JPH04341126A - 植物細胞内の代謝の変更 - Google Patents
植物細胞内の代謝の変更Info
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- JPH04341126A JPH04341126A JP2413067A JP41306790A JPH04341126A JP H04341126 A JPH04341126 A JP H04341126A JP 2413067 A JP2413067 A JP 2413067A JP 41306790 A JP41306790 A JP 41306790A JP H04341126 A JPH04341126 A JP H04341126A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子を組み換えた植
物およびその製造方法に関する。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】解糖
の際に炭素が入り込むのを抑制するための、主要な調節
酵素として、ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）（ＥＣ
２．７．１．１１ ）が広く知られている。特に植物
細胞を解糖すると、その細胞内に、エネルギー産生に必
要な呼吸炭素と、他の代謝経路に必要な中間体を送り込
むことができる。トマトの塊茎には、フルクトース−６
−ホスフェートを接触的にフルクトース−１，６−ビス
ホスフェートに転換させることが可能な４種の形態のＰ
ＦＫ（Ｋｒｕｇｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．，２６７，６９０−７００）およびピロ
ホスフェートフルクトース−６−ホスフェートホスホト
ランスフェラーゼ（ＰＥＰ）（ＥＣ ２．７．１．９０
）が含まれている。ＰＥＰは細胞は細胞ゾルと澱粉体
の双方に存在しているが、ＰＥＰは細胞ゾル内で生起す
ると判明しているに過ぎない。 【０００３】従来、ＰＦＫが単独で解糖の全段階を制御
すると考えられていたが、それは実状とは異なることが
見い出されるに至った。本発明者らは、遺伝子操作によ
って、トマト植物にＰＦＫを付加したところ、ＰＦＫ活
性の大幅上昇にもかかわらず、解糖を終えた段階におい
て実質的な変化は認められず、逆に中間体の貯留径が変
化した。経路に炭素を送り込むこと、あるいは炭素を取
り出すことのどちらの場合でも、解糖の流れは調節可能
であると、上記の結果からいえる。 【０００４】 【課題を解決するたけの手段】本発明によれば、プロモ
ーターとコード化系列とで構成され、かつ解糖経路にお
いて、あるいは澱粉、白糖または還元糖を合成または分
解する経路において、代謝中間体の量を調節できる物質
を含むキメラ遺伝子を使用することにより、植物細胞を
転換せしめる工程と、転換されたその細胞から植物を再
生せしめる工程とからなる遺伝子組み換え植物の製造方
法が提供される。さらに、本発明はキメラ遺伝子を提供
する。本発明の方法に適した中介物質には、中介物質に
よって転換された植物細胞内で表現が可能なキメラ遺伝
子が含まれる。従って、本発明での植物細胞は、その細
胞内でキメラ遺伝子が表現されるように、同遺伝子を保
護するものである。キメラ遺伝子が植物の細胞内で表現
されるように、その遺伝子を保護することで、遺伝子組
み換え植物が得られる。種子や他の植物の珠芽は、遺伝
子組み換え植物から入手でき、キメラ遺伝子によって安
定に転換された植物の生育を促進するのに使用できる。 本発明では、解糖経路において、あるいは澱粉、白糖ま
たはグルコースやフルトースの還元糖の分解の経路にお
いて、植物代謝を改変することができる一方、経路代謝
産物への蓄積を改めることも可能である。本発明に適用
できる経路例が添付図面に示してある。 【０００５】本発明は、特にジャガイモに適している。 トマトの塊茎にＰＦＫ遺伝子を付加的に導入して表現さ
せると、解糖経路の流れが助長される恐れがあると、従
来は考えられていた。さらに、ＰＦＫをトマト植物全体
に導入して表現された場合、その植物が死滅してしまう
と予想したとしても、理不尽ではなかったであろう。意
外なことに、ＰＦＫの導入、表現後であっても、トマト
植物は死滅せず、また解糖代謝経路の流れも助長されな
いことが判明した。ジャガイモ塊茎を低温条件下で貯蔵
すると、通常はＰＦＫ活性の低下を来たす。その結果、
ジャガイモ中の白糖や還元糖が増加すると考えられる。 これらの糖類が集積した場合、ジャガイモの加工上、大
きな問題が生ずる。例えば、ポテトチップやフレンチフ
ライとして知られているチップやクリスプの加工業者側
の問題として、糖類含量が高いため、チップやクリスプ
を油で揚げる際、製品の色合いが過剰のキツネ色を帯び
ることが挙げられる。本発明によるジャガイモ塊茎を低
温貯蔵しても、その植物中のＰＦＫが増量されているの
で、解糖代謝経路の流れが連続的に行われる。つまり、
白糖合成における流量は、従来の貯蔵ポテト塊茎に比較
して小さくなり、貯蔵中の白糖や還元糖類の蓄積が大幅
に減少する。 【０００６】本発明のキメラ遺伝子は、適切なプロモー
ター（ａ）と、そのプロモーターに操作自在に連結され
たコード化系列（ｂ）とで構成され、解糖経路において
、あるいは澱粉白糖または還元糖を合成または分解する
経路における代謝中間体の量を加減できる物質である。 キエラ遺伝子は、従来の方法で形成できる。コード化系
列は、植物細胞内で自在に表現できるように構成されて
いる。プロモーター（ａ）は、植物体内で必要なコード
を表現せしめることができるものでなければならない。 このプロモーターとは、植物の特定の組織内で、および
／または特定の発育段階において、表現を導くことが可
能な物質であって、植物に対して異族体でも同族体でも
よい。具体例としては、花キャベツのモザイクウイルス
プロモーター３５Ｓ、ノパーリンシンターゼまたは
オクトピンシンターゼ プロモーター、パタチン
プロモーター、リブスコの小遺伝子等がある。ポテト、
特にその塊茎内で表現を導くプロモーターとして好適で
あるプロモター（ａ）は構成プロモーター、特異組織プ
ロモーターのいずれでもよい。 【０００７】コード化系列（ｂ）を使用することで、あ
る特異経路の代謝中間体の量を調節する酵素のコード化
が可能である。特異経路には解糖経路が含まれる。解糖
とは、ＡＴＰまたはＮＡＤＨの随伴生産により、グルコ
ースをピルヴェートに換える一連の反応を指すもので、
エムデン−マイエルホーフ−パルナス経路とも呼ばれる
。白糖は、α−１−２ Ｏ−グリコシド結合を介して
