JPH0436193A - 膜型ホスホリパーゼａ↓２を認識するモノクローナル抗体および膜型ホスホリパーゼａ↓２の免疫測定法 - Google Patents
膜型ホスホリパーゼａ↓２を認識するモノクローナル抗体および膜型ホスホリパーゼａ↓２の免疫測定法Info
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- JPH0436193A JPH0436193A JP2142462A JP14246290A JPH0436193A JP H0436193 A JPH0436193 A JP H0436193A JP 2142462 A JP2142462 A JP 2142462A JP 14246290 A JP14246290 A JP 14246290A JP H0436193 A JPH0436193 A JP H0436193A
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- hybridoma
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
厳呈上二上月遣！
本発明は、模型ホスホリパーゼＡ、を認識するモノクロ
ーナル抗体、該モノクローナル抗体を産生ずるハイブリ
ドーマ、該モノクローナル抗体の製造法、および該モノ
クローナル抗体を用いる免疫測定法に関する。
ーナル抗体、該モノクローナル抗体を産生ずるハイブリ
ドーマ、該モノクローナル抗体の製造法、および該モノ
クローナル抗体を用いる免疫測定法に関する。
鴛Ｊ巨りｉ宣
ホスホリパーゼＡ ＊（ＰＬＡＩ ）（ＥＣ３，１，１
，４＞はｓｎ−グリセロ−３−リン脂質の２位のアシル
基を加水分解する酵素で、膵液やヘビ毒中に含まれてい
ることがよく知られており、膵ＰＬＡ！は膵疾患時にそ
の血中レベルが上昇することが認められている（小川ら
、現代医療２０ （１９８８） ３０１３−３０１７）
、１．カＬＰＬＡ、は、これら外分泌系に存在するばか
りでなく、生体内のほとんどの細胞にも微量ではあるが
見出されており（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｓｃｈ、 Ｈ，
ｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ （Ｈａｗｔｈｏｒ
ｎｓ、 Ｊ、 Ｎ、 ａｎｄ Ａｎｓａｌｌ、 Ｇ、
Ｂ、 ａｄｓ）（１９８２） ｐｐ、３１３−３５７．
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−ＨｏｌｌａｎｄＢｉ
ｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、 Ａｍｓｔｅｒｄａｍ
）、膜リン脂質の代ｌｉ１＃ｌｉ節やアラキドン酸を介
するエイフサノイド合成に重要な役割を果たす（Ｖａｎ
ｄｅｎ Ｂｏｓｃｈ、 Ｈ，。
，４＞はｓｎ−グリセロ−３−リン脂質の２位のアシル
基を加水分解する酵素で、膵液やヘビ毒中に含まれてい
ることがよく知られており、膵ＰＬＡ！は膵疾患時にそ
の血中レベルが上昇することが認められている（小川ら
、現代医療２０ （１９８８） ３０１３−３０１７）
、１．カＬＰＬＡ、は、これら外分泌系に存在するばか
りでなく、生体内のほとんどの細胞にも微量ではあるが
見出されており（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｓｃｈ、 Ｈ，
ｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ （Ｈａｗｔｈｏｒ
ｎｓ、 Ｊ、 Ｎ、 ａｎｄ Ａｎｓａｌｌ、 Ｇ、
Ｂ、 ａｄｓ）（１９８２） ｐｐ、３１３−３５７．
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−ＨｏｌｌａｎｄＢｉ
ｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、 Ａｍｓｔｅｒｄａｍ
）、膜リン脂質の代ｌｉ１＃ｌｉ節やアラキドン酸を介
するエイフサノイド合成に重要な役割を果たす（Ｖａｎ
ｄｅｎ Ｂｏｓｃｈ、 Ｈ，。
Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ （１
９８０） ６０４． １９１−２４６）と同時に、酵素
自体の膜リン脂質への作用やリゾレシチン、ロイコトリ
エン、ＰＡＦ、過酸化脂質なとの代謝産物により炎症反
応巣での組織障害などに深く係わっているものと考えら
れている〈Ｖａｄｅｓ、 Ｐ、ら、 Ｌａｂ、 Ｉｎｖ
ｅｓｔ、 （１９８６） ５５．６９１−４０４ン。
９８０） ６０４． １９１−２４６）と同時に、酵素
自体の膜リン脂質への作用やリゾレシチン、ロイコトリ
エン、ＰＡＦ、過酸化脂質なとの代謝産物により炎症反
応巣での組織障害などに深く係わっているものと考えら
れている〈Ｖａｄｅｓ、 Ｐ、ら、 Ｌａｂ、 Ｉｎｖ
ｅｓｔ、 （１９８６） ５５．６９１−４０４ン。
ヒト膵臓膜画分から分離精製された膜ＰＬＡＩ（Ｐｕ、
Ｍ）は、その蛋白−次構造の解析より膵ＰＬＡ ＊とは
異なるタイプのＰＬＡ ｔであることが明らかになり（
Ｋａｎｄａ、 Ａ ら、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍａ＋ｕｎ。
Ｍ）は、その蛋白−次構造の解析より膵ＰＬＡ ＊とは
異なるタイプのＰＬＡ ｔであることが明らかになり（
Ｋａｎｄａ、 Ａ ら、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍａ＋ｕｎ。
（１９８９） １６３．４２−４８＞、さらにＩＬ−１
やＩＮＦなどの炎症メディユーターによって誘導され細
胞外に分泌きれることも判明した（Ｎａｋａｎｏ、 Ｔ
、ら、 ＦＥＢＳＬｅｔｔ、 （１９９０） ２６１
１７１−１７４＞。またこのＰＬＡ 、 Ｍとノウマチ
患者関節液より精製したＰＬＡＩとを比較したところ、
両者の構造や反応性は同一であった（Ｋｒａｍｅｒ、
Ｒ，Ｍ ら、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ
、 （１９８９） ２６４゜５７６８−５７７５
）。
やＩＮＦなどの炎症メディユーターによって誘導され細
胞外に分泌きれることも判明した（Ｎａｋａｎｏ、 Ｔ
、ら、 ＦＥＢＳＬｅｔｔ、 （１９９０） ２６１
