JPH0565156B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
【0001】 本考案は細胞系内へのDNAの組み込
みを行うために、アクチノフアージTG１関連ベ
クター（vectors）に付加DNAを組み込む方法に
関する。 より詳細には、本発明はフアージTG１宿主菌種
ストレプトマイセス カトレヤ（Streptomyces
cattleya）NRRL8057、ストレプトマイセス
アベルミチリス（Streptomyces avermitillis）
MA4990、ストレプトマイセス ビリドクロモゲ
ネス（Ｓ．viridochromogenes）NRRL3414、ス
トレプトマイセス ガリフアルス（Ｓ．
garyphalus）NRRL2448などを含め細菌などの
生物体内へのクローニングベクターとして有用な
新規なバクテリオフアージTG１ゲノムおよびそ
の誘導体（欠失および挿入変異型）ゲノムへの外
来DNAの組み込み方法に関する。本発明によつ
て得られた細胞は新規であり、その細胞の複製及
び／又はDNAまたはフアージとしてのそのベク
ター誘発および複製を通じて、あるいはその外来
核酸の存在によつてその細胞に価値ある特性を付
与することを通じてこの外来核酸及び／又はその
産物の製造手段として有用性を持つものである。 【0002】 DNAのクローニングのためのバクテ
リオフアージの利用は、すでに確立された技法に
属する。しかしながら この技術のアクチノマイ
セス（Actinomyces）のフアージへの応用は最
近のことである。この点に関しては、下記の論文
および特許文献が参照される。 １ “Development of ａ DNA Cloning
System in Streptomyces Using Phage
Vectors”，J.E.SuarezとK.F.Chater；６
Cienc．Biol．第99〜110頁（1981年）。 ２ “Restriction Mapping of the DNA of
the Streptomyces Temperate PhageφC31
and Its Derivatives”，K.F. Chater，C.J.
BrutonおよびJ.E.Suarez；14 Gene，第183〜
194頁（1981年）。 ３ “DNA Cloning in Streptomyces：
Resistance Genes from Antibiotic−Producing
Species”、C.J.Thompson，J.M.WardおよびD.
A.Hopwood；286 Nature，第525〜527頁
（1980年）。 ４ “Dispensable Sequences and Packaging
Constraints of DNA from the Streptomyces
Temperate Phage φC31”，K.F.Chater，C.J.
Bruton，W.SpringerおよびJ.E.Suavez；15
Gene，第249〜256頁（1981年）。 ５ “Ａ DNA Cloning System for
Interspecies Gene Transfer in Antibiotic
Producing Streptomyces”，M.Bibb，J.L.
SchottelおよびS.N.Cohen；284 Nature，第
526〜531頁（1980年）。 ６ “DNA Cloning in streptomyces；Ａ
Bifunctional Replicon Comprising PBR 322
Inserted into Ａ Streptomyces Phage”，J.E.
SuarezとK.F.Chater；286 Nature，第527〜
529頁（1980年）。 ７ “Cloning and Expression in
Streptomyces lividans of Antibiotic
Resistance Genes Derived from Escherichia
coli．”，J.L.Schottel，Ｍ，．BibbおよびS.N.
Cohen；146 Journal of Bacteriology，第360
〜368頁（1981年）。 ８ “ActinoPhage DNA”，K.F.Chater；21
Developments in Industrial Microbiology，第
６章、第65〜74頁（1980年）。 ９ 英国特許願G.B.第2023612A号；No.7919158；
1980年１月３日発行。 10 英国特許願G.B.第2031434A号；No.7928156；
1980年４月23日発行。 11 英国特許願G.B.第2018778A号；No.7913033；
1979年10月24日発行。 12 欧州特許願第0036259A2号；No.81300858.8；
1981年９月23日発行。 13 英国特許願G.B.第2046272A号；No.8011000；
1980年11月12日発行。 14 英国特許願G.B.第2069503A号；No.8104473；
1981年８月26日発行。 15 欧州特許願第0020147A1号；No.8039178.4；
1980年12月16日発行。 16 欧州特許願第0020251A2号；No.80400722.7；
1980年12月10日発行。 【0003】 土壌から単離された本発明のバクテリ
オフアージTG１は広範な特性研究に基づき、従
来未だ記載されていないアクチノフアージである
ことが同定された。このフアージはテンペレート
（temperate）である、すなわちStreptomyces
cattleya MA4297（NRRL8057）の溶原化
（lysogenic）フアージである。このフアージは、
ブラツドレー［ David E.Bradley（1967）
“Ultrastructure of Bacteriophages and
Bactriocins”，Bacteriol．，Rev．31、第230〜
314頁］によるＢ型形態を有する。このフアージ
の頭部は正二十面体形であり平均頭部直径は約
57nmである；そうして第１図の電子顕微鏡に見
られるように基板を含めたフアージ尾部は長さ約
128nmである。このフアージの核酸は二本鎖
DNA分子であつて、付着末端を有し、長さは
41.47キロ塩基対である。第２図は、このフアー
ジDNAの制限エンドヌクレアーゼ分裂部位の位
置を示す地図である。これらの位置は、シングル
Pst部位に最も近いこのフアージDNAの末端か
らのキロ塩基対の部位距離として与えられてい
る。地図は、酵素Hind，Kpn，PstＩ，Sma
，Sph，Xbaのすべての部位を示してお
り、これらはアガロースゲル電気泳動と、0.2キ
ロ塩基対およびそれ以上の断片の臭化エチジウム
染色とによつて決定することができた。下記酵素
は、このDNAを分裂し得なかつた：Bam，
Nae，Nar，Pvu，Sst，Sst，Stu
およびXho。或る種の欠失変異体および雑種フ
アージ誘導体については、以下に同様に記載す
る。フアージTG１は以下にさらに詳細に記載す
る。なお、以下の記載においては、該フアージの
単離、保存、繁殖に関する明瞭な特定化情報なら
びに特にサイズとその制限マツピングとによつて
定義されたその核酸のデータが記載される。な
お、後記のごとく、TG１プロフアージを含む微
生物、代表的TG１プロフアージ誘導体および
TG１プラスミド誘導体は、特許手続上の微生物
の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下
に公認されたカルチヤーコレクシヨンに寄託され
ている（表参照）。 【0004】 本明細書に記載のごとく、フアージ
TG１、そのゲノム、誘導体およびTG１ゲノム
またはそのいくつかの部分を含むキメラDNA分
子は、特に組換えDNA技術におけるクローニン
グビヒクル（cloning vehicles）として有用性を
持つ。 フアージTG１は、DNAクローニングベクター
としてそれを格別に有用なものとするある特別な
性質を有している。そのDNAおよびその誘導体
は、単離が容易であり且つプロトプラストに細胞
感染（トランスフエクシヨン）させ次に得られた
フアージを溶菌増殖させることによつて容易に増
加させることができる（実施例１，Ｊ項参照）。
これらの機能ならびに宿主菌を溶原化する能力を
保持し且つ相当量（数キロ塩基対）の外来DNA
を挿入するに十分なスペースを与える欠失突然変
異体が容易に得られる。さらに、本フアージ
DNAは、制限エンドヌクレアーゼPstのための
ただ１つの開裂部位を有している。その部位は、
そのフアージゲノムの必要不可欠ではない領域内
に位置している。この部位における外来DNAの
挿入は、該フアージの溶菌的および溶原的機能を
損なうことがない（実施例１，項およびＭ項参
照）。このようなDNA挿入に格別に好適な部位を
持つことは、クローニングベクターの１つの重要
な特性である。なぜならば、所望立体配置の混成
分子が得られる可能性が、ただ２個の新しい
DNA結合の形成が必要となるだけで大幅に増大
されるからである。 【0005】 ある１つのベクターへのクローニング
のために使用しうる制限酵素について広い選択の
余地が或ることは、組換えDNAの実験において
きわめて有利である。多数の制限エンドヌクレア
ーゼは、このフアージDNAを開裂させ得ない
（実施例１，Ｈ項参照）。その特別なPst部位は、
アダプター分子の使用によつてこれら酵素のいず
れか１つのための独特な部位に変換させられうる
［R.G.Rothstein，L.F.Lau，C.P.Bahl，S.A.
NaraangおよびR.WuのMethods in
Enzymology68巻（1979年），S.P.Colowickおよ
びN.O.Kaplan編、第98〜109頁所載の論文参
照］。このPstクローニング部位を別の独自な部
位に変換するための別の技術は、所望部位を含む
短い断片を挿入することである。実施例２のＡ項
には、両側にPst部位を有する単一BamH
部位を持つ短断片をPst部位に挿入するための
方法が示されている。 【0006】 TGベクターとその誘導体が宿主
DNA内へ挿入されうることは、いま１つの重要
な特性である。この特性が、遺伝子および遺伝子
の新規な組合せを伝達する雑種ベクターを宿主内
へ安定的に組込むことを可能にし、これによつて
その宿主に対して新規な化合物の生産（たとえ
ば、Ｂ型肝炎表面抗原、実施例２参照）、あるい
は例えば増加された遺伝子量による通常細胞産物
の生産増加が可能となる。組込みはまた、宿主突
然変異体の遺伝的相補性によるクローン遺伝子の
検定のためにも役立つ。その遺伝子を含む溶原菌
が一旦同定されてしまえば、その溶原菌から得ら
れたフアージを増殖し、次いでそのフアージ
DNAを単離することによつて簡単に大量にその
遺伝子を回収することがベクターにより可能とな
る。すなわち、このベクターはプラスミド
pACYC177のDNAの大量生産に役立つ（実施例
１、Ｍ項参照）。 【0007】 このフアージの宿主域は、特別に興味
あるものである。Streptomyces cattleya
MA4297（NRRL8057）は化合物チエナマイシン
を産生する（米国特許第3950357号参照）。チエナ
マイシンは、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の
両者に対して強力な抗菌作用を持つている。これ
はさらに、ベーターラクタマーゼの存在の故に、
ペニシリンやセフアロスポリンのごときベーター
ラクタム抗生物質に対して耐性のある細菌に対し
ても有効である。別のフアージ宿主である
Streptomyces avermitilisは、アベルメクチン
と呼ばれている化学的に類縁の剤の錯体を産生
し、これはきわめて強力な駆虫作用を示す（R.
W.Burg等の論文：Antimicrobial Agents and
Chemotherapy，15、第361〜367頁（1979年）。
本フアージは、これら重要な化合物の合成および
合成制御に関連して、当該遺伝子中の突然変異体
の遺伝的相補性により遺伝子および遺伝子産物の
同定、単離および研究のために使用することがで
きる（たとえばチエナマイシンのために、実施例
３参照）。 【0008】 フアージTG１のある種の混成誘導体
は、別の面において役立つ。実施例１のＭ項にそ
の構造および特性が記載されているこれら雑種
は、TG１ベクターの誘導体がEscherichia coli
内でプラスミドとして複製されることを可能にす
る。これら雑種フアージープラスミドベクター
は、トランスフエクシヨンによつてあるいはトラ
ンスフオーメーシヨンによつて、異なる種の間を
転移させることができる。この特性は非常に価値
あるものである。なぜならばこれによつて
Escherichia coliのためにこれまで開発されて
きた遺伝子技術の使用が可能となるからである。
たとえば、Ｓ．cattleyaからの遺伝子をＥ．coli
へ組み入れて相補的な突然変異を生じさせること
が可能となろう。Ｅ．coli中のそのＳ．cattleya
遺伝子内への突然変異の導入が、たとえば、トラ
ンスポゾン突然変異誘発によつてできよう。ある
いはまた、ナンセンスサプレツサー（翻訳停止コ
ードン）によつて抑圧される突然変異体を単離す
ることが可能となろう。後者の突然変異された遺
伝子は、Ｓ．cattleya内へ戻すことができ、そし
てＳ．cattleya内の翻訳停止コードンを抑圧する
ことが可能な突然変異体を単離するために使用す
ることができる。このようなサプレツサー突然変
異は、かかる生物の遺伝研究に役立つ。Ｅ．coli
内でそのベクターが複製できるということは、別
の面でも有益である。この特性は、挿入プラスミ
ドDNAの領域外でのベクターDNAの欠失部の選
択のために使用された（実施例１，Ｎ参照）。か
かる欠失は、ベクター内のかなりの量のDNAの
クローニングのために重要である。 TG１とその誘導体は、特定フアージベクターの
DNA中への挿入のために適当な各種の制限酵素
を用いて切除されたDNA配列をクローン化する
ために別の仕方で利用することができる。組換え
DNA技術の有益な解説書の１つはMethods in
Enzymology，Vol.68（1979年）、Academic
Press社（ニユーヨーク）発行である。 【0009】 クローニング実施法の改良、変更は、
別のフアージ変種の使用および別の制限酵素の使
用以外にさらに以下のものを含む。 制限されたベクターDNAをホスフアターゼで処
理して末端リン酸基を除去し、しかしてそのベク
ターDNAの自己連結（self ligation）を防止す
ること； １つの制限酵素による開裂によつて生じた一本鎖
端部をＳヌクレアーゼを用いて除去、或いはか
かる一本鎖端部の相補部のDNAポリメラーゼに
よる合成の後に平滑末端連結を行う；および／ま
たは ベクターと挿入されるべきDNAとの間に付着端
を与えるDNA尾端反応（tailing reaction）を行
なうことである。（NelsonおよびBrutlag，
Methods in Enzymology，Vol.68（1979年）第
41〜50頁参照）。 【0010】 トランスフエクシヨン頻度は、記載さ
れている条件または成分を変えることによつて、
あるいは連結されたDNAをリポゾームカプセル
封入し、続いてかかるリポゾームを受容菌のプロ
トプラストへ融合することによつて向上させるこ
とができる。このような技法は、最近J.F.