結合されたグルコースとフラクトースからなる。従って
、白糖合成の経路には、同結合を形成するのに適した中
間体を生成せしめる酵素工程が組み込まれる。澱粉とは
、可変量の１−６結合グルコースを有し、１−４結合グ
ルコース主体の重合体であり、その合成経路には、重合
体形成用の中間体を生成する工程が必要とされる。コー
ド化系列（ｂ）としては、植物細胞内で表現されるとき
、上述した経路の代謝を増減するものが選ばれる。この
コード系列は、経路酵素または切形の経路酵素等の経路
酵素を活性化改質したものをコード化することができる
。経路酵素を例示すると、ＰＦＫ（ＥＣ ２．７．１．
１１ ）ピルヴェートキナーゼ（ＰＫ）（ＥＣ ２ ．
７．１．４０）、酸インバーターゼ（ＥＣ ３．２．１
．２６ ）、スターチンシターゼ（ＥＣ ２．４．１．
２１ ）、アデニンジホススクホルコースピロホスホリ
ラーゼ（ＥＣ ３．６．１．２１ ）、スクロースシン
ターゼ（ＥＣ ２．４．１．１３ ）、６−ホスホフル
クトキナーゼ（ピロホスフェート）（ＥＣ ２．７．１
．９０ ）、スクロースホスフェートシンターゼ（ＳＰ
Ｓ）（ＥＣ ２．４．１．１４ ）などがある。コード
化系列（ｂ）は、植物遺伝由来のもの、または微生物遺
伝子等の非植物遺伝子由来のもの、あるいはバクテリア
遺伝子由来のものが適用できる。後者の例として、Ｅ．
ｃｏｌｉの遺伝子やＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅの酵母遺伝子が挙げられる。特にＰＦ
Ｋコード系列は、Ｅ．ｃｏｌｉのｐｆｋＡ遺伝子または
Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ のｐｆｋ遺伝子
によって形成される。酸インバーターゼコード系列はＳ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由
来する。 【０００８】キメラ遺伝子によって植物細胞を転換する
場合、ＤＮＡの直接摂取を介し、代表的にはキメラ遺伝
子を含むＤＮＡ断片を介して行うことができる。代替法
として、キメラ遺伝子を有する中介物質を使用してもよ
い。キメラ遺伝子には、前記のごときプロモーター等の
再生制御系列と、転移開始および／または停止系列植物
停止系列や重アデニル化系列が例示できる。中介物質は
広範囲にわたって、キメラ遺伝子を植物細胞ゲノムに移
行し、かつひそのゲノム内に安定に結合させることので
きる物質である。通常、再生調節系列および／またはキ
メラ遺伝子のコード化系列３′端部に、もし存在してい
なければ、停止コドンが中介物質に設けられる。そのた
めに、ＤＮＡ断片は、停止系列と、キメラ遺伝子を植物
細胞内で表現させる系列を備えたものでもよい。増進遺
伝子、あるいは植物の特定部位またはある一定の条件下
における表現レベルを増減できる因子を、ＤＮＡ断片お
よび／または中介物質に設けることもできる。中介物質
、さらに抗生物質抵抗性を有する遺伝子を配することで
、転換された植物細胞に抵抗性を与えれば、抗生物質を
含む適切な媒体中での成長に見合った細胞や組織された
植物本体を選択することができる。 【０００９】転換された植物細胞の選択に当っては、あ
る適切な媒体中での成長を考慮すべきである。このよう
な観点からして、得られる植物組織は、例えば植物細胞
ゲノム内でのプロモーターの存在下、酵素をコード化せ
しめ遺伝子を保護するものでなければならない。その遺
伝子も、植物細胞内で表現自在なものが選ばれる。細胞
内に遺伝子とプロモーターを含む植物は、その遺伝子が
表現可能な状態に、例えば細胞ゲノム内に結合される。 植物細胞を転換せしめる好ましい状態によれば、前記の
ようなキメラ遺伝子を含んでなる中介物質を有するＡｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ が
使用される。この場合に適した中介物質は、下記の条件
を満たした混成プラスミッドである。 １）キメラ遺伝子が植物細胞のゲノムに結合されたとき
、その遺伝子の表現を可能ならしめる調節因子を含むキ
メラ遺伝子であること。 ２）植物ゲノム内に結合されるＤＮＡを識別する少なく
とも１種のＤＮＡ系列を含むこと。 ３）ＤＮＡを植物ゲノムに移行することのできるＤＮＡ
系列を有すること。 一般的見地からいって、植物細胞ゲノム内に結合される
ＤＮＡは、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ境界系列によっ
て識別される。境界系列が単一の場合、右側に配列され
ているのが好ましい。ＤＮＡを植物細胞ゲノムに移行せ
しめるようなＤＮＡ系列とは、プラスミドの毒性領域に
相当する。Ｔｉプラスミド酵素の遺伝子コード、その再
生と移行の制御因子は、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ境
界間に定められる。このプラスミドとは、腫瘍発生遺伝
子を除去した無防備のＴｉプラスミドであるが、その遺
伝子と再生制御因子は、毒性領域のＴｉプラスミドを有
するトランス型の二元性中介物質において、Ｔ−ＤＮＡ
の境界間に設けられる。このような二元性中介物質は、
次の構成を備えるものである。 １）植物細胞のゲノム内に結合されたとき、調節因子の
制御下で表現されるキエラ遺伝子。 ２）植物ゲノム内に結合されるＤＮＡを識別する少なく
とも１つのＤＮＡ系列。 それゆえに、植物細胞を転換せしめるのに使用するＡｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ は
、混成プラスミド中介物質または毒性領域のＴｉプラス
ミドを有するトランス型二元性中介物質を含み、このバ
クテリアで、幹や葉の組織移植片を接種することができ
る。植物原質体で転換する際、酵素をコード化し、かつ
適切な再生、移行制御因子を含むＤＮＡ断片を直接導入
するか、あるいはそのＤＮＡ断片を含む中介物質を使用
することができる。直接導入法では、電気導体法、ポリ
エチレングリコール、顕微鏡注射法または粒子衝撃投与
法が採用される。 【００１０】本発明によると、被子植物、単葉植物また
は双葉植物の細胞を転換することが可能である。単葉植
物として大麦、小麦、トウモロコシ、米等を例示するこ
とができ、また双葉植物として綿花、レタス、メロン、
エンドウ、ペチュニア、ジャガイモ、アブラナ、大豆、
ランサイ、ヒマワリ、タバコ、トマト等が例示できる。 本発明に適用されるトマト品種は、デジリー、マリスバ
ード、レコードおよびラセットバーバンクである。転換
された植物細胞の組織培養物を繁殖させると、組織的に