１７１−１７４＞。またこのＰＬＡ 、 Ｍとノウマチ
患者関節液より精製したＰＬＡＩとを比較したところ、
両者の構造や反応性は同一であった（Ｋｒａｍｅｒ、
Ｒ，Ｍ ら、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ
、 （１９８９） ２６４゜５７６８−５７７５
）。
臨床面からみると、敗血症や膿庖性乾癖、クローン病な
どの感染症患者血中において、ＰＬＡ、酵素活性の増加
が見らた。きらにバクテリアやウィルスや他の炎症誘導
物質の動物への皮内注射によってもＰＬＡ ！酵素活性
が誘導された（Ｖａｄｅｓ、 Ｐ、ら、前出）。
どの感染症患者血中において、ＰＬＡ、酵素活性の増加
が見らた。きらにバクテリアやウィルスや他の炎症誘導
物質の動物への皮内注射によってもＰＬＡ ！酵素活性
が誘導された（Ｖａｄｅｓ、 Ｐ、ら、前出）。
しかし、現在のところＰＬＡｊＭの測定法は報告されて
おらず、以上のような疾病に伴うＰＬＡ、酵素活性の上
昇が、はたしてＰＬＡｊＭによるものか否かは明らかに
きれていない。
おらず、以上のような疾病に伴うＰＬＡ、酵素活性の上
昇が、はたしてＰＬＡｊＭによるものか否かは明らかに
きれていない。
明が解決しようとする課
上記のように血中のＰＬＡ ＊酵素活性は、リウマチ、
敗血症、膿庖性乾癖、クローン病などで上昇するので、
ＰＬＡ ｓ Ｍを測定することによってもこれら疾病の
診断が可能になると期待きれ、ＰＬＡｓＭの測定法が待
望きれていた。
敗血症、膿庖性乾癖、クローン病などで上昇するので、
ＰＬＡ ｓ Ｍを測定することによってもこれら疾病の
診断が可能になると期待きれ、ＰＬＡｓＭの測定法が待
望きれていた。
課 を解決するための手段
本発明は、模型ホスホリパーゼＡＩを認識するモノクロ
ーナル抗体を提供する。該模型ホスホリパーゼＡ、は、
好ましくは前記Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ。
ーナル抗体を提供する。該模型ホスホリパーゼＡ、は、
好ましくは前記Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ。
Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、 Ｖｏｌ、 １６３． Ｎｏ
、 １．１９８９． Ｐａｇｅｓ ４２−４８に報告さ
れたヒト解繊由来のものである０本発明においては、後
記実施例に詳述されるように、モノクローナル抗体ＰＬ
−４９、モノクローナル抗体ＰＬ−７１、モノクローナ
ル抗体ＰＬ−７６およびモノクローナル抗体ＰＬ−７８
が得られた。
、 １．１９８９． Ｐａｇｅｓ ４２−４８に報告さ
れたヒト解繊由来のものである０本発明においては、後
記実施例に詳述されるように、モノクローナル抗体ＰＬ
−４９、モノクローナル抗体ＰＬ−７１、モノクローナ
ル抗体ＰＬ−７６およびモノクローナル抗体ＰＬ−７８
が得られた。
本発明は、きらに、上記モノクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマを提供するものである。
ハイブリドーマを提供するものである。
本発明で得られたハイブリドーマＰＬ−４９、ハイフッ
ドーマＰＬ−７１、ハイブリドーマＰＬ−７６およびハ
イブリドーマＰＬ−７８は、上記モノクローナル抗体Ｐ
Ｌ−４９、モノクローナル抗体ＰＬ−７１．モノクロー
ナル抗体ＰＬ−７６およびモノクローナル抗体ＰＬ−７
８をそれぞれ産生する。これらのハイブリドーマＰＬ−
４９、ハイブリドーマＰＬ−７１．ハイブリドーマＰＬ
−７６およびハイブリドーマＰＬ−７８は、平成２年（
１９９０年）５月９日から、茨城県つくば南東１丁目１
番３号の微生物工業技術研究所に、Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａ ＰＬ−４９、Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄ
ｏｍａ ＰＬ−７１、Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ
ＰＬ−７６およびＭｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ
ＰＬ−７８として、ブダペスト条約に基つき、受託番号
微工研条寄第２８９１号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８９１）
、微工研条寄第２８９２号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８９２
）、微工研条寄第２８８９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８
９＞および微工研条寄第２８９０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−
２８９０）の下に、それぞれ寄託されている。
ドーマＰＬ−７１、ハイブリドーマＰＬ−７６およびハ
イブリドーマＰＬ−７８は、上記モノクローナル抗体Ｐ
Ｌ−４９、モノクローナル抗体ＰＬ−７１．モノクロー
ナル抗体ＰＬ−７６およびモノクローナル抗体ＰＬ−７
８をそれぞれ産生する。これらのハイブリドーマＰＬ−
４９、ハイブリドーマＰＬ−７１．ハイブリドーマＰＬ
−７６およびハイブリドーマＰＬ−７８は、平成２年（
１９９０年）５月９日から、茨城県つくば南東１丁目１
番３号の微生物工業技術研究所に、Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａ ＰＬ−４９、Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄ
ｏｍａ ＰＬ−７１、Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ
ＰＬ−７６およびＭｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ
ＰＬ−７８として、ブダペスト条約に基つき、受託番号
微工研条寄第２８９１号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８９１）
、微工研条寄第２８９２号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８９２