MakinsとG.Holtによつて染色体DNAのリポゾ
ームトランスフオーメーシヨンの場合について記
載されている［Nature293（1981年）、第671〜673
頁］。そこに記載された方法またはその変法が使
用できる。 【0011】 所望の挿入DNAを含む雑種フアージ
のためのフアージクローンまたは溶原菌のスクリ
ーニングは、挿入体の形質的または遺伝的性状に
応じていくつかの方法で実施することができる。
たとえば、特にアミノ酸、ビタミン、プリンまた
はピリミジンのごとき一次代謝物質の合成の途中
がブロツクされた突然変異体を相補できる遺伝子
を、次の方法で検出することができる。 【0012】 特定突然変異種をプロトプラスト化
し、そして連結されたDNAでトランスフエクト
し、そしてなんら選択をせずに放置して再生させ
る。この結果生じるコロニーは、非トランスフエ
クト細胞、非雑種フアージによるトランスフエク
トから生じた溶原菌ならびに雑種フアージによる
感染から生じた溶原菌を含んでいる。所望の挿入
体を含んでいる溶原菌は、１つの特定栄養素が欠
乏している最小培地上でその再生培養を培養する
ことによつて単離される。コロニーは適当な
DNA挿入体を含む再生溶原菌からのみ生じる。 所望の挿入体を同じく簡単に検出できる第２の方
法は、野生型プロトプラストを連結DNAでトラ
ンスフエクトし、これを野生型菌（germlings）
と混合し、そしてこの混合物を適当なプレート上
で平板培養して溶菌斑（プラーク）を形成させる
方法である。増殖後の培地は親のフアージの再連
結（religation）に起因するプラークと、挿入体
を持つフアージに起因するプラークとを含む（実
質的にはプラスミドpACYC１７７をTG１誘導
体に挿入したものを単離するために使用される方
法と同じである；実施例１，Ｍ項参照）このフア
ージを採集して実施例Ｂ項に記載したような無菌
フアージストツクが得られる。これらの溶菌液は
適当な突然変異株に形質導入するために使用され
る。所望の挿入体を含むフアージのみが特定突然
変異の形質導入の能力を持ち、そしてコロニーを
形成させる。通常容易に検出可能な増殖表現型を
持たない抗生物質のごとき二次代謝生成物の生産
中にブロツクされる突然変異体の場合には、所望
の挿入体を含むフアージは、上記に記載した方法
のいずれかによつて得られた溶原菌を適当な培地
で培養することによつて検出される。ある時間だ
けコロニーを生育させたのち、その抗生物質に敏
感な生物の培養物を倍地に流し込み、そして更に
培養する。機能性抗生物質合成遺伝子を持つ挿入
体を含む溶原菌は、その抗生物質を産生し、そし
てコロニーのまわりに増殖阻止域を形成させる
（実施例２参照）。 【0013】 リポゾームRNAや移転RNAのよう
な、なんら検出可能な表現型を授けないDNAの
挿入体を含むフアージは、プローブとして相補
DNAを用いてプラークまたはコロニー交雑によ
つて検出することができる。 【0014】 所望コロニー単離の効率は、溶原菌の
直接選択の方法が開発されたならば、相当程度ま
で増大させることができる。このような選択は、
抗生物質に対する耐性または生合成ステツプをコ
ードする挿入DNAを含むDNAをベクターフアー
ジとして用いて行うことができる（実施例２及び
３を参照）。いずれの選択でも、未感染プロトプ
ラストから生じるコロニーの分析が不必要になろ
う。 【0015】 抗生物質合成のための遺伝子を含むフ
アージクローンは、いくつかの他の実験にも使用
することができる。このフアージは、野生型ある
いは他の抗生物質産生培養物に形質導入し生産レ
ベルでの、特定クローン遺伝子の増加量の効果を
調べるために使用できる。部位特異的突然変異誘
発の技術は、特定クローン遺伝子内の突然変異体
の単離のために使用することができ、これによつ
て、離れているが多分有害な損傷（lesions）が
ある株に導入されることが排除される。このよう
な局所突然変異誘発は、抗生物質の生産を増加ま
たは減少させる突然変異体の単離を可能にし、そ
して生産菌の改良および抗生物質の合成および制
御の遺伝的解析の助けになるであろう。組換え
DNAの技術はまた、特定の抗生物質合成遺伝子
の発現を大幅に増強するために、適当な部位に高
レベルプロモータ配列を導入することを可能なら
しめるであろう。遺伝子産物量の増加は、その菌
株の生産性を顕著に高めるであろう。クローン遺
伝子産物は、宿主細胞を紫外線照射し次いで特定
雑種フアージを感染させることによつて同定され
うる。放射線標識をつけたアミノ酸の存在下で増
殖させると、そのフアージによつてコードされた
タンパク質が放射線標識されて合成されるであろ
う。宿主細胞によつてコードされたタンパク質
は、紫外線処理によつて生じた損傷のために合成
されないであろう。これらタンパク質は、標準技
術によつて分離されそして分析されうる。 【0016】 外来DNA、すなわち宿主菌以外の源
からのDNAも本フアージベクター内へ挿入でき
る。pACYC177の該フアージへの挿入は、その
１例である。このような場合、宿主制御系の存在
は、トランスフエクシヨンの頻度を大幅に低下さ
せ、したがつて所望クローンの検出を困難にす
る。この問題を排除するために、宿主制限に欠陥
のある菌突然変異体を単離することができる。こ
のような菌株およびその誘導体は、次にクローニ
ング実験のための宿主として役立てることができ
る。有用であることが証明されうる外来DNAの
例は、抗生物質産生遺伝子、情報サツプレツサー
（転移RNA）の暗号を持つ遺伝子、あるいはトラ
ンスポゾンまたは突然変異遺伝子のごとき突然変
異誘発性要素である。 【0017】 クローン化抗生物質遺伝子は、標準的
組換えDNAの技術を用いて物理的に単離可能で
あり、そして他のクローニングベクターへ転移さ
れることができる。これらは、宿主生体内で複製
を行なうプラスミドまたは他の菌株内で複製を行
なうプラスミドを含む。クローン化抗生物質遺伝
子は、TG１またはその誘導体を介して、通常は
その抗生物質を産生しない他のStreptomyces菌
株へ転移されうる。この転移により、新規な抗生
物質の合成、あるいはそのクローン遺伝子の発現
の変化がもたらされるであろう。 【0018】 本ベクターは、DNAクローニングを
達成するためいくつかの別の仕方で使用すること
ができる。通常は無関係の菌株のプラスミドたと
えばE.coliのプラスミドは、それがあるフアージ
宿主菌株に導入された場合、それが外来起源であ
るが故に複製しないかあるいは保存されない。し
かしながら、もしそのプラスミドが該宿主染色体
に存在するものと相同なDNA配列の挿入によつ
て予め変えられていたならば、その相同座位にお
いて該染色体に該プラスミドが組み込まれた組換
えが可能となる。もしその宿主菌株がフアージ溶
原菌である場合には、プラスミド上のその相同シ
ーケンスは、１つのフアージ断片によつて提供さ
れうる。この場合、染色体に組み込まれるプロフ
アージに、そのプラスミドが挿入される。このよ
うな挿入されたプラスミドは、そのプロフアージ
が組み込まれた状態のままでいる限り宿主染色体
の一部として保存されるであろう。あるいは、フ
アージの通常の組み込みのために必要な機能を持
つているある特定フアージ断片、すなわち、付着
部位とフアージ組み込みに必要な遺伝子産物を指
示するコードを持つフアージ遺伝子とを持つ断片
をプラスミドに挿入してもよい。このようなベク
ターは、野生型フアージの組み込みと同様な態様
且つ同じ座位において宿主遺伝子へ挿入可能でな
ければならない。挿入されたベクターを持つ組換
え菌は、もしある選択可能な遺伝子型も同時にそ
のベクターによつて運ばれていたならば、容易に
同定することができる。このタイプのベクター
は、下記のごときいくつかの利点を持つ： (1) そのような分子内にクローン化されうる
DNAの量が、フアージパツケージングの束縛に
よつて制限されることがない。 (2) プラスミドがそのオリジナル宿主内で複製可
能である。たとえばStreptomyces宿主内よりも
はるかに容易に種々の遺伝的または物理的操作を
行なうことのできるＥ．coliオリジナル宿主内で
複製可能である； (3) たとえば、ラムダcos部位のようなエレメン
トも導入可能である。これによつてコスミド
DNAクローニングの技術（Methods in
Enzymology，Vol.68参照）を用いてプラスミド
宿主たとえばＥ．coli内で大きなDNA断片をク
ローニングし、次いで生じた雑種DNAを単離し
そしてStreptomyces菌株のプロトプラストをト
ランスフオーメーシヨンまたはトランスフエクシ
ヨンすることが可能となる。 【0019】 その他のフアージシーケンスもまたク
ローニングの目的のために使用することができ
る。一例を挙げれば、フアージTG１のcos部位
である。この部位は、DNAをフアージキヤプシ
ドの中にパツケージングする間ある１つのフアー
ジ産物によつて認識される。効果的なパツケージ
ングのために、順次連続するcos座位間のDNAの
長さが一定以上である必要がある。このcos部位
が１つのプラスミド内に挿入され且つ他のDNA
も挿入されれば、そのDNAを処理しそしてフア
ージ粒子を形成するために試験管内パツケージン
グシステムが使用できるcos座位間のDNAの正し
い長さを作り出すような挿入物のみをパツケージ
することができ、これによつて大きい挿入物が選
択される。 【0020】 染色体遺伝子を異なる制御下におくた
めにフアージプロモータシーケンスも利用するこ
とができる。フアージプロモータのいくつかは、
フアージレギユレータ機構によつて制御される。
すなわち、正しく挿入されたクローン遺伝子の発
現もまたかかる制御機構によつて制御されること
となる。例えば、温度感受性リプレツサーは、低
温においては、オペレータ座位に結合することに
よつてある特定のプロモータの発現を大幅に低減
させるであろう。他方、高温においては、そのリ
プレツサーは不活性となりそして高レベルの転写
が起こるであろう。もしある所望のクローン遺伝
子が適当な位置に挿入されたならば、その発現と
その遺伝子の生産レベルは、温度調節によつて発
酵の間制御可能である。 【0021】 ■■■ 亀の甲 ［0051］ ■■■ 【0022】注ａ 菌株の呼称はメルク社（Merk and Co.Inc.，
Rahway，New Jersey）の培養コレクシヨンの
呼称である。MA5766〜MA5770は指示したフア
ージベクターに対して溶原菌である
Streptomyces cattleyaMA4297（NRRL8057）
の誘導体である。MB4540〜MB4550は指示した
雑種フアージープラスミドベクターを含む
Escherichia coli Ｋ−12RR1の誘導体である。
Ｅ．coli Ｋ−12RR1はF.Bolivar，R.L.
Rodriquez，M.C.BetlachおよびH.W.Boyerによ
つて、Gene2、第75〜93頁（1977年）に記載され
ている。 注ｂ 各菌株の培養物はATCC（the American Type
Culture Collection）、米国メリーランド州、ロ
ツクビル、パークローンドライブ12301所在、に
永久寄託され、そして1982年４月２日現在すべて
完全である。また1982年現在the Agricultural
Research Culture Collection（NRRL），
Ferementation Laboratory，Northern
Regional Research Center，Science and
Education Administration，U.S.Department
of Agriculture、米国イリノイ州、ペオリア、ノ
ースユニバーシテイストリート1815所在、に寄託
されており、そして表に示した受託番号が与えら
れた。 【0023】図面についての説明 第１図 これはフアージTG１の電子顕微鏡写真である。
サンプルは、２％のリンタングステン酸水溶液
（1.0モルKOHでPH6.3に調整）で染色された。試
料は、フイリツプス300透過型電子顕微鏡
（Philips 300 Transmission Electron
Microscope）を用いて210570倍の倍率で観察さ
れた。 【0024】第２図 これはフアージTG１の制限地図である。位置は
任意的に左端として示してある単一のPst座位
に最も近いフアージDNAの端からのキロ塩基対
単位での座位距離として与えられている。この地
図は、Hind，Kpn，Pst，Sma，Sph
，Xbaの酵素のためのすべての部位を示す。
これらの位置はアガロースゲル電気泳動と、0.2
キロ塩基対およびそれより大きな断片の臭化エチ
ジウム染色とによつて決定することができた。 【0025】第３図 これはフアージTG１の欠失突然変異体を示す。
欠失は当該DNAを酵素Hind，Kpn，Pst，
Sph，Xbaで消化させることによつて解析さ
れた。TG１のための制限部位の位置は、第２図
と同様に、フアージDNAの左端からのキロ塩基
対で示されている。各誘導体についての欠失
DNAの位置が未確認であることはTG１の地図
の下に横向きカツコで指示さている。なお、フア
ージ地図の左端のみが示されていることに注意さ
れたい。この領域外には欠失は起こらなかつた。
欠失の最も左の可能位置は、上向きカギカツコで
示唆されており、最も右の可能位置は、下向きカ
ギカツコで示唆されている。キロ塩基対（Kbp）
単位で各欠失長さは、関連するカツコの右側の丸
カツコ内に記載してある。フアージ突然変異体は
左側に同定されている。ただし、一方のカギカツ
コの端位置の部位がその突然変異体い存在しない
場合には、それは他方のカギカツコの中に閉じら
れていることに注意されたい。その他の場合はそ
の所位は存在する。 【0026】第４図 これは雑種フアージTG６とTG７および欠失突
然変異体を示す。TG６とTG７の制限地図の左
端のみが示されていることに注意されたい。
10.28Kbpの位置にあるPstの右側のすべての制
限座位は第２図に示したTG１のそれと同じであ
る。ただし、これらの制限座位の位置は、Pst
座位のすぐ左の2.0KbpのDNAの欠失（第３図の
TG２参照）とこの部位への3.9Kbpの
pACYC177DNAの挿入を考慮すれば、1.9Kbpp
分だけ増えているはずである。pACYC177から
のDNAを含む領域は6.38Kbpと10.28Kbpとにそ
れぞれ位置するPstの２つの座位の間に濃い線
で示してある。各種誘導体の欠失部は、第３図の
場合と同様に各関連する親の下に指示されてい
る。 【0027】 しかして、本発明の目的の１つは、新
規なバクテリオフアージTG１それ自体およびそ
の誘導体（複数）を提供すること；かかるフアー
ジおよびその誘導体のゲノム（核酸）成分（欠失
突然変異体を含む）、フアージTG１ゲノムまた
はその部分を含む混成（キメラ）核酸分子および
生体へのDNAクローニングベクターとして有用
なその他のDNAシーケンスを提供することであ
る。上記生体は、たとえばＳ．cattleyaNRRL
8057のごとき菌である。上記フアージゲノムの部
分は、さらに組換えDNAクローニング技法にお
ける補助体として役立つ。たとえば下記の機能を
持つ： １ 組込まれた状態でも、自律的エレメントとし
ても、宿主内でのクローン化DNAの保存を可能
ならしめる。 ２ 内因性のまたは外来の遺伝子の発現を強化す
るプロモータとして働く。この場合、それが連結
されている遺伝子に対するプロモータとして働
く。また他の場合でもプロモータとして役立つ。 ３ 内因性および外来の遺伝子の発現を制御する
ための制御エレメントとして働く。 【0028】 クローニングベクターとして、TG１
およびその欠失突然変異体は、有用な機能をコー
ドするDNAシーケンス（遺伝子）たとえば抗生
物質チエナマイシン生産のために必要な遺伝子あ
るいはＢ型肝炎抗原の生産に必要な遺伝子の担体
として役立つ。またそれ自体が有用なDNAシー
ケンスたとえば本来有用性のある別個のプラスミ
ドベクターの担体として働く。かかる変異された
クローニングベクター（TG１ゲノムまたはその
部分および外来DNAシーケンスを含む混成DNA
分子）は感染、トランスフエクシヨンまたはトラ
ンスフオーメーシヨンによつて受容生体内へ導入
され、そこで該混成DNAは組込モード、溶菌
（増殖相）モードおよび／またはプラスミドモー
ドで機能する。 【0029】 本発明のいま１つの目的はしたがつ
て、TG１プロフアージおよびその欠失および雑
種（キメラ）誘導体を含む微生物、および雑種
（キメラ）フアージプラスミドおよびその誘導体
を含む微生物を提供することである。［なお、本
明細書で使用されている“TG１ベクター”とい
う言葉は、一般的意味において、TG１であるバ
クテリオフアージおよびすべてのその誘導体、
TG１およびその誘導体のゲノム（全部および部
分を含む）、およびTG１およびその誘導体のゲ
ノム（全部および部分を含む）を含有するクロー
ニングベクターを包括するものである］。 以下、本発明をいくつかの代表的実施例について
更に詳細に説明する。なお、“実施例”という言
葉は明細書の記載形式の点から便宜上使用するも
のであり、これらの実施例は上記した本発明に対
してなんら限定を加えるものではない。 【0030】実施例 １ TG１ベクターの単離、構成、保存および増殖 このフアージとDNAは、クローニングベクタ
ーとして従来使用されていた他のバクテリオフア
ージおよびプラスミドに関する作業によつて確立
された技法とは多少異なる方法で単離され、処理
された。技法の良い手引書の１つは、R.W.
Davis，D.BotsteinおよびJ.R.Rothによつて書か
れた“Ａ Manual for Genetic Engineering：
Advanced Bacterial Genetics”、ニユーヨーク、
コールドスプリングハーバー所在、Gold Spring
Harbor Laboratory刊行（1980年）である。本
願に係わる作業に使用した特定の方法が、上記マ
ニユアルに記載した方法と同一でない点について
は以下に記載がなされる。TG１ベクターとその
誘導体とを特定化するために役立つデータおよび
それらを他のクローニングベクターから役立つデ
ータは適当な箇所で記載がなされる。 【0031】Ａ フアージTG１の単離 約300種のさまざまな土壌試料を収集してＳ．
cattleya上で生育しうるフアージが存在しないか
を調べた。土壌試料1gを、105個／mlの濃度で菌
を含むYC肉汁５mlと混合し、そして30℃で振盪
しながら16時間培養することによつてフアージの
存否を検査した。この検査に使用した菌は、YC
肉汁中、107コロニー形成単位（cfu−colony−
forming unit）／mlの濃度のStoreptomyces
cattleyaMA4297の芽胞を振盪しながら37℃で３
時間培養することによつて準備された。YC肉汁
は１リツトルにつきデイフコ（Difco）イースト
抽出物4.0g、デイフコ麦芽抽出物10gよびＤ−グ
ルコース4.0gを含有する。オートクレーブしたの
ち1.0モルMgCl2および2.5モルCaCl2各10mmを添
加する。土と共にインキユベートしたこのブロス
を濾過し、106個の菌を含有している軟寒天を上
掛けしたプレートの上に濾過したブロスの１滴を
たらした。この培養プレートを30℃で16時間培養
した。使用した上掛けは菌0.1mlをYC軟寒天4.0
mlと混合し、そしてこの混合物を約40mlのYC寒
天を含有する１枚のペトリ皿に注入することによ
つて作成した。YC軟寒天は46℃の溶融デイフコ
寒天0.6％（ｗ／ｖ）を含むYC肉汁である。YC
寒天は2.0％（ｗ／ｖ）デイフコ寒天で固めたYC
肉汁である。 【0032】 菌細胞溶解域からの軟寒天を取り出
し、そして推定上のフアージを抽出してYCで希
釈した。各希釈物の0.1mlを試料として取つて菌
0.1mlと混ぜた。室温に10乃至20分間放置したの
ち、4.0mlのYC軟寒天を添加した。その軟寒天培
地が固化したのち、各培養皿を30度で16時間培養
した。わずか数個のフアージが加えられていた培
養皿に単一フアージの成長と繁殖から形成され
た、プラーク（溶菌斑）と呼ばれている菌細胞溶
解の小さな領域が観察された。各培養皿に観察さ
れるプラークの数はその懸濁物中のフアージの濃
度に正比例する。約30の異なるフアージ単離物
が、このようにして獲られた。フアージTG１は
他と異なりさらに２日の培養後に合一して広がつ
た溶菌域が濁つてきた。この観察がそのフアージ
が溶原性であることを示唆した。その可能性につ
いて更に詳細な吟味を行つた。（後記のＣ項およ
びＥ項参照）。 【0033】Ｂ フアージTG１の成長 フアージTG１は28℃から32℃までの間の温度に
おいて最も良く成長する。プラークの形成のため
にはCa++が要求される。プラークは通常その直
径が１乃至３mmである。安定性を得るためには二
価陽イオン（M++で十分）が要求される。このこ
とはピロリン酸塩、エチレンジアミンテトラ酢酸
塩のごときキレート剤の存在でフアージが不活性
化されることによつて明かである（後記のＩ項お
よびＮ項参照）。 単一ファージの子孫を繁殖させるためには、１つ
のプラークの中心から軟寒天培地を取り出して１
ml当り２×107cfuの菌を含有するYC肉汁10mlと
混合し、そして40乃至50r.p.m.の速度で回転して
いる組織培養ローラドラム（New Brunswick
Scientific，Model TC−７）中、25×150mm培養
管内で30℃の温度において16時間培養する。生じ
る溶菌物を0.45ミクロンの細孔サイズのフイルタ
ーに通す。この濾液が管１本のフアージストツク
となり、通常は1010pfu／mlの内容物を含む。 全面溶菌を起こすのに十分な量のフアージ（約
1014pfu=プラーク形成単位）で感染された平板培
養からその寒天上掛けを取り上げて5.0mlのYC肉
汁に再懸濁する。この混合物を約10秒間激しく混
合攪拌する。寒天を遠心分離によつて除き、そし
て上澄みを濾過する。この濾液が一皿のフアージ
ストツクとなり、通常109pfu／mlの内容物を含
む。これらのフアージストツクを４℃で貯蔵す
る。 【0034】Ｃ 溶原菌の単離と確認 プラークを有する培養皿をさらに１日または２日
培養すると、溶菌域内においてわずかながら菌増
殖が観察される。それらの菌を取り出して芽胞化
する。それらの芽胞を汚染フアージを除くため洗
滌し、希釈しそして単離コロニーとして成長させ
る。このような純粋培養から得られる芽胞または
成長能力のある細胞は溶原性であり、これがさら
に成長すると、それら細胞のいくつかはフアージ
を放出する。この培養液は新しい遊離のフアージ
を蓄積し、蓄積されたフアージは、濾過によつて
その菌から分離することができる。細胞自体は遊
離フアージが感染して溶菌することはない。Streptomyces oattleyaフアージ溶原菌の凍結
乾燥された芽胞の１本の管ストツクから次のよう
にしてフアージが調製できる。 凍結乾燥された芽胞の管を無菌的に開封し、その
内容物を25×150mmの培養管に入れられている10
mlの殺菌YC肉汁中に懸濁する。そして40乃至
50r.p.m.の回転速度で回転している組織培養ロー
ラドラム内で30℃の温度において６時間培養す
る。その培養液を細孔サイズ0.45ミクロンのフイ
ルターに通す。得られた懸濁物中のフアージは保
存可能であり、上記と同様にして増殖させること
ができる。 【0035】Ｄ Streptomyces oattleyaからの染色
体DNAの単離 約107芽胞を用いて接種を行なう。接種は二価陽
イオンが添加されていない。ただしグリシン0.1
％（ｗ／ｖ）を加えた25mlのYC肉汁を含有して
いる250mlのバツフルつきエルレンマイヤーフラ
スコに対して行なう。このフラスコを220r.p.m.