分化した植物が得られる。転換された植物細胞の培養に
当っては、好ましくは選択性成長境地を使用し、得られ
た組織体から植物を再生させる。その結果、細胞ゲノマ
内にキメマ遺伝子を含み、その遺伝子が細胞内で表現自
在な、遺伝子組み換え植物が得られる。この再生植物の
種子や珠芽を収集し、事後に備える。 【００１１】レコード品種のトマトに関連し、好ましい
製造例を説明する。 植物 レコード苗培養物を、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏ
ｏｇ （ＭＳ）培地を入れたＭａｇｅｎｔａ ＧＡ−７
容器中で２２℃に保持する（１６ｈｒ／８ｈ，明／暗）
。その培養物を３週間毎に結節的に二次培養する。長さ
２〜３インチ（５〜７．５ｃｍ）の試験管苗を、Ｌｅｖ
ｉｎｇｔｏｎｓ Ｆ１ 混合肥料入りの、長さ２．５イ
ンチ（６．４ｃｍ）のポットに移し、１８℃の生長室内
で繁殖させる（１６ｈｒ／８ｈｒ明／暗）。第３週目に
植物を、長さ５インチ（１２．７ｃｍ）のポットに移し
替える。５〜７週後の植物を転換させる。 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
例えばＬＢＡ４４０４やＣ５８−３菌株の液状の一
昼夜培養物を、２８℃でＬ−肉汁０．８のＯＤ６００ま
で生長させる。 共培養 最も若く、最も広い葉４枚を摘み取り、１０％Ｄｏ
ｍｅｓｔｏｓ（市販品漂白剤）で１５分間殺菌する。葉
を殺菌水で完全に洗浄し、７ｍｍコルクせん孔器で円板
に切り出す。 円板にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ を１〜５分間混合
し、濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎ０．１）で吸水して乾燥
したあと９０ｍｍの三重に通気したペトリ皿中で表皮を
下にして組織化培地上に載置する。ペトリ皿をテープで
密封し、ガス交換のために切断したあと、２２℃で培養
する（１６ｈｒ／８ｈｒ明／暗）。 ４８時間後、ペトリ皿をクラホラン５００μｇｍｌ−１
とカナマイシン３０μｇｍｌ−１の組織化培地に移行す
る。ここでバクテリアを取り除くとともに、転換された
細胞を選択する。 転換苗の再生 １週間経過後、上記と同様の抗生物質を含む発苗培地に
ペトリ皿を移す。切採が可能になるまで、同一培地によ
る移行を繰り返す（通常は約４週間）。十分に通気した
、例えばＭａｇｅｎｔａ 容器中で苗をセホタクシミの
ＭＳ培地に移し、ＭＳ培地上でセホタクシミを数回通す
ことで、バクテリアを除去する。この操作は、試験管中
で株植物と同様に成熟させることができる。転換された
レコード植物の収率は、共培養葉円板の場合で、度数当
り３０％である。 Ｌ−肉汁 １０ｇ ｌ−１ バコトリプトン５ｇ ｌ−
１ 酵母エキス ５ｇ ｌ−１ 塩化ナトリウム１ｇ ｌ−１
グルコース 組織化培地 ＭＳ ３％ス
クロース含０．５ｍｇ １−１ ２，４−Ｄ ２．５ｍｇ １−１ ＢＡＰ 発苗培地 ＭＳ ３
％スクロース含２．５ｍｇ １−１ ＢＡＰ １．０ｍｇ １−１ ＧＡ３ 【００１２】 【実施例】実施例に基づいて、本発明を詳しく説明する
。 実施例１：トマト塊茎中のＰＦＫの産生キメラＰＦＫ遺
伝子の産生により、ＰＦＫを特異表現させる手順を図２
に示した。Ｈ．Ｍ．Ｈｅｌｌｉｎｇａらの方法により、
ｐｆｋＡ遺伝子のクロンからＰＦＫコード化系列を得た
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １４９，３６３−
３７３，１９８５）。そのコード化系列を単離したとこ
ろ、移行開始位置の前段階では２０ｂｐのみが残った。 つまり、プラスミドｐＨＥ１０１２ 上のＥ．ｃｏｌｉ
ｐｆｋＡ遺伝子が５′端部で、移行開始位置から２
０ｂｐに削減され、３′端部では５０ｂｐに削減された
。このコード化系列を鈍化し、ＧＵＳ（β−グルクロニ
ターゼ）に代えてプラスミドｐＦＷ４１０１ に結紮し
、プラスミドｐＦＷ４０２３ を得た。ｐＦＷ４１０１
を、ＰＳ３とＰＳ２７の２種の遺伝子クロンで形成し
たペタチン プロモーターに組み込み、Ｍｉｇｎｅｒ
ｙ らの方法により、ペタチン断片ＰＳ３とＰＳ２７を
誘導した（Ｇｅｎｅ，６２，２７−４４，１９８８）。 得られた断片の組成は、再生開始に対して、ＰＳ３
−３．５ｋｂ〜−１ｋｂおよびＰＳ２７ −１ｋｂ〜
＋３ｋｂであった。ｐＦＷ４０２３ を保護したＥ．ｃ
ｏｌｉ，ｐＦＷ４１０１を保護したＥ．ｃｏｌｉはそれ
ぞれ１９９０年７月５日付で、受理番号ＮＣＩＭＢ ４
０３０５，ＮＣＩＭＢ ４０３０６ のもとに、ＮＣＩ
ＭＢ 機関に寄託された。中介物質ｐＦＷ４１０１ と
ｐＦＷ４０２３ を別個に、三代配偶法によって、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ の菌
株ＬＢＡ４４０４ に移行した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ 菌株をデジリー呂種のトマトの転換に使用した
。一族６０種以上の遺伝子組み換え植物を産した。これ
らの植物は１〜８のＥ．ｃｏｌｉ ｐｆｋＡ遺伝子を
含むものであった。その中のいくつかは、ＰＦＫ活性の
相当に高い塊茎を生み出した。ＰＦＫ活性の測定はＫｒ
ｕｇｅｒらの方法に準じた（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｂｉｏｐｈｙ．， ２６７，６９０−７００，１９８
９）。中間体を氷冷過塩素酸塩で抽出したあと、酵素測
定を行った。結果を表１に示した。 【００１３】 表１：
ＰＦＫ活性と解糖中間体量 ＰＦＫ
転換 ＧＵＳ転換 ｔ値
ｐ 平均
（ＳＤ） 平均（ＳＤ） ＰＦＫ活性
１） ６２５ （２０６）
２９ （１２） ４．０７ ＞９
９ Ｇｌｃ−６ｐ２） ７８
（８．９） １００ （２１）
１．９７ ＞９５ Ｆｒｕ−６ｐ２）
２１ （４．２） ２９
（ ９） １．７７ ＞９０
比率 ３．７ （
０．５６） ３．７ （０．６６） ０
．０９ Ｎ．Ｓ． ＰＥＰ２）
８２ （２０．４） ２
８ （８．０） ３．５４ ＞９９
Ｐｙｒ２） ４４
（２２．６） ３７ （１６）
０．８０ Ｎ．Ｓ． 比率
２．５ （１．３）
１．０ （０．６） ２．２０ ＞９５
１）ｎｍｏｌ ｍｉｎ−１ｇ ｆｒ ｗｔ −１２）ｎ
ｍｏｌ ｇ ｆｒ ｗｔ−１ 【００１４】活性の異なる２種の植物から得た抽出体の
混合物を評価分析した結果、活性体と抑制体を含むこと
が判った（データは呈示せず）。反復試験により、ＰＦ
Ｋの活性上昇がＥ．ｃｏｌｉに起因するか否かを確認し