）、微工研条寄第２８８９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８
９＞および微工研条寄第２８９０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−
２８９０）の下に、それぞれ寄託されている。
上記モノクローナル抗体は、上記ハイブリドーマをマウ
スの腹腔内で増殖きせ、該腹腔内に蓄積された腹水から
該モノクローナル抗体を採取することにより製造きれる
。
スの腹腔内で増殖きせ、該腹腔内に蓄積された腹水から
該モノクローナル抗体を採取することにより製造きれる
。
本発明はまた、上記モノクローナル抗体を用いる膜型ホ
スホリパーゼＡ＊の免疫測定法を提供する。好ましい免
疫測定法は、ラジオイムノアッセイである。また、２種
の上記モノクローナル抗体で該膜型ホスホリパーゼＡ、
をサンドイッチするサイドインチ免疫測定法においては
、酵素免疫測定法が望ましい。
スホリパーゼＡ＊の免疫測定法を提供する。好ましい免
疫測定法は、ラジオイムノアッセイである。また、２種
の上記モノクローナル抗体で該膜型ホスホリパーゼＡ、
をサンドイッチするサイドインチ免疫測定法においては
、酵素免疫測定法が望ましい。
寞」１４１
模型ＰＬＡ＊（ＰＬＡＪ）に対するモノクローナル抗体
作製 （１）免疫 免疫および抗体のアッセイに用いたＰＬＡＳＭの調製法
はＢｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒａｓ、 Ｃ
ｏｍｍｕｔｅ、 Ｖｏｌ、 １６３、 Ｎｏ、 １．１
９８９． Ｐａｇｅｓ ４２−４８に記載されたとおり
である。
作製 （１）免疫 免疫および抗体のアッセイに用いたＰＬＡＳＭの調製法
はＢｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒａｓ、 Ｃ
ｏｍｍｕｔｅ、 Ｖｏｌ、 １６３、 Ｎｏ、 １．１
９８９． Ｐａｇｅｓ ４２−４８に記載されたとおり
である。
第１回免疫： ＰＬＡｌＭのＰＢＳ （リン酸緩衝食塩
液）溶液をフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）ト
１゜１の乳濁液とし、マウス（Ｂａｌｂ／（、雌、１２
週令）１匹当りタンパク量２μｇを８匹に皮下投与した
。
液）溶液をフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）ト
１゜１の乳濁液とし、マウス（Ｂａｌｂ／（、雌、１２
週令）１匹当りタンパク量２μｇを８匹に皮下投与した
。
第２回免疫：第１回より２３日後に第１回と同し方法で
行なった。
行なった。
第３回免疫：第２回より４４日後に第１回と同じ方法で
行なった。
行なった。
第４回免疫：第３回より８１日後に第１回と同じ方法で
行なった。
行なった。
（２）血清力価測定
免疫動物の血液中の抗ＰＬＡ 、 Ｍ抗体レヘルをＥＬ
ＩＳＡ法によって測定した。即ち、ＰＬＡｌＭ Ｏ，５
ｎｇ１０．１ｍ１Ｏ，ＬＭ ＮａＨＣＯｓ／ｗｅｌｌを
マイクロタイタープレートに加えて４℃１夜靜置してコ
ーティングを行なった後、１１ｓＡ （牛血清アルブミ
ン）／ＰＢＳ ０．３ｍｌを加えて３７℃１時間インキ
ュベートしてブロッキングを行なった。これに試料液０
．０５ｍ１を加えて３７℃１時間反応せしめた後、ベク
タスティンＡＢＣキット（マウスＩｇＧキット、Ｖａｃ
ｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ、 ）を
用いそのプロトコールに従ってアッセイを行なった。発
色剤にはオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）１ｍｇ／
ｍｌを用い、４９２ｎｍと６６０ｎｍの吸光度の差をコ
ロナマイクロプレート光度計ＭＩＰ−２２で測定した。
ＩＳＡ法によって測定した。即ち、ＰＬＡｌＭ Ｏ，５
ｎｇ１０．１ｍ１Ｏ，ＬＭ ＮａＨＣＯｓ／ｗｅｌｌを
マイクロタイタープレートに加えて４℃１夜靜置してコ
ーティングを行なった後、１１ｓＡ （牛血清アルブミ
ン）／ＰＢＳ ０．３ｍｌを加えて３７℃１時間インキ
ュベートしてブロッキングを行なった。これに試料液０
．０５ｍ１を加えて３７℃１時間反応せしめた後、ベク
タスティンＡＢＣキット（マウスＩｇＧキット、Ｖａｃ
ｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ、 ）を
用いそのプロトコールに従ってアッセイを行なった。発
色剤にはオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）１ｍｇ／
ｍｌを用い、４９２ｎｍと６６０ｎｍの吸光度の差をコ
ロナマイクロプレート光度計ＭＩＰ−２２で測定した。
高いＰＬＡＩＭ抗体価を示したマウスをハイブリドーマ
作成に用いた。
作成に用いた。
（３）ハイブリドーマ作製
（３１）実験１
第４回免疫より３１日後に第５回免疫を行なった。ＰＬ
Ａ！Ｍ４μｇをＰＢＳ ０．２ｍｌに溶解して腹腔的投
与した。第５回免疫より３日後に細胞融合を行なった。
Ａ！Ｍ４μｇをＰＢＳ ０．２ｍｌに溶解して腹腔的投
与した。第５回免疫より３日後に細胞融合を行なった。
細胞融合の方法は概ねＧａ１ｆｒｅ ａｎｄ Ｍｉｌｓ
ｔｅｉｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、
７３．４６ （１９８１））に従った。即ち、マウスミ
エローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３＞をＲＰＭ
１１６４０培地（ＲＰＭ１１６４０９０ｙ、；子牛脂児
血涜１０ｘ；ピルビン酸ナトリウム０．１５ｍｇ／ｍｌ
；オキザロ酢酸０．１５ｍｇ／ｍｌ ；カナマイシン
０．１ｍｇ／ｍｌ）で培養し、その７．６９Ｘ１０’個
と免疫マウスの牌細胞９、３３Ｘ１０”個を合して遠心
し遠心管中でペレットとし、４８χポリ工チレングリコ
ール４０００溶液１ｍｌを１分間かけて滴下した。その
後きらに１．５分間攪拌し、血清無添加ＲＰＭ１１６４
０培地２ｍｌを２分間かけて、次いで同培地２ｍｌを１
分間かけて、さらに同培地−１を２分間かけて徐々に滴
下しつつ攪拌し、最後に同培地１５ヒ１を緩やかに加え
た後遠心してベレットトナシ、ＨＡＴ培地（ＲＰ１１１
１６４０７０Ｘ ； ＮＣＴＣ１０９１０Ｘ ；子牛胎
児血清２０ｘ；ヒボキサンチンｔｏ−’ＭＨアミノプテ
リン４Ｘ１０−’Ｍ ；チミジン１．６Ｘ１０− ’Ｍ
、ピルビン酸ナトリウム０．１５ｍｇ／ｍｌ ；オキ
ザロ酸＃ ０．１５ｍｇ／ｍｌ ；インスリン０．２Ｉ
Ｕ／ｍｌ ； ２−メルカブトエタノール２．５Ｘ１０
−’Ｍ 、 ヘペス５Ｘ１０−” ；カナマイシン０．
１ｍｇ／ｍｌ ；非必須アミノ酸混合液）に懸濁して、
脾臓細胞の濃度を０．７５Ｘ１０’個／ｍｌとして９６
穴プレートの各ウェルに０．２ｍｌずつ分注し、９５Ｘ
ａｉｒ−５ＸＣＯ，中３７℃湿度９５％以上で培養し、
必要に応じて培地の半量ずつを新鮮なＨＡＴ培地と交換
した。
ｔｅｉｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、
７３．４６ （１９８１））に従った。即ち、マウスミ
エローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３＞をＲＰＭ
１１６４０培地（ＲＰＭ１１６４０９０ｙ、；子牛脂児
血涜１０ｘ；ピルビン酸ナトリウム０．１５ｍｇ／ｍｌ
；オキザロ酢酸０．１５ｍｇ／ｍｌ ；カナマイシン
０．１ｍｇ／ｍｌ）で培養し、その７．６９Ｘ１０’個
と免疫マウスの牌細胞９、３３Ｘ１０”個を合して遠心
し遠心管中でペレットとし、４８χポリ工チレングリコ
ール４０００溶液１ｍｌを１分間かけて滴下した。その
後きらに１．５分間攪拌し、血清無添加ＲＰＭ１１６４
０培地２ｍｌを２分間かけて、次いで同培地２ｍｌを１
分間かけて、さらに同培地−１を２分間かけて徐々に滴
下しつつ攪拌し、最後に同培地１５ヒ１を緩やかに加え
た後遠心してベレットトナシ、ＨＡＴ培地（ＲＰ１１１
１６４０７０Ｘ ； ＮＣＴＣ１０９１０Ｘ ；子牛胎
児血清２０ｘ；ヒボキサンチンｔｏ−’ＭＨアミノプテ
リン４Ｘ１０−’Ｍ ；チミジン１．６Ｘ１０− ’Ｍ
、ピルビン酸ナトリウム０．１５ｍｇ／ｍｌ ；オキ
ザロ酸＃ ０．１５ｍｇ／ｍｌ ；インスリン０．２Ｉ
Ｕ／ｍｌ ； ２−メルカブトエタノール２．５Ｘ１０
−’Ｍ 、 ヘペス５Ｘ１０−” ；カナマイシン０．
１ｍｇ／ｍｌ ；非必須アミノ酸混合液）に懸濁して、
脾臓細胞の濃度を０．７５Ｘ１０’個／ｍｌとして９６
穴プレートの各ウェルに０．２ｍｌずつ分注し、９５Ｘ
ａｉｒ−５ＸＣＯ，中３７℃湿度９５％以上で培養し、
必要に応じて培地の半量ずつを新鮮なＨＡＴ培地と交換
した。
（３，２）実験２
第４回免疫より３５日後に第５回免疫を実験１と同様に
して行ない、第５回免疫より３日後に細胞融合を行なっ
た。マウスミエローマ細胞株とし−ｒ Ｐ３Ｘ６３−Ａ
ｇ、 ８．６５３（８，８９Ｘ１０’個）を用い、マウ
ス脾臓細胞１．７Ｘ１０”個と実験１と同様の方法で融
合せしめた。１！！１合処理した細胞をＨＡＴ培地に懸
濁して０．６３Ｘ１０＠個／ｍｌとし、９６穴プレート
の各ウェルに０゜２ＩＩＩｌずつ分注し、実験１と同様
の方法によって培養した。
して行ない、第５回免疫より３日後に細胞融合を行なっ
た。マウスミエローマ細胞株とし−ｒ Ｐ３Ｘ６３−Ａ
ｇ、 ８．６５３（８，８９Ｘ１０’個）を用い、マウ
ス脾臓細胞１．７Ｘ１０”個と実験１と同様の方法で融
合せしめた。１！！１合処理した細胞をＨＡＴ培地に懸
濁して０．６３Ｘ１０＠個／ｍｌとし、９６穴プレート
の各ウェルに０゜２ＩＩＩｌずつ分注し、実験１と同様
の方法によって培養した。
（４〉ハイプリドーマのスクリーニング約２週間後に増
殖してきたハイブリドーマの培養上清について、抗ＰＬ
Ａ ｊ Ｍ抗体産生の有無を検討した。アッセイは（２
）と同様の方法で行なった。
殖してきたハイブリドーマの培養上清について、抗ＰＬ
Ａ ｊ Ｍ抗体産生の有無を検討した。アッセイは（２
）と同様の方法で行なった。
ＰＬＡ 、 Ｈに特異的に反応する抗体を安定して産生
ずるハイブリドーマ４株（ＰＬ−４９、ＰＬ−７１、Ｐ
Ｌ−７６、孔−７８）を選択した。
ずるハイブリドーマ４株（ＰＬ−４９、ＰＬ−７１、Ｐ
Ｌ−７６、孔−７８）を選択した。
（５）ハイプリドーマのクローニングおよび凍結保存
上記４種のハイブリドーマ細胞は限界希釈法によるクロ
ーニングを行なった。即ち、各細胞を１Ｍ１１６４０培
地中にサスペンドして０．３個１０．２ｍｌ／ウェルの
濃度になるように９６穴プレートに加えて培養した。培
養上清の抗ｐｕｓＭ抗体の力価を（４）と同様にして測
定し、抗ＰＬＡ ＊ Ｍ抗体産生ハイブリドーマを選択
して培養した後、凍結用溶液（９０ｘ子牛血清、ＩＯＸ
ジメチルスルホキシド）中凍結保存した。
ーニングを行なった。即ち、各細胞を１Ｍ１１６４０培
地中にサスペンドして０．３個１０．２ｍｌ／ウェルの
濃度になるように９６穴プレートに加えて培養した。培
養上清の抗ｐｕｓＭ抗体の力価を（４）と同様にして測
定し、抗ＰＬＡ ＊ Ｍ抗体産生ハイブリドーマを選択
して培養した後、凍結用溶液（９０ｘ子牛血清、ＩＯＸ
ジメチルスルホキシド）中凍結保存した。
（６）腹水の調製
ハイブリドーマ細胞のＰＢＳ懸濁液（２−５Ｘ１０’個
／ｍ１）０． Ｓｍｌずつを、７〜１０日前にブリスタ
ン０．Ｓｍｌを腹腔内投与したマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ１
雌、１０−１５週令）に腹腔内投与し、約１週間後に貯
溜してきた腹水をタッピング法により採取した。腹水は
セパラピッドチューブ（セキスイ化学）で遠心すること
により沈殿物を除去した後、分注して凍結保存した。
／ｍ１）０． Ｓｍｌずつを、７〜１０日前にブリスタ
ン０．Ｓｍｌを腹腔内投与したマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ１
雌、１０−１５週令）に腹腔内投与し、約１週間後に貯
溜してきた腹水をタッピング法により採取した。腹水は
セパラピッドチューブ（セキスイ化学）で遠心すること
により沈殿物を除去した後、分注して凍結保存した。
（７〉抗体のクラスおよびサブクラスの決定ハイブリド
ーマの産生ずるモノクローナル抗体のイムノグロブリン
クラスおよびサブクラスをａＩＳＡ法によって同定した
。同定にはマウスＭｏｎｏＡｂＩＤＥＩＡキット（Ｚｙ
ｍｅｄ社）を用いた。ＰＬ−４９、ＰＬ−７１、ＰＬ−
７６、ＰＬ−７８の４株とも、産生ずるイムノグロブリ
ンはＩｇＧ ｒ （７１、に）と同定された。
ーマの産生ずるモノクローナル抗体のイムノグロブリン
クラスおよびサブクラスをａＩＳＡ法によって同定した
。同定にはマウスＭｏｎｏＡｂＩＤＥＩＡキット（Ｚｙ
ｍｅｄ社）を用いた。ＰＬ−４９、ＰＬ−７１、ＰＬ−
７６、ＰＬ−７８の４株とも、産生ずるイムノグロブリ
ンはＩｇＧ ｒ （７１、に）と同定された。
（８）抗体の精製
モノクローナル抗体は腹水からアフィゲルプロティンＡ
ＭＡＰＳ Ｉ［キット（ＢｉｏＲａｄ社）を用いてそ
のプロトフールに従って精製した。
ＭＡＰＳ Ｉ［キット（ＢｉｏＲａｄ社）を用いてそ
のプロトフールに従って精製した。
（９）Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅの作
成Ｎａｋａｎｅらの方法Ｕ、 Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、
Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、。
成Ｎａｋａｎｅらの方法Ｕ、 Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、
Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、。
２２、１０８４ ＜１９７４＞）に準じてＰＬ−７１の
西洋ワサビペルオキシダーゼとのｃｏｎｊｕｇａｔｅを
作成した。ペルオキシダーゼ（２ｍｇ１０．Ｓｍｌ ｗ
ａｔｅｒ）に０．１Ｍ Ｎａｌ０．０゜１ｍｌを加えて
室温で２０分間反応した後、１ｍＭｍｍナトリウム緩衝
液（ｐＨ４，４）に対し４℃１夜透析後０．２ＭＮａｔ
ｃＯｓでＰＨ９，５とし、ＰＬ−７１（４ｍｇ／ｍｌ
０．ＯＩＭ ＮａＨＣＯ。
西洋ワサビペルオキシダーゼとのｃｏｎｊｕｇａｔｅを
作成した。ペルオキシダーゼ（２ｍｇ１０．Ｓｍｌ ｗ
ａｔｅｒ）に０．１Ｍ Ｎａｌ０．０゜１ｍｌを加えて
室温で２０分間反応した後、１ｍＭｍｍナトリウム緩衝
液（ｐＨ４，４）に対し４℃１夜透析後０．２ＭＮａｔ
ｃＯｓでＰＨ９，５とし、ＰＬ−７１（４ｍｇ／ｍｌ
０．ＯＩＭ ＮａＨＣＯ。
〉を加えて室温２時間撹拌した後ＮａＢＨａ （４ｍｇ
／ｍ１ｗａｔｅｒ＞５０μｍを加えて４℃２時間攪拌し
、ＰＢＳに対し４°Ｃ１夜透析してｃａｎ ｊｕｇａｔ
ｅを得た。
／ｍ１ｗａｔｅｒ＞５０μｍを加えて４℃２時間攪拌し
、ＰＢＳに対し４°Ｃ１夜透析してｃａｎ ｊｕｇａｔ
ｅを得た。
（１０）ＰＬＡ、Ｍのサンドイッチアッセイモノクロー
ナル抗体（ＰＬ−７８＞溶液（０，１Ｍｇ７０．１ｃｏ
ＩＯ，ＬＭ ＮａＨＣＯｓ／ｗｅｌｌ）をマイクロタイ
タープレート各ウェルに加えて４°Ｃ１夜静置後、ＩＸ
ＢＳＡを含むＰＢＳｏ、３ｍｌを加えて３７℃１時間イ
ンキユヘートしヒトロ７キングを行ない、ＰＬＡ、Ｍ溶
液０．０５ｍ１（１χＢＳＡ／ＰＢＳ中〉を加えて３７
°Ｃ１時間反応する。これにモノクローナル抗体ＰＬ−
７１のｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔａの１
，０００倍希釈液０．０５ｍ１を加えて３７℃２時間反
応させた後、オルト７ ｘ−’−レンジアミン（ｌｎｇ
ｌｏ、 １ｍｌ Ｏ，１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ４，２
）およびＨ，Ｏバ終濃度０．０３Ｘ）を加えて室温３０
分間反応させた。ＩＮ Ｈ，Ｓｏ、 ０．１ｍｌを加え
て反応を停止し、４９２ｎｍと６６０ｎｍの吸光度の差
を測定した。このＰＬ−７８とＰＬ−７１−ｐｅｒｏｘ
ｉｄａｓｅｃｏｎ ｊｕｇａｔｅを用いたサンドイツチ
ア、セイにおけるＰＬＡ ＊ Ｍの検量線を第１図に示
す０本法によるＰＬＡＩＨの検出感度は凡そＯ，Ｏ１ｎ
ｇ／ｗｅｌｌであった（第１図参照）。
ナル抗体（ＰＬ−７８＞溶液（０，１Ｍｇ７０．１ｃｏ
ＩＯ，ＬＭ ＮａＨＣＯｓ／ｗｅｌｌ）をマイクロタイ
タープレート各ウェルに加えて４°Ｃ１夜静置後、ＩＸ
ＢＳＡを含むＰＢＳｏ、３ｍｌを加えて３７℃１時間イ
ンキユヘートしヒトロ７キングを行ない、ＰＬＡ、Ｍ溶
液０．０５ｍ１（１χＢＳＡ／ＰＢＳ中〉を加えて３７
°Ｃ１時間反応する。これにモノクローナル抗体ＰＬ−
７１のｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔａの１
，０００倍希釈液０．０５ｍ１を加えて３７℃２時間反
応させた後、オルト７ ｘ−’−レンジアミン（ｌｎｇ
ｌｏ、 １ｍｌ Ｏ，１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ４，２
）およびＨ，Ｏバ終濃度０．０３Ｘ）を加えて室温３０
分間反応させた。ＩＮ Ｈ，Ｓｏ、 ０．１ｍｌを加え
て反応を停止し、４９２ｎｍと６６０ｎｍの吸光度の差
を測定した。このＰＬ−７８とＰＬ−７１−ｐｅｒｏｘ
ｉｄａｓｅｃｏｎ ｊｕｇａｔｅを用いたサンドイツチ
ア、セイにおけるＰＬＡ ＊ Ｍの検量線を第１図に示
す０本法によるＰＬＡＩＨの検出感度は凡そＯ，Ｏ１ｎ
ｇ／ｗｅｌｌであった（第１図参照）。
憲】Ｊミス
原型ホスホリパーゼＡＩ（ＰＬＡ、Ｍ）のラジオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ） （１）”″Ｉ標識ＰＬＡ ＊ Ｍの作製ＰＬＡ Ｉ Ｍ
の１１６１による標識化をＨｕｎｔｅｒ−Ｇｒａｅｎｗ
ｏ ｏｄ法［Ｎａｔｕｒｅ １９４．４９５−４９６
（１９６２）コ番こ準してクロラミンＴ法によって行な
った。
アッセイ（ＲＩＡ） （１）”″Ｉ標識ＰＬＡ ＊ Ｍの作製ＰＬＡ Ｉ Ｍ
の１１６１による標識化をＨｕｎｔｅｒ−Ｇｒａｅｎｗ
ｏ ｏｄ法［Ｎａｔｕｒｅ １９４．４９５−４９６
（１９６２）コ番こ準してクロラミンＴ法によって行な
った。
■試薬
ＰＬＡ＊Ｍ溶液：１１１μｇ／ｍｌ Ｏ，化リン酸緩衝
液（ＰＢ）（ｐＨ７，４） Ｎ ａ ｌ ２ ’ Ｉ溶液： ３．７ＧＢｑ／ｍｌ、
Ａｍｅｒｓｈａｍ社製クロラミンＴ溶液： ２ｍｇ／ｍ
ｌ ０．５Ｍ ＦＢ （ｐＨ７，４）ピロ亜硫酸ナトリ
ウム溶液： ２．５ｍｇ／ｍｌ ０．１Ｍ円（ｐＨ７，
４） ＢＳＡ ： １０ｍｇ／ｍｌ ｏ、 ＩＭ ＰＢ （ｐ
Ｈ７，４）■方法 ポリプロピレンチューブに０．５Ｍ ＰＢ （ｐＨ７，
４）２５μｍおよびＰＬＡ ＊ Ｍ溶液２２．５μｍを
取り、Ｎａ ｌ ｋ ’ １溶液２．５μｍを加え混和
した後、クロラミンＴ溶液５μｍを加え室温で５０秒間
攪拌した。これにピロ亜硫酸ナトリウム溶液１２．５μ
ｍを加えて攪拌した後、Ｂシ２．５μｍとヨウ化カリウ
ム溶液２．５μｍを加え混和し、ついでゲル濾過［カラ
ム： ＰＤ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、溶出液
：０．５％塩化ナトリウム、０．５％ＢＳＡおよび０．
０５Ｘ７ジ化ナトリウムを含む０゜ＬＭ ＰＢ （ｐＨ
７゜５）］を行ない、その溶出液を１ｍｌずつ分取し、
各フラクション中の放射活性をウェル型シンチレーショ
ンカウンターで測定した。そのクロマトグラムを第２図
に示す、フラクションＮ０１４を１１８１標識九ＡＲＭ
とした。
液（ＰＢ）（ｐＨ７，４） Ｎ ａ ｌ ２ ’ Ｉ溶液： ３．７ＧＢｑ／ｍｌ、
Ａｍｅｒｓｈａｍ社製クロラミンＴ溶液： ２ｍｇ／ｍ
ｌ ０．５Ｍ ＦＢ （ｐＨ７，４）ピロ亜硫酸ナトリ
ウム溶液： ２．５ｍｇ／ｍｌ ０．１Ｍ円（ｐＨ７，
４） ＢＳＡ ： １０ｍｇ／ｍｌ ｏ、 ＩＭ ＰＢ （ｐ
Ｈ７，４）■方法 ポリプロピレンチューブに０．５Ｍ ＰＢ （ｐＨ７，
４）２５μｍおよびＰＬＡ ＊ Ｍ溶液２２．５μｍを
取り、Ｎａ ｌ ｋ ’ １溶液２．５μｍを加え混和
した後、クロラミンＴ溶液５μｍを加え室温で５０秒間
攪拌した。これにピロ亜硫酸ナトリウム溶液１２．５μ
ｍを加えて攪拌した後、Ｂシ２．５μｍとヨウ化カリウ
ム溶液２．５μｍを加え混和し、ついでゲル濾過［カラ
ム： ＰＤ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、溶出液
：０．５％塩化ナトリウム、０．５％ＢＳＡおよび０．
０５Ｘ７ジ化ナトリウムを含む０゜ＬＭ ＰＢ （ｐＨ
７゜５）］を行ない、その溶出液を１ｍｌずつ分取し、
各フラクション中の放射活性をウェル型シンチレーショ
ンカウンターで測定した。そのクロマトグラムを第２図
に示す、フラクションＮ０１４を１１８１標識九ＡＲＭ
とした。
（２）ＰＬＡ、ＭのＲＩＡ
■試薬
ＰＬＡ 、Ｍ標準液： ０．：２〜２００ｎｇ／ｍｌア
ッセイ緩衝液腹水希釈液： ＰＬ−４９、ＰＬ−７１、
ＰＬ−７６およびＰＬ−７８をアッセイ緩衝液でそれぞ
れ６８０゜ ０００倍、４７０．０００倍、ｓｓｏ、 ｏｏｏ倍およ
び２．３００．０００倍に・希釈したもの２１１標識Ｐ
ＬＡ 、 Ｍ溶液：上記（１）の標識物をアッセイ緩衝
液で希釈したもの（２ｘｌＯ’ｃｐｍ／ｍｌ）Ｉｍｍｕ
ｎｏｂｅａｄ液：ウサギ抗マウスイムノグロブリン結合
ポリアクリルアミドゲル （Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製〉をアッセイ緩衝液に懸濁したも
の（１ｍｇ／ｍｌ） アッセイ緩衝液：０．５Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸、０．５％ ＢＳＡオ、１−び００
２ｘアジ化ナトリウムを含む０．１ＭＦＢ （ｐＨ７，
５） ■方法 ＰＬＡＩＭ標準液あるいは血清試料１００μｍをポリプ
ロピレンチューブに取り、アッセイ緩衝液２７５μｍと
１１１１標準ＰＬＡ ＊ Ｍ溶液２５μｍを加え混和し
た後、腹水希釈液１００μｍを加え室温で１６時間イン
キユベーンヨンした。これにＩｍｍｕｎｏｂｅａｄ液１
００μｌを加え液温００μｌインキュベーションした後
、遠心分離（２０００Ｘｇ、１０分間）し、上清を吸引
除去した。その沈殿の放射活性をウェル型シンチレーシ
ョンカウンターで測定した。 ＰＬＡ、Ｍ標準液による
標準曲線から血清試料中のＰＬＡ、Ｍ濃度を求めた。
ッセイ緩衝液腹水希釈液： ＰＬ−４９、ＰＬ−７１、
ＰＬ−７６およびＰＬ−７８をアッセイ緩衝液でそれぞ
れ６８０゜ ０００倍、４７０．０００倍、ｓｓｏ、 ｏｏｏ倍およ
び２．３００．０００倍に・希釈したもの２１１標識Ｐ
ＬＡ 、 Ｍ溶液：上記（１）の標識物をアッセイ緩衝
液で希釈したもの（２ｘｌＯ’ｃｐｍ／ｍｌ）Ｉｍｍｕ
ｎｏｂｅａｄ液：ウサギ抗マウスイムノグロブリン結合
ポリアクリルアミドゲル （Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製〉をアッセイ緩衝液に懸濁したも
の（１ｍｇ／ｍｌ） アッセイ緩衝液：０．５Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸、０．５％ ＢＳＡオ、１−び００
２ｘアジ化ナトリウムを含む０．１ＭＦＢ （ｐＨ７，
５） ■方法 ＰＬＡＩＭ標準液あるいは血清試料１００μｍをポリプ
ロピレンチューブに取り、アッセイ緩衝液２７５μｍと
１１１１標準ＰＬＡ ＊ Ｍ溶液２５μｍを加え混和し
た後、腹水希釈液１００μｍを加え室温で１６時間イン
キユベーンヨンした。これにＩｍｍｕｎｏｂｅａｄ液１
００μｌを加え液温００μｌインキュベーションした後
、遠心分離（２０００Ｘｇ、１０分間）し、上清を吸引
除去した。その沈殿の放射活性をウェル型シンチレーシ
ョンカウンターで測定した。 ＰＬＡ、Ｍ標準液による
標準曲線から血清試料中のＰＬＡ、Ｍ濃度を求めた。
■標準曲線および感度
腹水としてＰＬ−４９を用いたときのＲＩＡの標準曲線
を第３図に示す、他の腹水の場合も同様な競合曲線が得
られた。それらの感度（９０ｘ阻害濃度）は、ＰＬ−４
９０，３ｎｇ／ｍｌ、ＰＬ−７１１，１ｎｇ／ｍｌ、Ｐ
Ｌ−７６０，９ｎｇ／ｍ１、ＰＬ−７８０，２ｎｇ／ｍ
ｌであり、いずれも高感度であった。
を第３図に示す、他の腹水の場合も同様な競合曲線が得
られた。それらの感度（９０ｘ阻害濃度）は、ＰＬ−４
９０，３ｎｇ／ｍｌ、ＰＬ−７１１，１ｎｇ／ｍｌ、Ｐ
Ｌ−７６０，９ｎｇ／ｍ１、ＰＬ−７８０，２ｎｇ／ｍ
ｌであり、いずれも高感度であった。
■特異性
末法によるヒト血清の希釈曲線は、第４図に示すように
いずれも良好に直線回帰し、血清の影響は認められなか
った。
いずれも良好に直線回帰し、血清の影響は認められなか
った。
また、末法に対するヒト膵ＰＬＡ ＊の交差反応性は全
く見られなかった。
く見られなかった。
ξらに、標準ＰＬＡ ＊ Ｍ及び関節リウマチ患者血清
についてイオン交換クロマトグラフィー［カラム： Ｓ
−５ｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｔｙｐｅ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、溶出液二０２→ＩＭ塩
化ナトリウム及び０．１χαＡＰＳ（ドータイト社製）
を含む５０ｍＭ トリス緩衝液〈−７，０）線状勾配コ
を行い溶出液を分取し、各フラグジョン中のＰＬＡｔＨ
を末法により測定した。その結果、第５図に示すクロマ
トグラムが得られ、標準ＰＬＡｔＭと患者血清のパター
ンはよく一致した。
についてイオン交換クロマトグラフィー［カラム： Ｓ
−５ｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｔｙｐｅ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、溶出液二０２→ＩＭ塩
化ナトリウム及び０．１χαＡＰＳ（ドータイト社製）
を含む５０ｍＭ トリス緩衝液〈−７，０）線状勾配コ
を行い溶出液を分取し、各フラグジョン中のＰＬＡｔＨ
を末法により測定した。その結果、第５図に示すクロマ
トグラムが得られ、標準ＰＬＡｔＭと患者血清のパター
ンはよく一致した。
これらの結果から、末法はヒト血清中ＰＬＡ 、Ｍのみ
を特異的に測定しうろことが分かった。
を特異的に測定しうろことが分かった。
■ヒト血清の測定
末法により、健常者および関節リウマチ患者、癌患者、
外傷患者の血清を、そのまままたはアッセイ緩衝液で適
宜希釈して、ＰＬＡｆｆｉ！ｌ！を測定した結果を第６
図に示す、関節リウマチ患者、癌患者、外傷患者の血清
は、健常者血清より高い値を示すものが多く、末法は関
節リウマチや癌の診断に有用である。
外傷患者の血清を、そのまままたはアッセイ緩衝液で適
宜希釈して、ＰＬＡｆｆｉ！ｌ！を測定した結果を第６
図に示す、関節リウマチ患者、癌患者、外傷患者の血清
は、健常者血清より高い値を示すものが多く、末法は関
節リウマチや癌の診断に有用である。
第１図は、ＰＬ−７８とＰＬ−７１−ｐｅｒｏｘｉｄａ
ｓｅ ｃｏｎｊｕ−ｇａｔｅを用いたサンドイッチアッ
セイにおけるＰＬＡｔＨの検量線を示す。 第２図は、ＰＬＡｔＨの１″ｌ工標識化液のゲル濾過の
クロマトグラムを示す。 第３図は、ＰＬＡ、ＭのＲＩＡの標準曲線を示す。 第４図は、ヒト血清の希釈曲線を示す。 第５図は、標準ＰＬＡ 、Ｍおよび関節リウマチ患者血
清のイオン交換クロマトグラフィーの結果を示す。 第６図は、健常者および関節リウマチ患者、癌患者、外
傷患者血清中のＰＬＡ、Ｍ濃度を示す。 光１しと叛朱 上記のとおり、本発明のモノクローナル抗体を用いるＰ
ＬＡｔＨの免疫測定法は、当初期待された関節リウマチ
の診断のみならず、外傷などを含む広範囲にわたる炎症
状態や癌の診断に有用であることが明らかになった。
ｓｅ ｃｏｎｊｕ−ｇａｔｅを用いたサンドイッチアッ
セイにおけるＰＬＡｔＨの検量線を示す。 第２図は、ＰＬＡｔＨの１″ｌ工標識化液のゲル濾過の
クロマトグラムを示す。 第３図は、ＰＬＡ、ＭのＲＩＡの標準曲線を示す。 第４図は、ヒト血清の希釈曲線を示す。 第５図は、標準ＰＬＡ 、Ｍおよび関節リウマチ患者血
清のイオン交換クロマトグラフィーの結果を示す。 第６図は、健常者および関節リウマチ患者、癌患者、外
傷患者血清中のＰＬＡ、Ｍ濃度を示す。 光１しと叛朱 上記のとおり、本発明のモノクローナル抗体を用いるＰ
ＬＡｔＨの免疫測定法は、当初期待された関節リウマチ
の診断のみならず、外傷などを含む広範囲にわたる炎症
状態や癌の診断に有用であることが明らかになった。
Claims (10)
- （１）膜型ホスホリパーゼＡ＿２を認識するモノクロー
ナル抗体。 - （２）該膜型ホスホリパーゼＡ＿２がヒト脾臓由来であ
る請求項１に記載のモノクローナル抗体。 - （３）モノクローナル抗体ＰＬ−４９、モノクローナル
抗体ＰＬ−７１、モノクローナル抗体ＰＬ−７６または
モノクローナル抗体ＰＬ−７８である請求項１に記載の
モノクローナル抗体。 - （４）請求項１ないし３のいずれかに記載のモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ。 - （５）ハイブリドーマＰＬ−４９、ハイブリドーマＰＬ
−７１、ハイブリドーマＰＬ−７６またはハイブリドー
マＰＬ−７８である請求項４に記載のハイブリドーマ。 - （６）請求項４または５に記載のハイブリドーマをマウ
スの腹腔内で増殖させ、該腹腔内に蓄積された腹水から
請求項１ないし３のいずれかに記載のモノクローナル抗
体を採取することを特徴とする該モノクローナル抗体の
製造法。 - （７）請求項１ないし３のいずれかに記載のモノクロー
ナル抗体を用いる膜型ホスホリパーゼＡ＿２の免疫測定
法。 - （８）ラジオイムノアッセイである請求項７に記載の免
疫測定法。 - （９）２種の該モノクローナル抗体で該膜型ホスホリパ
ーゼＡ＿２をサンドイッチする請求項７に記載の免疫測
定法。 - （１０）酵素免疫測定法である請求項９に記載の免疫測
定法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2142462A JP2984029B2 (ja) | 1990-05-30 | 1990-05-30 | 膜型ホスホリパーゼａ▲下２▼を認識するモノクローナル抗体および膜型ホスホリパーゼａ▲下２▼の免疫測定法 |
| DE69114361T DE69114361T2 (de) | 1990-05-30 | 1991-05-29 | Monoklonaler Antikörper, der Membran-Phopholipase A2 erkennt und Immuntest für Membran-Phospholipase A2. |
| ES91108806T ES2082040T3 (es) | 1990-05-30 | 1991-05-29 | Anticuerpos monoclonales que reconocen a la fosfolipasa a2 de membrana e inmunoensayos de fosfolipasa a2 de membrana. |
| DK91108806.0T DK0459450T3 (da) | 1990-05-30 | 1991-05-29 | Monoklonalt antistof, som genkender membran-phospholipase A2 og immunobestemmelse af membran-phospho liphase A2 |
| AT91108806T ATE130037T1 (de) | 1990-05-30 | 1991-05-29 | Monoklonaler antikörper, der membran-phopholipase a2 erkennt und immuntest für membran- phospholipase a2. |
| EP91108806A EP0459450B1 (en) | 1990-05-30 | 1991-05-29 | Monoclonal antibody recognizing membrane phospholipase A2 and immunoassay of membrane phospholipase A2 |
| KR1019910008931A KR100188816B1 (ko) | 1990-05-30 | 1991-05-30 | 막형 포스포리파제 a2를 인식하는 모노크로날 항체 및 막형 포스포리파제 a2의 면역 측정법 |
| US08/053,350 US5358849A (en) | 1990-05-30 | 1993-04-28 | Monoclonal antibody recognizing membrane phospholipase A2 and immunoassay of membrane phospholipase A2 |
| GR960400179T GR3018780T3 (en) | 1990-05-30 | 1996-01-24 | Monoclonal antibody recognizing membrane phospholipase A2 and immunoassay of membrane phospholipase A2. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2142462A JP2984029B2 (ja) | 1990-05-30 | 1990-05-30 | 膜型ホスホリパーゼａ▲下２▼を認識するモノクローナル抗体および膜型ホスホリパーゼａ▲下２▼の免疫測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0436193A true JPH0436193A (ja) | 1992-02-06 |
| JP2984029B2 JP2984029B2 (ja) | 1999-11-29 |
Family
ID=15315881
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2142462A Expired - Fee Related JP2984029B2 (ja) | 1990-05-30 | 1990-05-30 | 膜型ホスホリパーゼａ▲下２▼を認識するモノクローナル抗体および膜型ホスホリパーゼａ▲下２▼の免疫測定法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5358849A (ja) |
| EP (1) | EP0459450B1 (ja) |
| JP (1) | JP2984029B2 (ja) |
| KR (1) | KR100188816B1 (ja) |
| AT (1) | ATE130037T1 (ja) |
| DE (1) | DE69114361T2 (ja) |
| DK (1) | DK0459450T3 (ja) |
| ES (1) | ES2082040T3 (ja) |
| GR (1) | GR3018780T3 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996020959A1 (en) * | 1994-12-29 | 1996-07-11 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | Novel monoclonal antibody having inhibitory effect on type ii phospholipase a2 and protein containing a part of the same |
| JP2006517188A (ja) * | 2002-12-02 | 2006-07-20 | アブジェニックス・インコーポレーテッド | ホスホリパーゼａ２に対する抗体及びその使用 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4142552A1 (de) * | 1991-12-21 | 1993-06-24 | Boehringer Mannheim Gmbh | Monoklonale antikoerper gegen die typ i phospholipase a(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts) als entzuendungshemmendes therapeutikum |
| US5767249A (en) * | 1994-06-20 | 1998-06-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Monoclonal antibodies against type I phospholipase A2 as a diagnostic and anti-inflammatory therapeutic agent |
| WO1998010776A1 (en) | 1996-09-11 | 1998-03-19 | Shanahan Prendergast Elizabeth | Therapeutic formulations containing venom or venom anti-serum either alone or in combination for the therapeutic prophylaxis and therapy of neoplasms |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02286081A (ja) * | 1989-04-27 | 1990-11-26 | Shionogi & Co Ltd | ヒト脾臓由来膜結合型ホスホリパーゼａ↓２ |
-
1990
- 1990-05-30 JP JP2142462A patent/JP2984029B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-05-29 EP EP91108806A patent/EP0459450B1/en not_active Expired - Lifetime
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