シエーカー［工程約５cm（２インチ）］にのせて
37℃で16時間振盪する。この時間で培養には十分
である。遠心分利によつて細胞を集め、0.09％
（ｗ／ｖ）のNaClの25mlで１回洗い、そして25％
（ｗ／ｖ）スクロースと50ミリモルのトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタンを含有している溶
液５mlに再懸濁する。その溶液は予め塩酸でPH
8.0に調整されていて、そしてニワトリ卵白リソ
チームの最終濃度が２mg／mlとなるよう使用直前
に添加されている。この混合物を37℃で１時間培
養し、次いでNaOHでPH８に調整されたエチレ
ンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム0.25モルを含
有する溶液2.5mlに加える。この混合物を氷上に
15分間放置し、そして2.0％（ｗ／ｖ）のＮ−ラ
ウロイル−Ｎ−メチルグリシンを含有する溶液
7.5mlを加える。さらに30分間氷上に放置したの
ち、牛のパンクレアチンリボヌクレアーゼＡを添
加する（0.1モル酢酸ナトリウム中5mg／mlの溶
液として0.15ml。この溶液は予め100℃で10分間
加熱されていた）。次に新規に調整されたプロナ
ーゼ（Pronase（登録商標）溶液0.6mlを添加する。
この溶液は、緩衝液Ｐに25mg／mlの量で溶解され
たプロナーゼを含有し、使用直前に37℃で45分間
温められた。なお緩衝液Ｐは50ミリモルのNaCl、
50ミリモルのエチレンジアミンテトラ酢酸二ナト
リウムおよび30ミリモルのトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタンを含有しており、溶液は塩酸
でPH7.5に調整されていた。上記の添加による混
合物を37℃で２時間培養する。この溶菌液で30分
間で３回等容量のフエノールで抽出する。フエノ
ールは３回とも使用直前に0.2モルのトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタンの溶液（これは塩
酸でPH7.5に調整されていた）の等量で平衡化し
て中和されていた。次にその溶菌液を等容量のク
ロロホルムで10回抽出し、そして10分の１容量の
酢酸塩溶液と混合する（この溶液は酢酸ナトリウ
ム3.0モルとエチレンジアミンテトラ酢酸二ナト
リウム1.0ミリモルを含有しており、NaOHでPH
7.0に調整されていた）。そのあと0.54容量部のイ
ソプロパノールを添加する。DNAをガラスロツ
ドに巻きつけて回収し、そして0.1％（ｖ／ｖ）
のジエチルピロカーボネートを含有する水5.0ml
に再溶解する。連続して２回以上同様方法で沈殿
させる。但し、各回の沈殿後に10ミリモルのトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと1.0ミリ
モルのエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム
を含有する溶液50ml（塩酸でPH8.2に調整したも
の）に再溶解させる。 【0036】Ｅ フアージTG１溶原菌のゲルトラン
スフアーハイブリダイゼーシヨン分析 適当な制限酵素によつて消化されたDNAをアガ
ロースゲル電気泳動によつて分離する。それらの
断片を精製し、変性し、そしてニトロセルロース
ペーパーに移す（Schleicher and Sohuell，
BA85）。精製したフアージからのDNAで放射線
標識をつけた試料をつくり、この試料を熱で変性
し、そして上記のニトロセルロース上のDNAと
ハイブリダイズさせる。これはホルムアルデヒ
ド、フイコル、牛血清アルブミンおよびポリビニ
ルピロリドンの存在且つ硫酸デキストランの不存
在下で42℃で48時間、実質的にDavis等（前掲）
により記載されているような仕方で実施される。 【0037】 フアージTG１の溶原性モードを決定
するためには、フアージ制限地図が役立つた。一
般に、溶原性フアージはプラスミドとして、ある
いは宿主染色体内への組込みによつて溶原化する
［A.M.Cambell：The episomes.Adv．Genet．
11（1962年）第101〜145頁参照］。溶原化のモード
の知識はそのフアージがDNAベクターとして使
用される予定である場合にかなり重要なことであ
る。適当な制限エンドヌクレアーゼで消化された
溶原性染色体DNAのゲルトランスフアー分析に
よつて、いずれのモードの可能性があるかが判別
される。そのフアージがプラスミドとして溶原化
する場合には、プロフアージDNAと増殖能力あ
るフアージDNAとの間の差異は、その付着末端
がプロフアージでは共に結合されるということの
みである。そのフアージが組込まれる場合には、
しかしながら、組込み部位が存在する特定制限断
片が欠けている。それは元の断片の両半分が染色
体DNAと融合することによつて生じる２つの新
しい断片によつて置換されるからである。われわ
れの実験結果は、フアージTG１がＳ．cattleya
の染色体内へ組込まれることを示している。酵素
PstＩとClaＩとが選択され、そのフアージDNA
は実質的に２つの領域に分割された。すなわち、
25Kbpサイズの大きな１つの内部断片と、サイズ
16.3Kbpの、cos断片と呼ばれているフアージ付
着末端を持つ２つの断片が結合したことから結果
する１つの断片とである。結合する前の２つの断
片のサイズはそれぞれ8.4Kbpと7.9Kbpである。
増殖能力のあるフアージからのDNA（0.01μg）と
溶原菌からの染色体DNA（1.0μg）とをそれら酵
素で消化し、そしてアガロースゲル上で分離し
た。その制限パターンを上記した放射線標識フア
ージDNAとハイブリダイズして分析した。非溶
原菌からのDNAはフアージDNAと相同なシーケ
ンスを含んでいなかつた。cos断片はその溶原菌
内に欠けており、そしてフアージDNAとハイブ
リダイズするサイズ15kbpと11kbpとの２つの新
規な断片によつて置換されていた。この結果は、
そのフアージDNAが宿主DNA内へ組込まれたこ
とを示す。 【0038】Ｆ フアージ粒子の精製 １皿または１管のフアージストツクの試料1.0ml
を菌濃度107ofu／ml、温度30℃のYC肉汁1.0リツ
トルに加える。これを回転シエーカー上に2.0リ
ツトルフラスコ内で30℃で16時間培養する。シエ
ーカーの工程は約５センチ（２インチ）、そして
回転速度は220r.p.m.であつた。溶解物をガラス
ウールを通して濾過して清澄化する。この溶解物
は約109pfu／mlの内容を持つ。NaCl 20gとポリ
エチレングリコール（平均分子量6000）を加えて
フアージを沈殿させる。攪拌して添加物を溶解さ
せたのち、この混合物を攪拌しないで一晩４℃で
放置する。フアージを低速遠心分離によつて沈殿
させる。ペレツト状になつた物質を再び10mlの
SM緩衝液に溶解する。SM緩衝液はNaCl 0.5％
（ｗ／ｖ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン20ミリモル、ゼラチン0.01％，MgCl210ミリ
モル、CaCl2５ミリモルを含有し、その全体は塩
酸でPH7.5に調整されていた。 【0039】 ５分間2500×ｇの遠心分離にかけて上
記懸濁物を清澄化する。その上澄み液を新しい遠
心管に入れ、そしてSM緩衝液中下記量のCsClの
溶液各2.0mlを下に重層する。即ち密度1.3g／ml，
1.5g／ml、および1.7g／mlである。この間を10℃
で1.5時間ベツクマン60Tiロータを用い50000r.p.
m.の回転速度（平均回転遠心力180000×ｇ）で
遠心分離する。フアージ粒子は、底の２つの層の
間の界面に濁つた帯域として可視となる。この帯
域の物質をピペツトで取り、最終体積10mlを与え
るのに十分な量の密度1.5g／mlのSM緩衝液中
CsClの溶液と混合し、そしてベツクマン80Tiロ
ータにより40000r.p.m.（平均回転遠心力110000×
ｇ）、温度10℃で16時間遠心分離する。フアージ
は再び管の真中近くに１つの濁つたバンドとして
可視となる。これをピペツトで採集し、そのフア
ージ懸濁物を各バツチ2.0リツトルのバツフアー
液に対して順次透析する。使用バツフアー液はト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン20ミリモ
ル、MgCl210ミリモル、CaCl2５ミリモルを含有
し、塩酸でPH7.5に調整された溶液にNaClをそれ
ぞれ1.0モル、0.3モル、0.1モル、0.01モル溶解さ
せたものである。 【0040】Ｇ フアージDNAの製造 本DNAは、精製されたフアージ粒子から標準的
ないくつかの方法によつて製造することができ
る。そのうちの２つの方法をここに述べる。 方法１ 再蒸留されたフエノールを続けて３回、
塩酸でPH８に調整した0.2モルのトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタンの1.0容量で平衡化す
る。平衡化されたフエノールの等容量をフアージ
懸濁物に加え、そして30分間管の上下をくり返し
反転させて２相を混合する。フエノール（下層）
をピペツトで除去する。このフエノール抽出を２
回くり返す。水性相を等容量のエーテルで３回抽
出する。ピペツトで除去できないエーテルを放置
して蒸発させる。酢酸でPH6.5に調整された3.0モ
ルの酢酸ナトリウム溶液を10分の１の容量だけ添
加し、次いで２倍容量の200プルーフエタノール
を添加する。エタノールを水性相と混ぜ合わせる
と沈殿したDNAが可視となる。このDNAを
13000×ｇで10分間遠心分離にかけて回収する。
上澄みを傾瀉し、そのペレツトを70％（ｖ／ｖ）
のエタノールで洗い、そして残存液体を窒素ガス
流で蒸発させる。このDNAを少量のTEに再溶解
する。TEはトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン10ミリモルとエチレンジアミンテトラ酢酸
二ナトリウム1.0ミリモルとを含有するものであ
り、塩酸でPH7.8に調整される。精製したDNAを
４℃または−70℃で貯蔵する。 【0041】方法２ フアージ懸濁液を５分の１容量
のトリス（ヒデロキシメチル）アミノメタン0.5
モルとエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム
0.25モルとを含有し、塩酸でPH8.0に調整された
溶液に混合する１／5000の容量のジエチルピロカ
ーボネートを添加する。この混合物を37℃で１時
間培養する。 等容量のホルムアミドを加える。この時に完全な
フアージ粒子による濁りが消え、溶液はDNAの
放出のために粘性となる。透析によつてフアージ
懸濁物からCsClが除去されていない場合には最
初の水溶液と等容量の水をホルムアミド含有混合
物に加える。DNAを沈殿させるために、この溶
液を２倍容量の200プルーフエタノールと混合す
る。沈殿したDNAを回収して上記方法１の場合
と同様に貯蔵する。 純度はやや乏しいが、しかし制限分析（Ｈ項）、
トランスフエクシヨン（Ｊ項）またはトランスフ
オーメーシヨン（Ｋ項）のために使用できるフア
ージDNAもこの方法によつて、ベツクマン80Ti
ロータの45000r.p.m.（平均回転遠心力150000×
ｇ）で３時間遠心分離することにより管内溶菌物
から採集されたフアージから製造できる。このフ
アージペレツトを0.2ミリモルのトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタンと25ミリモルのエチレ
ンジアミンテトラ酢酸塩とを含み、予め塩酸でPH
8.5に調整された溶液0.5mlに懸濁させる。この懸
濁物に直接的にジエチルピロカーボネートを加え
る。上記と同様に単離されたDNAを、牛のパン
クレアチンリボヌクレアーゼＡを最終濃度
10μg／mlの量で添加して72℃で10分間加熱する。
そして上記のように貯蔵する。 【0042】Ｈ フアージDNAの制限分析 DNAを制限エンドヌクレアーゼの種々の組合わ
せで制限切断し、そしてそれらの制限生成物を実
質的にDavis等（上掲）により記載された方法に
よりアガロースゲル電気泳動によつて分析した。
結果は、フアージTG１核酸が付着末端を持つ長
さ41.47キロ塩基対（kpb）の線形二本鎖DNA分
子によりなることを示した。下記の酵素はこの
DNAを開裂させることができない：BamH Ｉ，NaeＩ，NarＩ，PvuＩ，SstＩ，Sst
，StuＩ，XhoＩ。 下記の酵素は複数部位において、このDNAを開
裂させる：Bgl Ｉ，BstE，HgiAＩ，HphＩ，Mbo，
SalＩ，Xma，Xor，NruＩ，PvuＩ，EcoR
Ｉ，BclＩ，Bgl，BalＩ，KpnＩ，HpaＩ，
Sph，AvaＩ，Hind。 下記酵素はただ１つの部位において、そのDNA
を開裂する：Pst Ｉ，XbaＩ，ClaＩ，SmaＩ。 これら酵素のいくつかの場合にもたらされた制限
パターンが第２図に示されている。 【0043】Ｉ フアージTG１の欠失突然変異体の
単離 欠失突然変異体はDNAのクローニングのために
特に役立つ。１個のフアージ粒子内にパツケージ
しうるDNAの量は限度がある。フアージDNAの
一部の欠失は、その欠失サイズに等しい付加的量
のDNAをそのフアージに挿入できるスペースを
与える。また、欠失によつて、そのフアージゲノ
ムのどの部分が必要不可欠でないか、すなわちど
の部分がDNA挿入のために適当かが判明する。
他の領域への挿入はおそらくフアージの機能に必
要な遺伝子をこわすことであろう。突然変異体は
キレート剤に耐性のあるフアージ変種を単離する
ために一般に使用されている技術（前記参考文献
８参照）によつて得られた。フアージ粒子の安定
性のためにはマグネシウムイオンが必要である。
もしMg++がキレート剤（この場合ではエチレン
ジアミンテトラ酢酸塩）の添加によつて有効的に
除去されると、生きたフアージの個数は急速に減
少する。フアージゲノムの幾分かの欠失に由来す
る突然変異のために、より短いDNA分子を含む
フアージ粒子はMg++の不存在でもより安定であ
り、生き残る。 【0044】 フアージTG１の欠失突然変異体を得
るため、KOHでPH6.5に調整した1.0モルの２−
（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸0.10mlと、
NaOHでPH７に調整した0.50モルのエチレンジア
ミンテトラ酢酸二ナトリウム0.10mlとをフアージ
の平板または管ストツクの1.0mlと混合する。こ
の混合物を37℃で30分間培養する。ついで、これ
を25mlのYC肉汁と0.10mlの菌とを含有している
250mlのエルレンマイヤーフラスコに添加する。
時としてはフアージの増殖を促進するため５ミリ
モルのHCl中FeCl3・6H2O10mg／mlの溶液を0.50
ml添加することが必要である。これの必要性は
YC肉汁の特定バツチの種類による。このフラス
コを140r.p.m.のシエーカー［行程約５センチ
（２インチ）］上で30℃において16時間振盪する。
一晩培養したのち得られた溶菌液を0.45ミクロン
の細孔サイズを持つフイルターに通して濾過し、
そして生きているフアージの濃度を判定する。も
しこれが107ptu／ml以上であつた場合には、エチ
レンジアミンテトラ酢酸塩による処理ならびにそ
れに続くフアージの培養をくり返す。エチレンジ
アミンテトラ酢酸塩の第１回目の処理でpfu／ml
濃度は約104乃至105倍低下する。その後の処理に
よるpfu／mlの減少度は段々と低くなる。通常こ
の処理を３回くり返す。最後の処理終了後に単一
プラークから増殖させたフアージのDNAを精製
し、そして制限エンドヌクレアーゼによる消化に
よつて分析する。クローンフアージの多くはそれ
らのDNAの一部が欠失されてしまつている。か
かる欠失フアージの制限分析により少なくとも４
つの型のフアージ欠失種が生じたことが判明す
る。例えばフアージTG２，TG３，TG４，TG
５（第３図参照）である。これらのフアージ
DNA分子について酵素Hind，KpnＩ，PstＩ，
SphＩの制限部位の存否を調べた。フアージTG
２はDNAの2.0kbpの欠失を持ち、これにより
6.72kbp位置のSphＩ部位、7.93kbp位置のKpnＩ
部位および7.99kbp位置のHind部位が取り去ら
れている。フアージTG３は2.5kbpのDNAの欠
失を持ち、7.93kbp位置のKpnＩ部位、7.99kbp位
置のHind部位および8.38kbp位置のPstＩ部位
が取り去られている。フアージTG４は2.1kbpの
DNA欠失を持ち、6.72kbp位置のSphＩ部位、
7.93kbp位置のKpnＩ部位および8.38kbp位置の
PstＩ部位が取り去られている。これらのフアー
ジを放出する能力を持つＳ．cattleyaNRRL8057
の溶原菌は前記表Ｉに記載したようにフアージ
TG２を放出するものは菌株ATCC39077
（MA5766）として、フアージTG４を放出するも
のは菌株NRRL 15034（MA5769）として、フア
ージTG５を放出するものは菌株NRRL 15035
（MA5770）として寄託されている。多分、他の
型の欠失突然変異体も同様にして得られ、そして
それらは有用性を持つているであろう。第３図は
これらフアージのそれぞれにおいて欠失された
TG１ゲノム部分を示す図である。第３図に示し
た欠失突然変異体のすべては溶原菌形成能力があ
る。偶発的に得られたすべての欠失突然変異体に
ついて同じことが言えるとは限らない。第３図に
示したフアージ内のDNA欠失或はそのフアージ
の細胞溶解性機能にも溶原性機能にも必要ない領
域である。これら欠失のうち２つはフアージゲノ
ムの単一PstＩ部位を取り去つてしまつている。
フアージの機能に影響を与えることなしにこの部
位に外来DNAが挿入可能であり、したがつて、
この部位はクローンされるべきDNAの挿入のた
めに有用な部位であることが判明している（Ｍ項
参照）。欠失型のうちの２つはPstＩ部位を手つけ
ずに残している。これらのDNA分子はクローン
されるべきDNAの挿入のために格別に有用であ
る。PstＩのための部位以外の他の部位もまた
DNAのクローニングのために役立つとが判明す
る可能性は大きい。 【0045】Ｊ Streptomyces cattleya MA4297ト
ランスフエクシヨン トランスフエクシヨンは下記方法で実施される。 遠心分離によつて菌を採集し、そして約1010