た。この酵素まで上昇させたアンチセラを使用して、塊
茎から抽出した組成蛋白質中のＥ．ｃｏｌｉ ＰＦＫ
活性を特異的に免疫不活性化した。結果を図３に示した
。活性上昇を示す線では、活性の大部分が除去されるが
、ＧＵＳを示す線（１２）では除去できなかった（図３
）。Ｅ．ｃｏｌｉ ＰＦＫまたは活性上昇ＰＦＫ（２
２）を有する対照植物の混合物は、予想したとおりの結
果を示し、免疫不活性化は抑制体に負うものではなかっ
た。次にウエスタンブロットにアンチセラを作用させて
、適正分子量の３６ｋＤ Ｅ．ｃｏｌｉの出現を調べ
た（データは提示せず）。得られた結果は、ジャガイモ
蛋白質（データは提示せず）または分子量５５〜６３ｋ
ＤのトマトＰＦＫの結果とは一致しなかった。最強組織
体の４０倍である上記の酵素活性上昇が解糖流れに影響
を及ぼすかどうか調べるために、Ｗａｒｂｕｒｇ のマ
ノメター（Ｕｍｂｒｅｉｔ ）で呼吸速度を測定した。 塊茎の呼吸速度は、０．５ｍＭグルコースを含むｐＨ５
．２、２０ｍＭホスフェート緩衝液中で２．７ｍｌであ
った。ＣＯ２ は１０％ＫＯＨ に吸収させた。結果を
表２に示した。 【００１５】
表２：塊茎の呼吸 ガス交
換 ｎｍｏｌ ｍｉｎ−１ ｇ−１ｆｒ．ｗｔ．（Ｓ
Ｄ）
ＰＦＫ転換 ＧＵＳ転換
Ｏ２ 摂取 −ａｔ ２ｈｒ ２９．
４ （８．９） ３６．３
（７．２） −ａｔ ５ｈｒ
４９．８ （４．１）
５５．２ （１０．４） ＣＯ２ 排
出 −ａｔ ２ｈｒ ２２．
２ （３．２） ２４．３
（８．６） −ａｔ ５ｈｒ
３３．７ （７．７）
４４．０ （９．０） 【００１６】Ｏ２ 摂取、ＣＯ２ 放出とも変化は認め
られなかった。もしガス交換によって決定された呼吸が
解糖流れを示すならば、ＰＦＫが過剰であっても事態は
変らないはずである。しかし、被験塊茎では、多量の炭
水化合物が解糖を介してではなく、ペントースホスフェ
ート経路を介して、くえん酸を摂り込む可能性がある。 両経路ともグルコース６−ｐを消費する。これが事実な
らば、ＰＦＫを過剰に付加すると、代謝の分配が改変さ
れよう。６１４Ｃ−グルコースと１１４Ｃ−グルコース
からの１４ＣＯ２ の放出速度をチェックした。６Ｃ／
１Ｃの比率から、解糖が呼吸に貢献することが判明した
。ＰＦＫとＧＵＳの転換植物は両者とも１４Ｃ−グルコ
ース接種４０分後で０．４であった。従って、ＰＦＫ活
性が４０倍以上であっても、解糖、ペントースホスフェ
ート経路とも、解糖流れに及ぼす相対貢献度は変らなか
った。 【００１７】これらの結果から見て、ＰＦＫがジャガイ
モ塊茎の解糖時に、炭素の導入を調節しないと思われる
ため、グルコース−６−Ｐ、フルコトース−６−Ｐ、ホ
スホエノールピルヴェート（ＰＥＰ）およびピルヴェー
トの各量を測定した（表１）。活性上昇ＰＦＫはヘキソ
ースホスフェートの量を低下させたが、Ｇｌｅ−６Ｐ／
Ｆｒｕ−６Ｐの比率は変わらず約４であった。これはグ
ルコース−６−ホスフェートイソメラーゼの平衡定数に
近似している（Ｓｃｉｅｎｃｅ，６７，４７−５６，１
９９０）。注目すべきことは、ＰＦＰが大幅に上昇し、
ＰＥＰ／ピルヴェート比率が変化したことである。この
ことからして、ＰＦＫの活性上昇が一定の呼吸流れのも
とで、解糖時に炭素を取り込むことに寄与し、またＰＥ
Ｐを含む酵素（多分ピルヴェートキナーゼとＰＥＰ炭水
化物）が呼吸に強く影響すると示唆される。上記したよ
うに転換したデジリートマト植物を田畑で育成させたあ
と、収穫時のトマト塊茎の量を測定した結果、高ＰＦＫ
表現では異化した。スクロース含量の差はｐ＝０．０５
である。このような解糖の改変は炭水化物代謝の経路（
図１）での代謝貯量を変えることができる。このような
変化はトマト塊茎に限ったものではない。スクロース媒
体中で植物葉を接種し、ペタチンプロモーターの作用で
葉組織を表現させてもよい（ＥＭＢＯＪ． ８，２３−
２９，１９８９）。キメラＰＦＫ遺伝子（ＰＦＫ２２）
を含む葉とキメラＧＵＳ遺伝子（ＰＳ２０−１２）を含
む対照植物葉のそれぞれから、円板を切り出し、１％グ
ルコースを含む培地中で昼光下に接種することにより、
ＰＦＫ遺伝子を表現させた。葉組織における中間体の変
化を分析した。 【００１８】 表３：塊茎
中のスクロース含量の変化 Ｐ
ＦＦ活性 スクロース
ｎｍｏ
ｌ ｍｉｎ−１ ｇ−１ｆｒ．ｗｔ． ％ ｗ／
ｗ ＰＦＫ２２
１０１１
０．２１９ ＰＦＫ３６
３７９
０．２９３ ＰＳ２０−２４
１８
０．３４７ ＰＳ２０−６
１８
０．３５８ 塊茎以外の組織では、ＰＦＫ活性の変化に伴って、代謝
中間体に変化が認められる。 【００１９】
表４ Ｐ
ＦＫ２２の中間体量
比率＝─────────────（ＳＤ）
ＰＳ２０−１
２の中間体量 Ｆｒｕ−２，６−Ｐ
２ ＰＥＰ ピルヴェート
２．２３±０．３７
１．１８（±０．３ ） ０．４９
（±０．１ ） 【００２０】実施例２：米組織のＥ．ｃｏｌｉの表現３
５Ｓプロモーターを使用した以外は、図２に示したよう
に、キエラ遺伝子を構成した。この遺伝子で米のプロト
ブラストを転換させ、組織体のＰＥＫ活性を分析した。 対照の活性が１，５００ｎｍｏｌ ｍｉｎ−１ ｇ−１
ｆｒ．ｗｔ．であるのに対し、転換体は、３，０００ｎ
ｍｏｌ ｍｉｎ−１ ｇ−１ｆｒ．ｗｔ．であった。そ
の結果、本発明の遺伝子を米などの単葉植物中で表現で
きることが判明した。ＰＦＫ活性が２倍に上昇したこと
で、Ｆｒｕ−２，６−Ｐ２ の量も随伴的に増加した。
物およびその製造方法に関する。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】解糖
の際に炭素が入り込むのを抑制するための、主要な調節
酵素として、ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）（ＥＣ
２．７．１．１１ ）が広く知られている。特に植物
細胞を解糖すると、その細胞内に、エネルギー産生に必
要な呼吸炭素と、他の代謝経路に必要な中間体を送り込
むことができる。トマトの塊茎には、フルクトース−６
−ホスフェートを接触的にフルクトース−１，６−ビス
ホスフェートに転換させることが可能な４種の形態のＰ
ＦＫ（Ｋｒｕｇｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．，２６７，６９０−７００）およびピロ
ホスフェートフルクトース−６−ホスフェートホスホト
ランスフェラーゼ（ＰＥＰ）（ＥＣ ２．７．１．９０
）が含まれている。ＰＥＰは細胞は細胞ゾルと澱粉体
の双方に存在しているが、ＰＥＰは細胞ゾル内で生起す
ると判明しているに過ぎない。 【０００３】従来、ＰＦＫが単独で解糖の全段階を制御
