JPH043501B2 - - Google Patents
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- JPH043501B2 JPH043501B2 JP58103248A JP10324883A JPH043501B2 JP H043501 B2 JPH043501 B2 JP H043501B2 JP 58103248 A JP58103248 A JP 58103248A JP 10324883 A JP10324883 A JP 10324883A JP H043501 B2 JPH043501 B2 JP H043501B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- electrode
- oxygen
- neutral lipid
- solution
- electrodes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、簡単に血清等に含まれる中性脂質の
濃度を測定することができる固定化酵素を利用し
た中性脂質センサーに関する。 従来、固定化酵素を利用した中性脂質分析に
は、固定化酵素カラムとPH電極を組合せたシステ
ム、固定化酵素膜と酵素電極あるいは過酸化水素
（H2O2）電極とを組合せたシステムが利用されて
いる。前者のシステムは、PH電極を使用してお
り、測定がポテンシヨメトリツクであるために測
定精度が充分でなく、又、カラムを用いるため、
ポンプや検出のためフローセルが必要となり、シ
ステムが大型となる。一方後者のシステムは、被
測定溶媒中に溶け込んでいる酸素分子あるいは過
酸化水素を電解し、その時の電解電流を測定する
ようにしており、アンペロメトリツクな測定であ
るために高い精度で測定を行うことができる。し
かしながら、中性脂質から過酸化水素を生成する
までの反応系が複雑であり、測定の途中で多数の
試薬を溶液中に添加しなければならず、複雑な作
業が要求される。 本発明は、上述した点に鑑みてなされたもの
で、簡単に高い精度で中性脂質を測定することが
できる中性脂質センサーを提供することを目的と
する。 本発明者は、中性脂質がリポプロテインリパー
ゼ（Lipoprotein lipase）を触媒として水
（H2O）と反応し、グリセロール（Glycerol）と
脂肪酸が生成されること、該生成されたグリセロ
ールがグリセロールオキイダーゼ
（Glyceroloxidase）を触媒として酸素分子（O2）
と反応し、グリセルアルデハイド
（Glyceraldehyde）と過酸化水素（H2O2）を生
成すること、及びこの２番目の反応による溶液中
の酸素量の減少あるいは、過酸化水素量の増加を
検出することにより、該中性脂質の量（濃度）を
簡単に測定することができることを見出した。 従つて、本発明に基づく中性脂質センサーは、
第１と第２の電極を有し、その一方の電極近傍に
固定化酵素を配置し、該電極間に流れる電流に基
づいて、被測定溶液中に含まれる中性脂質を測定
するようにしたセンサーにおいて、該固定化酵素
として、リポプロテインリパーゼとグリセロール
オキシダーゼを用いたことを特徴としている。 以下本発明の一実施例を添付図面に基づき詳述
する。 第１図は、本発明に基づく中性脂質センサーと
しての酸素電極を示しており、１はガラス製の内
管、２は同じくガラス製の外管であり、該内管１
の底部には、白金製のカソード（第１電極）３が
設けられ、又、該外管２の底部には、酸素分子を
透過するテフロン（商標名）膜４が取付けられて
いる。該内管１と該外管２との間には、内部液
（30％NaOH）５が入れられ、該内部液中には、
鉛製のアノード（第２電極）６が配置されてい
る。該カソード３、アノード６には夫々白金のリ
ード線１０が取付けられている。該酸素分子透過
性のテフロン（商標名）膜の外側には、中性脂質
が透過できる透析膜７が設けられ、その中にはリ
ポプロテインリパーゼとグリセロールオキシダー
ゼとが混合された固定化酵素８が入れられてい
る。尚、９はＯリングである。 第２図は、上述したセンサーとしての酸素電極
１１を用いた中性脂質測定システムの一例を示し
ている。該酸素電極１１は、30℃に維持された水
槽１２中に配置されているビーカ１３内に挿入さ
れる。該ビーカ１３内の溶液中には、テフロン
（商標名）がコーテイングされた磁性体１４が入
れられており、該ビーカ１３の下部に設けられた
回転磁場発生装置１５による回転磁場により、該
磁性体１４は回転し、その結果、該ビーカ１３中
の溶液は撹拌される。該酸素電極１１の第１と第
２の電極間に流れた電流は、Ａ−Ｖ変換器１６に
