JPH0921803A - ２型コラーゲンテロペプチドの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 哺乳動物の体液中に存在する２型コラーゲン
テロペプチドを簡便かつ精度よく測定する方法を提供す
ること、およびそれに用いるモノクローナル抗体を得る
こと。軟骨の代謝異常が原因となる疾患の診断、治療、
経時の追跡に用いられる。 【構成】 哺乳動物の体液中の存在する２型コラーゲン
テロペプチドの量の測定において、抗２型コラーゲンテ
ロペプチド抗体を用いる方法。特に不溶性担体に固定さ
れたものと、標識物質で標識されたものを用いたサンド
イッチ法による測定方法。また、それに用いる哺乳動物
の２型コラーゲンテロペプチドを認識するモノクローナ
ル抗体、ならびにそれを使用した２型コラーゲンテロペ
プチド測定キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、哺乳動物の２型コラー
ゲンテロペプチドを特異的に認識する抗体および該抗体
を用いる哺乳動物の体液中に存在する２型コラーゲンテ
ロペプチドの測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】２型コラーゲンテロペプチドは、１９８
９年にクリントン・Ｔ・バードウインによってヒトの２
型コラーゲンテロペプチドについての正確なｃＤＮＡ配
列が決定された蛋白質であって、分子量は２８８０の分
子であることが知られている（Clinton T.Bardwin et a
l., Biochem. J. ２６２ ５２１―５２８（１９８
９））。また、数々の文献でその存在が取り上げられ、
コラーゲン蛋白の抗原性を示す部分であることが明らか
になっている（藤本大三郎編「細胞外マトリックスのバ
イオサイエンスとバイオテクノロジー」ＩＣＰ社刊（１
９９０））。その生理作用については、まだ不明なとこ
ろが多いが、軟骨の代謝に深く関与することが推定され
ている。しかし、２型コラーゲンテロペプチドの病理学
的研究の報告はほとんどない。

【０００３】このように、軟骨の代謝に深く関与するこ
とが推定されながら、いまだ未開発の部分が多く、２型
コラーゲンテロペプチドの研究は今後の展開が期待され
る分野の一つである。したがって、その２型コラーゲン
テロペプチドを特異的にかつ簡便に感度よく測定する方
法が望まれており、かかる方法は基礎医学、臨床医学の
領域において非常に重要な意味をもつと考えられる。

【０００４】しかし、２型コラーゲンテロペプチドの測
定法の研究の報告としては、リーナ・アラ・コッコが、
マウスの細胞での２型プロコラーゲンの発現を調べるた
めに、当時、判明していたヒト２型コラーゲンテロペプ
チドの残基に対するポリクローナル抗体を用いた報告
（Leena Ala-Kokko et al., J. Biological Chemistry,
２６６（２２），１４１７５―１４１７８（１９９
１））があるのみである。この報告では、測定はウエス
タン ブロットを用いて定性的に行われているにすぎな
い。また、動物の体液を測定するには至っておらず、動
物の体液を直接測定できる測定方法は存在しなかった。
つまり、本発明で成し遂げた動物の体液についての測定
が、２３残基のペプチドに対する抗体では不可能であっ
た。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、哺乳動物の体液中に存在する２型コラーゲ
ンテロペプチドを簡便かつ精度よく測定する方法を提供
すること、およびそれに用いる哺乳動物の２型コラーゲ
ンテロペプチドを認識するモノクローナル抗体を得るこ
とである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる従
来技術の課題を鑑みて鋭意研究した結果、本発明に至っ
た。すなわち、本発明は哺乳動物の体液中に存在する２
型コラーゲンテロペプチド量の測定において、抗２型コ
ラーゲンテロペプチド抗体を用いることを特徴とする２
型コラーゲンテロペプチドの測定方法である。この方法
においては、例えば不溶性担体に固定された抗２型コラ
ーゲンテロペプチド抗体と、標識物質で標識された抗２
型コラーゲンテロペプチド抗体とを用いるサンドイッチ
法を採用することができる。また、かかる標識物質とし
ては、酵素を用いることが好ましい。

【０００７】さらに、不溶性担体に固定された抗２型コ
ラーゲンテロペプチド抗体と、標識物質で標識された抗
２型コラーゲンテロペプチド抗体のうち、少なくとも一
方については、２型コラーゲンテロペプチドを認識する
モノクローナル抗体を採用することが好ましい。

