JPH04356200A - インドキシル誘導体を基質とする酵素活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査の分野、特に
高感度を必要とする酵素免疫測定法、ＤＮＡプロ−ブア
ッセイ法等に用いられる。

【０００２】

【従来の技術】エステル結合を有するインドキシル誘導
体を酵素基質とする酵素活性の測定は、従来から行なわ
れていた。また、酵素組織化学の分野でもこの反応を利
用して、組織細胞内に局在する酵素の検出に使われてい
た（新酵素組織化学　　朝倉書店１９８２年）。しかし
、その測定は、インドキシルエステル誘導体が酵素の作
用によりインジゴ体に変換された結果生ずる青色を定性
的に利用するものがほとんどであった。

【０００３】例えば、インドキシルエステル誘導体であ
る、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフ
ェ−ト（ＢＣＩＰ）は、アルカリホスファタ−ゼ（ＡＬ
Ｐ）により水解されて、５、５’−ジブロモ−４、４’
−ジクロロ−インジゴを生じるので、ＡＬＰの活性は、
このインジゴ誘導体を比色することでなされていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】生体成分の定量は、被
検物質が生体ホルモンや生理活性ペプチドなど、その存
在量が微量になればなる程、より安定にそしてより高感
度に測定できることが要求される。

【０００５】インドキシルエステル誘導体を基質とする
酵素活性測定においても、より感度を高めるためにニト
ロブル−テトラゾリウム（ＮＢＴ）やテトラニトロブル
−テトラゾリウム（ＴＮＢＴ）を共存させて、これらが
還元されることにより生ずるホルマザンを比色する方法
に改良された。しかしながら、酵素免疫測定法や標識体
として酵素を用いたＤＮＡプロ−ブアッセイ法に適用す
るには、感度が若干不足しているうえに、測定に長時間
を要するなどの問題点があった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、インドキ
シルりん酸、酢酸インドキシルなどのエステル結合を有
するインドキシル誘導体を酵素基質とし、これらの基質
に酵素が作用すると、インジゴが形成される際に、過酸
化水素も同時に形成されることを見出した。

【０００７】そしてこの過酸化水素濃度が酵素の活性と
対応するところから、過酸化水素を化学発光等により測
定することにより、比色法に比べて１／１０００程度低
い酵素活性でも検出でき、定量分析にも適応できること
を見出し、この発明を完成した。

【０００８】［発明の構成］本発明は、３−Ｏ−インド
キシルエステル誘導体を基質とし、酵素作用により発生
する過酸化水素を測定することを特徴とする酵素活性測
定法に関するものである。３−Ｏ−インドキシルエステ
ル誘導体およびその塩は、一般式（Ｉ）

【０００９】

【化２】

【００１０】（式中Ｒ１　、Ｒ２　、Ｒ３　およびＲ４
　は同一または異なって、水素原子または求電子基を示
し、　　Ｒａ　は水素原子またはＲｂ　のアシル基を示
し、　　Ｒｂ　はアシルオキシ基を示す。）で示すこと
ができる。

【００１１】上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１　、Ｒ２
　、Ｒ３　およびＲ４　の求電子基としては、たとえば
シアノ基、アミノ基、１分子または２分子のメチル基、
またはエチル基で置換されたアミノ基、トリフルオロメ
チル基、水酸基、ハロゲン原子、メチル基、エチル基、
メトキシ基およびエトキシ基を挙げることができる。こ
のうち、ハロゲン原子としては臭素または塩素が好まし
い。

【００１２】Ｒａ　としては水素原子または、無機酸ま
たは低分子の有機酸のアシル基を挙げることができる。 無機酸としてはりん酸、ホスホン酸、硫酸、スルホン酸
および炭酸が好ましく、有機酸としては、酢酸、プロピ
オン酸、酪酸、イソ酪酸、ピルビン酸、糖およびＬ−ア
ミノ酸が好ましい。

【００１３】Ｒｂ　としては、３−Ｏ−アシルの形をと
り、酵素作用を受けるものであれば特に限定されないが
、好適なものとしては、ホスフェ−ト、アセテ−ト、ガ
ラクトピラノシド、サルフェ−ト、グルクロネ−ト、グ
ルコピラノシド、フラクトピラノシド、マンノピラノシ
ドおよびＲａ　と同一のアシル基を挙げることができる
。