よつて電圧信号に変換され、レコーダ１７に供給
される。尚、１８は測定試料をビーカ１３内に注
入するためのマイクロシリンジである。 上述した如き構成において、ビーカ１３内に酸
素電極１１を挿入し、磁性体１４を回転させて該
ビーカ内の溶液の撹拌を行う。該撹拌により、該
ビーカ１３内部の溶液中の酸素濃度はプラトーの
状態となり、その後、マイクロシリンダ１８より
血清が該溶液中に注入される。該血清中に含まれ
る中性脂質は、該酸素電極１１底部に設けられて
いる固定化酵素のリポプロテインリパーゼを触媒
として該溶液中の水と反応する。この反応によ
り、グリセロールと脂肪酸が生成されるが、該生
成されたグリセロールは、固定化酵素の内のグリ
セロールオキシダーゼを触媒として該溶液中の酸
素分子と反応し、グリセルアルデハイドと過酸化
水素を生成する。この結果、酸素電極底部のカソ
ード３周辺の酸素分子の量（濃度）は、該２番目
の反応によつて少くなり、該カソード３とアノー
ド１との間に流れる電流は低くなる。数分の後、
該電流値はプラトーの状態となり、グリセロール
との反応に寄与する酸素の量に比例した該電流値
の変化から、中性脂質の量（濃度）を測定するこ
とができる。 次に実験例を示す。 実験例 １ 人コントロール血清の希釈系列を試料として、
本発明に基づくセンサーの特性を調べた。コント
ロール血清は、栄研化学(株)製リピツドセーラム
を用いた。分析条件は、衝撃液：0.1M、PH8.0リ
ン酸緩衝液（トリトン×100 ４％）、反応温度：
30℃、試料量：50μであつた。各濃度における
応答曲線を第３図に示すが、この図において、縦
軸は検出電流値（μA）、横軸は時間（分）であ
る。第４図は、第３図の測定結果に基づいて得ら
れた電流値差と濃度との関係を示すグラフであ
り、このグラフを用い、未知試料中の中性脂質の
濃度を求めることができる。尚、この試験の同時
再現性は、５回の測定で相対標準偏差値6.6％で
あつた。 試験例 ２ 代表的中性脂質の１つであるトリオレインを試
料として本発明に基づくセンサーの特性を調べ
た。トリオレインは東京化成(株)製のものを使用し
た。分析条件（緩衝液、反応温度、試料量）は、
上述した試験例１と同じであり、この試験の結果
得られた検量線を第５図に示す。尚、この時の同
時再現性は、５回の測定で相対標準偏差値5.7％
であつた。 試験例 ３ 試料としての人血清を本発明に基づくセンサー
と従来法によつて分析し、比較した。分析条件
（緩衝液、反応温度、試料量）は、上記試験例１
と同じであり、検量線は、試験例１で得られたも
のを使用した。この分析結果を表１に示すが、表
の単位は、mg／dlである。尚、従来法とは、自動
化学分析装置を用い、試料と酵素試薬とを混合し
て反応させ、反応溶液を比色測定したものであ
る。
濃度を測定することができる固定化酵素を利用し
た中性脂質センサーに関する。 従来、固定化酵素を利用した中性脂質分析に
は、固定化酵素カラムとPH電極を組合せたシステ
ム、固定化酵素膜と酵素電極あるいは過酸化水素
（H2O2）電極とを組合せたシステムが利用されて
いる。前者のシステムは、PH電極を使用してお
り、測定がポテンシヨメトリツクであるために測
定精度が充分でなく、又、カラムを用いるため、
ポンプや検出のためフローセルが必要となり、シ
ステムが大型となる。一方後者のシステムは、被
測定溶媒中に溶け込んでいる酸素分子あるいは過
酸化水素を電解し、その時の電解電流を測定する
ようにしており、アンペロメトリツクな測定であ
るために高い精度で測定を行うことができる。し
かしながら、中性脂質から過酸化水素を生成する
までの反応系が複雑であり、測定の途中で多数の
試薬を溶液中に添加しなければならず、複雑な作
業が要求される。 本発明は、上述した点に鑑みてなされたもの
で、簡単に高い精度で中性脂質を測定することが
できる中性脂質センサーを提供することを目的と
する。 本発明者は、中性脂質がリポプロテインリパー
ゼ（Lipoprotein lipase）を触媒として水
（H2O）と反応し、グリセロール（Glycerol）と
脂肪酸が生成されること、該生成されたグリセロ
ールがグリセロールオキイダーゼ
（Glyceroloxidase）を触媒として酸素分子（O2）
と反応し、グリセルアルデハイド
（Glyceraldehyde）と過酸化水素（H2O2）を生
成すること、及びこの２番目の反応による溶液中
の酸素量の減少あるいは、過酸化水素量の増加を
検出することにより、該中性脂質の量（濃度）を
簡単に測定することができることを見出した。 従つて、本発明に基づく中性脂質センサーは、
第１と第２の電極を有し、その一方の電極近傍に
固定化酵素を配置し、該電極間に流れる電流に基
づいて、被測定溶液中に含まれる中性脂質を測定