【０００８】本発明はまた、上記の２型コラーゲンテロ
ペプチドの測定方法において用いられる、哺乳動物の２
型コラーゲンテロペプチドを認識するモノクローナル抗
体である。かかるモノクローナル抗体は、不溶性担体に
固定された抗２型コラーゲンテロペプチド抗体として
も、標識物質で標識された抗２型コラーゲンテロペプチ
ド抗体としても用いることができる。

【０００９】このような哺乳動物の２型コラーゲンテロ
ペプチドを認識するモノクローナル抗体としては、例え
ば（Ｎ末端）ＧＰＧＩＤＭＳＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰ
ＤＰＬＱＭＲＡ（Ｃ末端）からなるアミノ酸配列部分と
結合性を有するモノクローナル抗体が挙げられる。

【００１０】さらに、本発明には不溶性担体に固定され
た抗２型コラーゲンテロペプチド抗体と、標識物質で標
識された抗２型コラーゲンテロペプチド抗体を含む試薬
と、を含んでなる哺乳動物の体液中に存在する２型コラ
ーゲンテロペプチドの測定キットが含まれる。かかるキ
ットには、上記したもののほか、必要により該標識物質
を検出するための試薬を含めることができる。

【００１１】本発明で用いる抗体の作製にあたり、免疫
原として用いる２型コラーゲンテロペプチド（以下ＣＩ
Ｉ―Ｔと略す。）は、動物から分離精製された天然型の
ＣＩＩ―Ｔ、合成ペプチドＣＩＩ―Ｔ、あるいは遺伝子
工学的手法によって作製された遺伝子組み換えＣＩＩ―
Ｔを用いることができる。このなかでも、ＣＩＩ―Ｔの
ように比較的短いペプチドの場合には、精製純度、再現
性、収率の点から考えて合成ペプチドが好ましい。

【００１２】これらのＣＩＩ―Ｔは、公知の方法でキー
ホール・リンペット・ヘモシアニン（以下ＫＬＨと略
す。）、ウシアルブミン等のキャリアー蛋白と複合体を
作製して免疫原として用いられる。

【００１３】本発明で用いる抗体は、ポリクローナル抗
体であってもモノクローナル抗体であってもよい。ポリ
クローナル抗体の場合には、アジュバンドとしてFreund
´sComplete Adjuvant、またはＡｌ（ＯＨ）₃ などを用
い、ＣＩＩ―Ｔ―キャリアー蛋白複合体を公知の方法で
動物に免疫することにより、その抗血清として得ること
ができる。

【００１４】一方、モノクローナル抗体の場合には、ケ
ラーとミルシュタインによる細胞融合法（G. Koeller a
nd Milstein, Nature,２５６，４９５―４９７（１９７
５））により作製されたハイブリドーマを培養し、その
培養液からＣＩＩ―Ｔと反応する抗体を分離することに
より調製される。細胞融合に用いられる細胞としては、
Ｐ３Ｕ１などを挙げることができる。

【００１５】こうした抗体を用いて、免疫学的測定法に
より体液中のＣＩＩ―Ｔを修飾することなく、特異的か
つ感度よく測定することができる。免疫学的測定法とし
ては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫定量法（Ｒ
ＩＡ）、蛍光免疫測定法、免疫凝集法等を挙げることが
でき、ＥＩＡとしては、例えば「酵素免疫測定法」（第
二版、石川栄治他著、医学書院１９８２）などに記載さ
れている方法を用いることができる。ＥＩＡとしては、
サンドイッチ法および競合法と称される方法を用いるこ
とができる。

