JPH0435709B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 粒子または細胞分析に使用される市販の機器は
多数ある。粒子、特に生物学的粒子または細胞の
特性は分析中または粒子が流水中を移動したり懸
濁液中を運ばれる間粒子が比較的安定したままで
ある技法で決定され得る。フローサイトメーター
（流動細胞計測機）は知られており、動いている
粒子の特性を分析したり検出するのに役立つ。典
型的なフローサイトメトリー機器では、細胞や他
の生物学的粒子は液体流水中を流され、各粒子
を、好適なのは一時に、受容部位を通過させ、粒
子の物理的または化学的特性を測定する。種々の
信号は電気的、音響的および放射性を含む粒子の
種々の特性に関連して検出され得るが、フローサ
イトメーターは通常機器を通過する粒子の分析に
は光学的信号による。多くの場合、分析機器を静
的または動的な状態のいずれかで粒子の分析に使
用するとしても、機器の使用を準備するのに予備
的なセツトアツプ工程を通常必要とする。細胞ま
たは他の生物的粒子が極めて小さくその粒子に関
して検出される信号がしばしば低い場合、分析を
行なう前に、試験結果の信頼性を確実にするため
に機器の適当な検定を行なうのが望ましい。

（従来技術） 生物学的粒子または細胞分析に有用な機器を検
定するための現行の技法は測定者の技術に強く依
存する。換言すると、検定手順中に対照を調整
し、適当な閾値を決定し、実施される特定の試験
毎に何種もの標準を保持するために検定者の判断
および経験が必要である。実際に経験を積んだ測
定者は、使用前に機器を非常にうまく検定できる
とはいえ、適当な検定を達成したと感ずるにはこ
のような測定者は多くの感および熟考を強いられ
る。例えば、フローサイトメーターのような機器
の種々の光学的要素を配列する場合、検定する人
間は典型的には画面またはCRTを見て、種々の
対照の調整とともに視覚による判断によつて機器
が検定されたことを判断する。もちろん典型的な
視覚による検定技法を実行するときには、試験結
果の再現性に妥協あり得る。

フローサイトメーターおよび他の生物学的粒子
分析機器は通常実際の分析を受けようとする粒子
や細胞の型に似た粒子で検定する。従つて検定粒
子は大きさ、容積、表面特性、粒状性、色調の特
徴（細胞着色剤、染料、免疫蛍光標識など）のよ
うな調べる粒子に似た特性を持つように選択され
るべきである。フローサイトメトリー機器の過去
および現行の検定手順は検定段階にニワトリ赤血
球細胞の利用を含む。ニワトリ赤血球細胞は検定
手順のいくつかの点では信頼できるけれど、やは
りいくつかの光関連特性におけるスペクトル不足
のため完全に満足という訳ではない。検定目的の
ための生物学的試料に加えて、微細球状ビーズが
細胞分析機器の検定に役立つている。例えば米国
特許第4331862号には粒子計測機器の検定にラテ
ツクス物質からできたビーズの使用が記述されて
いる。フローサイトメトリー機器の検定に特に使
用される検定用ビーズは、フローサイトメトリー
スタンダーヅコーポレイシヨン（Flow
Cytometry Standards Corporation）、リサーチ
トライアングルパーク（Research Triangle
Park）、ノースカロライナから購入できる。

（発明が解決しようとする問題点） たとえ検定用ビーズの有効性が粒子分析機器の
検定技法を改善したとしても、また機器が適当に
検定されたか否かを決めるのに測定者の感がかな
り必要である。従つて再現性ある試験結果を提供
するだけでなく、現在利用されている検定技法に
伴なう熟考および感による推量を除去する検定手
順を確立する必要および要請が未だにある。本発
明が目指すのはこのような改善の実現に対するも
のである。

（問題点を解決するための手段） 本発明の方法は、分析下の粒子から少なくとも
１種類の光関連信号を得るための機器を用いるた
めにこのような機器を検定する方法であり、分析
したい粒子に関連した１個以上の既知特性を持つ
検定粒子に入射光ビームをあてることからなる。
検定粒子からの光信号およびノイズ信号の両方を
検出する。好ましくは、検定混合物中の蛍光粒子
のような一方の型の粒子から光信号を検出し、検
定混合物中の非蛍光粒子のようなもう一方の型の
粒子からノイズ信号を検出する。検出された光信
号とノイズ信号との比率を測定し、この比率を記
録する。その測定比率を機器の性能限界の閾値を
表わす先に決定された比率（以下、先決比率とよ
ぶ）と比較する。もし先決比率に到達しない場
合、検定粒子を入射光ビーム中に入れたまま機器
操作を調整して、測定比率を先決比率に到達また
は超過させ、それによつて機器は検定され、その
後分析する粒子から光信号を得るように検定され
ることを本方法は含む。

本発明はこの点の好適な実施態様では、フロー
サイトメトリー機器の検定にその方法を用い、そ
れは試験すべき粒子に関連した既知特性を持つ検
定粒子を液体流水中で流して、各検定粒子を実質
的に一時に１個づつ入射光ビームを通過させるこ
とを含む。検定粒子に関連する光信号およびノイ
ズ信号の両方を検出し、信号とノイズとの比率を
決定する。この比率は光信号とノイズ信号との間
の測定分離値として記録する。測定分離値を機器
の限界性能のための閾値を表わす先決の分離値と
比較する。もし先決の分離値に到達しない場合、
機器の操作を調整して、測定分離値を先決分離値
に到達させて、それによつて機器は検定され、ひ
きつづき分析する粒子からの光信号を得る。

本発明のもう一つの観点は、粒子の２色蛍光分
析を実行するための機器の検定に使用するための
試薬キツトである。そのキツトは第１波長で蛍光
を発光できる検定粒子を持つ第１容器からなる。
第２容器は第２波長で蛍光を発光できる検定粒子
を含有する。第３容器は実質的に蛍光を発光でき
ない検定粒子を持つている。このキツトまたは試
薬はフローサイトメトリー機器を検定するための
上述の方法に使用するのに適している。

本発明の更にもう一つの観点は蛍光分析機器を
検定するための粒子標準品に関するもので、該標
準品は特定の蛍光団と反応するまでは、自動蛍光
を含めていかなる蛍光も発光しない四酸化オスミ
ウム固定ニワトリ赤血球からなる。

本発明の原理によると、検定方法および物質は
現行の既知の使用されている検定技法へのかなり
の改善法を提供する。本発明は、検定標準品およ
び／または先に決定されて測定者が保有している
閾値を使つて粒子分析機器を測定者が検定するこ
とを可能にする。好ましくは、機器の限界性能を
明示するための閾値は、検定標的がわかるように
検定手順中測定者に表示される。閾値が達成され
るまで機器を調整およびチユーニングすることに
よつて、測定者は機器が実施される試験に正しく
機能することを確実にする。検定の感および視覚
に依存する技法は、本発明の検定手順によつて不
要とされ、検定誤差は軽減または除去され、試験
の再現性は高められる。本発明の検定手順は、適
正な検定が機器の光学系統の適正な配列を確実に
し、補正技法の実施によつてスペクトルの混合を
補償し、そして特に粒子の免疫蛍光分析のための
機器の性能を最適にするために、機器の感度につ
いて測定者に情報を提供するので、フローサイト
メトリー機器に特に適している。本発明の利点や
特色はフローサイトメトリー以外にも及び、自動
顕微鏡、蛍光顕微鏡、定量顕微鏡、画像分析機な
どのような他の分析機器にも利用できることを指
摘すべきである。

図面の簡単な説明 第１図ａから第１図ｄはそれぞれ容積、側面散
乱、蛍光色１および蛍光色２の４種類のパラメー
ターのチヤンネルに対する事例数（カウント）を
例示するヒストグラムのグラフ表示である；第１
図にはさらに容積がノイズ事例や平均チヤンネル
統計に関連した結果であつて、側面散乱、蛍光色
１および蛍光色２の平均チヤンネル目盛りには信
号、ノイズ、分離および最小値をも例示する。

第２図ａは２色蛍光分析（FL２対FL１）の点
分布グラフ表示であり、第２図ｂは蛍光分析に対
する側面散乱の点分布グラフ表示である；第２図
は機器配列目的へのチヤンネル平均をも表示す
る。

第３図ａは２色蛍光分析（FL２対FL１）の点
分布グラフ表示であり、第３図ｂは容積分析に対
する側面散乱の点分布グラフ表示である；第３図
は更に機器の光電子増倍管による蛍光色１（FL
１）、蛍光色２（FL２）および側面散乱（SSC）
の分布のチヤンネル平均を表示する。

第４図ａは未補正蛍光分析を例示する２色蛍光
分析（FL２対FL１）の点分布グラフ表示であ
る；第４図ａは蛍光色１で着色されていない分布
と着色された分布との間の平均チヤンネルの差異
をも表示する；第４図ｂは補正された蛍光分析を
例示する２色蛍光分析（FL２対FL１）の点分布
グラフ表示である；第４図ｂは補正をした後、未
着色分布と蛍光色２分布（FL２）との間の平均
チヤンネル差異をも表示する。

本発明は多種類の形態における実施態様によつ
て満足されるが、本明細書には発明の好適な実施
態様を図面を引用して詳細に記述する。本明細書
中の例は発明の原理の典型と考えるべきであり、
例示された実施態様に発明を限定するつもりでな
いことは言うまでもない。発明の範囲は特許請求
の範囲およびそれらの均等範囲によつて判断され
る。

図面を直接参照する前に、以下に図面と共に記
述される検定技法は、フローサイトメトリー機器
に関連しているものである。特に記述されている
典型的な検定手順は、ベクトンデイツキンソンイ
ムノサイトメトリーシステム社（Becton
Dickinson Immunocytometry Systems）、マウ
ンテンビユー（Mountain View）、カリホルニア
によつて市販されているFACS^TM分析器に関連し
ている。第１図のヒストグラムおよび第２〜４図
の点分布表示は検定操作中にFACS分析器のスク
リーンに見られる典型的な表示である。本発明の
原理に従つて検定操作を実施するための適当なソ
フトウエアは種々の検定操作や機能を容易にする
ためにフローサイトメトリー機器に供給され得
る。

簡単に言えば、検定されるべきフローサイトメ
トリー機器は、分析される粒子の液体流水を提供
するためのノズルまたは類似装置を含む。典型的
には、粒子の液体流水は鞘液で覆うことによつ
て、流体力学的に収束させて、粒子流液の流れに
正しい角度で通常照射される入射光ビームを通つ
て流すことができるようにする。これらの粒子が
光ビームを通過する時、各粒子に伴なう光特性を
検出し得る。それ故、蛍光を測定するための光検
出器１個以上および１以上の方向における光散乱
の吸収を測定するための光検出器などが含まれ得
る。これらの光検出器は光信号を電気信号に変換
する光電子増倍管（PMT）を含む。粒子に伴な
う光の検出に加えて、粒子が穴（オリフイス）を
通過するときに、電気的インピーダンス測定が行
なわれ得る。このインピーダンス測定は、粒子容
積に関連し、よく知られたコールター（Coulter）
の原理に基づいている。FACS分析機では、以下
に記述されるようにして検定されるが、蛍光と光
散乱（この場合は入射光ビームに対して粒子から
大体90゜への散乱を測定する側面散乱）の２種類
の色を検出するためのPMTが備えられている。
FACS分析機は更に、粒子容積に伴なう電気的イ
ンピーダンスの測定をも可能にする。従つて粒子
の４種類のパラメーターまたは特性を検出または
測定できるが、それらの全てのパラメーターは、
試料中の粒子のこれらの特性の測定においてこの
機器を用いる前に検定してなければならない。

本発明の検定技法は、機器性能下限の閾値に基
づいて検定されることをその機器の測定者に知ら
せる。この最小閾値から、粒子分析、特に免疫蛍
光測定を行なうための機器の感度がわかる。例え
ば側面散乱および容積に加えて、記述されている
特定のフローサイトメトリー機器は２種類の色の
蛍光、すなわち全体で４種類のパラメーターの検
出ができる。説明の都合上典型的な用途を例にし
て述べれば、分析される粒子の第１の蛍光色は、
FITC着色細胞で代表されるフルオレセインで標
識された粒子に関連した緑色スペクトル領域であ
り；分析される粒子の第２の蛍光色は、PE着色
細胞で代表されるフイコエリスリン標識粒子に関
連した赤色スペクトル領域であろう。もちろん、
望むならば、行なう試験および分析される粒子ま
たは細胞によつて他の蛍光団や標識剤を用いるこ
ともできる。

測定者が、例えばその日の始めに、処方された
試験用の準備のために機器のスイツチを入れる
時、機器の光学要素は配列されていないかも知れ
ない。もし実施される試験が白血球試料のような
免疫系の粒子を検査するためのデータ獲得に関連
する場合、測定者は機器がこれらの試験を行なう
のに適当な感度に検定されているかどうかの確認
を望むであろう。機器の感度性能およびそれによ
つて供給される結果を第１図に示す。第１図の詳
細を記述するにあたり、この感度試験は単に機器
が白血球や他の免疫系細胞や粒子のようなある型
の粒子を分析するのに適切に検定できるかどうか
を決めるための確認試験であることは言うまでも
ない。もし感度試験の結果が機器の最小性能のた
めの閾値が満足されたときは、機器は適切に検定
されたことを意味し、その後機器を粒子分析に用
いるのに機器を更に調整したり、配列したり、チ
ユーニングする必要はない。しかし信頼性のある
測定のためには、通常さらにいくらかの調整をし
て機器を検定する必要があるので、第１図の表示
に関して感度を決定する前に、測定者は以下の第
２−４図に関して説明される調整および検定工程
を保証することを希望するかも知れない。以下の
説明において、感度の決定およびそれを達成する
方法をまず第１図の表示をもとに記述する。

本手順を始めるには、測定者は本発明の検定粒
子を使用する。各容器に好ましくは異なつたプラ
スチツク微細球形またはビーズを有する３個の容
器を含む試薬キツトが供給される。好適な形とし
ては、これらの種々のビーズはゼラチン、0.1％
ツイーン20および防腐剤として0.1％アジ化ナト
リウムを含むリン酸緩衝液（PBS）に保持する。
約５ミクロンの直径のフルオレセイン標識
（FITC）ビーズを第１容器に用意する。約５ミ
クロンの直径のフイコエリスリン標識（PE）ビ
ーズを第２容器に用意する。約4.5ミクロンの直
径の非標識ビーズを第３容器に含める。その３個
の容器の各々のビーズの濃度は約10⁶粒子／mlで
ある。滅菌PBS3mlにFITC、PEおよび非標識ビ
ーズの３種類の試薬を１滴ずつ添加して１：１：
１の比率に混合して試料管を作製する。混合物の
入つたこの試料管を次にFACS分析機に入れて、
実質的に一時に１個の粒子を入射光ビームに通過
させる既知の方法で測定する。

容積、光散乱および２種類の蛍光決定因子に関
する信号の検出に加えて、各パラメータへのノイ
ズ信号もその機器で検出される。第１図はヒスト
グラムの型式で与えられる４つののパラメーター
の機器画面への表示を表わす。ヒストグラムのＹ
軸は粒子カウント数であり、Ｘ軸はデータ獲得を
行なう間の電気的チヤンネル数である。記述され
ている実施態様では、種々のヒストグラムのＸ軸
に沿つて255チヤンネルが存在する。ヒストグラ
ムは対数目盛りの相関で記録または表示すること
により、ノイズと信号との間のヒストグラムピー
クの分離を一定の差異として視認できるが、実際
には直線的比率として表わされるのが好ましい。

より詳しくは、光関連信号は側面散乱、FITC
およびPEに関してそれぞれ第１図ｂ，ｃおよび
ｄに示されている。まず第１図ｂを見ると、側面
散乱信号は曲線１２で示され、ノイズは領域１４
で示される。同様に第１図ｃではFIC信号は曲線
１６で示され、ノイズは領域１８で示される。第
１図ｄではPE信号は曲線２０で示され、ノイズ
は領域２２内に示される。第１図ａに示される容
積に関しては、容積信号は曲線２４で示され、ノ
イズ検出はノイズ事例数としてヒストグラムの下
に示される。

散乱および蛍光の光関連信号、すなわち第１図
ｂ，ｃおよびｄに関して、実際の光信号とノイズ
信号との間に分離または差異があることがわか
る。上述のように、信号とノイズとの間の分離は
対数目盛で計算するのが好ましいが、信号のノイ
ズへの比率はヒストグラムのＸ軸に直線的差異と
して表わされる。それ故、ヒストグラムを見る時
に、散乱、FITCおよびPEに関して信号とノイズ
のピークの間の間隔や分離を容易に認識できる。

蛍光分析についての第１図ｃおよびｄのヒスト
グラムでは、実際に測定されているものは前述の
試薬によつて与えられるような非標識ビーズに比
較した標識ビーズの平均蛍光強度間の分離量であ
る。それ故、第１図ｃでは曲線１６はFITCで標
識されたビーズの平均蛍光強度を表わし、曲線１
８は検定目的に使用された試薬混合物中の非標識
ビーズの結果として生じるノイズ強度を表わす。
同様に第１図ｄでは曲線２０はPEで標識された
ビーズの平均蛍光強度を表わし、曲線２２は検定
のために試薬混合物によつて与えられる非標識ビ
ーズからのノイズの平均強度を表わす。このよう
に、FITC標識ビーズ、PE標識ビーズおよび非標
識ビーズの等しい割合の単一の試薬混合物を与え
ることによつて、２色蛍光分析への機器の検定は
容易に達成され得る。

第１図ｂで表わされるような側面散乱信号に関
しては、ノイズが実際に検出されて、ノイズと信
号との間の分離値を測定し得る。第１図ｂの領域
１４で表わされるノイズは蛍光信号で生ずるよう
な非標識細胞によるものではないのでこれが必要
である。この図では、側面散乱（SSC）ノイズは
関連のない信号で誘発され、ノイズのための対照
信号を生ずる。従つて、対照信号を生じさせるた
めに、FL２信号が任意に選択されている。フロ
ーサイトメトリー機器でFL２基準を調整して、
機器を通る事例速度（または粒子の流速）を容
積、FL１およびFL２に関するデータを得るとき
の事例速度の約２倍にすることによつて、ノイズ
を側面散乱信号に導入する。この手段によつてノ
イズが側面散乱信号中に生じて、ノイズと散乱信
号との間に直線化された分離量が決定され得る。
ヒストグラム型式で好ましく与えられるグラフ表
示に加えて、検定される機器の画面にはデジタル
読み出しの型式で結果を表示するようにプログラ
ムすることもできる。検定手順を含めて、機器の
ためのソフトウエアは蓄積されたデータに関する
情報を供給するように容易にプログラムすること
ができる。それ故第１図ではヒストグラムの下
に、ノイズ事例および平均チヤンネル信号が測定
者によつて読めるように容積結果がデジタル読み
出し型式で記録されている。FACS分析機のよう
な機器の検定では、容積平均チヤンネルは容積ヒ
ストグラムのほぼ真中の目盛のはずである。真中
の目盛を読むということは粒子が流れるオリフイ
スが正しく選択され、機器の容積基準が適切に設
定されていることを示す。500以下のノイズ事例
レベルは機器が適切に設定されていることを意味
する。

第１図の画面には第１図ｂ，ｃおよびｄの各ヒ
ストグラムに関連したデジタル読み取り値も表示
する。SSC，FL１およびFL２の種々のパラメー
ターを信号、ノイズ、分離、最小およびロツト
IDの読み取りと共に表示する。ロツトIDおよび
最小値は相互に関連している。機器に検定用ビー
ズの混合物を入れる前に、測定者は検定手順を規
定するプログラムにロツトID番号を入力する。
検定用ビーズは種々の蛍光光度、強度などを含む
変化しやすい性質を持つので、機器の検定はこれ
らの変化しやすい性質を考慮に入れねばならな
い。従つてどのロツトID番号の検定用ビーズを
用いるかに依存して、種々の分離値が最小機器性
能のための最小または閾値として予め確立されて
いる。ソフトウエアを前もつてプログラムし得る
ので、ロツトID番号を検定手順の最初に測定者
がプログラムに入れさえすれば先決の最小分離値
が確立されて第１図ののデイスプレーに表示され
る。

第１図ｂ，ｃ，およびｄのそれぞれのヒストグ
ラムに関連した側面散乱、FL１およびFL２の信
号およびノイズに対する平均中央チヤンネル値が
第１図の底部に表示されている。例えば、側面散
乱信号は192の平均チヤンネル中央値を持つこと
が表示され、これに対してノイズの平均チヤンネ
ル中央値は16である。これらの信号およびノイズ
結果の間の分離は176と記録される。側面散乱信
号のために先に決定された最小分離値は160であ
る。この最小側面散乱分離値は、機器が側面散乱
測定を確実に行なうために十分検定するための目
標の水準である。それ故、実際に測定された分離
は176であるので最小を越えている。従つてその
機器は側面散乱を検出信号とするその後の粒子試
験を検定できるとみなされる。

信号、ノイズおよび分離の平均チヤンネル中央
値のデジタル表示はFL１およびFL２信号につい
ても提供される。第１図の例に示されるように、
FL１およびFL２の両方の分離値は最小分離値を
越えているので、機器がこれら２種類の信号につ
いても適切に検定されていることを測定者は容易
に判断できる。上述の検定手順のソフトウエア
は、対数目盛で信号とノイズとの比率を検定する
が、画面上ではピークが相互に離れ、それ故解釈
するのに便利なように間隔をあける直線性（常
数）を基にして比率を表示する。散乱や蛍光の光
関連信号の多くまたは全てが先に決められた最小
以下の分離値と測定された場合には、適切な検定
のために更に機器を調整しなければならない。第
２，３および４図は機器性能を最適にするように
光学的要素を配列するためにこの検定調整を実施
し、PM調整を行ない、粒子の２色蛍光分析にお
けるスペクトルの混合や重複を補正する際の
FACS分析機の画面表示を例示する。

光学的要素を最適な性能のために適切に配列さ
れたことを確実にするために機器を調整するに
は、上述の試薬キツトの第１容器からFITC標識
ビーズを用いて検定を実施することができる。滅
菌PBS1mlにFICビーズ試薬を１滴加えてFITC標
識ビーズ懸濁液の試験管を用意する。次にこの試
験管をFACS分析機に装着して、検定用ソフトウ
エアを組合せると画面に第２図に示されるような
点分布図が表示される。第２図ａはFL２対FL１
を示し、第２図ｂは側面散乱（SSC）対FL１を
示す。点分布図の下にはFL１，FL２およびSSC
の信号のチヤンネル平均に関するデジタル情報が
表示されている。まず第２図ａに関しては言及す
れば、緑色（FITC）ビーズの点分布が表示の中
央付近に位置すると、検定が達成される。点分布
がこの位置に移動するように機器の蛍光PMT電
圧を調整する。点分布図の下に表示されたFL１
およびFL２信号平均に関して述べれば、測定者
はこれらの信号を最大にすることによつて検定を
確かなものにする。集光レンズ制御のような機器
の光学的要素とこれらの信号の平均が最大になる
ように調整し、しかも、これらがほぼ同時に最大
になるようにすべきである。最大付近になると、
第２図ａに表示される点分布は測定者によつてで
きるだけ〓間のないようにされる。第２図ｂおよ
び点分布図の下に示されるSSC信号平均に関して
述べれば、通常前もつて決められた目標値が検定
のための目標である。例えば、FACS分析機で
は、SSC信号チヤンネル平均の目標は約190であ
る。この目標値を達成するため、SSC信号平均が
約190に到達するまで、測定者は機器の側面散乱
（SSC）PMT電圧を調整する。光学的要素または
PMTのその他の調整もSSC信号平均を目標水準
に到達させるのに必要でありうる。点分布および
デジタル読み取り数の両者は、測定者が適当な光
学的配列に機器を検定する手助けをする。

光学的配列と同様にして、光電子増倍管
（PMT）も検定手順中に調整されうる。第３図は
PM調整に関連した典型的な点分布図を示す。第
３図ａはFL２対FL１の点分布図であり、第３図
ｂは側面散乱（SSC）対容積の点分布図である。
PMT調整を行なうべきかどうかの決定には、測
定者は上述とは異なる検定粒子を用いて手順を行
なう。このPMT調整の場合、測定者は滅菌
PBS1mlに上述の試薬キツトの非標識ビーズ容器
から１滴の非標識ビーズを添加して、非標識ビー
ズ懸濁液を用意する。次にこの非標識ビーズの試
験管をFACS分析機に装着し、検定用ソフトウエ
アと組合せると、画面に第３図に示されるような
点分布図が表示される。点分布図に加えて、第３
図はFL１，FL２およびSSCの３種類のパラメー
ターの分布のチヤンネル中央平均値を表わす３つ
の数字も表示される。検定粒子をコントロールさ
れた一定の速度で機器中に流しながら、測定者は
FL１平均、FL２平均およびSSC平均の値を前も
つて決めた目標値に合せる。FL１およびFL２平
均の両方に、前もつて決められた目標は例えば30
付近に設定され、もしその値が達成されない場
合、測定者は画面に表示されるFL１またはFL２
のチヤンネル平均ができるだけ30近くに設定され
るまで機器の各蛍光１または蛍光２のPMT電圧
調整をする。同様にして、SSC平均の目標を例え
ば190に設定する。もしこの水準が最初に表示さ
れない場合、測定者は画面に表示されるSSCのチ
ヤンネル平均ができるだけ190近くに設定される
まで機器の光散乱のPMT電圧調整をする。もち
ろん、これらの平均値は典型的な目標値を意味す
るものであつて、機器設計、実施する試験やその
他の要素によつて変化し得ることは言うまでもな
い。もしチヤンネル平均の満足な値を達成できな
い場合、測定者は第２図に関連して記載した機器
の配列手順に戻らねばならない。

PMを調整して機器の光学的要素の配列を行な
つた後、機器の検定を達成するにはもう一つの調
整を行なう。この追加された調整は、２色蛍光分
析を行なう場合におけるスペクトルの混合や重複
の補正に関連する。この手順は望ましくない緑色
信号を赤色（PE着色）集団から除去し、望まし
くない赤色信号を緑色（FITC着色）集団から除
去して、蛍光補正のための調整を果す。

蛍光補正手順を行なうには、上述の感度試験に
関して作成したものと同様の検定粒子の試験管で
始めるのが好ましい。この試験管は滅菌PBS3ml
に上述容器からFITC，PEおよび非標識ビーズの
各々１滴ずつを添加することによりその３種類の
試薬の１：１：１混合物として用意される。この
試験管が分析機器に装着されると、検定手順用の
ソフトウエアプログラムと組合わされて、画面は
第４図ａに見られるような非補正蛍光を表わす点
分布図を即時に表示する。第４図ａに表示された
３つの分離した点の集団は非着色、緑色着色およ
び赤色着色検定ビーズを表わす。非着色ビーズは
スクリーン上で領域２８として例示される左下部
角の正方形の内側に位置するのが典型である。赤
色（PE着色）ビーズは領域３０として示される
非着色集団の上方部位に位置するのが典型であ
る。緑色集団は領域３２として示される非着色集
団の右側部位に位置する。蛍光補正が機器によつ
て与えられるまで、領域２８，３０および３２の
位置は近似だけである。第４図ａの点分布図の下
にはFL１補正およびFL２補正のデジタル表示が
ある。もしこれらのデジタル値が零または零近く
の値として変動しない場合、蛍光補正のための調
整を行なわねばならない。

画面に記録される補正値ができるだけ零に近づ
くまで、機器のFL１補正およびFL２補正を調整
することによつて、２色蛍光分析のための補正を
する。調整を行つた後、補正値は零の上方と下で
等しく変動及び変化するはずである。FL１補正
に関して、補正された値は非着色集団の平均横軸
チヤンネルと緑色着色集団の平均横軸チヤンネル
との間の差を表わす。FL１補正調節を機器で調
整して画面上の値が零に近ずくと、点分布図の緑
色集団３２は第４図ｂで見られるように、水平軸
に平行な水平軸について非着色集団２８と等しく
なるまで下方向に移動するはずである。

同様の方法で、画面上のFL２補正の次に記載
されている平均チヤンネル差異は、非着色と赤色
着色集団の平均垂直チヤンネルの相異を表わす。
FL２補正調節を機器で調整して画面上の値が零
に近ずいた時、点分布図の赤色集団３０は第４図
ｂに示されるように垂直軸に平行な垂直軸につい
て非着色集団２８と等しくなるまで垂直に移動す
るはずである。FL１およびFL２調節のこれらの
調整は、赤色集団から不要な緑色信号の集団を電
気的に差し引くこと、および緑色集団から不要の
赤色信号の集団を電気的に差し引くことによつて
蛍光補正を達成する。コンピユータプログラムに
よつて零に設定された画面上の蛍光補正の前もつ
て決められた値が満たされると補正は達成され
る。もし満足なまたは目標の設定を達成できない
場合、測定者は上で説明されたような配列および
PMT調整手順に戻る必要がある。

配列、PMT調整および蛍光補正が達成される
と、測定者は第１図に基づいて上述した感度試験
に戻る。もし検定される各パラメーターについて
最小分離値を達成すれば、測定者は実施せんとす
る試験が適切に検定されているという十分な信頼
を持つてその機器の使用に移ることができる。

ここに記述された検定手順に利用される検定粒
子に関しては、標準品として種々の粒子が使用し
得る。例えば分析を受ける実際の粒子と同様の特
性を持つか、または持つように処理され得る粒子
または細胞のような生物学的試料を用いることが
できる。この方針に沿うと、ニワトリ赤血球は適
切な選択技法で使用され得る。ニワトリ赤血球細
胞を修飾した形態の粒子は粒子標準品として使用
され得る。特に蛍光で標識した四酸化オスミウム
固定ニワトリ赤血球細胞は、生物学的細胞と同様
の大きさの散乱特性を持つので、粒子標準品とし
て役立つ。更に四酸化オスミウム固定化は細胞の
自己蛍光を消す。これらの細胞をビオチン化し
て、既知の方法でアビジンに結合された蛍光団と
反応させる。細胞に結合したアビジン複合体の蛍
光は細胞上の四酸化オスミウムによつて消される
ことはない。アビジンに結合される特定の蛍光団
は細胞表面着色に特色をもつスペクトル性を持
つ。多種類の蛍光団が下記のものを含めて複合体
に使用し得る。

本発明の検定粒子として最も好適なものはプラ
スチツク微細球状ビーズである。このようなビー
ズは大体均一の直径に仕上げて、蛍光団や他の色
素標識剤が表面結合するための好適な表面特性を
有し得る。実質的に球状のビーズは0.5と20ミク
ロンの間の直径（最も好ましくは２と８ミクロン
の間）を持つように作製して、これらの検定用ビ
ーズの白血球と同程度の大きさにする。ビーズは
通常は充実体として作製されるがリポゾームや他
の微小担体のような中空や小胞にもできる。更に
ビーズは本発明に従つて作用するためには完全な
球形である必要はない。ポリスチレン、ポリアク
リルアミドおよび他のラテツクス物質がビーズの
成形に使用することができ、ポリビニルクロリ
ド、ポリプロピレンなどのような他のプラスチツ
ク物質も利用することができる。上述のビーズへ
のフルオレセインやフイコエリスリン標識の他
に、本発明用の蛍光標識剤としてアロフイコシア
ニン、テキサスレツド、ローダミン、ローダミン
型化合物およびその他の蛍光着色剤も使用でき
る。機器の検定用のこれらの試薬のキツトの作製
では、標識あるいは非標識のビーズは10⁵から10⁸
粒子／ml（好ましくは少なくとも10⁶粒子／ml）
の範囲の濃度で存在するようにビーズを水中分散
物として供給するのが好ましい。

検定手順をフローサイトメトリー機器を具体的
な例として上述したが、本発明はこれに限定され
るものではない、実際、本発明の検定手順は移動
粒子のみならず非移動粒子を分析する機器にも適
用できる。画像分析機とともに蛍光、自動および
定量顕微鏡のような種々の顕微鏡も本発明に従つ
て検定することができる。

従つて、本発明は分析中の粒子から少なくとも
１種類の光関連信号を得るための機器を、使用す
る前に検定するための方法および物質を提供す
る。本発明は適当なソフトウエアを使用して、機
器で特定の光関連パラメーターを検定することを
決定するために満たさねばならない信号のノイズ
への比率の最小値を表示することができる。直線
性目盛での差異としての信号のノイズへの比率を
記録することによつて、測定者に便利になるばか
りでなく当て推量、目分量への依存や誤差が実質
的に減少または排除される。本発明の技法および
物質は臨床診断的応用にもすばらしい確実性を与
える。

【図面の簡単な説明】

第１図ａないしｄは、夫々粒子容積、側面散
乱、蛍光色１および蛍光色２と、粒子カウント数
との関係を示すヒストグラフであり、第１図ａな
いしｄの下方の文字は、上記ヒストグラフと組合
せて本発明に係る機器を検定するために該機器の
表示装置に上記ヒストグラフと共に表示された情
報の一例を図示したものである。第２図ａは２色
蛍光分析における蛍光１と蛍光２の関係を示す点
分布グラフであり、第２図ｂは蛍光１と側面散乱
の関係を示す点分布グラフであり、第２図ａおよ
びｂの下方の文字は、上記点分布グラフを利用し
て本発明に係る機器を検定するために必要な情報
の一例が機器の表示部に表示された状態を図示し
たものである。第３図ａは２色蛍光分析における
蛍光１と蛍光２の関係を示す点分布グラフであ
り、第３図ｂは粒子容積分布に対する側面散乱の
関係を示す点分布グラフであり、第３図ａおよび
ｂの下の文字は、上記点分布グラフを利用して本
発明に係る機器を検定するために必要な情報の一
例が機器の表示部に表示された状態を図示したも
のある。第４図ａは、未補正状態の機器での蛍光
分析における蛍光１と蛍光２の関係を示す点分布
グラフであり、第４図ｂは、補正後の機器での蛍
光分析における蛍光１と蛍光２の関係を示す点分
布グラフであり、第４図ａおよびｂの下方の文字
は、上記点分布グラフを利用するために有用な情
報の一例の機器の表示部に表示された状態を図示
したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 第１波長で蛍光を発光できる検定粒子を有す
   る第１容器； 第２波長で蛍光を発光できる検定粒子を有する
   第２容器；および 実質的に蛍光を発光できない検定粒子を有する
   第３容器； からなる粒子の２色蛍光分析を実施する機器の検
   定に用いる試薬キツト。 ２ 該検定粒子の全てが、実質的に0.5と20ミク
   ロンの間の直径を持つ球形ビーズである特許請求
   の範囲第１項記載のキツト。 ３ 該ビーズが、プラスチツク製物質でできてい
   る特許請求の範囲第２項記載のキツト。 ４ 第１容器内の粒子が表面結合型蛍光染色剤で
   標識されている特許請求の範囲第１項記載のキツ
   ト。 ５ 蛍光染色剤がフルオレセインである特許請求
   の範囲第４項記載のキツト。 ６ 第２容器内の粒子が表面結合型蛍光染色剤で
   標識されている特許請求の範囲第１項記載のキツ
   ト。 ７ 蛍光染色剤がフイコエリスリンである特許請
   求の範囲第６項記載のキツト。 ８ ３個の容器の各々の粒子が少なくとも10⁵粒
   子／mlの濃度で水溶液中に存在する特許請求の範
   囲第１項記載のキツト。 ９ フルオレセイン標識されて実質的に球形であ
   るビーズを有する第１容器； フイコエリスリン標識されて実質的に球形であ
   るビーズを有する第２容器； 標識されておらず、実質的に球形のビーズを有
   する第３容器からなり； 上記全ての容器内のビーズはプラスチツクでで
   きていて、0.5と20ミクロンの間の直径を持ち、
   該容器内に少なくとも10⁵ビーズ／mlの濃度で水
   溶液中に存在することからなる、粒子の２色蛍光
   分析の実施のための機器の検定に用いる試薬キツ
   ト。