するようにしたセンサーにおいて、該固定化酵素
として、リポプロテインリパーゼとグリセロール
オキシダーゼを用いたことを特徴としている。 以下本発明の一実施例を添付図面に基づき詳述
する。 第１図は、本発明に基づく中性脂質センサーと
しての酸素電極を示しており、１はガラス製の内
管、２は同じくガラス製の外管であり、該内管１
の底部には、白金製のカソード（第１電極）３が
設けられ、又、該外管２の底部には、酸素分子を
透過するテフロン（商標名）膜４が取付けられて
いる。該内管１と該外管２との間には、内部液
（30％NaOH）５が入れられ、該内部液中には、
鉛製のアノード（第２電極）６が配置されてい
る。該カソード３、アノード６には夫々白金のリ
ード線１０が取付けられている。該酸素分子透過
性のテフロン（商標名）膜の外側には、中性脂質
が透過できる透析膜７が設けられ、その中にはリ
ポプロテインリパーゼとグリセロールオキシダー
ゼとが混合された固定化酵素８が入れられてい
る。尚、９はＯリングである。 第２図は、上述したセンサーとしての酸素電極
１１を用いた中性脂質測定システムの一例を示し
ている。該酸素電極１１は、30℃に維持された水
槽１２中に配置されているビーカ１３内に挿入さ
れる。該ビーカ１３内の溶液中には、テフロン
（商標名）がコーテイングされた磁性体１４が入
れられており、該ビーカ１３の下部に設けられた
回転磁場発生装置１５による回転磁場により、該
磁性体１４は回転し、その結果、該ビーカ１３中
の溶液は撹拌される。該酸素電極１１の第１と第
２の電極間に流れた電流は、Ａ−Ｖ変換器１６に
よつて電圧信号に変換され、レコーダ１７に供給
される。尚、１８は測定試料をビーカ１３内に注
入するためのマイクロシリンジである。 上述した如き構成において、ビーカ１３内に酸
素電極１１を挿入し、磁性体１４を回転させて該
ビーカ内の溶液の撹拌を行う。該撹拌により、該
ビーカ１３内部の溶液中の酸素濃度はプラトーの
状態となり、その後、マイクロシリンダ１８より
血清が該溶液中に注入される。該血清中に含まれ
る中性脂質は、該酸素電極１１底部に設けられて
いる固定化酵素のリポプロテインリパーゼを触媒
として該溶液中の水と反応する。この反応によ
り、グリセロールと脂肪酸が生成されるが、該生
成されたグリセロールは、固定化酵素の内のグリ
セロールオキシダーゼを触媒として該溶液中の酸
素分子と反応し、グリセルアルデハイドと過酸化
水素を生成する。この結果、酸素電極底部のカソ
ード３周辺の酸素分子の量（濃度）は、該２番目
の反応によつて少くなり、該カソード３とアノー
ド１との間に流れる電流は低くなる。数分の後、
該電流値はプラトーの状態となり、グリセロール
との反応に寄与する酸素の量に比例した該電流値
の変化から、中性脂質の量（濃度）を測定するこ
とができる。 次に実験例を示す。 実験例 １ 人コントロール血清の希釈系列を試料として、
本発明に基づくセンサーの特性を調べた。コント
ロール血清は、栄研化学(株)製リピツドセーラム
を用いた。分析条件は、衝撃液：0.1M、PH8.0リ
ン酸緩衝液（トリトン×100 ４％）、反応温度：
30℃、試料量：50μであつた。各濃度における
応答曲線を第３図に示すが、この図において、縦
軸は検出電流値（μA）、横軸は時間（分）であ
る。第４図は、第３図の測定結果に基づいて得ら
れた電流値差と濃度との関係を示すグラフであ
り、このグラフを用い、未知試料中の中性脂質の
濃度を求めることができる。尚、この試験の同時
再現性は、５回の測定で相対標準偏差値6.6％で
あつた。 試験例 ２ 代表的中性脂質の１つであるトリオレインを試
料として本発明に基づくセンサーの特性を調べ
た。トリオレインは東京化成(株)製のものを使用し
た。分析条件（緩衝液、反応温度、試料量）は、
上述した試験例１と同じであり、この試験の結果
得られた検量線を第５図に示す。尚、この時の同
時再現性は、５回の測定で相対標準偏差値5.7％
であつた。 試験例 ３ 試料としての人血清を本発明に基づくセンサー
と従来法によつて分析し、比較した。分析条件
（緩衝液、反応温度、試料量）は、上記試験例１
と同じであり、検量線は、試験例１で得られたも
のを使用した。この分析結果を表１に示すが、表
の単位は、mg／dlである。尚、従来法とは、自動
化学分析装置を用い、試料と酵素試薬とを混合し
て反応させ、反応溶液を比色測定したものであ
る。
【表】
以上詳述した如く、本発明によれば、固定化酵
素としてリポプロテインリパーゼとグリセロール
オキシダーゼを用いる簡単な構成で、中性脂質の
検出をアンペロメトリツクに高精度で行うことが
できる。尚、本発明は上述した実施例に限定され
ることなく幾多の変形が可能である。例えば、酸