【００１６】サンドイッチ法によるＥＩＡにおいては、
ＣＩＩ―Ｔに対する抗体を２種類用い、例えば次のよう
な手順に従い測定する。すなわち、２種類の抗体のうち
の一方の抗体（第一抗体）を適当な不溶性担体（例えば
プラスチック容器）に固定化する（以下これを“固定化
抗体”という）。次いで、不溶性担体と測定しようとす
る試薬または検体試料との非特異的結合を避けるため
に、適当な物質（例えばウシ血清アルブミン）で不溶性
担体の表面を被覆する。このようにして得られた第一抗
体が固定化された不溶性担体を、検体試料と一定時間お
よび温度で接触させ反応させる。この間に固定化抗体
（第一抗体）と検体試料中のＣＩＩ―Ｔが結合する。次
いで不溶性担体を適当な洗浄液で洗浄した後、適当な標
識物質（例えば酵素）で標識したＣＩＩ―Ｔに対する他
方の抗体（第二抗体）の溶液（例えば水溶液）と一定時
間および温度で接触させ、固定化抗体に結合したＣＩＩ
―Ｔと第二抗体を反応させる。これを適当な洗浄液で洗
浄し、次いで不溶性担体上の固定化抗体とＣＩＩ―Ｔを
介して結合している第二抗体の標識物質の量を測定す
る。なお、上記サンドイッチ法は、固定化抗体、標識抗
体、およびＣＩＩ―Ｔを含有する検体試料を同時に混合
し、一定時間および温度でこれら三者を同時に接触させ
て行うこともできる。

【００１７】かくして、その値から検体試料中のＣＩＩ
―Ｔの量を算出することができる。通常サンドイッチ法
では、第一抗体と第二抗体とが双方ともモノクローナル
抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であっても
よいし、一方をモノクローナル抗体とし、他方をポリク
ローナル抗体として用いることもできる。

【００１８】競合法としては、例えば固相に固定した抗
原と測定すべき抗原とに対し、一定量の標識抗体を競争
的に反応させて固相抗原・標識抗体複合体を形成せし
め、洗浄操作の後、固相に結合した標識抗体の標識物質
の量を測定する方法や、固相に抗体を固定し標識抗原と
測定すべき抗原とを競争的に反応させて固相抗体・標識
抗原複合体を形成せしめ、洗浄操作の後、固相に結合し
た標識抗原の標識物質の量を測定する方法を挙げること
ができる。

【００１９】こうしたサンドイッチ法および競合法のそ
れぞれにおいては、抗体に代えてＩｇＧをペプシンで消
化して得られるＦ（ａｂ′）₂ 、Ｆ（ａｂ′）₂ を還元
して得られるＦａｂ′、または抗体をパパインで消化し
て得られるＦａｂなどの抗体フラグメントを、あるいは
これらを標識して使用することができる。

【００２０】本発明のＣＩＩ―Ｔの測定方法において使
用される不溶性担体としては、例えばポリスチレン、ポ
リプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、
フッ素樹脂、架橋デキストラン、アガロース、ポリサッ
カライドなどの高分子の他、紙、ガラス、金属、および
これらの組み合わせなどを挙げることができる。不溶性
担体の形状は、例えばトレイ状、球状、繊維状、粒状、
棒状、盤状、容器状、試験管等の種々の形状であっても
よい。

【００２１】また、標識抗体の標識物質としては、酵
素、蛍光物質、蛍光物質または放射性物質等を使用する
ことができる。酵素としては、ペルオキシダーゼ、アル
カリフォスファターゼ、β―Ｄ―ガラクトシダーゼ等
を、蛍光物質としてはフルオレッセインソチオシアネー
ト、フイコピリプロテインなどを、そして放射性物質と
しては ¹²⁵Ｉ、 ¹³¹Ｉ、¹⁴Ｃ、 ³Ｈなどを使用すること
ができるが、免疫学的測定法に使用し得るものであれば
他のものでもよい。

【００２２】標識物質が酵素の場合、酵素と抗ＣＩＩ―
Ｔ抗体の結合方法は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素
酸法、マレイミド法など通常の方法に従うことができ
る。例えばマレイミド化された抗体または抗体のフラグ
メントと、ＳＨ化された酵素を溶液中で反応することに
より行うことができる。抗体または抗体のフラグメント
のマレイミド化は、例えばサクシンイミジル―４―（Ｎ
―マレイミドメチル）シクロヘキサンカーボネート、ス
ルホサクシンイミジル―４―（Ｎ―マレイミドメチル）
シクロヘキサンカーボネート、サクシンイミジル―メタ
マレイミドベンゾエート（以下ＭＢＳと略す）、サクシ
ンイミジル―６―マレイミドヘキサノエートなどにより
マレイミド化することができる。酵素へのＳＨ基の導入
は公知の方法（「酵素免疫測定法」第二版、石川栄治他
著、医学書院１９８２）に従うことができる。例えば酵
素とＳ―アセチルメルカプト無水コハク酸、またはＮ―
サクシンイミジル―３―（２―ピリジルチオ）プロピオ
ネートなどと反応することにより行われる。