cfu／mlで2.0mlのPMC20に懸濁する。PMC20は
スクロース200g，K2SO40.25g，MgCl2・6H2Ｏ
2.0gおよび微量元素液2.0mlを最終体積が1.0リ
ツトルとなるよう水に溶解し、オートクレーブ後
に2.5モルCaCl210mlおよびKOHでPH6.0に調整し
た1.0モル２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン
酸と0.5％（ｗ／ｖ）KH2PO4の溶液10mlを１リ
ツトルにつき添加することによつて調整される。
微量元素液は１リツトルにつきZnCl2を40mg，
FeCl3・6H2Ｏを200mg，CuCl2・2H2Ｏを10mg，
MnCl2・2H2Ｏを10mg，Na2B4O7・10H2Ｏを10
mg，（NH4）6Mo7O24・4H2Ｏを10mg含有する。 上記の菌懸濁物にニワトリ卵白リゾチーム2.0ml
（２mg／mlPMC20）を加える。この混合物を37℃
で90分間培養し、その後で2500×ｇの遠心分離に
５分間かけてプロトプラストを集める。このペレ
ツトをPMC20の4.0mlに再懸濁して氷上に保持す
る。DNAのサンプル、たとえばベクターDNAを
１マイクロリツトル当り0.25μgを含有している
DNAサンプル20μを等容量のヘパリン溶液
（シグマ、ナトリウム塩、２倍濃縮したPMC20の
１mlにつき５mg）と混合し、そしてPMC20の
240μを添加し、次いでPMC20に溶解した28％
（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（シグマ、平
均分子量1000）1.50mlを添加する。この混合物を
室温で10分間培養する。0.7mlの試料を取つて
RM軟寒天10mlおよびPMC20の１ml当り107cfuの
濃度のＳ．cattleyaの芽胞0.20mlと混合し、そし
て直ちに四角（100×15mm）のペトリ皿に注入す
る。この皿にはRM寒天約60mlが入つている。な
お、RMはスクロース200g，K2SO4 0.25g，
MgCl2・6H2O10g，Ｄ−グルコース10g、デイフ
コカサミノ酸類0.1g，デイフコオートミール寒天
3.5g、微量元素液2.0ml，Ｌ−プロリン3g、デイ
フコイースト抽出物2gおよび２−（Ｎ−モルホリ
ノ）エタンスルホン酸1.95gを含有しており、こ
れらは水の中で十分に混合され、KOHでPH6.0に
調整され、1.0リツトルまで希釈されてオートク
レーブで煮られた。オートクレーブで煮たのち、
１リツトルにつき8.0mlの2.5モルCaCl2と10mlの
0.5％（ｗ／ｖ）KH2PO4が添加された。RM寒天
は2.0％（ｗ／ｖ）のデイフコ寒天で固めたRM
のことである。RM軟寒天とは温度46℃で0.6％
（ｗ／ｖ）溶融デイフコ寒天を含んでいるRMで
ある。軟寒天の上掛けが固まつたのち、皿を28℃
で２日間培養する。フアージは菌溶解域から単離
され、そして増殖される。 【0046】Ｋ Escherichia coli Ｋ−12RR−１の
トランスフオーメーシヨン DNAの取込みにコンピテントとなつたＥ．coli
細胞が下記方法によつて得られる。 Escherichia coli Ｋ−12RR−１［F.
Bolivar，R.L.Rodriquerz，M.C.Betlach，H.W.
Boyerの論文、2Gene、第75〜93頁（1977年）参
照］は、培地LB250ml中、37℃の温度で指数関数
的に増殖する。LBは蒸留水１リツトル中にバク
トートリプトン10g、バクトーイースト抽出物5g
およびNaCl5gを含有するものである。細胞濃度
が２×108cfu／mlに達したらその培養物を氷の温
度まで15分間冷却し、しかるのち４℃で遠心分離
（6000xg，５分間）により細胞を集める。上澄み
液を傾瀉し、そして細胞を氷冷した0.1モルCaCl2
溶液125mlで懸濁する。この細胞懸濁物を15分間
氷の上に保持する。再び遠心分離によつて細胞を
集め、氷冷0.1モルCaCl225mlに懸濁し、そしてさ
らに15分間氷上に保持する。この細胞懸濁物に
0.1モルCaCl中40％（ｗ／ｖ）グリセリンを含む
氷冷溶液（15ml）を混合する。これは−70℃で貯
蔵しておくこともできるし、また直接使用するこ
ともできる。 DNA（TE30μ中約0.1乃至1.0μg）を、50ミリモ
ルNaCl，５ミリモル クエン酸ナトリウム、67
ミリモルCaCl2を含有する溶液100μと混合す
る。次に細胞懸濁物（0.20ml）を加え、そしてこ
の混合物を45分乃至１時間氷上においておく。培
養液LB（4.0ml）を加え、振盪しながら37℃で３
時間細胞を培養する。この培養期間中にプラスミ
ドの確立と変換DNAによつて授与された選択可
能な特性の表現が可能である。遠心分離によつて
細胞を集め、そして種々の量でこれを寒天培養皿
の上に拡げる。これらの培養皿には付加された
DNAによつて授与された特性を獲得した菌のみ
の成長を許容する培養培地を入れておく。たとえ
ば、1.5％（ｗ／ｖ）のデイフコ寒天で固められ、
そして抗生物質たとえば50μg／mlの濃度のカナ
マイシンを添加したLBを培養培地とする。 【0047】Ｌ E.coli Ｋ−12からのプラスミド
DNAの製造 プラスミドDNAはＥ．coli Ｋ−12のプラスミ
ド含有誘導体から標準的技法、たとえばDavis等
（前掲）の第116〜119頁に記載された方法によつ
て単離することができる。純度はやや低いが、し
かしトランスフオーメーシヨン、トランスフエク
シヨンまたは制限分析のために使用するのに適当
なDNAが下記方法によつてより早く単離するこ
とができる。 選択性培地、通常は抗生物質を加えたLBの５ml
中で細胞を静止相になるまで一晩増殖させる。こ
れらの細胞を遠心分離（3000xg，５分間）によ
つて採集し、そして下記成分を含み全体がKOH
でPH８に調整された溶液0.45mlに懸濁する。８％
（ｗ／ｖ）スクロース、５％（ｗ／ｖ）Triton
Ｘ−100，50ミリモルのエチレンジアミンテトラ
酢酸二ナトリウムおよび50ミリモルのトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン、リゾチーム
（TEの１ml中10mgの新しく調整した溶液25μ）
を加える。この混合物を沸騰水中で60秒間インキ
ユベートし、そしてその後直ちに室温で遠心分離
する（12000xg，10分間）。上澄み液の100μを
取り、そして100μのイソプロパノールと混合
する。−20℃で30分間培養後、DNA沈殿を遠心分
離（12000xg、10分間）により回収し、100μの
TEに溶解して４℃で貯蔵する。制限分析、トラ
ンスフエクシヨンまたはトランスフオーメーシヨ
ンのためには５乃至20μで十分である。 【0048】Ｍ フアージTG２DNA内へのプラス
ミドpACYC177の挿入 この実験は、このベクター内への外来DNAのク
ローニングが実行可能であることを実証するもの
である。 プラスミドpACYC177はA.C.Y.ChangとS.N.
CohenによつてJ.Bacteriol.134（1978年）第1141
〜1156頁に記載さている。これはＥ．Coliから得
られたものであり、サイズは約3.6キロ塩基対で
ある。これはアムピシリンおよびカナマイシンに
対する耐性を与え、そしてアムピシリンに対する
耐性をコードしているDNAシーケンス内に単一
PstＩ部位を持つている。共有結合的に閉環して
いるpACYC177プラスミドDNAとフアージTG
２DNAとは、下記組成の反応混合物0.25ml中で
37℃で８時間インキユベートすることによつて
別々に開裂された。反応混合物はTE0.20ml中の
DNA50μgに５×KC［0.1モルのトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン、50ミリモルのMgCl2，
0.1モルのKClを含み、HClでPH7.7に調整した溶
液］0.05mlとPstエンドヌクレアーゼ15μ（150
単位、Bethesda Researoh Laboratories製品）
とを混合してなるものであつた。４時間インキユ
ベートしたのち、さらに100単位のエンドヌクレ
アーゼをフアージDNA含有反応混合物に添加し
た。各混合物を70℃に10分間加熱し、しかるのち
ジエチルピロカーボネート1.0μを添加し、そし
てさらに37℃で１時間インキユベートしてエンド
ヌクレアーゼを不活性化した。前記のごとく、こ
のDNAをエタノールを添加して沈殿させ、そし
てTEの0.20mlに再溶解する。各開裂されたDNA
試料（75μ）を、次のものをプラスして互いに
混合したTE75μ，LM［0.66モルのトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン、66ミリモルの
MgCl2を含み、HClでPH7.5に調整したもの］28μ
，4.0ミリモルのアデノシン−5′−三リン酸塩
（二ナトリウム塩）25μ，0.10モルのジチオスレ
イトール25μおよびT4DNAリガーゼ3μ（６
単位、Bethesda Research Laboratories）。こ
の混合物を3.5℃で24時間インキユベートした。
エタノールでDNAを沈殿させ、そしてTE75μ
に再溶解した。このDNA調整物の数部量がＪ項
に記載したようにＳ．cattleyaのプロトプラスト
のトランスフエクトのために使用された。フアー
ジが単離されて、それらのDNAが制限分析によ
つて調べられた。挿入によつて親のフアージとは
異なつたDNAを持つフアージが得られた。この
挿入は、プラスミドpACYC177のサイズと制限
特性を有するDNAが単一PstＩ部位に挿入された
ものであり、PstＩの消化によつて線形に切り出
すことができた。第４図に示すように、互いに反
対の配位（orientation）で挿入された
pACYC177を持つ２種のフアージ、TG６とTG
７とが得られた。これらフアージのDNAがＫ項
に記載したようにＥ．coli −12RR １のトラン
スフオームのために使用された形質転換体（トラ
ンスフオーマツト）は1.5％（ｗ／ｖ）デイフコ
寒天で固められ、そして50μg／mlのカナマイシ
ンを補足されたLBを含有するペトリ皿上で選択
された。 【0049】 上記のペトリ皿を37℃で一晩培養し
た。カナマイシン耐性菌の多数のコロニーがフア
ージTG６とTG７のDNAにさらされた細胞から
得られた。このような菌を再精製した。そしてフ
アージTG６から得られたプラスミドpTG６を含
有する菌は菌株ATCC39079（MB4540）として、
そしてフアージTG７からのプラスミドpTG７を
含有するものは菌株ATCC39082（MB4543）とし
て寄託されている。Ｌ項に記載したように、これ
ら菌株からプラスミドDNAが単離され、そして
Hindの制限分析によつて検査された。そのプ
ラスミドは付着末端が結合されている点を除き対
応する増殖能力のあるフアージ、TG６とTG７
のDNAと同じであつた。さらに、未消化のDNA
調整物をＪ項に記載した仕方と同様な仕方で
Streptomyces cattleyaMA4297のプロトプラス
トをトランスフエクトするために使用した。その
結果、同様判定によつてはフアージTG６および
TG７から区別不能なフアージが生じた。 【0050】Ｎ 交配フアージの欠失突然変異体の単
離 プラスミドpACYC177を欠失フアージTG２に挿
入すると、そのゲノム（核酸）が元のフアージ
TG１のそれよりも4.7％長いフアージが生じる。
このフアージにパツケージされたDNAのその余
分な長さは、元のTG１よりもキレート剤に対し
てそのDNAをより敏感にする。この特性は、次
のようにして欠失突然変異体の単離のために利用
することができる。注目すべきは、元の単離物の
ゲノムよりも大きいゲノムサイズをもたらすこと
になるフアージTG１のいずれの誘導体内へのい
ずれのDNAの挿入も類似の特性を示すであろう
ことである。 フアージTG６およびTG７の欠失突然変異体を
単離するため、単一プラークから調整された管ス
トツクの10μを、二価陽イオンを添加されてい
ないそして25ミリモルのピロリン酸ナトリウムが
補足され且つNaOHでPH6.0に調整されたYC肉汁
0.10mlと混合する。35℃で30分間培養したのち
（この時点で生き残つているフアージ個体数は最
初の濃度の約10-3である）、YC肉汁い菌を懸濁し
た懸濁物0.20mlを加える。室温で10乃至20分間経
過させたのち、YC軟寒天4.0mlを加え、その混合
物をYC寒天皿の上に注ぎ、そして30℃で一晩培
養する。これにより１皿のフアージストツクが得
られる。ピロリン酸塩によるフアージ処理を続け
て２回以上くり返す。 【0051】 第２回目、第３回目の処理後に生き残
るフアージの割合は、実質的に段々と大きくな
る。このようなピロリン酸塩耐性フアージから単
離された単一プラークのDNAは、通常その挿入
されたプラスミドの領域が欠失されている。この
欠失の平均サイズは４乃至6kbpである。挿入さ
れたプラスミドの領域とは別の領域に欠失を持つ
突然変異体を選択するため、上記のピロリン酸塩
耐性フアージ皿ストツクの試料0.10mlから直接的
に調製されたフアージ管ストツクからDNAを単
離する。このようなストツクは混合集団であり、
そのうちのいくつかのメンバーが所望の欠失を持
つフアージである。そのDNAをＥ．coliＫ−
12RR1をカナマイシン耐性にするために使用す
る。かかる形質転換（トランスフオーマント）の
プラスミドDNAは再生機能と挿入された
pACYC177プラスミドのカナマイシン耐性遺伝
子とを保持しているはずである。二者択一的に選
択可能な特質を授与する挿入DNAを持つ誘導体
は同じような方法で利用することができる。も
し、その特質がＥ．coliではなくてＳ．cattleya
の中で発現されるならば、そのピロリン酸塩耐性
フアージ混合集団をＳ．cattleya菌に直接感染さ
せることによつて、これら欠失突然変異体を得る
ことができる。そのフアージを吸着させたのち、
菌を２乃至４時間増殖させれば、選択的培地に移
す前にそのベクター分子の確立とその選択可能な
特質の発現とがなされる。 【0052】 ベクターDNAを形質転換細胞から
（或は場合によつては溶原菌から放出されたフア
ージから）単離し、そして欠失の有無を調べる。
フアージTG６とTG７のピロリン酸塩耐性集団
からのDNAで得られたカナマイシン耐性形質転
換体は増殖性フアージDNA制限地図の左端（第
４図）と挿入プラスミドのカナマイシン耐性遺伝
子との間の位置に欠失を持つプラスミドを含有し
ていた。フアージTG６とTG７の制限地図に関
する位置およびそれら欠失のサイズは第４図に示
されている。制限酵素Hidn，SphＩ，PstＩ，
SmaＩおよびBamHＩについてそれらプラスミ
ドを分析した。 【0053】 TG６から下記のプラスミドが誘導さ
れた： pTG８：これは3.1kbpのDNA欠失を持ち、これ
によつて6.38kbp位置のPstＩの部位および
7.27kbp位置のBamHＩ部位が取り去られてい
る； pTG９：これは4.7kbpのDNA欠失を持ち、その
結果4.75kbp位置のSphＩ部位、6.38kbp位置の
PstＩ部位および7.27kbp位置のBamHＩ部位が
取り除かれている； pTG１０：これは3.0kbpのDNA欠失を持ち、そ
の結果1.66位置のHidn部位が除去されてい
る； pTG１１：これは2.0kbpのDNA欠失を持ち、こ
れにより6.38kbp位置のPstＩの部位と7.27kbp位
置のBamHＩ部位が除去られている； pTG１２：これは6.0kbpのDNA欠失を持ち、
4.75kbp位置のSphＩ部位、6.38kbp位置のPstＩ
部位および7.2kbp位置のBamHＩ部位が除去さ
れている； pTG１３：これは2.8kbpのDNA欠失を持ち、そ
の結果6.38kbp位置のPstＩの部位と7.27kbp位置
のBamHＩ部位とが取り去られている； pTG１４：これは4.1kbpのDNA欠失を持ち、そ
のため4.75kbp位置のSphＩ部位が取り去られて
いる。 【0054】 TG７からは下記のプラスミドが誘導
された： pTG１５：これは3.1kbpの欠失を持ち、これに
より4.75kbp位置のSphＩ部位が除去られてい
る； pTG１６：これは4.6kbpのDNA欠失を持ち、そ
の結果4.75kbp位置のSphＩ部位が除去られてい
る。 これらのプラスミド誘導体のいくつかを含む代表
的誘導体は以下の菌株番条をもつて委託されてい
る。 プラスミドpTG１２を含む菌株ATCC39080
（MB4541）； プラスミドpTG１６を含む菌株ATCC39081
（MB4542）； プラスミドpTG８を含む菌株NRRLB−15027
（MB4544）； プラスミドpTG９を含む菌株NRRLB−15028
（MB4545）； プラスミドpTG１０を含む菌株NRRLB−15029
（MB4546）； プラスミドpTG１１を含む菌株NRRLB−15030
（MB4547）； プラスミドpTG１３を含む菌株NRRLB−15031
（MB4548）； プラスミドpTG１４を含む菌株NRRLB−15032
（MB4549）； プラスミドpTG１５を含む菌株NRRLB−15033
（MB4550）。 【0055】 これらのプラスミドはＳ．cattleyaの
プロトプラストをトランスフエクトするために使
用され、そしてそのDNAが、付着末端が分離さ
れうる点を除き、対応するプラスミドDNAと同
じであつたフアージを生じた。プラスミドpTG
８はフアージTG８を、pTG９はフアージTG９
を与えた。他についても同様であつた。 【0056】実施例 ２ チエナマイシン遺伝子のクローニング この実施例はTG１ベクターの誘導体がどのよう
にしてチエナマイシン遺伝子の同定およびクロー
ニングのために使用しうるかを示すものである。 実験は種々の方法で実施可能であり、ここに記載
するのはその一例を示すにすぎない。したがつ
て、本実施例は目的を達成するためにTG１およ
びその誘導体を用いる方法を例示するだけであ
り、なんら限定的なものではない。 【0057】Ａ チオストレプトン耐性遺伝子を担持
するTG１誘導体の構成 薬剤に対する耐性の遺伝子を担持するTG１誘導
体を構成する事は、溶原菌の直接的選択を可能に
する。これはチエナマイシン遺伝子のためのハイ
ブリツドベクタークローンをスクリーニングする
ために役立つ（本実施例のＢ項参照）。
Streptomycesでは抗生物質チオストレプトンに
対する耐性を与える遺伝子がすでにクローンされ
ている［C.J.Ward，J.M.およびHopwood.D.