素電極を使用せず、グリセロールと酸素との反応
によつて生成される過酸化水素を検出するための
過酸化水素電極を用いても良い。又、測定システ
ムは第２図の構成に限定されないもので、溶液の
撹拌手段、試料の注入手段等は、他の機構を用い
ることができる。
素としてリポプロテインリパーゼとグリセロール
オキシダーゼを用いる簡単な構成で、中性脂質の
検出をアンペロメトリツクに高精度で行うことが
できる。尚、本発明は上述した実施例に限定され
ることなく幾多の変形が可能である。例えば、酸
素電極を使用せず、グリセロールと酸素との反応
によつて生成される過酸化水素を検出するための
過酸化水素電極を用いても良い。又、測定システ
ムは第２図の構成に限定されないもので、溶液の
撹拌手段、試料の注入手段等は、他の機構を用い
ることができる。
第１図は、本発明に基づくセンサーの一実施例
を示す図、第２図は中性脂質測定システムの一例
を示す図、第３図は時間と検出電流との関係を示
すグラフ、第４図及び第５図は検出電流値差と中
性脂質濃度との関係を示すグラフである。 １……内管、２……外管、３……カソード、４
……酸素ガス透過性膜、６……アノード、７……
透析膜、８……固定化酵素、１１……酵素電極、
１２……水槽、１３……ビーカ、１４……磁性
体、１５……回転磁場発生装置、１６……Ａ−Ｖ
変換器、１７……レコーダ、１８……マイクロシ
リンジ。
を示す図、第２図は中性脂質測定システムの一例
を示す図、第３図は時間と検出電流との関係を示
すグラフ、第４図及び第５図は検出電流値差と中
性脂質濃度との関係を示すグラフである。 １……内管、２……外管、３……カソード、４
……酸素ガス透過性膜、６……アノード、７……
透析膜、８……固定化酵素、１１……酵素電極、
１２……水槽、１３……ビーカ、１４……磁性
体、１５……回転磁場発生装置、１６……Ａ−Ｖ
変換器、１７……レコーダ、１８……マイクロシ
リンジ。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 第１と第２の電極を有し、その一方の電極近
傍に固定化酵素を配置し、該電極間に流れる電流
に基づいて、被測定溶液中に含まれる中性脂質を
測定するようにしたセンサーにおいて、該固定化
酵素として、リポプロテインリパーゼとグリセロ
ールオキシダーゼを用いたことを特徴とする中性
脂質センサー。 ２ 該両電極間に流れる電流は、該一方の電極近
傍の酸素の量に応じて変化する特許請求の範囲第
１項記載の中性脂質センサー。 ３ 該両電極間に流れる電流は、該一方の電極近
傍の過酸化水素の量に応じて変化する特許請求の
範囲第１項記載の中性脂質センサー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58103248A JPS59228158A (ja) | 1983-06-09 | 1983-06-09 | 中性脂質センサ− |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58103248A JPS59228158A (ja) | 1983-06-09 | 1983-06-09 | 中性脂質センサ− |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59228158A JPS59228158A (ja) | 1984-12-21 |
| JPH043501B2 true JPH043501B2 (ja) | 1992-01-23 |
Family
ID=14349137
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58103248A Granted JPS59228158A (ja) | 1983-06-09 | 1983-06-09 | 中性脂質センサ− |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59228158A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101151526B (zh) | 2005-03-29 | 2012-05-30 | Cci株式会社 | 生物传感器 |
-
1983
- 1983-06-09 JP JP58103248A patent/JPS59228158A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59228158A (ja) | 1984-12-21 |
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