【００２３】標識物質が酵素である場合には、その活性
を測定するために基質および必要により発色剤が用いら
れる。これらの例としては、ペルオキシダーゼを用いる
場合には基質として過酸化水素を用い、発色剤として
２，２′―アジノジ―（３―エチルベンズチアゾリンス
ルホン酸）アンモニウム塩、５―アミノサリチル酸、ｏ
―フェニレンジアミン、４―アミノアンチピリン、また
は３，３′，５，５′―テトラメチルベンジジンなどを
用いる。また、蛍光基質として３―（ｐ―ヒドロキシフ
ェニル）プロピオン酸などを用いることができる。酵素
としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、基
質としてｏ―ニトロフェニルホスフェート、３―（２′
―スピロアダマンタン）―４―メトキシ―４―（３″―
ホスホリルオキシ）フェニル―１，２―ジオキセタンな
どを、酵素としてβ―Ｄ―ガラクトシダーゼを用いる場
合には基質としてフルオレセインジ（β―Ｄ―ガラクト
ピラノシド）、または４―メチルウンベリフェリシル―
β―Ｄ―ガラクトピラノシド等と組み合わせて用いられ
る。

【００２４】本発明の方法において測定の対象となるＣ
ＩＩ―Ｔを含有する哺乳動物の体液とは、ヒト、ウマ、
ウサギ、ラット、マウス、ウシ等の体液をいい、血清あ
るいは血漿形態の血液、関節液、リンパ液、胸腺水、腹
水、羊水、細胞組織液、骨髄液、尿等の体液のいずれで
あってもよい。かくして、本発明により、体液中のＣＩ
Ｉ―Ｔを簡便かつ精密に測定することができる。

【００２５】

【実施例】以下、実施例により本発明を記述するが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【００２６】［実施例１］（１）ヒトＣＩＩ―Ｔの合成 ２７アミノ酸配列（一文字表記による配列は以下であ
る。：（Ｎ末端）ＧＰＧＩＤＭＳＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫ
ＧＤＰＬＱＹＭＲＡ（Ｃ末端）を有するヒトＣＩＩ―Ｔ
をペプチド合成機（Applied Biosystems社製）で合成し
た。さらに、合成が終了したペプチド樹脂を、以下の順
でＴＭＳＢｒクリベッジ法で合成時の保護基の脱保護を
行いＣＩＩ―Ｔを得た。すなわち、ペプチド樹脂４００
ｍｇをチオアニソール１．２ｍｌ、エタンジオール０．
６ｍｌ、ｍ―クレゾール０．２ｍｌ、ＴＦＡ７．５ｍ
ｌ、ＴＭＳＢｒ１．３５ｍｌに溶解し、氷冷下２時間攪
拌した。次に、予め冷やしておいたジエチルエーテルを
加え、析出した沈殿を濾過し、残渣に２規定酢酸を加え
てペプチドを抽出し、ｐＨを６．０に調整後、ゲル濾過
を行いＣＩＩ―Ｔを得た。

【００２７】（２）ＣＩＩ―Ｔ―キャリア蛋白複合体の
調製 ＣＩＩ―Ｔ０．５ｍｇを０．１Ｍ燐酸緩衝液（以下ＰＢ
と略す）（ｐＨ６．５）５０μｌに溶解した。これとは
別にＫＬＨ０．５ｍｇを０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ６．５）
５０μｌに溶解した。この二つの溶液を混和し、ゆっく
りと攪拌した。そこへ、グルタルアルデヒドの０．１Ｍ
ＰＢ（ｐＨ６．０）溶液を２倍当量加え、３７℃で２
時間攪拌した。その後、ゲル濾過による精製を行い、目
的物を得た。

