JPH04360855A - カテコール誘導体、その製造法及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アラキドン酸カスケー
ドのリポキシゲナーゼ系代謝酵素のうち、５−リポキシ
ゲナーゼ阻害活性を有し、この作用に基づく、気管支喘
息などのアレルギー性疾患や、各種炎症の治療や予防に
有効なカテコール誘導体、その製造法及びそれを有効成
分として含有する医薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】気管支喘息などのアレルギー性疾患や、
各種炎症には、ヒスタミン、セロトニン、プロスタグラ
ンジン（ＰＧ）、ロイコトリエン（ＬＴ）、トロンポキ
サン（ＴＸ）、血小板活性化因子、リゾレシチン、各種
リンホカインなど多数の因子が関与しているが、これら
の因子の中でＰＧとＬＴはその数と生理活性の多様性か
ら、アレルギー性疾患や各種炎症反応に特別に重要な役
割を果たしている。アラキドン酸代謝系に異常が起こる
と、細胞内においてＰＧ、ＬＴ、ＴＸなどのアラキドン
酸代謝産物の産生過剰や産生不足が生じてそれらが原因
となって血管透過性亢進、気管支収縮、血小板凝集促進
反応などいろいろな病的状態が出現し、各種炎症やアレ
ルギー性疾患の起因となっている。アラキドン酸代謝経
路に関与するいろいろな酵素を特異的に阻害する薬剤が
抗炎症剤として数多く開発されている。例えばシクロオ
キシゲナーゼ活性を阻害し、その結果ＰＧ生成を抑制す
ることにより抗炎症作用を示す薬剤として、アスピリン
やインドメタシンなど非ステロイド抗炎症剤がある。こ
れらはＰＧ系が関与する炎症には有効であるが、ＬＴを
起因とする炎症を抑制する作用はない。気管支喘息の強
力なケミカルメディエーターとしてアナフィラキシーの
遅反応性物質（ｓｌｏｗ　ｒｅａｃｔｉｎｇ　ｓｕｂｓ
ｔａｎｃｅ　ｏｆ　ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ　；　ＳＲ
Ｓ−Ａ）の存在が明らかにされている。このＳＲＳ−Ａ
はＬＴＣ４、ＬＴＤ４及びＬＴＥ４の混合物である。ま
た、ＬＴＢ４は強力な白血球誘引作用、白血球活性化作
用を有し、炎症への関与が注目されている。従って、ア
ラキドン酸からこれらＬＴを産生する際の初発酵素であ
る５−リポキシゲナーゼを阻害する化合物は、気管支喘
息などのアレルギー疾患や、各種炎症に対する治療や予
防に有効であると予想される。このような観点から５−
リポキシゲナーゼ活性を阻害する化合物が数多く報告さ
れている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来５
−リポキシゲナーゼ阻害活性を有すると報告されている
化合物は、その抗アレルギー作用、抗炎症作用及び安全
性において充分満足すべきものではなく、未だ医薬品と
して上市されていないのが現状である。従って本発明は
、優れた５−リポキシゲナーゼ阻害活性を有し、かつ安
全性の高い新規化合物、及びこれを有効成分とする医薬
を提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、５
−リポキシゲナーゼ阻害活性を抗炎症剤や抗アレルギー
剤をスクリーニングする指標として、数多くの微生物の
代謝産物の中からスクリーニングしてきたところ、スト
レプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する
微生物によって産生される新規なカテコール誘導体が著
明な５−リポキシゲナーゼ阻害作用、抗炎症作用及び抗
アレルギー作用を有し、医薬品として有用であることを
見出し本発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明は次式（１）

【０００６
】

【化１】

【０００７】で表わされる４−（２−ニトロエチル）−
１，２−ベンゼンジオール、その製造法、これを有効成
分とする医薬及びこれを生産する微生物を提供するもの
である。

【０００８】本発明の４−（２−ニトロエチル）−１，
２−ベンゼンジオール［化合物（１）］は、例えばスト
レプトミセス属に属する化合物（１）生産菌を培養し、
この培養物から化合物（１）を採取することによって製
造することができる。

【０００９】化合物（１）生産菌の例としては、仙台市
の土壌から分離したＭＡ−１１８９株が挙げられる。Ｍ
Ａ−１１８９株の菌学的性質を以下に示す。

【００１０】（ａ）　形態 グルコース・アスパラギン寒天培地、イースト・麦芽寒
天培地及びオートミール寒天培地上で、２５℃、１４日
間培養した培養物について顕微鏡及び電子顕微鏡を用い
て観察した。その結果、成熟胞子は、直線状に３０個を
超える数の胞子鎖として生じた。胞子は電子顕微鏡観察
によれば円筒状であり、大きさは０．９〜１．４×０．
６〜０．９μｍであった。胞子表面は平滑であった。