すると考えられていたが、それは実状とは異なることが
見い出されるに至った。本発明者らは、遺伝子操作によ
って、トマト植物にＰＦＫを付加したところ、ＰＦＫ活
性の大幅上昇にもかかわらず、解糖を終えた段階におい
て実質的な変化は認められず、逆に中間体の貯留径が変
化した。経路に炭素を送り込むこと、あるいは炭素を取
り出すことのどちらの場合でも、解糖の流れは調節可能
であると、上記の結果からいえる。 【０００４】 【課題を解決するたけの手段】本発明によれば、プロモ
ーターとコード化系列とで構成され、かつ解糖経路にお
いて、あるいは澱粉、白糖または還元糖を合成または分
解する経路において、代謝中間体の量を調節できる物質
を含むキメラ遺伝子を使用することにより、植物細胞を
転換せしめる工程と、転換されたその細胞から植物を再
生せしめる工程とからなる遺伝子組み換え植物の製造方
法が提供される。さらに、本発明はキメラ遺伝子を提供
する。本発明の方法に適した中介物質には、中介物質に
よって転換された植物細胞内で表現が可能なキメラ遺伝
子が含まれる。従って、本発明での植物細胞は、その細
胞内でキメラ遺伝子が表現されるように、同遺伝子を保
護するものである。キメラ遺伝子が植物の細胞内で表現
されるように、その遺伝子を保護することで、遺伝子組
み換え植物が得られる。種子や他の植物の珠芽は、遺伝
子組み換え植物から入手でき、キメラ遺伝子によって安
定に転換された植物の生育を促進するのに使用できる。 本発明では、解糖経路において、あるいは澱粉、白糖ま
たはグルコースやフルトースの還元糖の分解の経路にお
いて、植物代謝を改変することができる一方、経路代謝
産物への蓄積を改めることも可能である。本発明に適用
できる経路例が添付図面に示してある。 【０００５】本発明は、特にジャガイモに適している。 トマトの塊茎にＰＦＫ遺伝子を付加的に導入して表現さ
せると、解糖経路の流れが助長される恐れがあると、従
来は考えられていた。さらに、ＰＦＫをトマト植物全体
に導入して表現された場合、その植物が死滅してしまう
と予想したとしても、理不尽ではなかったであろう。意
外なことに、ＰＦＫの導入、表現後であっても、トマト
植物は死滅せず、また解糖代謝経路の流れも助長されな
いことが判明した。ジャガイモ塊茎を低温条件下で貯蔵
すると、通常はＰＦＫ活性の低下を来たす。その結果、
ジャガイモ中の白糖や還元糖が増加すると考えられる。 これらの糖類が集積した場合、ジャガイモの加工上、大
きな問題が生ずる。例えば、ポテトチップやフレンチフ
ライとして知られているチップやクリスプの加工業者側
の問題として、糖類含量が高いため、チップやクリスプ
を油で揚げる際、製品の色合いが過剰のキツネ色を帯び
ることが挙げられる。本発明によるジャガイモ塊茎を低
温貯蔵しても、その植物中のＰＦＫが増量されているの
で、解糖代謝経路の流れが連続的に行われる。つまり、
白糖合成における流量は、従来の貯蔵ポテト塊茎に比較
して小さくなり、貯蔵中の白糖や還元糖類の蓄積が大幅
に減少する。 【０００６】本発明のキメラ遺伝子は、適切なプロモー
ター（ａ）と、そのプロモーターに操作自在に連結され
たコード化系列（ｂ）とで構成され、解糖経路において
、あるいは澱粉白糖または還元糖を合成または分解する
経路における代謝中間体の量を加減できる物質である。 キエラ遺伝子は、従来の方法で形成できる。コード化系
列は、植物細胞内で自在に表現できるように構成されて
いる。プロモーター（ａ）は、植物体内で必要なコード
を表現せしめることができるものでなければならない。 このプロモーターとは、植物の特定の組織内で、および
／または特定の発育段階において、表現を導くことが可
能な物質であって、植物に対して異族体でも同族体でも
よい。具体例としては、花キャベツのモザイクウイルス
プロモーター３５Ｓ、ノパーリンシンターゼまたは
オクトピンシンターゼ プロモーター、パタチン
プロモーター、リブスコの小遺伝子等がある。ポテト、
特にその塊茎内で表現を導くプロモーターとして好適で
あるプロモター（ａ）は構成プロモーター、特異組織プ
ロモーターのいずれでもよい。 【０００７】コード化系列（ｂ）を使用することで、あ
る特異経路の代謝中間体の量を調節する酵素のコード化
が可能である。特異経路には解糖経路が含まれる。解糖
とは、ＡＴＰまたはＮＡＤＨの随伴生産により、グルコ
ースをピルヴェートに換える一連の反応を指すもので、
エムデン−マイエルホーフ−パルナス経路とも呼ばれる
。白糖は、α−１−２ Ｏ−グリコシド結合を介して
結合されたグルコースとフラクトースからなる。従って
、白糖合成の経路には、同結合を形成するのに適した中
間体を生成せしめる酵素工程が組み込まれる。澱粉とは
、可変量の１−６結合グルコースを有し、１−４結合グ
ルコース主体の重合体であり、その合成経路には、重合
体形成用の中間体を生成する工程が必要とされる。コー
ド化系列（ｂ）としては、植物細胞内で表現されるとき
、上述した経路の代謝を増減するものが選ばれる。この
コード系列は、経路酵素または切形の経路酵素等の経路
酵素を活性化改質したものをコード化することができる
。経路酵素を例示すると、ＰＦＫ（ＥＣ ２．７．１．
１１ ）ピルヴェートキナーゼ（ＰＫ）（ＥＣ ２ ．
７．１．４０）、酸インバーターゼ（ＥＣ ３．２．１
．２６ ）、スターチンシターゼ（ＥＣ ２．４．１．
２１ ）、アデニンジホススクホルコースピロホスホリ
ラーゼ（ＥＣ ３．６．１．２１ ）、スクロースシン
ターゼ（ＥＣ ２．４．１．１３ ）、６−ホスホフル
クトキナーゼ（ピロホスフェート）（ＥＣ ２．７．１
．９０ ）、スクロースホスフェートシンターゼ（ＳＰ
Ｓ）（ＥＣ ２．４．１．１４ ）などがある。コード
化系列（ｂ）は、植物遺伝由来のもの、または微生物遺
伝子等の非植物遺伝子由来のもの、あるいはバクテリア
遺伝子由来のものが適用できる。後者の例として、Ｅ．
ｃｏｌｉの遺伝子やＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅの酵母遺伝子が挙げられる。特にＰＦ
Ｋコード系列は、Ｅ．ｃｏｌｉのｐｆｋＡ遺伝子または
Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ のｐｆｋ遺伝子
によって形成される。酸インバーターゼコード系列はＳ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由
来する。 【０００８】キメラ遺伝子によって植物細胞を転換する
場合、ＤＮＡの直接摂取を介し、代表的にはキメラ遺伝
子を含むＤＮＡ断片を介して行うことができる。代替法
として、キメラ遺伝子を有する中介物質を使用してもよ