A.：DNA Cloning in Streptomyces：
resistance genes from antibiotic−producing
species.Nature 286（1980）第525〜527頁参照］。
この遺伝子を持つプラスミドDNAを単離し、そ
してBamHＩで開裂する。そのチオストレプト
ン耐性遺伝子を持つ断片（2.0kbp）を、アガロー
スゲル電気泳動により精製する。精製された断片
をBclＩで部分的に消化する。この断片は、その
薬剤性遺伝子の両側にBclＩ部位を持つている。
部分的に開裂されたDNAとBamHＩですでに開
裂されているベクターTG１５のDNAとを混合
し、そして結合する。結合されたDNAを実施例
１、Ｊ項に記載したようにStreptomyces
cattleyaのプロトプラストをトランスフエクトす
るために使用する。ただし今回は、ポリエチレン
グリコールによる処理後にそのプロトプラストを
10mlのRMおよび芽胞と混合し、そして250mlの
エルレンマイヤーフラスコ内30℃の温度でゆつく
りと振り回しながら一晩培養する。細胞を種々の
度合いに希釈し、そして最初濃度５および
10μg／mlでチオストレプトンを追加したYC寒天
を含有するペトリ皿の上に撒く。チオストレプト
ン耐性溶原菌の成長によりコロニーが生じる。こ
れらの溶原菌からのフアージのDNAを分析して
BamHＩ部位の有無を調べる。 【0058】 単一のBamHＩ部位を持つハイブリ
ツドベクターとBamHＩ部位を全く持たないハ
イブリツドベクターとを選択する。BclＩで消化
されて生じた端はBamHＩの消化によつて生じ
た端で連結されうるが、しかしその新規連結はい
ずれの酵素のための部位も再生しないからして、
１端においてBamHＩでそして他端においてBcl
Ｉで開裂されて生じた断片の挿入は単一の
BamHＩ部位を持つベクターを与え、両端にお
いてBclＩで開裂されて生じた断片の挿入は全く
BamHＩ部位を持たないベクターを与える。１
端にBamHＩ部位を持つチオストレプトン耐性
遺伝子を担持する挿入体の長さは約1.5kbpであ
る。BamHＩ部位を全く持たないチオストレプ
トン耐性遺伝子を担持する挿入体の長さは1.1kbp
である。 【0059】 チオストレプトン遺伝子の左側に位置
するフアージおよびpACYC177の欠失は、実質
的に上記した方法（実施例１，Ｉ項およびＮ項参
照）により得られる。所望の欠失により４乃至
4.5kbpのDNAとpACYC177DNAの左端に位置す
るPstＩ部位が除去される。これは、そのフアー
ジをキレート剤で処理し、そして所望の欠失を持
つDNAを有するフアージを放出するチオストレ
プトン耐性溶原菌をスクリーニングすることによ
つて選択される。BamH Ｉ部位のないベクター内へBamHＩ部位
を次のごとくして導入することができる。 プラスミドpBR322のDNAをRsaＩおよびSphＩ
で消化させる。この消化によつて生じた0.4kbpの
断片にNelsonおよびBrutlagによつて記載された
方法に従つて10乃至15のデオキシチジンヌクレオ
チド残分を端付加する［T.NelsonおよびD.
Brutlagの論文“Additcon of homopolymers
to 3′−ends of duplex DNA with terminal
transferase”；Methods in Enzymology.Vol.68
（1979年），S.P.ColdwickおよびN.O.Kaplan編、
第41〜50頁参照］。 【0060】 BamHＩ部位を持たず挿入チオスト
レプトン耐性遺伝子の左側のフアージとプラスミ
ドDNAの１部分が欠失されたベクターのDNA
を、PstＩで開裂する。このベクター内には、挿
入された遺伝子の右側にただ１つのPstＩ部位が
残る。開裂されたベクターDNAに10乃至15のデ
オキシグアノシンヌクレオチド基の尾端を付ける
（NelsonおよびBrutlagの論文（前掲参照）。尾端
をつけた断片と尾端をつけたベクターとを混合
し、そしてStreptomyces cattleyaのプロトプ
ラストをトランスフエクトとするために使用す
る。生じたフアージのDNAをpBR322からの断
片の挿入のために調べる。このベクターはクロー
ン断片に隣接するPstＩ部位とSphＩ部位を持つ、
Sau3AＩによる部分消化によつて生じた任意断
片のクローニング（Ｂ項参照）に有利である。
PstＩで開裂されたDNAにデオキシグアノシンで
尾端をつけると最終混合成分子内にPstＩ部位が
再生され、他方SphＩで開裂されたDNAにデオ
キシシチジンの尾端をつけるとSphＩ部位が再生
される。これらの余分な部位は、その後のクロー
ン断片の切取りのために有利である。 【0061】Ｂ チエナマイシン遺伝子の単離と同定Streptomyces cattleyaの染色体DNAをSan3A
Ｉで部分的に消化させる。この消化生成物をアガ
ロースゲル電気泳動によつて分割する。長さ３乃
至10kbp範囲の断片をそのゲルから抽出する
（David等、（前掲）参照）。これらの断片を
BamHＩですでに開裂されているベクターTG１
５の誘導体と混合する。この誘導体の構成は上記
した。このDNAを用いてＳ．cattleyaのプロト
プラストのランスフエクシヨンを行ない、そして
チオストレプトンの耐性のある溶原菌を本実施例
のＡ項に記載のように単離する。これらの溶原菌
中のベクターの多くはＳ．cattleya染色体DNA
の挿入体を担持する。これをスクリーニングにか
けて、次のようにしてチエナマイシン合成の途中
がブロツクされているＳ．cattle ya の突然変異体を補足できる挿入体の存在を調
べる。 【0062】 上記溶原菌の混合物からフアージスト
ツクを調製し、そして液体培養基中で各種チエナ
マイシン突然変異体を感染させるために使用す
る。フアージと共に数時間培養したのち、細胞を
チオストレプトンを付加したYC寒天皿の上に撒
く。宿主内に存在する突然変異を補完する能力の
ある遺伝子を担持する雑種ベクターの寄宿してい
る細胞のコロニーを検出する。この検出はチエナ
マイシンに感受性のある菌を接種した軟寒天上掛
けをその培養皿にかけることによつて行なわれる
［J.S.Kahn，F.M.Kahn，R.Goegelman，S.A.
Currie，M.Jackson，E.O.Stapley，T.W.
Miller，A.K.Miller，D.Hendlin，S.Mochales，
S.Hernandez，H.B.WoodruffおよびJ.Birnbanm
の論文、“Thienamycin，ａ new beta−
lactam antibiotic，I.Discovery，taxonomy，
isolation and physical properties”J.Antibiot．
32（1979年）第１〜12参照］。そのような雑種ベク
ターを持つ菌のコロニーは、チエナマイシン感受
性菌の大きい円形溶解域の中央にある。雑種ベク
ターの存在は、その溶原菌によつて産出されたフ
アージからのDNAを分析することによつて確認
される。チエナマイシン遺伝子の存在はその突然
変異体に雑種フアージを再感染させることによつ
て確認される。この新規雑種フアージを用いて得
られたすべての溶原菌はチエナマイシン合成能力
を獲得するはずである。 【0063】実施例 ３ Ｂ型肝炎表面抗原のS.cattleyaへのクローニングＳ ．cattleya内で発現される遺伝子に、Ｂ型肝炎
表面抗原遺伝子のＣ−末端部の大部分を挿入する
ことによつてＳ．cattleya内へＢ型肝炎表面抗原
をクローニングすることができる。もしその表面
抗原挿入が正しい配位と正しい暗号翻訳の読み枠
でなされたならば、Ｂ型肝炎表面抗原の抗原特性
を持つ配合タンパク質が産生されるであろう［J.
C.Edman等の論文、Nature 291（1981年）第503
〜506頁参照］。本実施例ではＢ型肝炎表面抗原
が、ネオマイシンに耐性を授与する遺伝子に挿入
される。Ｓ．cattleyaの中においてＢ型肝炎表面
抗原を発現させるという目的は種々の方法で達成
することができる。ここに記載する方法はTG１
ベクターおよびその誘導体がこの目的達成のため
にどのように使用できるかを例示するだけのもの
であり、なんら限定的なものではない。 【0064】Ａ ネオマイシン耐性遺伝子を担持する
TG１ベクターの誘導体の構成Streptomyces において抗生物質ネオマイシンに
耐性を授与する遺伝子はすでにクローンされてい
る（Thompson等、supra参照）。この遺伝子はネ
オマイシンホスホトランスフエラーゼのコードを
有する。この遺伝子を持つプラスミドDNAを単
離し、そしてSstで開裂させる。ナオマイシン
耐性遺伝子を持つている断片（長さ1.0kbp）をア
ガロースゲル電気泳動で精製する。この断片を
Sstですでに開裂されているベクターTG８の
DNAと混合する。ベクターTG８は、そのDNA
のpACYC177部内のSmaＩ部位とPatＩ部位との
間に位置する単一のSst部位を持つている。こ
のDNAを連結してＳ．cattleyaのプロトプラス
トのトランスフエクシヨンのために使用する。ネ
オマイシンに耐性のある溶原菌を10および
20μg／mlのネオマイシンを補給されたYC寒天皿
の上で単離する（実施例２，Ａ項に記載した方法
と同様にして行なう）。 【0065】Ｂ ネオマイシンホスホトランスフエラ
ーゼーＢ型肝炎表面抗原融解タンパク質を発現す
る誘導体の構成Sst 部位にネオマイシン断片が挿入されたフア
ージのDNAをBamHＩで開裂する。このベクタ
ーはネオマイシン耐性の暗号を持つ遺伝子の中央
付近に位置した単一のBamHＩ部位を持つてい
る。このベクターに約10乃至15のデオキシグアノ
シンヌクレオチド残分の尾端をつける（Nelson
およびBrutlag，spura参照）。クローンされたＢ
型肝炎ウイルスのDNAをHincで消化し、そし
てＢ型肝炎表面抗原の部分を含む744−塩基対断
片（その22アミノ末端アミノ酸は欠けている）を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離する
［J.C.Edman，R.H.Hallewell，P.Valenzuela，
H.M.GoodomanおよびW.J.Rutterの“Synthesis
of hepatitis Ｂ surface and core antigens in
Ｅ．coli”，Nature Vol 291（1981年），503〜
506頁参照］。この断片に約10乃至15のデオキシチ
ジンヌクレオチド残分の尾端をつける（Nelson
およびBrutlag，supra参照）。ついでこの断片を
尾端をつけたベクターと交配し、そしてその混合
物を用いてＳ．cattleyaのプロトプラストにトラ
ンスフエクシヨンを行なう。生じたプラークから
フアージを単離し、そそてそれらのDNAを制限
分析によつてＢ型肝炎表面抗原断片の挿入につい
て調べる。溶原菌を単離し、そして35S−システ
イン標識タンパク抽出物の免疫沈殿によつて
（Edman等、supra参照）、予期したネオマイシン
ホスホトランスフエラーゼーＢ型肝炎表面抗原融
合タンパク質（ネオマイシン遺伝子のアミノ末端
のデオキシグアノシン尾端から由来する短いグリ
シン残分によつて結合されている）の産生の有無
を調べる。挿入されたＢ型肝炎表面抗原断片は正
しい配位と正しい読み枠になければならないか
ら、雑種クローンの６つのうちのわずか１つぐら
いがその融合タンパク質を産生するにすぎないだ
ろう。
みを行うために、アクチノフアージTG１関連ベ
クター（vectors）に付加DNAを組み込む方法に
関する。 より詳細には、本発明はフアージTG１宿主菌種
ストレプトマイセス カトレヤ（Streptomyces
cattleya）NRRL8057、ストレプトマイセス
アベルミチリス（Streptomyces avermitillis）
MA4990、ストレプトマイセス ビリドクロモゲ
ネス（Ｓ．viridochromogenes）NRRL3414、ス
トレプトマイセス ガリフアルス（Ｓ．
garyphalus）NRRL2448などを含め細菌などの
生物体内へのクローニングベクターとして有用な
新規なバクテリオフアージTG１ゲノムおよびそ
の誘導体（欠失および挿入変異型）ゲノムへの外
来DNAの組み込み方法に関する。本発明によつ
て得られた細胞は新規であり、その細胞の複製及
び／又はDNAまたはフアージとしてのそのベク
ター誘発および複製を通じて、あるいはその外来
核酸の存在によつてその細胞に価値ある特性を付
与することを通じてこの外来核酸及び／又はその
産物の製造手段として有用性を持つものである。 【0002】 DNAのクローニングのためのバクテ
リオフアージの利用は、すでに確立された技法に
属する。しかしながら この技術のアクチノマイ
セス（Actinomyces）のフアージへの応用は最
近のことである。この点に関しては、下記の論文
および特許文献が参照される。 １ “Development of ａ DNA Cloning
System in Streptomyces Using Phage
Vectors”，J.E.SuarezとK.F.Chater；６
Cienc．Biol．第99〜110頁（1981年）。 ２ “Restriction Mapping of the DNA of
the Streptomyces Temperate PhageφC31
and Its Derivatives”，K.F. Chater，C.J.
BrutonおよびJ.E.Suarez；14 Gene，第183〜
194頁（1981年）。 ３ “DNA Cloning in Streptomyces：
Resistance Genes from Antibiotic−Producing
Species”、C.J.Thompson，J.M.WardおよびD.
A.Hopwood；286 Nature，第525〜527頁
（1980年）。 ４ “Dispensable Sequences and Packaging
Constraints of DNA from the Streptomyces
Temperate Phage φC31”，K.F.Chater，C.J.