【００２８】（３）抗原刺激リンパ球の調製 雄Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に、ＣＩＩ―Ｔ―ＫＬＨ
複合体９０μｇとFreund´s Complete Adjuvantとのエ
マルジョンを投与した。その後１〜２週間間隔で５回Ｃ
ＩＩ―Ｔ―ＫＬＨ複合体４０μｇとFreund´s Complete
Adjuvantとのエマルジョンを腹腔内投与した。５回目
投与後１０日目に、ＣＩＩ―Ｔ―ＫＬＨ複合体５０μｇ
を生理食塩水０．２５ｍｌに溶解して静脈内に投与し
た。その４日後に無菌的にマウスから脾臓を摘出し、ス
テンレス製メッシュを通過させることにより、ＲＰＭＩ
―１６４０培地（ＧＩＢＣＯ製）中に浮遊させた脾細胞
懸濁液を調製した。

【００２９】（４）細胞融合 マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１は、ＧＩＴ培地（日本製薬
（株）製）の中で培養した。（３）で調製した該脾細胞
とＰ３Ｕ１とを、細胞数３対１の比率で無血清ＲＰＭＩ
―１６４０培地中に懸濁し、１５００ｒｐｍ×５分間の
条件で遠心分離した。上記培地を除去した後、沈降細胞
に平均分子量１５００の５０％ポリエチレングリコール
／無血清ＲＰＭＩ―１６４０培地溶液（ｐＨ７．２）１
ｍｌを静かに加えつつ懸濁液とした。その後、１５００
ｒｐｍ×５分間で遠心分離して上清培地を除去した後、
沈降した細胞にＨＡＴ培地４０ｍｌを加え懸濁した。

【００３０】（５）クローン化ハイブリドーマの取得 融合細胞液を９６穴マイクロプレート上に分配した（１
穴につき２００μｌ）。このプレートを３７℃、５％Ｃ
Ｏ₂ 雰囲気で培養した。１日後、２日後、およびそれ以
後２日毎に半分量の培地を新たなＨＡＴ培地と交換して
培養した。１１日後にハイブリドーマの培養上清中のＣ
ＩＩ―Ｔに対する抗体について、酵素免疫測定法により
スクリーニングを行った。スクリーニングに用いられた
抗原はＣＩＩ―Ｔ、第２抗体は西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ（以下ＨＲＰと略す）標識したヤギ抗マウスＩｇＧ
抗体であった。ハイブリドーマを分配した１９２穴のう
ち１０２穴中に融合細胞のコロニーを認め、その内２穴
が陽性であった。

【００３１】かくして得られた抗体陽性の各穴中のハイ
ブリドーマを、９６穴マイクロプレートの１穴あたり
０．９細胞になるように稀釈し、Ｂａｌｂ／ｃマウスの
腹腔マクロファージ細胞をフィーダー細胞として予め培
養しておいた９６穴マイクロプレートで培養した。顕微
鏡下で観察し、確実にシングルコロニーであることを認
めた穴のハイブリドーマの培養上清中のＣＩＩ―Ｔに対
する抗体について、酵素免疫測定法によりスクリーニン
グを行った。両穴ともに抗体陽性であり、抗ＣＩＩ―Ｔ
モノクローナル抗体を産生していた。

【００３２】（６）ハイブリドーマの培養 これらのクローン化ハイブリドーマを、１週間前にプリ
スタン（Aldrich 社製）０．１ｍｌを腹腔内投与したＢ
ａｌｂ／ｃマウスに、細胞数１０⁶ 〜１０⁷ 個／匹の割
合で腹腔内投与した。その後７〜１０日目に、腹水を１
匹あたり２〜３ｍｌ採取した。

【００３３】（７）モノクローナル抗体の精製 採取した腹水を、エイらの方法（P.L. Ey et al., Immu
nochemistry,１５，４２９―４３６（１９７８））によ
り精製した。すなわち０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ８．０）で
平衡化したプロテインＡ―セファロースカラム（ゲル容
量５ｍｌ）に、腹水２ｍｌを流し、その後０．１Ｍクエ
ン酸ナトリウムのｐＨが６．０、５．０、４．０および
３．０である緩衝液を順次流してカラムからモノクロー
ナル抗体を溶出し、精製モノクローナル抗体、すなわち
ＣＩＩ―Ｔ―３Ｂ８―Ａ９―Ａ９、ＣＩＩ―Ｔ―２Ａ９
―Ｈ９―Ｅ１およびＣＩＩ―Ｔ―２Ｆ９―Ｄ１―Ｄ２を
得た。

【００３４】（８）精製したモノクローナル抗体のクラ
ス 精製したモノクローナル抗体のクラスを、マウスモノク
ローナル抗体タイピングキット（THE BINDING SITE社
製）を用いて決定した。その結果を表１に示す。

【００３５】

【表１】

【００３６】［実施例２］ポリクローナル抗体の作製 ウサギの皮下に、実施例１で精製したＣＩＩ―Ｔ―ＫＬ
Ｈ複合体１ｍｇとFreund´s Complete Adjuvantとのエ
マルジョンを皮内投与した。さらに、１０日間隔でＣＩ
Ｉ―Ｔ―ＫＬＨ複合体０．５ｍｇとFreund´s Complete
Adjuvantとのエマルジョンを４回皮内投与した。最終
投与後１０日目に採血し、血清とした後、酵素免疫測定
法で抗体価を測定した。すなわちＣＩＩ―Ｔを抗原と
し、第２抗体にＨＲＰ標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体
で、ＣＩＩ―Ｔに対する抗体価を測定し、４０万倍であ
ることを確認した。その後、全血を採取して血清とし、
プロテインＡ―セファロースカラムで精製してＣＩＩ―
Ｔに対する抗体を得た。

【００３７】［実施例３］（１）抗体固定化ビーズの調製 ポリスチレン製ビーズ（直径６ｍｍ）をよく洗浄してか
ら、実施例２で得た２０μｇ／ｍｌの抗ＣＩＩ―Ｔポリ
クローナル抗体のＰＢＳ溶液中に、４℃の温度で一昼夜
放置した。これをＰＢＳで洗浄し、１％ウシ血清アルブ
ミン（以下ＢＳＡと略す）のＰＢＳ溶液中に、４℃の温
度で一昼夜放置してアフターコーティング処理し、抗Ｃ
ＩＩ―Ｔ抗体固定化ビーズを得た。

【００３８】（２）ＨＲＰ標識抗体の調製 実施例１で採取した抗ＣＩＩ―Ｔモノクローナル抗体Ｃ
ＩＩ―Ｔ―３Ｂ８―Ａ９―Ａ９の１ｍｇ／ｍｌ ０．０
１Ｍ燐酸―０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．４）
に、１０ｍｇ／ｍｌのＭＢＳのジメチルホルムアミド
（以下ＤＭＦと略す）溶液５０μｌを添加し、２５℃の
温度で３０分間反応させた。次いでセファデックスＧ―
２５を充填したカラム、０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ６．０）
を用いてゲル濾過を行い、マレイミド化抗体と未反応Ｍ
ＢＳを分離した。

【００３９】一方、ＨＲＰの１０ｍｇ／ｍｌ ０．１Ｍ
ＰＢ（ｐＨ６．５）溶液２ｍｌに、Ｓ―アセチルメル
カプト無水コハク酸の６０ｍｇ／ｍｌ ＤＭＦ溶液１２
０μｌを加え、２５℃で２時間反応させた。次に０．１
Ｍトリス―塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を８００μｌ、
０．１Ｍ ＥＤＴＡ１６０μｌ、１Ｍヒドロキシルアミ
ン１．６ｍｌを加え、３７℃で４分間反応させた。次
に、反応液をニトロセルロース透析膜に入れ、５ｍＭ
ＥＤＴＡ―０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ６．０）溶液に対し、
４℃で３日間透析し、チオール化ＨＲＰを得た。

【００４０】次に、マレイミド化抗体２ｍｇとチオール
化ＨＲＰ４ｍｇとを混合し、フィルトロン攪拌セル（富
士フィルター工業（株））を用いて氷冷下、蛋白濃度が
４〜１０ｍｇ／ｍｌになるまで濃縮した後、４℃の温度
で一昼夜放置した。その溶液を、ウルトロゲルＡｃＡ４
４（ＬＫＢ社）を充填したカラムでゲル濾過し、ＨＲＰ
標識抗ＣＩＩ―Ｔ抗体を得た。