【００１１】（ｂ）　各種培地における生育状態（１）
　　シュークロース・硝酸塩寒天培地白色気菌糸；気菌
糸生育良好；コロニー表面やや紫がかった桃色；白色基
中菌糸 （２）　　グルコース・アスパラギン寒天培地白色気菌
糸；分生子は灰色；表面は薄褐色（３）　　グリセリン
・アスパラギン寒天培地淡黄色の光沢のあるコロニー；
表面白色粉状あるいは淡桃色；裏面黄味薄褐色〜黒褐色 （４）　　スターチ・無機塩寒天培地 白色で盛り上がったコロニー；表面淡桃色〜白色；裏面
淡黄色で中央青みがかった黒色 （５）　　チロシン寒天培地 中央部青みがかった黒色；周辺淡黄色の偏平コロニー；
裏面も同色 （６）　　栄養寒天培地 淡黄色表面光沢あるコロニー；気菌糸は白色；裏面は淡
黄色 （７）　　イースト・麦芽寒天培地 全面白色〜紫がかった桃色；裏面薄褐色（８）　　オー
トミール寒天培地 コロニー表面は白色〜紫がかった桃色；裏面淡黄色なお
、上記全ての培地において、培地中への拡散性色素の産
生は、認められない。

【００１２】（ｃ）　生理的性質 （１）　　生育温度範囲 １０〜３７℃で良好に生育し、２０〜３２℃で特に良好
に生育する。 （２）　　ゼラチンの液化　　　　　　　　少し液化（
３）　　スターチ加水分解　　　　　　　　＋（４）　
　リトマスミルク凝固・ペプトン化凝固なし、ややペプ
トン化 （５）　　メラニン様色素生成 チロシン寒天培地　　　　　　　　　　　　　　　　生
成なしペプトン・イースト鉄寒天培地　　　　生成なし
（６）　　糖資化性 Ｌ−アラビノース　　　　　　　　＋ Ｄ−キシロース　　　　　　　　　　＋Ｄ−グルコース
　　　　　　　　　　＋Ｄ−フラクトース　　　　　　
　　− シュークロース　　　　　　　　＋ イノシトール　　　　　　　　　　− Ｌ−ラムノース　　　　　　　　　　−ラフィノース　
　　　　　　　　　− Ｄ−マンニット　　　　　　　　　　−（７）　　細胞
壁分析 本菌株の全細胞加水分解物を分析した結果、ＬＬ−ジア
ミノピメリン酸が含まれていた。従って、本菌株の細胞
壁はＩ型であると考えられた。

【００１３】以上の性状からＭＡ−１１８９株はストレ
プトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　属に属する
菌と同定し、通産省工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌第１２２７３号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１２２７３）
として寄託した。

【００１４】ＭＡ−１１８９株は、他の放線菌の株と同
様にその性状が変化し易く、例えば紫外線、Ｘ線或いは
各種薬品などを用いる人工的な変異手段により容易に変
異株を得ることが可能であるが、このようにして得られ
た変異株も化合物（１）を産生する限り、本発明に使用
することができる。

【００１５】本発明により、化合物（１）を製造するに
は、まず前記菌株を通常のストレプトミセス属に属する
菌株が増殖しうる栄養源を含む培地で好気的に培養する
。栄養源としては、従来からストレプトミセス属の菌株
の培養に用いられている公知のものが使用できる。培地
としては、特に麦芽エキス培地として知られている麦芽
エキス、ペプトン及びグルコースからなる培地、或いは
イースト・麦芽（ＹＭ）培地などの液体培地が好適に用
いられる。培養法としては公知の各種好気的培養方法を
用いることができるが、液体培地による振盪培養法が大
量生産の上から最も好ましい。培養温度は約１０〜３７
℃、培地のｐＨは中性及至微酸性が好ましい。培養開始
後２〜７日経過すると培地中に化合物（１）が蓄積され
るので培養を停止し、培養液を濾別して培養上清を得る
。かくして得られた培養上清から化合物（１）を採取す
るには、培養上清を吸着カラムクロマトグラフィーにか
けた後、メタノールで溶出する。５−リポキシゲナーゼ
阻害活性が認められるメタノール溶出画分を減圧下で濃
縮し、酢酸エチルで抽出する。抽出液を減圧下で濃縮し
、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかける
。次いでメタノール含有クロロホルムのメタノール濃度
をあげつつ溶出し、５−リポキシゲナーゼ阻害活性の認
められる溶出画分を減圧下濃縮し、最後に高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製する。

【００１６】本発明化合物（１）はアラキドン酸カスケ
ードにおける５−リポキシゲナーゼの著明な阻害作用を
示し、その代謝産物である５（Ｓ）−ヒドロペルオキシ
エイコサテトラエン酸（５−ＨＰＥＴＥ）、ロイコトリ
エン、５（Ｓ）−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（５
−ＨＥＴＥ）などの生成抑制作用を示す。また本発明化
合物（１）は毒性試験による毒性が極めて低いことから
、本発明化合物（１）を有効成分として含有する医薬は
気管支喘息などのアレルギー性疾患やリウマチ性疾患、
乾癬その他各種炎症等の治療・予防に有用である。

【００１７】本発明化合物（１）を有効成分として含有
する医薬は、本発明化合物（１）をそのまま、或いは公
知の担体や賦形剤を用いて錠剤、カプセル剤、液剤、注
射剤、坐剤等の剤型にして経口的又は非経口的に投与す
ることができる。投与量はその対象や経路、症状などに
よって異なるが、例えば成人の気管支喘息に対して投与
する場合は通常０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重程度投与す
るのがよい。

【００１８】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

【００１９】実施例１（化合物（１）の製造）（培養） 培地組成（ＹＭ培地） グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１０ｇペプトン（Ｄｉｆｃ
ｏ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　５酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　３麦芽エキス（Ｄｉ
ｆｃｏ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　３精製水　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１，０００ｍ
ｌｐＨ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６．２前記
組成のＹＭ培地１００ｍｌを容量５００ｍｌの三角フラ
スコに分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌
した。この滅菌培地にＭＡ−１１８９株を一白金耳接種
し、２５℃で毎分２５０回転の条件で４日間振盪培養し
て種培養とした。化合物（１）を生産するために、容量
３ｌの三角フラスコ６本にＹＭ培地１．５ｌずつを新た
に分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌して
生産培地とし、この培地で前記によって調製した種培養
液を各三角フラスコに１５ｍｌずつ接種し、２５℃で毎
分２５０回転の条件で４日間振盪培養した。以上のよう
な培養を５回行って、最終的に４５ｌの培養液を得た。 このようにして得られた培養液を吸引濾過して培養上清
と菌体を分離した。 （精製）前記により得られた培養上清を７．５ｌの吸着
クロマトグラフィーカラムＨＰ−２０にかけた後、２０
％メタノール水溶液２５ｌ、５０％メタノール水溶液２
５ｌ及び１００％メタノール２５ｌの順に溶出した。５
−リポキシゲナーゼ阻害活性は５０％メタノール溶出区
及び１００％メタノール溶出区にのみ認められたので、
これらの溶出区を合わせて減圧下濃縮してメタノールを
完全に留去した。残った水溶液を塩酸でｐＨ３に調整し
た後、酢酸エチル５ｌで３回抽出を行って抽出液を合わ
せた。次いでこの酢酸エチル抽出液を飽和ＮａＨＣＯ３
水溶液５ｌで３回洗浄し、更に無水Ｎａ２ＳＯ４を加え
て脱水した。脱水処理後Ｎａ２ＳＯ４を除去し、減圧下
で酢酸エチルを留去したところ、油状物質が得られた。 この油状物質を５００ｇのシリカゲルカラムにかけ、ク
ロロホルム中メタノールの濃度を段階的にあげていく方
法で溶出した。即ち、メタノール０％、２％、４％、及
び６％の溶液各５ｌでそれぞれ溶出した。メタノール２
％溶出区にのみ５−リポキシゲナーゼ阻害活性が認めら
れたので、この溶出区のみを減圧下濃縮した。得られた
濃縮物を以下の条件のＨＰＬＣで精製した。 　　溶出条件；　　　　　０分　　　Ａ＝１００　％、
　Ｂ＝０％　　　　→　　５０分　Ａ＝７０％、　　　
　　　　　　　　　　　　　　Ｂ＝３０％の濃度勾配を
つけて１０ｍｌ／ｍｉｎで溶出　　この結果、１９〜２
１分の溶出区に活性が認められた。この画分についてＨ
ＰＬＣ及びガスクロマトグラフィーで純度検定を行なっ
たところ、ほぼ純品と確認されたので機器分析にて構造
解析を行なった。その結果を以下に示す。

【００２０】（１）　分子量 質量分析　　：　　１８３ 高分解能質量分析　　：　１８３．０４５７（２）　紫
外部吸収スペクトル（溶媒：メタノール）図１ （３）　赤外部吸収スペクトル（ＮａＣｌに塗布）図２ （４）　１Ｈ−　核磁気共鳴スペクトル［４００ＭＨｚ
、溶媒ＣＤ３ＯＤ、内部標準（ＣＨ３）４Ｓｉ］ 図３ （５）　溶解性 メタノール　　　　　　　　　　易溶 アセトン　　　　　　　　　　　　易溶クロロホルム　
　　　　　　　難溶 酢酸エチル　　　　　　　　　　溶 ｎ−ヘキサン　　　　　　　　　　不溶水　　　　　　
　　　　　　　　　　　　不溶（６）　構造 以上（１）〜（５）の物性より、得られた化合物は４−
（２−ニトロエチル）−１，２−ベンゼンジオールと同
定した。

【００２１】実施例２（５−リポキシゲナーゼ阻害作用
）ＲＢＬ−１細胞（ｒａｔ　ｂａｓｏｐｈｉｌｉｃ　ｌ
ｅｕｋｅｍｉａ、大日本製薬より購入）１．０×１０８
細胞を、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）　
で２回洗って０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液を加えて１ｍ
ｌとした後超音波で細胞を破砕する。得られた細胞破砕
液を１００，０００×ｇで９０分間超遠心にかけ、その
上清を５−リポキシゲナーゼ酵素液とする。この酵素液
２５０μｌと０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５
）１．７５ｍｌ　、アラキドン酸１００μＭ、ＣａＣｌ
２　１ｍＭ１ｍｌ、ＡＴＰ（アデノシン三燐酸）１ｍＭ
及び本発明化合物（最終濃度が１０μＭ、３．０μＭ、
１．０μＭ、０．３μＭ、及び０．１μＭからなる）と
からなる反応液を３７℃で１０分間反応させる。反応液
に１Ｎ−ＨＣｌ　５０μｌを加えて反応を停止させ、酢
酸エチル６ｍｌで抽出する。この抽出液を減圧下で濃縮
し、この濃縮液を天野らの方法（ビタミン、５９、２１
１−２１９（１９８５））に従ってＨＰＬＣにかけ、Ｕ
Ｖ検出器で５−ＨＥＴＥを定量する。５−リポキシゲナ
ーゼを５０％阻害する本発明化合物（１）の濃度（ＩＣ
５０）は、５−ＨＥＴＥの生成を、対照群と比較して、
５０％抑制するときの本発明化合物（１）の濃度で表さ
れる。その結果、化合物（１）の５−リポキシゲナーゼ
阻害活性のＩＣ５０は３．７　×１０−６Ｍであった。

【００２２】実施例３（マウスにおける単回投与毒性試
験） 化合物（１）を５週齢のＩＣＲ系雄性マウス（日本エス
エルシーより購入）マウスの静脈内へ単回投与し、１４
日間の死亡例を観察した。その結果、化合物（１）は１
０ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ投与において死亡例は
全く見られず、１４日後の剖検においても何ら異常は見
られなかった。故にマウスに対する化合物（１）の静脈
内単回投与による致死量は２００ｍｇ以上である。

【００２３】

【発明の効果】本発明の化合物（１）は、著明な５−リ
ポキシゲナーゼ阻害作用を有し、かつ安全性も高く、気
管支喘息などのアレルギー性疾患やリウマチ性疾患、乾
癬その他の各種炎症などの治療・予防薬として有用であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】化合物（１）の紫外部吸収スペクトルを示す図
面である。

【図２】化合物（１）の赤外部吸収スペクトルを示す図
面である。

【図３】化合物（１）の１Ｈ−　核磁気共鳴スペクトル
を示す図面である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　４−（２−ニトロエチル）−１，２−
   ベンゼンジオール。
2. 【請求項２】　　ストレプトミセス属に属する４−（２
   −ニトロエチル）−１，２−ベンゼンジオール生産菌を
   培養し、その培養物より４−（２−ニトロエチル）−１
   ，２−ベンゼンジオールを採取することを特徴とする、
   ４−（２−ニトロエチル）−１，２−ベンゼンジオール
   の製造法。
3. 【請求項３】　　４−（２−ニトロエチル）−１，２−
   ベンゼンジオールを有効成分とする５−リポキシゲナー
   ゼ阻害剤。
4. 【請求項４】　　４−（２−ニトロエチル）−１，２−
   ベンゼンジオールを有効成分とする抗炎症剤。
5. 【請求項５】　　４−（２−ニトロエチル）−１，２−
   ベンゼンジオールを有効成分とする抗アレルギー剤。
6. 【請求項６】　　ストレプトミセス属に属する４−（２
   −ニトロエチル）−１，２−ベンゼンジオール生産菌。
7. 【請求項７】　　ストレプトミセス　　エスピー．ＭＡ
   −１１８９（微工研菌寄第１２２７３号）である請求項
   ６記載の４−（２−ニトロエチル）−１，２−ベンゼン
   ジオール生産菌。