、１．３−３．０×１０６であった（表−１）。
説明するが、本発明はこれに限定されない。 〔実施例１〕プラスミドによる形質転換Ｋ１株とＰｒ４
７株の感受性株（５０μｌ）に２０ｎｇのＰＢＲ３２２
株および対照区として蒸留水を数μｌ加え、十分混合し
た後、氷中に１時間静置した。４２℃で１分間静置し、
再び氷中に数分間置いた後、ＳＯＣ培地（バクトトリプ
トン２０ｇ、イーストエクストラクト５ｇ、塩化ナトリ
ウム０．５ｇ、２０ｍＭブドウ糖、２０ｍＭ 硫酸マ
グネシウム、蒸留水１ｌ）にて３５℃３時間培養後、テ
トラサイクリン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ平板培地
にて、３５℃一夜培養する。形成されたコロニー数を測
定し、プラスミド１μ当たりのコロニー数に換算して形
質転換効率を算出した。表−１に５反復の平均値を示し
た。ｐＢＲ３２５およびｐＢＲ３２８の場合、クロラム
フェニコール（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で培養
した。これらの結果から、Ｋ１株はｐＢＲ３２２、ｐＢ
Ｒ３２５およびｐＢＲ３２８を高率に形質転換した。さ
らにＰｒ４７株はＫ１株に比べその高率が約１０〜５０
倍高く、１．３−３．０×１０６であった（表−１）。
【００１４】〔実施例２〕電気泳動による形質転換の確
認 プラスミドがＰｒ４７株に形質転換されたことを確認す
るために、形成されたコロニーを液体培養し、プラスミ
ドの抽出を行なった。ｐＢＲ３２５を用いてＰｒ４７株
を形質転換して得られたコロニーを１２個とり、クロラ
ムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）を含む１．５ｍｌの
液体培地中で３５℃一夜振とう培養した。アルカリ法に
てプラスミドを抽出し、１％アガロース電気泳動にかけ
た結果、抽出したプラスミドは形質転換にもちいたｐＢ
Ｒ３２５と同じ移動度を示し、１２個すべてが形質転換
されたことが確認された。結果を図１に示す。図１にお
いて、レーンＡはマーカーＤＮＡ、レーンはプラスミド
ｐＢＲ３２５、レーン１〜６は形質転換体から抽出した
プラスミドを示す。
認 プラスミドがＰｒ４７株に形質転換されたことを確認す
るために、形成されたコロニーを液体培養し、プラスミ
ドの抽出を行なった。ｐＢＲ３２５を用いてＰｒ４７株
を形質転換して得られたコロニーを１２個とり、クロラ
ムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）を含む１．５ｍｌの
液体培地中で３５℃一夜振とう培養した。アルカリ法に
てプラスミドを抽出し、１％アガロース電気泳動にかけ
た結果、抽出したプラスミドは形質転換にもちいたｐＢ
Ｒ３２５と同じ移動度を示し、１２個すべてが形質転換
されたことが確認された。結果を図１に示す。図１にお
いて、レーンＡはマーカーＤＮＡ、レーンはプラスミド
ｐＢＲ３２５、レーン１〜６は形質転換体から抽出した
プラスミドを示す。
【図１】形質転換体より抽出したプラスミドのアガロー
スゲル電気泳動の電気泳動パターンを示す図である。
スゲル電気泳動の電気泳動パターンを示す図である。
Claims (2)
- 【請求項１】 ■プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３
２５またはｐＢＲ３２８をベクターとして用い、■シュ
ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌を宿主と
して用いる、宿主ベクター系。 - 【請求項２】 プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２
５またはｐＢＲ３２８で形質転換され、プロリン要求性
変異株である、イネ褐状病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｖｅｎａｅ）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17908991A JP2600090B2 (ja) | 1991-04-19 | 1991-04-19 | 宿主ベクター系 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17908991A JP2600090B2 (ja) | 1991-04-19 | 1991-04-19 | 宿主ベクター系 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04320689A true JPH04320689A (ja) | 1992-11-11 |
| JP2600090B2 JP2600090B2 (ja) | 1997-04-16 |
Family
ID=16059882
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17908991A Expired - Lifetime JP2600090B2 (ja) | 1991-04-19 | 1991-04-19 | 宿主ベクター系 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2600090B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8288127B2 (en) | 2003-11-19 | 2012-10-16 | Pfenex, Inc | Protein expression systems |
-
1991
- 1991-04-19 JP JP17908991A patent/JP2600090B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8288127B2 (en) | 2003-11-19 | 2012-10-16 | Pfenex, Inc | Protein expression systems |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2600090B2 (ja) | 1997-04-16 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |