JPH04346936A - コラーゲン代謝賦活剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はコラゲナーゼ産生促進物
質とコラーゲン合成促進物質を含有することを特徴とす
るコラーゲン代謝賦活剤に係り、更に詳しくは、コラー
ゲンの分解を亢進させるとともに、コラーゲンの合成を
刺激することによって、コラーゲンの代謝回転を高める
ことの出来るコラーゲン代謝賦活剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】通常の蛋白質の代謝回転に比べ、コラー
ゲンの代謝回転は非常に遅く、生理的条件に於いても、
老化に伴ってコラーゲンの代謝回転がさらに低下してゆ
くことが知られている。コラーゲンの代謝回転はコラー
ゲンの分解速度と合成速度により決まるが、この様な老
化に伴う代謝回転の低下はコラーゲンの架橋構造（老化
架橋）の増加につながり、例えば、皮膚の硬化やしわの
形成に関わっている。難分解・難抽出性の固いコラーゲ
ンが増加することにより、細胞の足場として増殖・分化
・移動に関与するコラーゲンの機能が損なわれ、細胞活
性の低下を来し、さらにコラーゲンの代謝回転が低下す
るという悪循環に陥ると考えられている（現代化学、１
２月号、３６頁、１９９０年参照）。

【０００３】この様な老化に伴うコラーゲン代謝回転の
低下を食い止めるためには、コラーゲン分解の律速酵素
であるコラゲナーゼを増強する方法が考えられる。即ち
、コラーゲンの分解を促すことにより老化架橋の形成を
阻止し、かつコラーゲン分解の結果として合成の刺激を
促す方法である。

【０００４】コラゲナーゼは、結合組織中の間質型コラ
ーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型コラーゲン）を
分解する際の律速酵素であり、コラーゲンの代謝に重要
な役割を果たしている。コラゲナーゼは、前駆体である
プロコラゲナーゼとして細胞より分泌され、生体内では
その後プラスミンやストロムライシン等のタンパク分解
酵素によってコラゲナーゼに活性化される（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ、１６６　巻、２１頁、
１９７７年および　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔ
ｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅＵ．Ｓ．Ａ．、８６巻、２
６３２頁、１９８９年参照）と考えられているが、プロ
コラゲナーゼは一般的に得ることが困難で、充分に研究
が進んでいるとは言えず、その産生制御や活性化機構等
まだ未知の点が多い。

【０００５】プロコラゲナーゼの産生を促進する物質に
ついては、既に本発明者らにより、例えば、エタノール
アミン誘導体（特願平２−９７０７１、特願平２−１２
７３９０および特願平２−２１２９３１）、セリン誘導
体（特願平２−９９５７９および特願平２−１８６７６
３）、絹部分水解物（特願平３−５９７５２）などの低
分子物質が見出されている。

【０００６】一方、コラーゲン，特に結合組織内で主た
るコラーゲンであるＩ型コラーゲンの合成あるいは分泌
の亢進は、線維芽細胞を用いた実験により、ＴＧＦ−β
、アスコルビン酸およびその誘導体、エストロジェン、
テストステロンおよびインシュリンなどで達成できるこ
とが知られている（細胞外マトリクスのバイオサイエン
スとバイオテクノロジー、１６５　頁、株式会社アイピ
ーシー、１９９０年参照）。

【０００７】ところで、例えばＴＧＦ−βやエストロジ
ェンの場合は、コラーゲンの合成を促進し、しかもコラ
ゲナーゼの分泌を抑制する為、コラーゲンの代謝賦活と
いうよりはむしろコラーゲンの蓄積を促進する物質であ
る。また、インターロイキン−１は、コラゲナーゼの分
泌を促進すると同時に、コラーゲンの合成を抑制する為
、この場合、コラーゲンの代謝賦活というよりはむしろ
コラーゲンの一方的な減少を促すと考えられる。また、
グルココルチコイドやレチノイン酸は、コラーゲンとコ
ラゲナーゼの分泌をともに抑制する物質である（細胞マ
トリクスのバイオサイエンスとバイオテクノロジー，１
６５頁，株式会社アイピーシー，１９９０年参照）。