Bruton，W.SpringerおよびJ.E.Suavez；15
Gene，第249〜256頁（1981年）。 ５ “Ａ DNA Cloning System for
Interspecies Gene Transfer in Antibiotic
Producing Streptomyces”，M.Bibb，J.L.
SchottelおよびS.N.Cohen；284 Nature，第
526〜531頁（1980年）。 ６ “DNA Cloning in streptomyces；Ａ
Bifunctional Replicon Comprising PBR 322
Inserted into Ａ Streptomyces Phage”，J.E.
SuarezとK.F.Chater；286 Nature，第527〜
529頁（1980年）。 ７ “Cloning and Expression in
Streptomyces lividans of Antibiotic
Resistance Genes Derived from Escherichia
coli．”，J.L.Schottel，Ｍ，．BibbおよびS.N.
Cohen；146 Journal of Bacteriology，第360
〜368頁（1981年）。 ８ “ActinoPhage DNA”，K.F.Chater；21
Developments in Industrial Microbiology，第
６章、第65〜74頁（1980年）。 ９ 英国特許願G.B.第2023612A号；No.7919158；
1980年１月３日発行。 10 英国特許願G.B.第2031434A号；No.7928156；
1980年４月23日発行。 11 英国特許願G.B.第2018778A号；No.7913033；
1979年10月24日発行。 12 欧州特許願第0036259A2号；No.81300858.8；
1981年９月23日発行。 13 英国特許願G.B.第2046272A号；No.8011000；
1980年11月12日発行。 14 英国特許願G.B.第2069503A号；No.8104473；
1981年８月26日発行。 15 欧州特許願第0020147A1号；No.8039178.4；
1980年12月16日発行。 16 欧州特許願第0020251A2号；No.80400722.7；
1980年12月10日発行。 【0003】 土壌から単離された本発明のバクテリ
オフアージTG１は広範な特性研究に基づき、従
来未だ記載されていないアクチノフアージである
ことが同定された。このフアージはテンペレート
（temperate）である、すなわちStreptomyces
cattleya MA4297（NRRL8057）の溶原化
（lysogenic）フアージである。このフアージは、
ブラツドレー［ David E.Bradley（1967）
“Ultrastructure of Bacteriophages and
Bactriocins”，Bacteriol．，Rev．31、第230〜
314頁］によるＢ型形態を有する。このフアージ
の頭部は正二十面体形であり平均頭部直径は約
57nmである；そうして第１図の電子顕微鏡に見
られるように基板を含めたフアージ尾部は長さ約
128nmである。このフアージの核酸は二本鎖
DNA分子であつて、付着末端を有し、長さは
41.47キロ塩基対である。第２図は、このフアー
ジDNAの制限エンドヌクレアーゼ分裂部位の位
置を示す地図である。これらの位置は、シングル
Pst部位に最も近いこのフアージDNAの末端か
らのキロ塩基対の部位距離として与えられてい
る。地図は、酵素Hind，Kpn，PstＩ，Sma
，Sph，Xbaのすべての部位を示してお
り、これらはアガロースゲル電気泳動と、0.2キ
ロ塩基対およびそれ以上の断片の臭化エチジウム
染色とによつて決定することができた。下記酵素
は、このDNAを分裂し得なかつた：Bam，
Nae，Nar，Pvu，Sst，Sst，Stu
およびXho。或る種の欠失変異体および雑種フ
アージ誘導体については、以下に同様に記載す
る。フアージTG１は以下にさらに詳細に記載す
る。なお、以下の記載においては、該フアージの
単離、保存、繁殖に関する明瞭な特定化情報なら
びに特にサイズとその制限マツピングとによつて
定義されたその核酸のデータが記載される。な
お、後記のごとく、TG１プロフアージを含む微
生物、代表的TG１プロフアージ誘導体および
TG１プラスミド誘導体は、特許手続上の微生物
の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下
に公認されたカルチヤーコレクシヨンに寄託され
ている（表参照）。 【0004】 本明細書に記載のごとく、フアージ
TG１、そのゲノム、誘導体およびTG１ゲノム
またはそのいくつかの部分を含むキメラDNA分
子は、特に組換えDNA技術におけるクローニン
グビヒクル（cloning vehicles）として有用性を
持つ。 フアージTG１は、DNAクローニングベクター
としてそれを格別に有用なものとするある特別な
性質を有している。そのDNAおよびその誘導体
は、単離が容易であり且つプロトプラストに細胞
感染（トランスフエクシヨン）させ次に得られた
フアージを溶菌増殖させることによつて容易に増
加させることができる（実施例１，Ｊ項参照）。
これらの機能ならびに宿主菌を溶原化する能力を
保持し且つ相当量（数キロ塩基対）の外来DNA
を挿入するに十分なスペースを与える欠失突然変
異体が容易に得られる。さらに、本フアージ
DNAは、制限エンドヌクレアーゼPstのための
ただ１つの開裂部位を有している。その部位は、
そのフアージゲノムの必要不可欠ではない領域内
に位置している。この部位における外来DNAの
挿入は、該フアージの溶菌的および溶原的機能を
損なうことがない（実施例１，項およびＭ項参
照）。このようなDNA挿入に格別に好適な部位を
持つことは、クローニングベクターの１つの重要
な特性である。なぜならば、所望立体配置の混成
分子が得られる可能性が、ただ２個の新しい
DNA結合の形成が必要となるだけで大幅に増大
されるからである。 【0005】 ある１つのベクターへのクローニング
のために使用しうる制限酵素について広い選択の
余地が或ることは、組換えDNAの実験において
きわめて有利である。多数の制限エンドヌクレア
ーゼは、このフアージDNAを開裂させ得ない
（実施例１，Ｈ項参照）。その特別なPst部位は、
アダプター分子の使用によつてこれら酵素のいず
れか１つのための独特な部位に変換させられうる
［R.G.Rothstein，L.F.Lau，C.P.Bahl，S.A.
NaraangおよびR.WuのMethods in
Enzymology68巻（1979年），S.P.Colowickおよ
びN.O.Kaplan編、第98〜109頁所載の論文参
照］。このPstクローニング部位を別の独自な部
位に変換するための別の技術は、所望部位を含む
短い断片を挿入することである。実施例２のＡ項
には、両側にPst部位を有する単一BamH
部位を持つ短断片をPst部位に挿入するための
方法が示されている。 【0006】 TGベクターとその誘導体が宿主
DNA内へ挿入されうることは、いま１つの重要
な特性である。この特性が、遺伝子および遺伝子
の新規な組合せを伝達する雑種ベクターを宿主内
へ安定的に組込むことを可能にし、これによつて
その宿主に対して新規な化合物の生産（たとえ
ば、Ｂ型肝炎表面抗原、実施例２参照）、あるい
は例えば増加された遺伝子量による通常細胞産物
の生産増加が可能となる。組込みはまた、宿主突
然変異体の遺伝的相補性によるクローン遺伝子の
検定のためにも役立つ。その遺伝子を含む溶原菌
が一旦同定されてしまえば、その溶原菌から得ら
れたフアージを増殖し、次いでそのフアージ
DNAを単離することによつて簡単に大量にその
遺伝子を回収することがベクターにより可能とな
る。すなわち、このベクターはプラスミド
pACYC177のDNAの大量生産に役立つ（実施例
１、Ｍ項参照）。 【0007】 このフアージの宿主域は、特別に興味
あるものである。Streptomyces cattleya
MA4297（NRRL8057）は化合物チエナマイシン
を産生する（米国特許第3950357号参照）。チエナ
マイシンは、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の
両者に対して強力な抗菌作用を持つている。これ
はさらに、ベーターラクタマーゼの存在の故に、
ペニシリンやセフアロスポリンのごときベーター
ラクタム抗生物質に対して耐性のある細菌に対し
ても有効である。別のフアージ宿主である
Streptomyces avermitilisは、アベルメクチン
と呼ばれている化学的に類縁の剤の錯体を産生
し、これはきわめて強力な駆虫作用を示す（R.
W.Burg等の論文：Antimicrobial Agents and
Chemotherapy，15、第361〜367頁（1979年）。
本フアージは、これら重要な化合物の合成および
合成制御に関連して、当該遺伝子中の突然変異体
の遺伝的相補性により遺伝子および遺伝子産物の
同定、単離および研究のために使用することがで
きる（たとえばチエナマイシンのために、実施例
３参照）。 【0008】 フアージTG１のある種の混成誘導体
は、別の面において役立つ。実施例１のＭ項にそ
の構造および特性が記載されているこれら雑種
は、TG１ベクターの誘導体がEscherichia coli
内でプラスミドとして複製されることを可能にす
る。これら雑種フアージープラスミドベクター
は、トランスフエクシヨンによつてあるいはトラ
ンスフオーメーシヨンによつて、異なる種の間を
転移させることができる。この特性は非常に価値
あるものである。なぜならばこれによつて
Escherichia coliのためにこれまで開発されて
きた遺伝子技術の使用が可能となるからである。
たとえば、Ｓ．cattleyaからの遺伝子をＥ．coli
へ組み入れて相補的な突然変異を生じさせること
が可能となろう。Ｅ．coli中のそのＳ．cattleya
遺伝子内への突然変異の導入が、たとえば、トラ
ンスポゾン突然変異誘発によつてできよう。ある
いはまた、ナンセンスサプレツサー（翻訳停止コ
ードン）によつて抑圧される突然変異体を単離す
ることが可能となろう。後者の突然変異された遺
伝子は、Ｓ．cattleya内へ戻すことができ、そし
てＳ．cattleya内の翻訳停止コードンを抑圧する
ことが可能な突然変異体を単離するために使用す
ることができる。このようなサプレツサー突然変
異は、かかる生物の遺伝研究に役立つ。Ｅ．coli
内でそのベクターが複製できるということは、別
の面でも有益である。この特性は、挿入プラスミ
ドDNAの領域外でのベクターDNAの欠失部の選
択のために使用された（実施例１，Ｎ参照）。か
かる欠失は、ベクター内のかなりの量のDNAの
クローニングのために重要である。 TG１とその誘導体は、特定フアージベクターの
DNA中への挿入のために適当な各種の制限酵素
を用いて切除されたDNA配列をクローン化する
ために別の仕方で利用することができる。組換え
DNA技術の有益な解説書の１つはMethods in
Enzymology，Vol.68（1979年）、Academic
Press社（ニユーヨーク）発行である。 【0009】 クローニング実施法の改良、変更は、
別のフアージ変種の使用および別の制限酵素の使
用以外にさらに以下のものを含む。 制限されたベクターDNAをホスフアターゼで処
理して末端リン酸基を除去し、しかしてそのベク
ターDNAの自己連結（self ligation）を防止す
ること； １つの制限酵素による開裂によつて生じた一本鎖
端部をＳヌクレアーゼを用いて除去、或いはか
かる一本鎖端部の相補部のDNAポリメラーゼに
よる合成の後に平滑末端連結を行う；および／ま
たは ベクターと挿入されるべきDNAとの間に付着端
を与えるDNA尾端反応（tailing reaction）を行
なうことである。（NelsonおよびBrutlag，
Methods in Enzymology，Vol.68（1979年）第
41〜50頁参照）。 【0010】 トランスフエクシヨン頻度は、記載さ
れている条件または成分を変えることによつて、
あるいは連結されたDNAをリポゾームカプセル
封入し、続いてかかるリポゾームを受容菌のプロ
トプラストへ融合することによつて向上させるこ
とができる。このような技法は、最近J.F.
MakinsとG.Holtによつて染色体DNAのリポゾ
ームトランスフオーメーシヨンの場合について記
載されている［Nature293（1981年）、第671〜673
頁］。そこに記載された方法またはその変法が使
用できる。 【0011】 所望の挿入DNAを含む雑種フアージ
のためのフアージクローンまたは溶原菌のスクリ
ーニングは、挿入体の形質的または遺伝的性状に
応じていくつかの方法で実施することができる。
たとえば、特にアミノ酸、ビタミン、プリンまた
はピリミジンのごとき一次代謝物質の合成の途中
がブロツクされた突然変異体を相補できる遺伝子
を、次の方法で検出することができる。 【0012】 特定突然変異種をプロトプラスト化
し、そして連結されたDNAでトランスフエクト
し、そしてなんら選択をせずに放置して再生させ
る。この結果生じるコロニーは、非トランスフエ
クト細胞、非雑種フアージによるトランスフエク
トから生じた溶原菌ならびに雑種フアージによる
感染から生じた溶原菌を含んでいる。所望の挿入
体を含んでいる溶原菌は、１つの特定栄養素が欠
乏している最小培地上でその再生培養を培養する
ことによつて単離される。コロニーは適当な
DNA挿入体を含む再生溶原菌からのみ生じる。 所望の挿入体を同じく簡単に検出できる第２の方
法は、野生型プロトプラストを連結DNAでトラ
ンスフエクトし、これを野生型菌（germlings）
と混合し、そしてこの混合物を適当なプレート上
で平板培養して溶菌斑（プラーク）を形成させる
方法である。増殖後の培地は親のフアージの再連
結（religation）に起因するプラークと、挿入体
を持つフアージに起因するプラークとを含む（実
質的にはプラスミドpACYC１７７をTG１誘導
体に挿入したものを単離するために使用される方
法と同じである；実施例１，Ｍ項参照）このフア
ージを採集して実施例Ｂ項に記載したような無菌
フアージストツクが得られる。これらの溶菌液は
適当な突然変異株に形質導入するために使用され
る。所望の挿入体を含むフアージのみが特定突然
変異の形質導入の能力を持ち、そしてコロニーを
形成させる。通常容易に検出可能な増殖表現型を
持たない抗生物質のごとき二次代謝生成物の生産
中にブロツクされる突然変異体の場合には、所望
の挿入体を含むフアージは、上記に記載した方法
のいずれかによつて得られた溶原菌を適当な培地
で培養することによつて検出される。ある時間だ
けコロニーを生育させたのち、その抗生物質に敏
感な生物の培養物を倍地に流し込み、そして更に
培養する。機能性抗生物質合成遺伝子を持つ挿入
体を含む溶原菌は、その抗生物質を産生し、そし
てコロニーのまわりに増殖阻止域を形成させる
（実施例２参照）。 【0013】 リポゾームRNAや移転RNAのよう
な、なんら検出可能な表現型を授けないDNAの
挿入体を含むフアージは、プローブとして相補
DNAを用いてプラークまたはコロニー交雑によ
つて検出することができる。 【0014】 所望コロニー単離の効率は、溶原菌の
直接選択の方法が開発されたならば、相当程度ま
で増大させることができる。このような選択は、
抗生物質に対する耐性または生合成ステツプをコ
ードする挿入DNAを含むDNAをベクターフアー
ジとして用いて行うことができる（実施例２及び
３を参照）。いずれの選択でも、未感染プロトプ
ラストから生じるコロニーの分析が不必要になろ
う。 【0015】 抗生物質合成のための遺伝子を含むフ
アージクローンは、いくつかの他の実験にも使用
することができる。このフアージは、野生型ある
いは他の抗生物質産生培養物に形質導入し生産レ
ベルでの、特定クローン遺伝子の増加量の効果を
調べるために使用できる。部位特異的突然変異誘
発の技術は、特定クローン遺伝子内の突然変異体
の単離のために使用することができ、これによつ
て、離れているが多分有害な損傷（lesions）が
ある株に導入されることが排除される。このよう
な局所突然変異誘発は、抗生物質の生産を増加ま
たは減少させる突然変異体の単離を可能にし、そ
して生産菌の改良および抗生物質の合成および制
御の遺伝的解析の助けになるであろう。組換え
DNAの技術はまた、特定の抗生物質合成遺伝子
の発現を大幅に増強するために、適当な部位に高
レベルプロモータ配列を導入することを可能なら
しめるであろう。遺伝子産物量の増加は、その菌
株の生産性を顕著に高めるであろう。クローン遺
伝子産物は、宿主細胞を紫外線照射し次いで特定
雑種フアージを感染させることによつて同定され
うる。放射線標識をつけたアミノ酸の存在下で増
殖させると、そのフアージによつてコードされた
タンパク質が放射線標識されて合成されるであろ
う。宿主細胞によつてコードされたタンパク質
は、紫外線処理によつて生じた損傷のために合成
されないであろう。これらタンパク質は、標準技
術によつて分離されそして分析されうる。 【0016】 外来DNA、すなわち宿主菌以外の源
からのDNAも本フアージベクター内へ挿入でき
る。pACYC177の該フアージへの挿入は、その
１例である。このような場合、宿主制御系の存在
は、トランスフエクシヨンの頻度を大幅に低下さ
せ、したがつて所望クローンの検出を困難にす
る。この問題を排除するために、宿主制限に欠陥
のある菌突然変異体を単離することができる。こ
のような菌株およびその誘導体は、次にクローニ
ング実験のための宿主として役立てることができ
る。有用であることが証明されうる外来DNAの
例は、抗生物質産生遺伝子、情報サツプレツサー
（転移RNA）の暗号を持つ遺伝子、あるいはトラ
ンスポゾンまたは突然変異遺伝子のごとき突然変
異誘発性要素である。 【0017】 クローン化抗生物質遺伝子は、標準的
組換えDNAの技術を用いて物理的に単離可能で
あり、そして他のクローニングベクターへ転移さ
れることができる。これらは、宿主生体内で複製
を行なうプラスミドまたは他の菌株内で複製を行
なうプラスミドを含む。クローン化抗生物質遺伝
子は、TG１またはその誘導体を介して、通常は
その抗生物質を産生しない他のStreptomyces菌
株へ転移されうる。この転移により、新規な抗生
物質の合成、あるいはそのクローン遺伝子の発現
の変化がもたらされるであろう。 【0018】 本ベクターは、DNAクローニングを
達成するためいくつかの別の仕方で使用すること
ができる。通常は無関係の菌株のプラスミドたと
えばE.coliのプラスミドは、それがあるフアージ
宿主菌株に導入された場合、それが外来起源であ
るが故に複製しないかあるいは保存されない。し
かしながら、もしそのプラスミドが該宿主染色体
に存在するものと相同なDNA配列の挿入によつ
て予め変えられていたならば、その相同座位にお
いて該染色体に該プラスミドが組み込まれた組換
えが可能となる。もしその宿主菌株がフアージ溶
原菌である場合には、プラスミド上のその相同シ
ーケンスは、１つのフアージ断片によつて提供さ
れうる。この場合、染色体に組み込まれるプロフ
アージに、そのプラスミドが挿入される。このよ
うな挿入されたプラスミドは、そのプロフアージ
が組み込まれた状態のままでいる限り宿主染色体
の一部として保存されるであろう。あるいは、フ
アージの通常の組み込みのために必要な機能を持
つているある特定フアージ断片、すなわち、付着
部位とフアージ組み込みに必要な遺伝子産物を指
示するコードを持つフアージ遺伝子とを持つ断片
をプラスミドに挿入してもよい。このようなベク
ターは、野生型フアージの組み込みと同様な態様
且つ同じ座位において宿主遺伝子へ挿入可能でな
ければならない。挿入されたベクターを持つ組換
え菌は、もしある選択可能な遺伝子型も同時にそ
のベクターによつて運ばれていたならば、容易に
同定することができる。このタイプのベクター
は、下記のごときいくつかの利点を持つ： (1) そのような分子内にクローン化されうる
DNAの量が、フアージパツケージングの束縛に
よつて制限されることがない。 (2) プラスミドがそのオリジナル宿主内で複製可
能である。たとえばStreptomyces宿主内よりも
はるかに容易に種々の遺伝的または物理的操作を
行なうことのできるＥ．coliオリジナル宿主内で
複製可能である； (3) たとえば、ラムダcos部位のようなエレメン
トも導入可能である。これによつてコスミド
DNAクローニングの技術（Methods in
Enzymology，Vol.68参照）を用いてプラスミド
宿主たとえばＥ．coli内で大きなDNA断片をク
ローニングし、次いで生じた雑種DNAを単離し
そしてStreptomyces菌株のプロトプラストをト
ランスフオーメーシヨンまたはトランスフエクシ
ヨンすることが可能となる。 【0019】 その他のフアージシーケンスもまたク
ローニングの目的のために使用することができ
る。一例を挙げれば、フアージTG１のcos部位
である。この部位は、DNAをフアージキヤプシ
ドの中にパツケージングする間ある１つのフアー
ジ産物によつて認識される。効果的なパツケージ
ングのために、順次連続するcos座位間のDNAの
長さが一定以上である必要がある。このcos部位
が１つのプラスミド内に挿入され且つ他のDNA
も挿入されれば、そのDNAを処理しそしてフア
ージ粒子を形成するために試験管内パツケージン
グシステムが使用できるcos座位間のDNAの正し
い長さを作り出すような挿入物のみをパツケージ
することができ、これによつて大きい挿入物が選
択される。 【0020】 染色体遺伝子を異なる制御下におくた
めにフアージプロモータシーケンスも利用するこ
とができる。フアージプロモータのいくつかは、
フアージレギユレータ機構によつて制御される。
すなわち、正しく挿入されたクローン遺伝子の発
現もまたかかる制御機構によつて制御されること
となる。例えば、温度感受性リプレツサーは、低
温においては、オペレータ座位に結合することに
よつてある特定のプロモータの発現を大幅に低減
させるであろう。他方、高温においては、そのリ
プレツサーは不活性となりそして高レベルの転写
が起こるであろう。もしある所望のクローン遺伝
子が適当な位置に挿入されたならば、その発現と
その遺伝子の生産レベルは、温度調節によつて発
酵の間制御可能である。 【0021】 ■■■ 亀の甲 ［0051］ ■■■ 【0022】注ａ 菌株の呼称はメルク社（Merk and Co.Inc.，
Rahway，New Jersey）の培養コレクシヨンの
呼称である。MA5766〜MA5770は指示したフア
ージベクターに対して溶原菌である
Streptomyces cattleyaMA4297（NRRL8057）
の誘導体である。MB4540〜MB4550は指示した
雑種フアージープラスミドベクターを含む
Escherichia coli Ｋ−12RR1の誘導体である。
Ｅ．coli Ｋ−12RR1はF.Bolivar，R.L.
Rodriquez，M.C.BetlachおよびH.W.Boyerによ
つて、Gene2、第75〜93頁（1977年）に記載され
ている。 注ｂ 各菌株の培養物はATCC（the American Type
Culture Collection）、米国メリーランド州、ロ
ツクビル、パークローンドライブ12301所在、に
永久寄託され、そして1982年４月２日現在すべて
完全である。また1982年現在the Agricultural
Research Culture Collection（NRRL），
Ferementation Laboratory，Northern
Regional Research Center，Science and
Education Administration，U.S.Department
of Agriculture、米国イリノイ州、ペオリア、ノ
ースユニバーシテイストリート1815所在、に寄託
されており、そして表に示した受託番号が与えら
れた。 【0023】図面についての説明 第１図 これはフアージTG１の電子顕微鏡写真である。
サンプルは、２％のリンタングステン酸水溶液
（1.0モルKOHでPH6.3に調整）で染色された。試
料は、フイリツプス300透過型電子顕微鏡
（Philips 300 Transmission Electron
Microscope）を用いて210570倍の倍率で観察さ
れた。 【0024】第２図 これはフアージTG１の制限地図である。位置は
任意的に左端として示してある単一のPst座位
に最も近いフアージDNAの端からのキロ塩基対
単位での座位距離として与えられている。この地
図は、Hind，Kpn，Pst，Sma，Sph
，Xbaの酵素のためのすべての部位を示す。
これらの位置はアガロースゲル電気泳動と、0.2
キロ塩基対およびそれより大きな断片の臭化エチ
ジウム染色とによつて決定することができた。 【0025】第３図 これはフアージTG１の欠失突然変異体を示す。
欠失は当該DNAを酵素Hind，Kpn，Pst，
Sph，Xbaで消化させることによつて解析さ
れた。TG１のための制限部位の位置は、第２図
と同様に、フアージDNAの左端からのキロ塩基
対で示されている。各誘導体についての欠失
DNAの位置が未確認であることはTG１の地図
の下に横向きカツコで指示さている。なお、フア
ージ地図の左端のみが示されていることに注意さ
れたい。この領域外には欠失は起こらなかつた。
欠失の最も左の可能位置は、上向きカギカツコで
示唆されており、最も右の可能位置は、下向きカ
ギカツコで示唆されている。キロ塩基対（Kbp）
単位で各欠失長さは、関連するカツコの右側の丸
カツコ内に記載してある。フアージ突然変異体は
左側に同定されている。ただし、一方のカギカツ
コの端位置の部位がその突然変異体い存在しない
場合には、それは他方のカギカツコの中に閉じら
れていることに注意されたい。その他の場合はそ
の所位は存在する。 【0026】第４図 これは雑種フアージTG６とTG７および欠失突
然変異体を示す。TG６とTG７の制限地図の左
端のみが示されていることに注意されたい。
10.28Kbpの位置にあるPstの右側のすべての制
限座位は第２図に示したTG１のそれと同じであ
る。ただし、これらの制限座位の位置は、Pst
座位のすぐ左の2.0KbpのDNAの欠失（第３図の
TG２参照）とこの部位への3.9Kbpの
pACYC177DNAの挿入を考慮すれば、1.9Kbpp
分だけ増えているはずである。pACYC177から
のDNAを含む領域は6.38Kbpと10.28Kbpとにそ
れぞれ位置するPstの２つの座位の間に濃い線
で示してある。各種誘導体の欠失部は、第３図の
場合と同様に各関連する親の下に指示されてい
る。 【0027】 しかして、本発明の目的の１つは、新
規なバクテリオフアージTG１それ自体およびそ
の誘導体（複数）を提供すること；かかるフアー
ジおよびその誘導体のゲノム（核酸）成分（欠失
突然変異体を含む）、フアージTG１ゲノムまた
はその部分を含む混成（キメラ）核酸分子および
生体へのDNAクローニングベクターとして有用
なその他のDNAシーケンスを提供することであ
る。上記生体は、たとえばＳ．cattleyaNRRL
8057のごとき菌である。上記フアージゲノムの部
分は、さらに組換えDNAクローニング技法にお
ける補助体として役立つ。たとえば下記の機能を
持つ： １ 組込まれた状態でも、自律的エレメントとし
ても、宿主内でのクローン化DNAの保存を可能
ならしめる。 ２ 内因性のまたは外来の遺伝子の発現を強化す
るプロモータとして働く。この場合、それが連結
されている遺伝子に対するプロモータとして働
く。また他の場合でもプロモータとして役立つ。 ３ 内因性および外来の遺伝子の発現を制御する
ための制御エレメントとして働く。 【0028】 クローニングベクターとして、TG１
およびその欠失突然変異体は、有用な機能をコー
ドするDNAシーケンス（遺伝子）たとえば抗生
物質チエナマイシン生産のために必要な遺伝子あ
るいはＢ型肝炎抗原の生産に必要な遺伝子の担体
として役立つ。またそれ自体が有用なDNAシー
ケンスたとえば本来有用性のある別個のプラスミ
ドベクターの担体として働く。かかる変異された
クローニングベクター（TG１ゲノムまたはその
部分および外来DNAシーケンスを含む混成DNA
分子）は感染、トランスフエクシヨンまたはトラ
ンスフオーメーシヨンによつて受容生体内へ導入
され、そこで該混成DNAは組込モード、溶菌
（増殖相）モードおよび／またはプラスミドモー
ドで機能する。 【0029】 本発明のいま１つの目的はしたがつ
て、TG１プロフアージおよびその欠失および雑
種（キメラ）誘導体を含む微生物、および雑種
（キメラ）フアージプラスミドおよびその誘導体
を含む微生物を提供することである。［なお、本
明細書で使用されている“TG１ベクター”とい
う言葉は、一般的意味において、TG１であるバ
クテリオフアージおよびすべてのその誘導体、
TG１およびその誘導体のゲノム（全部および部
分を含む）、およびTG１およびその誘導体のゲ
ノム（全部および部分を含む）を含有するクロー
ニングベクターを包括するものである］。 以下、本発明をいくつかの代表的実施例について
更に詳細に説明する。なお、“実施例”という言
葉は明細書の記載形式の点から便宜上使用するも
のであり、これらの実施例は上記した本発明に対
してなんら限定を加えるものではない。 【0030】実施例 １ TG１ベクターの単離、構成、保存および増殖 このフアージとDNAは、クローニングベクタ
ーとして従来使用されていた他のバクテリオフア
ージおよびプラスミドに関する作業によつて確立
された技法とは多少異なる方法で単離され、処理
された。技法の良い手引書の１つは、R.W.
Davis，D.BotsteinおよびJ.R.Rothによつて書か
れた“Ａ Manual for Genetic Engineering：
Advanced Bacterial Genetics”、ニユーヨーク、
コールドスプリングハーバー所在、Gold Spring
Harbor Laboratory刊行（1980年）である。本
願に係わる作業に使用した特定の方法が、上記マ
ニユアルに記載した方法と同一でない点について
は以下に記載がなされる。TG１ベクターとその
誘導体とを特定化するために役立つデータおよび
それらを他のクローニングベクターから役立つデ
ータは適当な箇所で記載がなされる。 【0031】Ａ フアージTG１の単離 約300種のさまざまな土壌試料を収集してＳ．
cattleya上で生育しうるフアージが存在しないか
を調べた。土壌試料1gを、105個／mlの濃度で菌
を含むYC肉汁５mlと混合し、そして30℃で振盪
しながら16時間培養することによつてフアージの
存否を検査した。この検査に使用した菌は、YC
肉汁中、107コロニー形成単位（cfu−colony−
forming unit）／mlの濃度のStoreptomyces
cattleyaMA4297の芽胞を振盪しながら37℃で３
時間培養することによつて準備された。YC肉汁
は１リツトルにつきデイフコ（Difco）イースト
抽出物4.0g、デイフコ麦芽抽出物10gよびＤ−グ
ルコース4.0gを含有する。オートクレーブしたの
ち1.0モルMgCl2および2.5モルCaCl2各10mmを添
加する。土と共にインキユベートしたこのブロス
を濾過し、106個の菌を含有している軟寒天を上
掛けしたプレートの上に濾過したブロスの１滴を
たらした。この培養プレートを30℃で16時間培養
した。使用した上掛けは菌0.1mlをYC軟寒天4.0
mlと混合し、そしてこの混合物を約40mlのYC寒
天を含有する１枚のペトリ皿に注入することによ
つて作成した。YC軟寒天は46℃の溶融デイフコ
寒天0.6％（ｗ／ｖ）を含むYC肉汁である。YC
寒天は2.0％（ｗ／ｖ）デイフコ寒天で固めたYC
肉汁である。 【0032】 菌細胞溶解域からの軟寒天を取り出
し、そして推定上のフアージを抽出してYCで希
釈した。各希釈物の0.1mlを試料として取つて菌
0.1mlと混ぜた。室温に10乃至20分間放置したの
ち、4.0mlのYC軟寒天を添加した。その軟寒天培
地が固化したのち、各培養皿を30度で16時間培養
した。わずか数個のフアージが加えられていた培
養皿に単一フアージの成長と繁殖から形成され
た、プラーク（溶菌斑）と呼ばれている菌細胞溶
解の小さな領域が観察された。各培養皿に観察さ
れるプラークの数はその懸濁物中のフアージの濃
度に正比例する。約30の異なるフアージ単離物
が、このようにして獲られた。フアージTG１は
他と異なりさらに２日の培養後に合一して広がつ
た溶菌域が濁つてきた。この観察がそのフアージ
が溶原性であることを示唆した。その可能性につ
いて更に詳細な吟味を行つた。（後記のＣ項およ
びＥ項参照）。 【0033】Ｂ フアージTG１の成長 フアージTG１は28℃から32℃までの間の温度に
おいて最も良く成長する。プラークの形成のため
にはCa++が要求される。プラークは通常その直
径が１乃至３mmである。安定性を得るためには二
価陽イオン（M++で十分）が要求される。このこ
とはピロリン酸塩、エチレンジアミンテトラ酢酸
塩のごときキレート剤の存在でフアージが不活性
化されることによつて明かである（後記のＩ項お
よびＮ項参照）。 単一ファージの子孫を繁殖させるためには、１つ
のプラークの中心から軟寒天培地を取り出して１
ml当り２×107cfuの菌を含有するYC肉汁10mlと
混合し、そして40乃至50r.p.m.の速度で回転して
いる組織培養ローラドラム（New Brunswick
Scientific，Model TC−７）中、25×150mm培養
管内で30℃の温度において16時間培養する。生じ
る溶菌物を0.45ミクロンの細孔サイズのフイルタ
ーに通す。この濾液が管１本のフアージストツク
となり、通常は1010pfu／mlの内容物を含む。 全面溶菌を起こすのに十分な量のフアージ（約
1014pfu=プラーク形成単位）で感染された平板培
養からその寒天上掛けを取り上げて5.0mlのYC肉
汁に再懸濁する。この混合物を約10秒間激しく混
合攪拌する。寒天を遠心分離によつて除き、そし
て上澄みを濾過する。この濾液が一皿のフアージ
ストツクとなり、通常109pfu／mlの内容物を含
む。これらのフアージストツクを４℃で貯蔵す
る。 【0034】Ｃ 溶原菌の単離と確認 プラークを有する培養皿をさらに１日または２日
培養すると、溶菌域内においてわずかながら菌増
殖が観察される。それらの菌を取り出して芽胞化
する。それらの芽胞を汚染フアージを除くため洗
滌し、希釈しそして単離コロニーとして成長させ
る。このような純粋培養から得られる芽胞または
成長能力のある細胞は溶原性であり、これがさら
に成長すると、それら細胞のいくつかはフアージ
を放出する。この培養液は新しい遊離のフアージ
を蓄積し、蓄積されたフアージは、濾過によつて
その菌から分離することができる。細胞自体は遊
離フアージが感染して溶菌することはない。Streptomyces oattleyaフアージ溶原菌の凍結
乾燥された芽胞の１本の管ストツクから次のよう
にしてフアージが調製できる。 凍結乾燥された芽胞の管を無菌的に開封し、その
内容物を25×150mmの培養管に入れられている10
mlの殺菌YC肉汁中に懸濁する。そして40乃至
50r.p.m.の回転速度で回転している組織培養ロー
ラドラム内で30℃の温度において６時間培養す
る。その培養液を細孔サイズ0.45ミクロンのフイ
ルターに通す。得られた懸濁物中のフアージは保
存可能であり、上記と同様にして増殖させること
ができる。 【0035】Ｄ Streptomyces oattleyaからの染色
体DNAの単離 約107芽胞を用いて接種を行なう。接種は二価陽
イオンが添加されていない。ただしグリシン0.1
％（ｗ／ｖ）を加えた25mlのYC肉汁を含有して
いる250mlのバツフルつきエルレンマイヤーフラ
スコに対して行なう。このフラスコを220r.p.m.