【００１４】塩としては、ｐ−トルイジン塩、モノまた
はジナトリウム塩およびモノシクロフェニ−ルアンモニ
ウム塩が好ましい。

【００１５】インドキシルエステル誘導体の代表的化合
物としては、たとえば５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリルホスフェ−ト、５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリルホスフェ−ト（ジナトリウム塩）、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリルホスフェ−ト（ｐ−ト
ルイジン塩）、３−インドリルホスフェ−ト（ジナトリ
ウム塩）、３−インドリルホスフェ−ト（ｐ−トルイジ
ン塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−３−インドリ
ル−βーＤ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリルアセテ−ト、５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリル−１、３−ジアセテ−ト、５−ブ
ロモ−６−クロロ−３−インドリルアセテ−ト、５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリル−サルフェ−ト（ｐ
−トルイジン塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−βーＤ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（ＮＣ
ＨＡ塩）の様な化合物があげられる。

【００１６】測定対象の酵素としては、特に限定されな
いが、アルカリホスファタ−ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
−ゼ、エステラ−ゼ、アセチルコリンエステラ−ゼ、ア
リルスルファタ−ゼ、スルファタ−ゼ、β−Ｄ−グルコ
シダ−ゼ、β−Ｄ−グルクロニダ−ゼの様な、上記イン
ドキシル誘導体に作用して過酸化水素を発生する酵素で
あればよい。

【００１７】これらのうち、アルカリホスファタ−ゼ（
ＡＬＰ）やβ−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ（β−Ｇａｌ）は
、安定性に富み、入手が容易であるところから酵素免疫
測定法の標識酵素、ノンアイソトピックのＤＮＡプロ−
ブアッセイ法の標識酵素等、様々な方法に利用されてい
る。

【００１８】酵素活性の検出は化学発光法等によってな
される。化学発光法とは化学反応に伴って生じた発光現
象を利用する定量分析法であり、本発明においては、イ
ンドキシルエステル誘導体から酵素反応によって発生し
た過酸化水素の濃度を化学発光量から測定するものであ
る。

【００１９】発光剤としては特に限定しないが過酸化水
素と反応して光を発する物質、例えばルミノ−ル、イソ
ルミノ−ルの様なルミノ−ル誘導体、ルシゲニン、アク
リジニウム、ピロガロ−ルおよびビス（２、４、６−ト
リクロロフェニル）オキザレ−トの様なオキザレ−ト誘
導体と蛍光色素例えば、８−アニリノナフタレン−１−
スルホン酸との組み合わせ等が適している。これらの物
質と過酸化水素との反応には、酸化触媒としてペルオキ
シダ−ゼ、ミクロペルオキシダ−ゼおよびフェリシアン
化カリウムなどの存在が必要である。

【００２０】また、蛍光法による測定も可能である。蛍
光剤としては、例えば、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル
）プロピオン酸、チラミンおよびホモバニリン酸等が適
している。

【００２１】本発明によりインドキシルエステル誘導体
に作用する酵素活性の定量的測定が可能になったのみな
らず、比色法では反応に長時間を要し実用化に問題のあ
った酵素免疫測定法においても、標識酵素に該酵素を用
いることにより実用化が可能となった。

【００２２】酵素免疫測定法への適用については、酵素
免疫測定法自体は公知の方法が適用できる。例えば、測
定対象物質（抗原）を当該酵素にて標識し、対応する抗
体との反応を検体中の抗原と競合させ、抗体と結合した
酵素活性を化学発光法を用い測定する方法（競合法）測
定対象とする抗原をあらかじめ、固相化された対応する
抗体と反応させ、Ｂ／Ｆを行なうための洗浄後、抗原に
対する抗体を当該酵素で標識した標識抗体と反応させて
、固相上の酵素活性を化学発光法を用い定量する方法。 （２ステップサンドイッチ法）測定対象とする抗原をあ
らかじめ固相化された対応する抗体と抗原に対する抗体
を当該酵素で標識した標識抗体と同時に反応させて、固
相上の酵素活性を化学発光法を用い定量する方法。（１
ステップサンドイッチ法）などあげられるが、これら以
外の従来使用されていた方法にも適用することができる
。

【００２３】これらの抗原性を有する物質および、抗原
性を有する物質に対する抗体への酵素標識は常法により
行なわれる。

【００２４】測定の対象としては、抗原性を有するもの
であればどれでもよいが、特に生体液中の生理活性物質
があげられる。生体液としては、例えば血清、血漿、尿
、腹水などであり、生理活性物質としては、例えばα−
フェトプロティン、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）などの胎児
性蛋白質、種々のペプチドホルモン、ステロイドホルモ
ン、免疫グロブリン、抗ウィルス抗体、また、各種の医
薬品などがあげられる。

【００２５】これらの抗原性を有する物質及び抗原性を
有する物質に対する抗体への酵素標識は常法によって行
なわれる。（酵素免疫測定法／第三版　　医学書院１９
８７年発行）。

【００２６】ＤＮＡプロ−ブアッセイ法においては、Ｄ
ＮＡの標識に放射性同位元素が用いられているが、放射
性同位元素は被爆の危険性があり、安定性も問題がある
ところから、酵素を標識体とする改良法が最近になって
使用されている。この標識酵素の検出にも本発明の酵素
活性測定法が適用できる。

【００２７】例えば、血液より抽出したＤＮＡあるいは
ＲＮＡに相補的な塩基配列をもつＤＮＡあるいはＲＮＡ
をプロ−ブとし、これにあらかじめ酵素あるいはビオチ
ン等を標識する。ついで、このプロ−ブを目的とする一
本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにハイブリダイズ反応を行な
わせ、目的とする遺伝子に結合したプロ−ブを分離する
。プロ−ブの検出は、標識してある酵素を本発明の化学
発光法を用いて検出する。これら以外の従来使用されて
いた方法にも適用できる。ＤＮＡプロ−ブアッセイ法は
、先天的疾患や感染症の診断に有効である。

【００２８】これらの本発明の実施において、抗原抗体
反応、酵素反応および発光反応等の各々の反応時間およ
び温度等は、常法の範囲内でなしうる。（酵素免疫測定
法／第３版　　前述）。

【００２９】

【実施例】以下に比較例、実施例をあげて本発明の方法
を更に具体的に説明するが、本発明はこれに限定される
ものではない。なお、実施例においては、抗原物質の標
準液を使用しているが、検体（例えば抗原物質を含む血
清あるいは血漿等）を使用しても全く同様に実施できる
。

【００３０】［比較例］ アルカリホスファタ−ゼの比色法による検出試薬および
方法 （ａ）基質発色液 ＢＣＩＰ／ＮＢＴ　　キット キルケガ−ド・ペリ−製（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　　＆
　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．） （ｂ）ニトロセルロ−ス膜 シュライヒャ−・シュ−ル製　　　　ＢＡ　　８５　（
Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌｌ） （ｃ）酵素 アルカリホスファタ−ゼ（ＡＬＰ）（ベ−リンガ−社製
　　ＥＩＡグレ−ド） （ｄ）試験方法 ドットプロット用のニトロセルロ−ス膜にＡＬＰ溶液１
０μｌ　をドットプロットし、基質発色液にひたし、３
７℃で１時間反応し発色させた。その結果、ＡＬＰとし
て１００ｐｇ　／１０μｌ　まで検出可能であった。

【００３１】［実施例１］ アルカリホスファタ−ゼの化学発光法による検出試薬お
よび方法 （ａ）基質 ５−ブロム−４−クロロ−３−インドリルホスフェ−ト
（ｐ−トルイジン塩）（ＢＣＩＰ）和光純薬製（ｂ）基
質緩衝液 ０．１　％ウシ血清アルブミンおよび１００　ｍＭの塩
化マグネシウムを含む０．１　Ｍトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ９．５）（ｃ）発光試薬 ０．１２ｍＭのイソルミノ−ルおよび　０．５μＭのミ
クロペルオキシダ−ゼを含む０．４　Ｍ炭酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ９．５） （ｄ）酵素 アルカリホスファタ−ゼ（ＡＬＰ）（ベ−リンガ−社製
　　ＥＩＡグレ−ド） （ｅ）測定装置 アロカ　　ルミネッセンスリ−ダ−（アロカ社）（ｆ）
試験方法 ０．３８ｍＭのＢＣＩＰを含む緩衝液１００　μｌに対
し、希釈したＡＬＰ（１００　ｐｇ／ｍｌ〜１　μｇ／
ｍｌ）を１０μｌ　加え、３７℃１時間反応させた後、
発光試薬を５００　μｌ加え生じた発光量を測定装置を
用いて測定した。その結果を第１図に示す。ＡＬＰは０
．１ｐｇ／１０μｌまで測定可能であった。従って、従
来の比色法（比較例）に比べて感度が１０００倍上昇し
た。

【００３２】［実施例２］ アルカリホスファタ−ゼの１ステップ測定試薬および方
法 （ａ）基質 ５−ブロム−４−クロロ−３−インドリルホスフェ−ト
（ｐ−トルイジン塩）（ＢＣＩＰ）和光純薬製（ｂ）基
質発光試薬 ０．１９ｍＭのＢＣＩＰ、０．２５ｍＭのイソルミノ−
ル、５　Ｕ／ｍｌのペルオキシダ−ゼ（西洋わさび　　
東洋紡製）および１００　ｍＭの塩化マグネシウムを含
む０．１　Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．５） （ｃ）酵素 アルカリホスファタ−ゼ（ＡＬＰ）（ベ−リンガ−社製
　　ＥＩＡグレ−ド） （ｄ）測定装置 アロカ　　ルミネッセンスリ−ダ−（アロカ社）（ｅ）
試験方法 希釈したＡＬＰ（１００　ｐｇ／ｍｌ〜１　μｇ／ｍｌ
）１０μｌ　に対し、基質発光試薬の混液を２００　μ
ｌ加え、酵素反応と発光反応を同時に行なわせ発光量を
測定した。その結果を第２〜５図に示す。ＡＬＰは１０
ｐｇ／１０μｌまで測定可能であった。実施例１と比べ
て感度は劣るものの、基質と発光試薬との同時添加によ
る１ステップの測定が可能であった。

【００３３】［実施例３］ β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ（β−Ｇａｌ）の化学発光に
よる検出 試薬および方法 （ａ）基質 ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）　　和光純薬製（ｂ）
基質緩衝液 ０．１　％ウシ血清アルブミンおよび０．５　ｍＭの塩
化マグネシウムを含む０．０１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ８
．０）（ｃ）発光試薬 ０．１２ｍＭのイソルミノ−ルおよび０．５　μＭのミ
クロペルオキシダ−ゼを含む０．４　Ｍ炭酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ９．５） （ｄ）酵素 βーＤ−ガラクトシダ−ゼ（β−Ｇａｌ）（ベ−リンガ
−社製　　ＥＩＡグレ−ド） （ｅ）測定装置 アロカ　　ルミネッセンスリ−ダ−（アロカ社）（ｆ）
試験方法 ０．２　ｍＭのＸ−Ｇａｌを含む緩衝液１００　μｌに
対し、希釈したβ−Ｇａｌ（０．２５×１０−１４　Ｍ
〜１　×１０−１０　Ｍ）を５０μｌ　加え、３７℃で
２時間反応の後、発光試薬を添加し、発光量を測定した
。その結果を第６図に示す。β−Ｇａｌは、２×１０−
１９ｍｏｌ／５０　μｌ　まで測定可能であった。

【００３４】［実施例４］ β−Ｄ−グルコシダ−ゼの化学発光による検出試薬およ
び方法 （ａ）基質 ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グ
ルコピラノシド（ＢＣＩＧ）　　アルドリッチ社製（ｂ
）基質緩衝液 ０．１　％ウシ血清アルブミンおよび０．５　ｍＭの塩
化マグネシウムを含む０．１　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．
４）（ｃ）発光試薬 ０．１２ｍＭのイソルミノ−ルおよび０．５　μＭのミ
クロペルオキシダ−ゼを含む０．４　Ｍ炭酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ９．５） （ｄ）酵素 βーＤ−グルコシダ−ゼ（β−Ｇｌｕ）（ベ−リンガ−
社製ＥＩＡグレ−ド） （ｅ）測定装置 アロカ　　ルミネッセンスリ−ダ−（アロカ社）（ｆ）
試験方法 ０．２　ｍＭのＢＣＩＧを含む緩衝液１００　μｌに対
し、希釈したβ−Ｇｌｕ（０．０２ｍＵ／ｍｌ〜２００
　ｍＵ／ｍｌ）を５０μｌ　加え、３７℃で２時間反応
の後、反応液と発光試薬を混合し、発光量を測定装置を
用い測定した。その結果を第７図に示す。β−Ｇｌｕは
、５×１０−１６　ｍｏｌ／５０μｌ（０．０２ｍＵ／
ｍｌ）まで測定することができた。

【００３５】［実施例５］ ＡＬＰ標識抗体を用いたα−フェトプロティン（ＡＦＰ
）の化学発光法を用いた検量線 （ａ）基質 ＢＣＩＰ　　和光純薬製 （ｂ）基質緩衝液 ０．１　％ウシ血清アルブミンおよび１００　ｍＭの塩
化マグネシウムを含む０．１　Ｍトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ９．５）（ｃ）発光試薬 ０．２　ｍＭのルミノ−ルおよび６０μＭのミクロペル
オキシダ−ゼを含むＣＨＥＳ−緩衝液（同仁化学製）（
ｐＨ９．５） （ｄ）酵素 アルカリホスファタ−ゼ（ＡＬＰ）（ベ−リンガ−社製
　　ＥＩＡグレ−ド） （ｅ）抗体固相化チュ−ブ 抗ＡＦＰ抗体固相化チュ−ブ（分析化学　　３４，５４
４−５４８（１９８５）「サイロキシンの蛍光酵素イム
ノアッセイ法」に準じて調製） （ｆ）酵素標識抗体 ＡＬＰ標識抗ＡＦＰ抗体（酵素免疫測定法／第３版　　
前述に従い調製） （ｇ）試料 ＡＦＰ１０００ｎｇ／ｍｌ　を０．０１Ｍりん酸緩衝液
を用いて希釈し、０．５、１、１０、１００、１０００
ｎｇ／ｍｌ　の各濃度液を作成 （ｈ）測定装置 化学発光検出装置（三共（株）製） 発光量は、光電子増倍管の出力電流を１０秒間積分した
もので、その単位はμＡ×ｓｅｃである。（Ａ：アンペ
ア） （ｉ）試験方法 抗ＡＦＰ抗体固相化チュ−ブ（ＡＦＰチュ−ブ）に３０
μｌの試料液と０．０１Ｍのりん酸緩衝液２７０μｌを
加え、３７℃で１５分間インキュベ−トの後、このＡＦ
Ｐチュ−ブを０．０１Ｍのりん酸緩衝液１．５ｍｌを用
いて洗浄、これを３回繰り返し、Ｂ／Ｆ分離を行なった
。ついで、このＡＦＰチュ−ブにＡＬＰ標識抗ＡＦＰ抗
体３００μｌを加え、３７℃で１５分間インキュベ−ト
の後、０．０１Ｍのりん酸緩衝液１．５ｍｌを用いて３
回洗浄を行なった。つぎに、０．３８ｍＭのＢＣＩＰを
含む緩衝液３００μｌを加え、３７℃で１５分間反応さ
せた後、反応液１００μｌと発光試薬１００μｌとを混
ぜ直ちにその発光量を測定した。その結果を第８図に示
す。ＡＦＰとして１ｎｇ／ｍｌまでの検量線を作成する
ことができ、ＡＦＰを高感度に定量できることが判明し
た。

【００３６】［実施例６］ 化学発光法を用いたノンアイソトピックＤＮＡプロ−ブ
アッセイの検量線 試薬および方法 （ａ）基質 ５−ブロム−４−クロロ−３−インドリルホスフェ−ト
（ｐ−トルイジン塩）（ＢＣＩＰ）　　和光純薬製（ｂ
）基質緩衝液 ０．１　％ウシ血清アルブミンおよび１００　ｍＭの塩
化マグネシウムを含む０．１　Ｍトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ９．５）（ｃ）発光試薬 ０．１２ｍＭのイソルミノ−ルおよび　０．５μＭのミ
クロペルオキシダ−ゼを含む０．４　Ｍ炭酸ナトウム緩
衝液（ｐＨ９．５） （ｄ）酵素結合物 アルカリホスファタ−ゼ標識アビジン（ＡＬＰ−アビジ
ン結合物）　　バイオ−イエダ社製 （ｅ）ビオチン標識λ−ＤＮＡプロ−ブ特開平１−２２
８５００号に準じて調製（ｆ）プレハイブリダイゼ−シ
ョンおよびハイブリダイゼ−ション溶液 プレハイブリダイゼ−ション溶液の調製４×ＳＳＣ　、
０．０６４％　ＰＶＰ、　０．０６４　％ＦｉＣＯｌｌ
（　膨潤剤　　Σ　　社製）、０．０６４　％ウシ血清
アルブミンおよび５０μｇ／ｍｌの熱変性ウシ胸腺ＤＮ
Ａを含む溶液 ハイブリダイゼ−ション溶液 ４×ＳＳＣ　　０．０６４％　ＰＶＰ、０．０６４％Ｆ
ｉＣＯｌｌ（膨潤剤　　Σ社製）、０．０６４％ウシ血
清アルブミン、１０％デキストランサルフェ−ト、５０
μｇ／ｍｌの熱変性ウシ胸腺ＤＮＡおよびビオチン標識
λ−ＤＮＡプロ−ブ１μｇ／ｍｌを含む溶液。

【００３７】（ｇ）測定装置 アロカ　　ルミネッセンスリ−ダ−（アロカ社）６秒間
積算により発光強度（カウント）を測定 （ｈ）試験方法 １）ハイブリダイゼ−ション 熱変性したλ−ＤＮＡ（１０ｐｇ〜１０ｎｇ）　溶液２
００μｌをマイクロタイタ−プレ−トに加え、４℃で一
夜放置しλ−ＤＮＡをプレ−ト上に吸着させた。プレ−
ト上の上清を除去した後、プレハイブリダイゼ−ション
溶液２５０μｌを各ウェルに加え、６５℃で１時間反応
させた。反応終了後、プレハイブリダイゼ−ション溶液
を除去し、ハイブリダイゼ−ション溶液２５０μｌを加
え、６５℃で一夜反応させた後、反応液を除去し、２×
ＳＳＣ２５０μｌを加え６５℃で３０分間反応させた。 次いで、ウェルを０．９％ＮａＣｌ含有りん酸緩衝液（
ｐＨ７．０）２５０μｌで３回洗浄した。

【００３８】２）ハイブリダイズしたビオチン標識λ−
ＤＮＡプロ−ブの化学発光法による検出洗浄したマイク
ロタイタ−プレ−トのウェルにＡＬＰ−アビジン結合物
の希釈溶液（２万倍）１５０μｌを加え、室温で２時間
反応させた。反応終了後、各ウェルを０．９％ＮａＣｌ
含有りん酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μｌで３回洗浄
し、次いで、０．３８ｍＭのＢＣＩＰを含む基質緩衝液
１５０μｌを加え、３７℃で１時間反応させた。反応終
了液１００μｌに発光試薬を５００μｌを加え、混合後
１５秒から２１秒までの６秒間の発光量を測定した。そ
の結果を第９図に示す。λ−ＤＮＡとして１０ｐｇ／ウ
ェルまでの検量線を作成することができ、λ−ＤＮＡを
高感度に定量できることが判明した。

【００３９】［実施例７］ アルカリホスファタ−ゼ標識プロ−ブを用いた特異的遺
伝子の検出 （ａ）基質 ５−ブロム−４−クロロ−３−インドリルホスフェ−ト
（ｐ−トルイジン塩）（ＢＣＩＰ）　　　　和光純薬製
（ｂ）基質緩衝液 ０．１％ウシ血清アルブミン及び１００ｍＭ　の塩化マ
グネシウムを含む０．１　Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
９．５）（ｃ）発光試薬 ０．１２ｍＭのイソルミノ−ルおよび　０．５μＭのミ
クロペルオキシダ−ゼを含む０．４　Ｍ炭酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ９．５） （ｄ）試料ＤＮＡ ＨＳＶ　ＩＩ　遺伝子を組み込んだプラスミドコントロ
−ル（ＳＮＡＰキット　　モレキュラ−　　バイオシス
テム社製） （ｅ）ＤＮＡ固定溶液 ８　ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、　１．５　ｍＭ　ＫＨ２Ｐ
Ｏ４、　１３７ｍＭ　ＮａＣｌ、　２．７ｍＭ　ＫＣｌ
、　０．１Ｍ　ＭｇＣｌ２・　Ｈ２Ｏを含む溶液（ｆ）
ＤＮＡプロ−ブ アルカリホスファタ−ゼ標識ＨＳＶ　ＩＩ　遺伝子プロ
−ブ（ＳＮＡＰキット　　モレキュラ−　　バイオシス
テム社製） ｇ）ハイブリダイゼ−ション溶液 ５×ＳＳＣ、０．５　％　ＢＳＡ、　０．５　％ＰＶＰ
　の溶液に熱変性（５分煮沸、５分冷却）牛胸腺ＤＮＡ
　５０　μｌ／　ｍｌを添加した液 （ｈ）測定機器 アロカ　　ルミネッセンスリ−ダ−（アロカ社）６秒間
積算により発光強度（カウント）を測定 （ｉ）試験方法 １）ＤＮＡのマイクロタイタ−への固定試料であるＤＮ
Ａ（ＨＳＶ　ＩＩ　プラスミド）を精製水で希釈後、５
分間煮沸し、次いで急冷して一本鎖ＤＮＡとした後、１
００μｌのＤＮＡ固定液を含むウェルに加え、混合し、
塩化マグネシウムの存在下４℃で一夜放置し、ポリスチ
レンプレ−トに吸着させる。 ２）プレハイブリダイゼ−ション ウェルからＤＮＡ溶液を除去し、ハイブリダイゼ−ショ
ン溶液２００μｌを加え、６０℃、２０分間水浴上で反
応さす。 ３）ハイブリダイゼ−ション ウェルからハイブリダイゼ−ション溶液を除去し、次に
ＤＮＡプロ−ブ１％を含むハイブリダイゼ−ション溶液
２００μｌを加え、６０℃、２０分間水浴上で反応さす
。反応終了後、ウェルよりハイブリダイゼ−ション溶液
を除去し、２×ＳＳＣ２５０μｌで１分間室温で洗浄し
、次いで、２×ＳＳＣ２５０μｌを用い６０℃、５分間
洗浄後、室温で２時間放置する。次いで、ウェルを０．
９　％の塩化ナトリウムを含む２５０μｌのりん酸緩衝
液で３回洗浄する。次に、０．３８ｍＭのＢＣＩＰを含
む基質緩衝液１５０μｌをウェルに加え、３７℃で１時
間反応させる。この反応終了液１００μｌに５００μｌ
の発光試薬を加え、混合後１５秒から２１秒までの６秒
間の発光量を測定したところ、実施例６と同様に、試料
のＨＳＶ　ＩＩ　遺伝子の増加と共に発光量が増加する
検量線を作成することができた。

【００４０】

【発明の効果】インドキシル誘導体を基質とする酵素反
応において、その酵素活性を化学発光法等にて測定する
ことにより、比色法に比べて、短時間でより感度よく測
定できることを見出した。この結果、比色法では定性分
析が主たる用途であったのに対して、化学発光法では定
量分析が可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】化学発光法におけるアルカリホスファタ−ゼの
検量線 縦軸は発光量（カウント）、横軸はアルカリホスファタ
−ゼの濃度を示す。

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】これらの４図は、化学発光法における各種濃度
のアルカリホスファタ−ゼの経時における発光量の変化
をみたもので、縦軸は発光量（カウント）、横軸は時間
を示す。

【図６】化学発光法におけるβ−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ
の検量線 縦軸は発光量（カウント）、横軸はβ−Ｄ−ガラクトシ
ダ−ゼの濃度を示す。

【図７】化学発光法におけるβ−Ｄ−グルコシダ−ゼの
検量線 縦軸は　　発光量（カウント）、横軸はβ−グルコシダ
−ゼの濃度を示す。

【図８】化学発光法酵素免疫測定法によるα−フェトプ
ロティンの検量線 縦軸は発光量、横軸はα−フェトプロティンの濃度を示
す。

【図９】化学発光ＤＮＡプロ−ブアッセイ法によるλ−
ＤＮＡの検量線 縦軸は発光量、横軸はλ−ＤＮＡの濃度を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　３−Ｏ−インドキシルエステル誘導体
   を基質とし、酵素作用により発生する過酸化水素を測定
   することを特徴とする酵素活性測定法。
2. 【請求項２】３−Ｏ−インドキシルエステル誘導体およ
   びその塩が、一般式（Ｉ） 【化１】 （式中Ｒ１　、Ｒ２　、Ｒ３　およびＲ４　は同一また
   は異なって、水素原子または求電子基を示し、Ｒａは水
   素原子またはＲｂ　のアシル基を示し、Ｒｂ　はアシル
   オキシ基を示す。）である請求項１記載の酵素活性測定
   法。