【０００８】つまり、これまでは、コラーゲンの合成又
は分解の一方のみを促す物質，コラーゲンの合成を促進
しかつ分解をも抑制する物質，逆にコラーゲンの分解を
促進しかつ合成をも抑制する物質，あるいはコラーゲン
とコラゲナーゼを同時に抑制する物質（コラーゲン代謝
を抑制するもの）はあったが、本発明の如く、コラーゲ
ンの合成と分解と言う相反する作用を同時に促し、より
積極的にコラーゲンの代謝を促進しようという試みは、
全くされていなかった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、かかる
事情に鑑み鋭意研究を行った結果、驚くべきことに、プ
ロコラゲナーゼの産生を促進する物質とコラーゲンの合
成を促進する物質が、互いの作用を妨げることなく働く
事を見いだし本発明を完成したものであって、その目的
とするところは、プロコラゲナーゼの産生を促進し、コ
ラーゲンの分解を促すことにより、老化架橋の形成を阻
止し、コラーゲンの代謝回転を高めるコラーゲン代謝賦
活剤を提供するにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上述の目的は、コラゲナ
ーゼ産生促進物質とコラーゲン合成促進物質を含有する
ことを特徴とするコラーゲン代謝賦活剤，又は、分子量
が５００以下の絹繊維の硫酸加水分解物とアスコルビン
酸あるいはその誘導体を含有することを特徴とするコラ
ーゲン代謝賦活剤により達成される。

【００１１】本発明に用いられるコラゲナーゼ産生促進
物質としては、プロコラゲナーゼ産生促進物質として一
般に知られているもの，例えば、絹部分水解物などを用
いることができ、中でも、分子量が５００以下の絹繊維
の硫酸加水分解物等の低分子物質が特に好ましいものと
して挙げられる。

【００１２】絹部分水解物、特に、可溶化した水溶性絹
ペプチドは皮膚化粧料等に用いられる公知物質であり、
例えばその製造法として特公昭５８−１７７６３号公報
（分子量分布；１５００〜５００００）、特公昭５９−
３１５２０号公報（平均重合度；２〜２０）、特公昭６
０−４１０４３号公報（分子量分布；２００〜４００）
等が知られている。

【００１３】絹繊維の硫酸加水分解物としては、精練絹
繊維に４０〜６０容量％硫酸を直接添加し、６０℃で１
〜４８時間処理する（特公昭６０−４１０４３号公報）
か、或いは絹繊維を塩化カルシウム等により予め可溶化
フィブロイン溶液とした後、硫酸を添加（特公昭５９−
３１５２０号公報）することにより得た加水分解物等が
使用でき、プロコラゲナーゼの産生促進活性をもつのは
、分子量５００以下の低分子物質である。

【００１４】本発明に用いられるコラーゲン合成促進物
質としては、前記した様なコラーゲン合成促進物質とし
て一般に知られているものを用いることがきるが、老化
予防化粧品として皮膚に適用するときは、皮膚線維芽細
胞の存在する真皮層（結合組織）への作用が大きいので
、アスコルビン酸およびその誘導体，エストロジェン，
テストステロンなどの様な低分子物質が望ましい。

【００１５】アスコルビン酸およびその誘導体としては
、アスコルビン酸とその塩、アスコルビン酸りん酸エス
テルおよび硫酸エステルとその塩、ステアリン酸エステ
ル、ジパルミチン酸エステルおよびモノパルミチン酸エ
ステルなどを用いることができる。

【００１６】本発明のコラーゲン代謝賦活剤を、その使
用目的に応じて、通常用いられる公知の成分に配合する
ことによって、液剤，固形剤，半固形剤等の各種剤形に
調製することが可能で、好ましい組成物として軟膏、ゲ
ル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション等が挙
げられる。

【００１７】その例として、本発明のコラーゲン代謝賦
活剤を、ワセリン等の炭化水素、ステアリルアルコール
等の高級アルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高
級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリン等の動物性油
脂、グリセリン等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸
エステル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール等
の界面活性剤、無機塩、蝋、樹脂、水および要すればパ
ラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等
の防腐剤に混合することによって、化粧品や医薬品を製
造することができる。

【００１８】その際のコラーゲン代謝賦活剤の添加量は
剤形により異なるが、プロコラゲナーゼ産生促進物質で
ある絹繊維の硫酸加水分解物を用いる場合は、絹繊維と
して０．　５〜４重量％含むコラーゲン代謝賦活剤を、
適用する組成物全量を基準として通常０．　１〜１０重
量％、好ましくは１〜５重量％添加することが望ましい
。

【００１９】同時に用いるコラーゲン合成・分泌促進物
質としては、アスコルビン酸およびその誘導体の場合は
、適用する組成物全量を基準として通常０．　０１〜１
０重量％、好ましくは０．　１〜３重量％含有すること
が望ましい。

【００２０】

【発明の効果】本発明のコラーゲン代謝賦活剤をヒト皮
膚線維芽細胞の培養系に添加すると、プロコラゲナーゼ
の産生が促進されると共に、同時にコラーゲン産生量を
増加させることができる（後記試験例参照）。従って、
本発明のコラーゲン代謝賦活剤は、線維芽細胞に作用し
、コラゲナーゼ活性を増強することにより低下したコラ
ーゲンの分解を促すとともに、コラーゲンの合成・分泌
を亢進して、コラーゲンの代謝回転を高めることができ
る。

【００２１】

【実施例】実施例１〜３ 絹晒ノイル１０ｇを４０容量％硫酸５０ｍｌに浸積し、
６０℃で１２時間加熱した後、２００ｍｌの冷水を加え
１夜室温で放置した。次いで、１０Ｎ水酸化ナトリウム
溶液を徐々に加えて中和した後、濾過して上清液３３０
ｍｌ（３重量％相当のフィブロインを含む）の絹部分水
解物溶液を得た。本水解物溶液に、Ｌ−アスコルビン酸
りん酸エステルマグネシウム塩水和物（和光純薬工業株
式会社製、２０〜２９重量％の水分を含む）を加え、そ
れぞれ終濃度１．２，２．０および４．０ｍｇ／ｍｌと
した３種のコラーゲン代謝賦活剤を得た（実施例１〜３
）。

【００２２】（試験例）正常ヒト線維芽細胞株〔白人女
性の皮膚より採取されたＤｅｔｒｏｉｔ−５５１　（Ａ
ＴＣＣ　ＣＣＬ　１１０）〕を１０容量％ウシ胎仔血清
（以下ＦＢＳと略記）を含むＭＥＭ培地にて１ｘ１０５
　個／ｍｌに調整し、２枚の２４穴プレートにそれぞれ
０．　４ｍｌずつ播種（４ｘ１０４　個／穴）して、５
％炭酸ガス、飽和水蒸気下、３７℃で培養した。

【００２３】尚、ＭＥＭ培地は、大日本製薬社製最少必
須培地１０−１０１に、それぞれ終濃度０．　１重量％
ラクトアルブミン酵素水解物（シグマ社製）、１容量％
非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（以上い
ずれも大日本製薬社製）、０．１２重量％炭酸水素ナト
リウムおよび５０ｍｇ／ｌストレプトマイシンを添加し
て調製した。

【００２４】２４時間後培養液を吸引除去し、終濃度０
．　６容量％ＦＢＳを添加したＭＥＭで細胞を２回洗浄
した後、ポアーサイズが０．　２μｍのニトロセルロー
ス膜（アドバンテック東洋製、ＤＩＳＭＩＣ−２５　）
で濾過滅菌した実施例１〜３の３種のコラーゲン代謝賦
活剤を終濃度２．５容量％添加した同培地に交換した。

【００２５】なお、比較例として培地のみの群（比較例
１）および絹部分水解物のみ終濃度２．５容量％含む培
地群（比較例２）を設け（全てｎ＝４／プレート）、同
プレートを２枚作製して、１枚をコラーゲン産生量の測
定に、残りの１枚をプロコラゲナーゼ産生量の測定に用
いた。

【００２６】２日間同様に培養後、１枚のプレートより
培養上清を得、プロコラゲナーゼ産生量の測定に用いた
。他の１枚には、β−アミノプロピオニトリルを終濃度
５０μｇ／ｍｌ、トリチウム−Ｌ−プロリンを最終１μ
Ｃｉ／ｍｌ添加して、さらに２４時間培養した。

【００２７】本発明に於いて用いられる、絹繊維の硫酸
加水分解物のプロコラゲナーゼ産生促進活性を調べるの
に先立って、培養上清中にプロコラゲナーゼと同時に産
生されている、コラゲナーゼインヒビター（蛋白質）の
除去を行う。

【００２８】コラゲナーゼインヒビターの除去：　　得
られた培養上清２５０μｌに１０ｍＭトリス塩酸緩衝液
〔４℃でｐＨ７．８に調整、１ｍＭ塩化カルシウム、０
．０５容量％Ｂｒｉｊ−３５（ＩＣＩ社製ポリオキシエ
チレン（２３）ラウリルエーテル）を含む〕を１．７５
ｍｌ加え、同緩衝液で平衡化した　ＣＭ−セファロース
ＣＬ−６Ｂ　ＴＭ（ファルマシア社製、ベッド容量０．
５ｍｌ）に供した。

【００２９】次に、１２５ｍＭ食塩を含む同緩衝液０．
５ｍｌにてインヒビターを除去（計４回、総量２ｍｌ）
し、５００ｍＭ食塩を含む同緩衝液０．５ｍｌにてプロ
コラゲナーゼを回収（計４回、総量２ｍｌ）した。