【００４１】（３）サンドイッチＥＩＡ測定系 （１）で調製した抗ＣＩＩ―Ｔ固定化ビーズ１個と精製
したＣＩＩ―Ｔ（標準物質）を０〜１６ｎｇ／ｍｌの範
囲で含有する１％ＢＳＡ―０．０５Ｍ ＴＢＳ（トリス
バッファードセイライン）（ｐＨ８．０）２００μｌ
と、（２）で作製したＨＲＰ標識ＣＩＩ―Ｔ抗体の１％
ＢＳＡ―０．０５Ｍ ＴＢＳ（ｐＨ８．０）溶液２００
μｌとを各試験管に加え、３７℃で９０分間インキュベ
ートした。次に試験管内の溶液を吸引除去した後、０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０―生理食塩水で洗浄を行った。そ
の後０．０２％３，３′，５，５′―テトラメチルベン
ジジン塩酸塩、および２．５ｍＭの濃度で過酸化水素を
含有する０．１Ｍ燐酸／クエン酸緩衝液（ｐＨ４．３）
を０．４ｍｌずつ各試験管に加え、３７℃の温度で３０
分間反応させた後、１規定硫酸水溶液を１ｍｌずつ加え
て酵素反応を停止させた。

【００４２】次いで、分光光度計を用いてこの溶液の４
５０ｎｍの波長における吸引強度を測定した。この吸引
強度を標準物質濃度０〜１６ｎｇ／ｍｌに対してプロッ
トし、検量線を得た。この検量線を図１に示す。図１よ
り、本発明の測定方法を用いれば、０．０５ｎｇ／ｍｌ
まで精度よく測定可能であることがわかる。

【００４３】［実施例４］ヒト関節液中のＣＩＩ―Ｔの測定 実施例３の手法および実施例３で得た検量線を用いて、
慢性関節リウマチ患者２名と変形性関節症患者２名の関
節液を測定した。結果を表２に示す。

【００４４】

【表２】

【００４５】［実施例５］ヒト正常小児血漿中のＣＩＩ―Ｔの測定 実施例３の手法および実施例３で得た検量線を用いて、
４名分のヒト正常小児血漿を測定した。結果を表３に示
す。

【００４６】

【表３】

【００４７】

【発明の効果】本発明は、軟骨破壊が進行する慢性関節
リウマチ、変形性関節症患者検体において、初めて直接
２型コラーゲンテロペプチドの測定を可能にした。ま
た、正常小児血漿中に２型コラーゲンテロペプチドが存
在することを明らかにした。本発明は、軟骨の代謝異常
が原因となる疾患の診断、治療、経時の追跡に効果を発
揮すると考えられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】２型コラーゲンペプチドの検量線

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/535 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 細田 健治 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社東京研究センター内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳動物の体液中に存在する２型コラー
   ゲンテロペプチド量の測定において、抗２型コラーゲン
   テロペプチド抗体を用いることを特徴とする２型コラー
   ゲンテロペプチドの測定方法。
2. 【請求項２】 不溶性担体に固定された抗２型コラーゲ
   ンテロペプチド抗体と、標識物質で標識された抗２型コ
   ラーゲンテロペプチド抗体とを用いるサンドイッチ法で
   ある請求項１記載の２型コラーゲンテロペプチドの測定
   方法。
3. 【請求項３】 標識物質が酵素である請求項２記載の２
   型コラーゲンテロペプチドの測定方法。
4. 【請求項４】 不溶性担体に固定された抗２型コラーゲ
   ンテロペプチド抗体と、標識物質で標識された抗２型コ
   ラーゲンテロペプチド抗体のうち、少なくとも一方が２
   型コラーゲンテロペプチドを認識するモノクローナル抗
   体である請求項２または請求項３記載の２型コラーゲン
   テロペプチドの測定方法。
5. 【請求項５】 不溶性担体に固定された抗２型コラーゲ
   ンテロペプチド抗体と、標識物質で標識された抗２型コ
   ラーゲンテロペプチド抗体を含む試薬と、を含んでなる
   哺乳動物の体液中に存在する２型コラーゲンテロペプチ
   ドの測定キット。
6. 【請求項６】 哺乳動物の２型コラーゲンテロペプチド
   を認識するモノクローナル抗体。
7. 【請求項７】 （Ｎ末端）ＧＰＧＩＤＭＳＡＦＡＧＬＧ
   ＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱＭＲＡ（Ｃ末端）からなるアミノ
   酸配列部分と結合性を有する請求項６記載のモノクロー
   ナル抗体。