い。キメラ遺伝子には、前記のごときプロモーター等の
再生制御系列と、転移開始および／または停止系列植物
停止系列や重アデニル化系列が例示できる。中介物質は
広範囲にわたって、キメラ遺伝子を植物細胞ゲノムに移
行し、かつひそのゲノム内に安定に結合させることので
きる物質である。通常、再生調節系列および／またはキ
メラ遺伝子のコード化系列３′端部に、もし存在してい
なければ、停止コドンが中介物質に設けられる。そのた
めに、ＤＮＡ断片は、停止系列と、キメラ遺伝子を植物
細胞内で表現させる系列を備えたものでもよい。増進遺
伝子、あるいは植物の特定部位またはある一定の条件下
における表現レベルを増減できる因子を、ＤＮＡ断片お
よび／または中介物質に設けることもできる。中介物質
、さらに抗生物質抵抗性を有する遺伝子を配することで
、転換された植物細胞に抵抗性を与えれば、抗生物質を
含む適切な媒体中での成長に見合った細胞や組織された
植物本体を選択することができる。 【０００９】転換された植物細胞の選択に当っては、あ
る適切な媒体中での成長を考慮すべきである。このよう
な観点からして、得られる植物組織は、例えば植物細胞
ゲノム内でのプロモーターの存在下、酵素をコード化せ
しめ遺伝子を保護するものでなければならない。その遺
伝子も、植物細胞内で表現自在なものが選ばれる。細胞
内に遺伝子とプロモーターを含む植物は、その遺伝子が
表現可能な状態に、例えば細胞ゲノム内に結合される。 植物細胞を転換せしめる好ましい状態によれば、前記の
ようなキメラ遺伝子を含んでなる中介物質を有するＡｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ が
使用される。この場合に適した中介物質は、下記の条件
を満たした混成プラスミッドである。 １）キメラ遺伝子が植物細胞のゲノムに結合されたとき
、その遺伝子の表現を可能ならしめる調節因子を含むキ
メラ遺伝子であること。 ２）植物ゲノム内に結合されるＤＮＡを識別する少なく
とも１種のＤＮＡ系列を含むこと。 ３）ＤＮＡを植物ゲノムに移行することのできるＤＮＡ
系列を有すること。 一般的見地からいって、植物細胞ゲノム内に結合される
ＤＮＡは、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ境界系列によっ
て識別される。境界系列が単一の場合、右側に配列され
ているのが好ましい。ＤＮＡを植物細胞ゲノムに移行せ
しめるようなＤＮＡ系列とは、プラスミドの毒性領域に
相当する。Ｔｉプラスミド酵素の遺伝子コード、その再
生と移行の制御因子は、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ境
界間に定められる。このプラスミドとは、腫瘍発生遺伝
子を除去した無防備のＴｉプラスミドであるが、その遺
伝子と再生制御因子は、毒性領域のＴｉプラスミドを有
するトランス型の二元性中介物質において、Ｔ−ＤＮＡ
の境界間に設けられる。このような二元性中介物質は、
次の構成を備えるものである。 １）植物細胞のゲノム内に結合されたとき、調節因子の
制御下で表現されるキエラ遺伝子。 ２）植物ゲノム内に結合されるＤＮＡを識別する少なく
とも１つのＤＮＡ系列。 それゆえに、植物細胞を転換せしめるのに使用するＡｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ は
、混成プラスミド中介物質または毒性領域のＴｉプラス
ミドを有するトランス型二元性中介物質を含み、このバ
クテリアで、幹や葉の組織移植片を接種することができ
る。植物原質体で転換する際、酵素をコード化し、かつ
適切な再生、移行制御因子を含むＤＮＡ断片を直接導入
するか、あるいはそのＤＮＡ断片を含む中介物質を使用
することができる。直接導入法では、電気導体法、ポリ
エチレングリコール、顕微鏡注射法または粒子衝撃投与
法が採用される。 【００１０】本発明によると、被子植物、単葉植物また
は双葉植物の細胞を転換することが可能である。単葉植
物として大麦、小麦、トウモロコシ、米等を例示するこ
とができ、また双葉植物として綿花、レタス、メロン、
エンドウ、ペチュニア、ジャガイモ、アブラナ、大豆、
ランサイ、ヒマワリ、タバコ、トマト等が例示できる。 本発明に適用されるトマト品種は、デジリー、マリスバ
ード、レコードおよびラセットバーバンクである。転換
された植物細胞の組織培養物を繁殖させると、組織的に
分化した植物が得られる。転換された植物細胞の培養に
当っては、好ましくは選択性成長境地を使用し、得られ
た組織体から植物を再生させる。その結果、細胞ゲノマ
内にキメマ遺伝子を含み、その遺伝子が細胞内で表現自
在な、遺伝子組み換え植物が得られる。この再生植物の
種子や珠芽を収集し、事後に備える。 【００１１】レコード品種のトマトに関連し、好ましい
製造例を説明する。 植物 レコード苗培養物を、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏ
ｏｇ （ＭＳ）培地を入れたＭａｇｅｎｔａ ＧＡ−７
容器中で２２℃に保持する（１６ｈｒ／８ｈ，明／暗）
。その培養物を３週間毎に結節的に二次培養する。長さ
２〜３インチ（５〜７．５ｃｍ）の試験管苗を、Ｌｅｖ
ｉｎｇｔｏｎｓ Ｆ１ 混合肥料入りの、長さ２．５イ
ンチ（６．４ｃｍ）のポットに移し、１８℃の生長室内
で繁殖させる（１６ｈｒ／８ｈｒ明／暗）。第３週目に
植物を、長さ５インチ（１２．７ｃｍ）のポットに移し
替える。５〜７週後の植物を転換させる。 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
例えばＬＢＡ４４０４やＣ５８−３菌株の液状の一
昼夜培養物を、２８℃でＬ−肉汁０．８のＯＤ６００ま
で生長させる。 共培養 最も若く、最も広い葉４枚を摘み取り、１０％Ｄｏ
ｍｅｓｔｏｓ（市販品漂白剤）で１５分間殺菌する。葉
を殺菌水で完全に洗浄し、７ｍｍコルクせん孔器で円板
に切り出す。 円板にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ を１〜５分間混合
し、濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎ０．１）で吸水して乾燥
したあと９０ｍｍの三重に通気したペトリ皿中で表皮を
下にして組織化培地上に載置する。ペトリ皿をテープで
密封し、ガス交換のために切断したあと、２２℃で培養
する（１６ｈｒ／８ｈｒ明／暗）。 ４８時間後、ペトリ皿をクラホラン５００μｇｍｌ−１
とカナマイシン３０μｇｍｌ−１の組織化培地に移行す