【００３０】プロコラゲナーゼ産生量の定量：　　本実
験で用いた細胞では、産生されるコラゲナーゼはそのま
までは活性をもたないプロコラゲナーゼとして回収され
るので、プロコラゲナーゼ産生量は、トリプシンで活性
化して得られるコラゲナーゼ活性として定量した。トリ
プシンによる活性化法、およびフルオレッセインイソチ
オシアネートで標識されたＩ型コラーゲン（コスモバイ
オ社製）を基質としたコラゲナーゼ活性の測定法は、永
井らの方法（ＪａｐａｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ、４巻、１２３　頁、１９８４
年参照）に準じた。

【００３１】なお１単位は、３５℃で１分間に１μｇの
Ｉ型コラーゲンを分解する酵素量を示す。

【００３２】コラーゲン産生量の定量：コラーゲンの産
生量はβ−アミノプロピオニトリルを終濃度５０μｇ／
ｍｌ，トリチウム−Ｌ−プロリンを最終１μＣｉ／ｍｌ
添加して、更に２４時間培養した培養液より、ペプシン
に耐性かつ食塩濃度依存的溶解度によって分画されたコ
ラーゲン画分に取り込まれた放射活性で測定した。ペプ
シン処理及び食塩濃度によるコラーゲンの分画法は、Ｗ
ｅｂｓｔｅｒらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　，２２０頁，１９７９年参照）に
準じた。

【００３３】得られた結果を表１に示した。

【表１】 平均値　　±　　ＳＤ（ｎ＝４） ＊培養時の終濃度として表示： 絹水解物；絹部分水解物、重量％Ａｓｃ−Ｐ　；アスコ
ルビン酸りん酸エステルマグネシウム塩（２０〜２９重
量％の水分を含有），μｇ／ｍｌ

【００３４】絹部分水解物（終濃度２．５％）はＡｓｃ
−Ｐ　の存在の有無によらずプロコラゲナーゼの産生量
を増加させ（コラゲナーゼ活性を発現し）、その条件下
で、Ａｓｃ−Ｐは用量依存的にコラーゲン産生を促進す
ることが分かった。

【００３５】この結果、本発明のコラーゲン代謝賦活剤
は、コラーゲン分解を促し、かつコラーゲン合成・分泌
を促進して、コラーゲンの代謝回転を高める作用を有す
る。

【００３６】以下に本発明のコラーゲン代謝賦活剤を応
用した組成物の処方例を示す。

【００３７】処方例１−軟膏実施例３のコラーゲン代謝
賦活剤３ｇと下記親水性成分とを、湯浴で８０℃に加温
して混合し、これを、８０℃に加温した下記の親油性成
分混合物に攪拌しながら徐々に加えた。次に、ホモジナ
イザー（ＴＯＫＵＳＹＵＫＩＫＡ　ＫＯＧＹＯ　製）で
２分半激しく攪拌（２５００ｒｐｍ）　して各成分を充
分乳化分散させた後、攪拌しながら徐々に冷却し、１０
０ｇ中に３重量％のコラーゲン代謝賦活剤を含む軟膏を
得た。

【００３８】 「親水性成分」　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　（ｇ）　　　　パラオキシ安息香酸メチ
ル　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　０．１　　　　プロピレング
リコール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６．７　　　
　精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　４１．１

【００３９】 「親油性成分」 　　　　スクワラン　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　４．７　　　　白色ワセリン　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２４．０　　　
　ステアリルアルコール　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　８．７　　　　ミリスチン酸イソプロピル　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　６．０　　　　モノステアリン酸ポリエチ
レングリコール　　　　（商品名ＮＩＫＫＯＬ　ＭＹＳ
−４５　、日本サーファクタント工業（株）製）　　１
．３　　　　ポリエチレンアルキルエーテルリン酸　　
　　（商品名ＮＩＫＫＯＬ　ＤＤＰ−２、日本サーファ
クタント工業（株）製）　　　　２．３　　　　モノス
テアリン酸グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０　　　
　パラオキシ安息香酸ブチル　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０
．１

【００４０】 処方例２−ローション

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】コラゲナーゼ産生促進物質とコラーゲン合
   成促進物質を含有することを特徴とするコラーゲン代謝
   賦活剤
2. 【請求項２】コラゲナーゼ産生促進物質が、分子量が５
   ００以下の絹繊維の硫酸加水分解物であり、コラーゲン
   合成促進物質がアスコルビン酸あるいはその誘導体であ
   る請求項１記載のコラーゲン代謝賦活剤