る。ここでバクテリアを取り除くとともに、転換された
細胞を選択する。 転換苗の再生 １週間経過後、上記と同様の抗生物質を含む発苗培地に
ペトリ皿を移す。切採が可能になるまで、同一培地によ
る移行を繰り返す（通常は約４週間）。十分に通気した
、例えばＭａｇｅｎｔａ 容器中で苗をセホタクシミの
ＭＳ培地に移し、ＭＳ培地上でセホタクシミを数回通す
ことで、バクテリアを除去する。この操作は、試験管中
で株植物と同様に成熟させることができる。転換された
レコード植物の収率は、共培養葉円板の場合で、度数当
り３０％である。 Ｌ−肉汁 １０ｇ ｌ−１ バコトリプトン５ｇ ｌ−
１ 酵母エキス ５ｇ ｌ−１ 塩化ナトリウム１ｇ ｌ−１
グルコース 組織化培地 ＭＳ ３％ス
クロース含０．５ｍｇ １−１ ２，４−Ｄ ２．５ｍｇ １−１ ＢＡＰ 発苗培地 ＭＳ ３
％スクロース含２．５ｍｇ １−１ ＢＡＰ １．０ｍｇ １−１ ＧＡ３ 【００１２】 【実施例】実施例に基づいて、本発明を詳しく説明する
。 実施例１：トマト塊茎中のＰＦＫの産生キメラＰＦＫ遺
伝子の産生により、ＰＦＫを特異表現させる手順を図２
に示した。Ｈ．Ｍ．Ｈｅｌｌｉｎｇａらの方法により、
ｐｆｋＡ遺伝子のクロンからＰＦＫコード化系列を得た
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １４９，３６３−
３７３，１９８５）。そのコード化系列を単離したとこ
ろ、移行開始位置の前段階では２０ｂｐのみが残った。 つまり、プラスミドｐＨＥ１０１２ 上のＥ．ｃｏｌｉ
ｐｆｋＡ遺伝子が５′端部で、移行開始位置から２
０ｂｐに削減され、３′端部では５０ｂｐに削減された
。このコード化系列を鈍化し、ＧＵＳ（β−グルクロニ
ターゼ）に代えてプラスミドｐＦＷ４１０１ に結紮し
、プラスミドｐＦＷ４０２３ を得た。ｐＦＷ４１０１
を、ＰＳ３とＰＳ２７の２種の遺伝子クロンで形成し
たペタチン プロモーターに組み込み、Ｍｉｇｎｅｒ
ｙ らの方法により、ペタチン断片ＰＳ３とＰＳ２７を
誘導した（Ｇｅｎｅ，６２，２７−４４，１９８８）。 得られた断片の組成は、再生開始に対して、ＰＳ３
−３．５ｋｂ〜−１ｋｂおよびＰＳ２７ −１ｋｂ〜
＋３ｋｂであった。ｐＦＷ４０２３ を保護したＥ．ｃ
ｏｌｉ，ｐＦＷ４１０１を保護したＥ．ｃｏｌｉはそれ
ぞれ１９９０年７月５日付で、受理番号ＮＣＩＭＢ ４
０３０５，ＮＣＩＭＢ ４０３０６ のもとに、ＮＣＩ
ＭＢ 機関に寄託された。中介物質ｐＦＷ４１０１ と
ｐＦＷ４０２３ を別個に、三代配偶法によって、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ の菌
株ＬＢＡ４４０４ に移行した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ 菌株をデジリー呂種のトマトの転換に使用した
。一族６０種以上の遺伝子組み換え植物を産した。これ
らの植物は１〜８のＥ．ｃｏｌｉ ｐｆｋＡ遺伝子を
含むものであった。その中のいくつかは、ＰＦＫ活性の
相当に高い塊茎を生み出した。ＰＦＫ活性の測定はＫｒ
ｕｇｅｒらの方法に準じた（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｂｉｏｐｈｙ．， ２６７，６９０−７００，１９８
９）。中間体を氷冷過塩素酸塩で抽出したあと、酵素測
定を行った。結果を表１に示した。 【００１３】 表１：
ＰＦＫ活性と解糖中間体量 ＰＦＫ
転換 ＧＵＳ転換 ｔ値
ｐ 平均
（ＳＤ） 平均（ＳＤ） ＰＦＫ活性
１） ６２５ （２０６）
２９ （１２） ４．０７ ＞９
９ Ｇｌｃ−６ｐ２） ７８
（８．９） １００ （２１）
１．９７ ＞９５ Ｆｒｕ−６ｐ２）
２１ （４．２） ２９
（ ９） １．７７ ＞９０
比率 ３．７ （
０．５６） ３．７ （０．６６） ０
．０９ Ｎ．Ｓ． ＰＥＰ２）
８２ （２０．４） ２
８ （８．０） ３．５４ ＞９９
Ｐｙｒ２） ４４
（２２．６） ３７ （１６）
０．８０ Ｎ．Ｓ． 比率
２．５ （１．３）
１．０ （０．６） ２．２０ ＞９５
１）ｎｍｏｌ ｍｉｎ−１ｇ ｆｒ ｗｔ −１２）ｎ
ｍｏｌ ｇ ｆｒ ｗｔ−１ 【００１４】活性の異なる２種の植物から得た抽出体の
混合物を評価分析した結果、活性体と抑制体を含むこと
が判った（データは呈示せず）。反復試験により、ＰＦ
Ｋの活性上昇がＥ．ｃｏｌｉに起因するか否かを確認し
た。この酵素まで上昇させたアンチセラを使用して、塊
茎から抽出した組成蛋白質中のＥ．ｃｏｌｉ ＰＦＫ
活性を特異的に免疫不活性化した。結果を図３に示した
。活性上昇を示す線では、活性の大部分が除去されるが
、ＧＵＳを示す線（１２）では除去できなかった（図３
）。Ｅ．ｃｏｌｉ ＰＦＫまたは活性上昇ＰＦＫ（２
２）を有する対照植物の混合物は、予想したとおりの結
果を示し、免疫不活性化は抑制体に負うものではなかっ
た。次にウエスタンブロットにアンチセラを作用させて
、適正分子量の３６ｋＤ Ｅ．ｃｏｌｉの出現を調べ
た（データは提示せず）。得られた結果は、ジャガイモ
蛋白質（データは提示せず）または分子量５５〜６３ｋ
ＤのトマトＰＦＫの結果とは一致しなかった。最強組織
体の４０倍である上記の酵素活性上昇が解糖流れに影響
を及ぼすかどうか調べるために、Ｗａｒｂｕｒｇ のマ
ノメター（Ｕｍｂｒｅｉｔ ）で呼吸速度を測定した。 塊茎の呼吸速度は、０．５ｍＭグルコースを含むｐＨ５
．２、２０ｍＭホスフェート緩衝液中で２．７ｍｌであ
った。ＣＯ２ は１０％ＫＯＨ に吸収させた。結果を
表２に示した。 【００１５】
表２：塊茎の呼吸 ガス交
換 ｎｍｏｌ ｍｉｎ−１ ｇ−１ｆｒ．ｗｔ．（Ｓ
Ｄ）
ＰＦＫ転換 ＧＵＳ転換
Ｏ２ 摂取 −ａｔ ２ｈｒ ２９．
４ （８．９） ３６．３
（７．２） −ａｔ ５ｈｒ
４９．８ （４．１）
５５．２ （１０．４） ＣＯ２ 排
出 −ａｔ ２ｈｒ ２２．
２ （３．２） ２４．３
（８．６） −ａｔ ５ｈｒ
３３．７ （７．７）
４４．０ （９．０） 【００１６】Ｏ２ 摂取、ＣＯ２ 放出とも変化は認め
られなかった。もしガス交換によって決定された呼吸が
解糖流れを示すならば、ＰＦＫが過剰であっても事態は
変らないはずである。しかし、被験塊茎では、多量の炭
水化合物が解糖を介してではなく、ペントースホスフェ
ート経路を介して、くえん酸を摂り込む可能性がある。 両経路ともグルコース６−ｐを消費する。これが事実な
らば、ＰＦＫを過剰に付加すると、代謝の分配が改変さ
れよう。６１４Ｃ−グルコースと１１４Ｃ−グルコース
からの１４ＣＯ２ の放出速度をチェックした。６Ｃ／
１Ｃの比率から、解糖が呼吸に貢献することが判明した
。ＰＦＫとＧＵＳの転換植物は両者とも１４Ｃ−グルコ
ース接種４０分後で０．４であった。従って、ＰＦＫ活
性が４０倍以上であっても、解糖、ペントースホスフェ
ート経路とも、解糖流れに及ぼす相対貢献度は変らなか
った。 【００１７】これらの結果から見て、ＰＦＫがジャガイ
モ塊茎の解糖時に、炭素の導入を調節しないと思われる
ため、グルコース−６−Ｐ、フルコトース−６−Ｐ、ホ
スホエノールピルヴェート（ＰＥＰ）およびピルヴェー
トの各量を測定した（表１）。活性上昇ＰＦＫはヘキソ
ースホスフェートの量を低下させたが、Ｇｌｅ−６Ｐ／
Ｆｒｕ−６Ｐの比率は変わらず約４であった。これはグ
ルコース−６−ホスフェートイソメラーゼの平衡定数に
近似している（Ｓｃｉｅｎｃｅ，６７，４７−５６，１
９９０）。注目すべきことは、ＰＦＰが大幅に上昇し、
ＰＥＰ／ピルヴェート比率が変化したことである。この
ことからして、ＰＦＫの活性上昇が一定の呼吸流れのも
とで、解糖時に炭素を取り込むことに寄与し、またＰＥ
Ｐを含む酵素（多分ピルヴェートキナーゼとＰＥＰ炭水
化物）が呼吸に強く影響すると示唆される。上記したよ
うに転換したデジリートマト植物を田畑で育成させたあ
と、収穫時のトマト塊茎の量を測定した結果、高ＰＦＫ
表現では異化した。スクロース含量の差はｐ＝０．０５
である。このような解糖の改変は炭水化物代謝の経路（
図１）での代謝貯量を変えることができる。このような
変化はトマト塊茎に限ったものではない。スクロース媒
体中で植物葉を接種し、ペタチンプロモーターの作用で
葉組織を表現させてもよい（ＥＭＢＯＪ． ８，２３−
２９，１９８９）。キメラＰＦＫ遺伝子（ＰＦＫ２２）
を含む葉とキメラＧＵＳ遺伝子（ＰＳ２０−１２）を含
む対照植物葉のそれぞれから、円板を切り出し、１％グ
ルコースを含む培地中で昼光下に接種することにより、
ＰＦＫ遺伝子を表現させた。葉組織における中間体の変
化を分析した。 【００１８】 表３：塊茎
中のスクロース含量の変化 Ｐ
ＦＦ活性 スクロース
ｎｍｏ
ｌ ｍｉｎ−１ ｇ−１ｆｒ．ｗｔ． ％ ｗ／
ｗ ＰＦＫ２２
１０１１
０．２１９ ＰＦＫ３６
３７９
０．２９３ ＰＳ２０−２４
１８
０．３４７ ＰＳ２０−６
１８
０．３５８ 塊茎以外の組織では、ＰＦＫ活性の変化に伴って、代謝
中間体に変化が認められる。 【００１９】
表４ Ｐ
ＦＫ２２の中間体量
比率＝─────────────（ＳＤ）
ＰＳ２０−１
２の中間体量 Ｆｒｕ−２，６−Ｐ
２ ＰＥＰ ピルヴェート
２．２３±０．３７
１．１８（±０．３ ） ０．４９
（±０．１ ） 【００２０】実施例２：米組織のＥ．ｃｏｌｉの表現３
５Ｓプロモーターを使用した以外は、図２に示したよう
に、キエラ遺伝子を構成した。この遺伝子で米のプロト
ブラストを転換させ、組織体のＰＥＫ活性を分析した。 対照の活性が１，５００ｎｍｏｌ ｍｉｎ−１ ｇ−１
ｆｒ．ｗｔ．であるのに対し、転換体は、３，０００ｎ
ｍｏｌ ｍｉｎ−１ ｇ−１ｆｒ．ｗｔ．であった。そ
の結果、本発明の遺伝子を米などの単葉植物中で表現で
きることが判明した。ＰＦＫ活性が２倍に上昇したこと
で、Ｆｒｕ−２，６−Ｐ２ の量も随伴的に増加した。
【図１】ジャガイモなどの貯蔵植物の炭水化物代謝を示
す該略図であって、破線は経路を示す。
す該略図であって、破線は経路を示す。
【図２】キメラＰＦＫ遺伝子を産生する工程を概略的に
示す図である。
示す図である。
【図３】Ｅ．ｃｏｌｉ ＰＦＫ活性の免疫検出をグラ
フで示す図である。
フで示す図である。
Claims (16)
- 【請求項１】 プロモーターとコード化系列とで構成
され、かつ解糖経路において、あるいは澱粉、白糖また
は還元糖を合成または分解する経路において代謝中間体
の量を調節できる物質を含むキメラ遺伝子を使用するこ
とにより、植物細胞を転換せしめる工程と、転換された
その細胞から植物を再生せしめる工程とからなる遺伝子
組み換え植物の製造方法。 - 【請求項２】 該コード化系列が、ホスホフルクトキ
ナーゼ、ピルヴェートキナーゼ、酸インバーターゼ、ス
ターチシンターゼ、アデニンジホスホグルコーゼピロホ
スポリラーゼ、スクロースシンターゼ、６−ホスホフル
クトキナーゼまたはスクロースホスフェートシンセター
ゼから選ばれた酵素をコード化する請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】 該コード化系列が微生物遺伝子に由来
する請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 該コード化系列がバクテリア遺伝子に
由来する請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項５】 該コード化系列がホスホフルクトキナ
ーゼをコード化する請求項１，３，４のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項６】 該コード化系列が２種またはそれ以上
の酵素をコード化する請求項１，３，７のいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項７】 該植物細胞が、大麦、小麦、タマネギ
または米から選ばれた単子葉細胞あるいは綿花、レタス
、メロン、エンドウ、ペチュニア、ジャガイモ、アブラ
ナ、大豆、サトウダイコン、ヒマワリ、トマトまたはタ
バコから選ばれた双子葉細胞である請求項１から６のい
ずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 トマトが、デジリー、マリスバード、
レコードまたはラセットバーバンク種から選ばれたトマ
トである請求項５に記載の方法。 - 【請求項９】 請求項１から６のいずれか１項に記載
のキメラ遺伝子。 - 【請求項１０】 請求項９に記載のキメラ遺伝子から
なり、その遺伝子が転換時に植物細胞内で表現される中
介物質。 - 【請求項１１】 該中介物質がプラスミドである請求
項１０に記載の中介物質。 - 【請求項１２】 請求項９に記載のキメラ遺伝子を、
表現可能な状態に保護する植物細胞。 - 【請求項１３】 請求項９に記載のキメラ遺伝子を、
表現可能な状態に細胞内に保護する遺伝子組み換え植物
。 - 【請求項１４】 該植物がトマトである請求項１３に
記載の植物。 - 【請求項１５】 請求項１３または１４に記載の植物
から得られる種子。 - 【請求項１６】 請求項１４に記載のトマトから得ら
れる塊茎。
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