シエーカー［工程約５cm（２インチ）］にのせて
37℃で16時間振盪する。この時間で培養には十分
である。遠心分利によつて細胞を集め、0.09％
（ｗ／ｖ）のNaClの25mlで１回洗い、そして25％
（ｗ／ｖ）スクロースと50ミリモルのトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタンを含有している溶
液５mlに再懸濁する。その溶液は予め塩酸でPH
8.0に調整されていて、そしてニワトリ卵白リソ
チームの最終濃度が２mg／mlとなるよう使用直前
に添加されている。この混合物を37℃で１時間培
養し、次いでNaOHでPH８に調整されたエチレ
ンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム0.25モルを含
有する溶液2.5mlに加える。この混合物を氷上に
15分間放置し、そして2.0％（ｗ／ｖ）のＮ−ラ
ウロイル−Ｎ−メチルグリシンを含有する溶液
7.5mlを加える。さらに30分間氷上に放置したの
ち、牛のパンクレアチンリボヌクレアーゼＡを添
加する（0.1モル酢酸ナトリウム中5mg／mlの溶
液として0.15ml。この溶液は予め100℃で10分間
加熱されていた）。次に新規に調整されたプロナ
ーゼ（Pronase（登録商標）溶液0.6mlを添加する。
この溶液は、緩衝液Ｐに25mg／mlの量で溶解され
たプロナーゼを含有し、使用直前に37℃で45分間
温められた。なお緩衝液Ｐは50ミリモルのNaCl、
50ミリモルのエチレンジアミンテトラ酢酸二ナト
リウムおよび30ミリモルのトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタンを含有しており、溶液は塩酸
でPH7.5に調整されていた。上記の添加による混
合物を37℃で２時間培養する。この溶菌液で30分
間で３回等容量のフエノールで抽出する。フエノ
ールは３回とも使用直前に0.2モルのトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタンの溶液（これは塩
酸でPH7.5に調整されていた）の等量で平衡化し
て中和されていた。次にその溶菌液を等容量のク
ロロホルムで10回抽出し、そして10分の１容量の
酢酸塩溶液と混合する（この溶液は酢酸ナトリウ
ム3.0モルとエチレンジアミンテトラ酢酸二ナト
リウム1.0ミリモルを含有しており、NaOHでPH
7.0に調整されていた）。そのあと0.54容量部のイ
ソプロパノールを添加する。DNAをガラスロツ
ドに巻きつけて回収し、そして0.1％（ｖ／ｖ）
のジエチルピロカーボネートを含有する水5.0ml
に再溶解する。連続して２回以上同様方法で沈殿
させる。但し、各回の沈殿後に10ミリモルのトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと1.0ミリ
モルのエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム
を含有する溶液50ml（塩酸でPH8.2に調整したも
の）に再溶解させる。 【0036】Ｅ フアージTG１溶原菌のゲルトラン
スフアーハイブリダイゼーシヨン分析 適当な制限酵素によつて消化されたDNAをアガ
ロースゲル電気泳動によつて分離する。それらの
断片を精製し、変性し、そしてニトロセルロース
ペーパーに移す（Schleicher and Sohuell，
BA85）。精製したフアージからのDNAで放射線
標識をつけた試料をつくり、この試料を熱で変性
し、そして上記のニトロセルロース上のDNAと
ハイブリダイズさせる。これはホルムアルデヒ
ド、フイコル、牛血清アルブミンおよびポリビニ
ルピロリドンの存在且つ硫酸デキストランの不存
在下で42℃で48時間、実質的にDavis等（前掲）
により記載されているような仕方で実施される。 【0037】 フアージTG１の溶原性モードを決定
するためには、フアージ制限地図が役立つた。一
般に、溶原性フアージはプラスミドとして、ある
いは宿主染色体内への組込みによつて溶原化する
［A.M.Cambell：The episomes.Adv．Genet．
11（1962年）第101〜145頁参照］。溶原化のモード
の知識はそのフアージがDNAベクターとして使
用される予定である場合にかなり重要なことであ
る。適当な制限エンドヌクレアーゼで消化された
溶原性染色体DNAのゲルトランスフアー分析に
よつて、いずれのモードの可能性があるかが判別
される。そのフアージがプラスミドとして溶原化
する場合には、プロフアージDNAと増殖能力あ
るフアージDNAとの間の差異は、その付着末端
がプロフアージでは共に結合されるということの
みである。そのフアージが組込まれる場合には、
しかしながら、組込み部位が存在する特定制限断
片が欠けている。それは元の断片の両半分が染色
体DNAと融合することによつて生じる２つの新
しい断片によつて置換されるからである。われわ
れの実験結果は、フアージTG１がＳ．cattleya
の染色体内へ組込まれることを示している。酵素
PstＩとClaＩとが選択され、そのフアージDNA
は実質的に２つの領域に分割された。すなわち、
25Kbpサイズの大きな１つの内部断片と、サイズ
16.3Kbpの、cos断片と呼ばれているフアージ付
着末端を持つ２つの断片が結合したことから結果
する１つの断片とである。結合する前の２つの断
片のサイズはそれぞれ8.4Kbpと7.9Kbpである。
増殖能力のあるフアージからのDNA（0.01μg）と
溶原菌からの染色体DNA（1.0μg）とをそれら酵
素で消化し、そしてアガロースゲル上で分離し
た。その制限パターンを上記した放射線標識フア
ージDNAとハイブリダイズして分析した。非溶
原菌からのDNAはフアージDNAと相同なシーケ
ンスを含んでいなかつた。cos断片はその溶原菌
内に欠けており、そしてフアージDNAとハイブ
リダイズするサイズ15kbpと11kbpとの２つの新
規な断片によつて置換されていた。この結果は、
そのフアージDNAが宿主DNA内へ組込まれたこ
とを示す。 【0038】Ｆ フアージ粒子の精製 １皿または１管のフアージストツクの試料1.0ml
を菌濃度107ofu／ml、温度30℃のYC肉汁1.0リツ
トルに加える。これを回転シエーカー上に2.0リ
ツトルフラスコ内で30℃で16時間培養する。シエ
ーカーの工程は約５センチ（２インチ）、そして
回転速度は220r.p.m.であつた。溶解物をガラス
ウールを通して濾過して清澄化する。この溶解物
は約109pfu／mlの内容を持つ。NaCl 20gとポリ
エチレングリコール（平均分子量6000）を加えて
フアージを沈殿させる。攪拌して添加物を溶解さ
せたのち、この混合物を攪拌しないで一晩４℃で
放置する。フアージを低速遠心分離によつて沈殿
させる。ペレツト状になつた物質を再び10mlの
SM緩衝液に溶解する。SM緩衝液はNaCl 0.5％
（ｗ／ｖ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン20ミリモル、ゼラチン0.01％，MgCl210ミリ
モル、CaCl2５ミリモルを含有し、その全体は塩
酸でPH7.5に調整されていた。 【0039】 ５分間2500×ｇの遠心分離にかけて上
記懸濁物を清澄化する。その上澄み液を新しい遠
心管に入れ、そしてSM緩衝液中下記量のCsClの
溶液各2.0mlを下に重層する。即ち密度1.3g／ml，
1.5g／ml、および1.7g／mlである。この間を10℃
で1.5時間ベツクマン60Tiロータを用い50000r.p.
m.の回転速度（平均回転遠心力180000×ｇ）で
遠心分離する。フアージ粒子は、底の２つの層の
間の界面に濁つた帯域として可視となる。この帯
域の物質をピペツトで取り、最終体積10mlを与え
るのに十分な量の密度1.5g／mlのSM緩衝液中
CsClの溶液と混合し、そしてベツクマン80Tiロ
ータにより40000r.p.m.（平均回転遠心力110000×
ｇ）、温度10℃で16時間遠心分離する。フアージ
は再び管の真中近くに１つの濁つたバンドとして
可視となる。これをピペツトで採集し、そのフア
ージ懸濁物を各バツチ2.0リツトルのバツフアー
液に対して順次透析する。使用バツフアー液はト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン20ミリモ
ル、MgCl210ミリモル、CaCl2５ミリモルを含有
し、塩酸でPH7.5に調整された溶液にNaClをそれ
ぞれ1.0モル、0.3モル、0.1モル、0.01モル溶解さ
せたものである。 【0040】Ｇ フアージDNAの製造 本DNAは、精製されたフアージ粒子から標準的
ないくつかの方法によつて製造することができ
る。そのうちの２つの方法をここに述べる。 方法１ 再蒸留されたフエノールを続けて３回、
塩酸でPH８に調整した0.2モルのトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタンの1.0容量で平衡化す
る。平衡化されたフエノールの等容量をフアージ
懸濁物に加え、そして30分間管の上下をくり返し
反転させて２相を混合する。フエノール（下層）
をピペツトで除去する。このフエノール抽出を２
回くり返す。水性相を等容量のエーテルで３回抽
出する。ピペツトで除去できないエーテルを放置
して蒸発させる。酢酸でPH6.5に調整された3.0モ
ルの酢酸ナトリウム溶液を10分の１の容量だけ添
加し、次いで２倍容量の200プルーフエタノール
を添加する。エタノールを水性相と混ぜ合わせる
と沈殿したDNAが可視となる。このDNAを
13000×ｇで10分間遠心分離にかけて回収する。
上澄みを傾瀉し、そのペレツトを70％（ｖ／ｖ）
のエタノールで洗い、そして残存液体を窒素ガス
流で蒸発させる。このDNAを少量のTEに再溶解
する。TEはトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン10ミリモルとエチレンジアミンテトラ酢酸
二ナトリウム1.0ミリモルとを含有するものであ
り、塩酸でPH7.8に調整される。精製したDNAを
４℃または−70℃で貯蔵する。 【0041】方法２ フアージ懸濁液を５分の１容量
のトリス（ヒデロキシメチル）アミノメタン0.5
モルとエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム
0.25モルとを含有し、塩酸でPH8.0に調整された
溶液に混合する１／5000の容量のジエチルピロカ
ーボネートを添加する。この混合物を37℃で１時
間培養する。 等容量のホルムアミドを加える。この時に完全な
フアージ粒子による濁りが消え、溶液はDNAの
放出のために粘性となる。透析によつてフアージ
懸濁物からCsClが除去されていない場合には最
初の水溶液と等容量の水をホルムアミド含有混合
物に加える。DNAを沈殿させるために、この溶
液を２倍容量の200プルーフエタノールと混合す
る。沈殿したDNAを回収して上記方法１の場合
と同様に貯蔵する。 純度はやや乏しいが、しかし制限分析（Ｈ項）、
トランスフエクシヨン（Ｊ項）またはトランスフ
オーメーシヨン（Ｋ項）のために使用できるフア
ージDNAもこの方法によつて、ベツクマン80Ti
ロータの45000r.p.m.（平均回転遠心力150000×
ｇ）で３時間遠心分離することにより管内溶菌物
から採集されたフアージから製造できる。このフ
アージペレツトを0.2ミリモルのトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタンと25ミリモルのエチレ
ンジアミンテトラ酢酸塩とを含み、予め塩酸でPH
8.5に調整された溶液0.5mlに懸濁させる。この懸
濁物に直接的にジエチルピロカーボネートを加え
る。上記と同様に単離されたDNAを、牛のパン
クレアチンリボヌクレアーゼＡを最終濃度
10μg／mlの量で添加して72℃で10分間加熱する。
そして上記のように貯蔵する。 【0042】Ｈ フアージDNAの制限分析 DNAを制限エンドヌクレアーゼの種々の組合わ
せで制限切断し、そしてそれらの制限生成物を実
質的にDavis等（上掲）により記載された方法に
よりアガロースゲル電気泳動によつて分析した。
結果は、フアージTG１核酸が付着末端を持つ長
さ41.47キロ塩基対（kpb）の線形二本鎖DNA分
子によりなることを示した。下記の酵素はこの
DNAを開裂させることができない：BamH Ｉ，NaeＩ，NarＩ，PvuＩ，SstＩ，Sst
，StuＩ，XhoＩ。 下記の酵素は複数部位において、このDNAを開
裂させる：Bgl Ｉ，BstE，HgiAＩ，HphＩ，Mbo，
SalＩ，Xma，Xor，NruＩ，PvuＩ，EcoR
Ｉ，BclＩ，Bgl，BalＩ，KpnＩ，HpaＩ，
Sph，AvaＩ，Hind。 下記酵素はただ１つの部位において、そのDNA
を開裂する：Pst Ｉ，XbaＩ，ClaＩ，SmaＩ。 これら酵素のいくつかの場合にもたらされた制限
パターンが第２図に示されている。 【0043】Ｉ フアージTG１の欠失突然変異体の
単離 欠失突然変異体はDNAのクローニングのために
特に役立つ。１個のフアージ粒子内にパツケージ
しうるDNAの量は限度がある。フアージDNAの
一部の欠失は、その欠失サイズに等しい付加的量
のDNAをそのフアージに挿入できるスペースを
与える。また、欠失によつて、そのフアージゲノ
ムのどの部分が必要不可欠でないか、すなわちど
の部分がDNA挿入のために適当かが判明する。
他の領域への挿入はおそらくフアージの機能に必
要な遺伝子をこわすことであろう。突然変異体は
キレート剤に耐性のあるフアージ変種を単離する
ために一般に使用されている技術（前記参考文献
８参照）によつて得られた。フアージ粒子の安定
性のためにはマグネシウムイオンが必要である。
もしMg++がキレート剤（この場合ではエチレン
ジアミンテトラ酢酸塩）の添加によつて有効的に
除去されると、生きたフアージの個数は急速に減
少する。フアージゲノムの幾分かの欠失に由来す
る突然変異のために、より短いDNA分子を含む
フアージ粒子はMg++の不存在でもより安定であ
り、生き残る。 【0044】 フアージTG１の欠失突然変異体を得
るため、KOHでPH6.5に調整した1.0モルの２−
（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸0.10mlと、
NaOHでPH７に調整した0.50モルのエチレンジア
ミンテトラ酢酸二ナトリウム0.10mlとをフアージ
の平板または管ストツクの1.0mlと混合する。こ
の混合物を37℃で30分間培養する。ついで、これ
を25mlのYC肉汁と0.10mlの菌とを含有している
250mlのエルレンマイヤーフラスコに添加する。
時としてはフアージの増殖を促進するため５ミリ
モルのHCl中FeCl3・6H2O10mg／mlの溶液を0.50
ml添加することが必要である。これの必要性は
YC肉汁の特定バツチの種類による。このフラス
コを140r.p.m.のシエーカー［行程約５センチ
（２インチ）］上で30℃において16時間振盪する。
一晩培養したのち得られた溶菌液を0.45ミクロン
の細孔サイズを持つフイルターに通して濾過し、
そして生きているフアージの濃度を判定する。も
しこれが107ptu／ml以上であつた場合には、エチ
レンジアミンテトラ酢酸塩による処理ならびにそ
れに続くフアージの培養をくり返す。エチレンジ
アミンテトラ酢酸塩の第１回目の処理でpfu／ml
濃度は約104乃至105倍低下する。その後の処理に
よるpfu／mlの減少度は段々と低くなる。通常こ
の処理を３回くり返す。最後の処理終了後に単一
プラークから増殖させたフアージのDNAを精製
し、そして制限エンドヌクレアーゼによる消化に
よつて分析する。クローンフアージの多くはそれ
らのDNAの一部が欠失されてしまつている。か
かる欠失フアージの制限分析により少なくとも４
つの型のフアージ欠失種が生じたことが判明す
る。例えばフアージTG２，TG３，TG４，TG
５（第３図参照）である。これらのフアージ
DNA分子について酵素Hind，KpnＩ，PstＩ，
SphＩの制限部位の存否を調べた。フアージTG
２はDNAの2.0kbpの欠失を持ち、これにより
6.72kbp位置のSphＩ部位、7.93kbp位置のKpnＩ
部位および7.99kbp位置のHind部位が取り去ら
れている。フアージTG３は2.5kbpのDNAの欠
失を持ち、7.93kbp位置のKpnＩ部位、7.99kbp位
置のHind部位および8.38kbp位置のPstＩ部位
が取り去られている。フアージTG４は2.1kbpの
DNA欠失を持ち、6.72kbp位置のSphＩ部位、
7.93kbp位置のKpnＩ部位および8.38kbp位置の
PstＩ部位が取り去られている。これらのフアー
ジを放出する能力を持つＳ．cattleyaNRRL8057
の溶原菌は前記表Ｉに記載したようにフアージ
TG２を放出するものは菌株ATCC39077
（MA5766）として、フアージTG４を放出するも
のは菌株NRRL 15034（MA5769）として、フア
ージTG５を放出するものは菌株NRRL 15035
（MA5770）として寄託されている。多分、他の
型の欠失突然変異体も同様にして得られ、そして
それらは有用性を持つているであろう。第３図は
これらフアージのそれぞれにおいて欠失された
TG１ゲノム部分を示す図である。第３図に示し
た欠失突然変異体のすべては溶原菌形成能力があ
る。偶発的に得られたすべての欠失突然変異体に
ついて同じことが言えるとは限らない。第３図に
示したフアージ内のDNA欠失或はそのフアージ
の細胞溶解性機能にも溶原性機能にも必要ない領
域である。これら欠失のうち２つはフアージゲノ
ムの単一PstＩ部位を取り去つてしまつている。
フアージの機能に影響を与えることなしにこの部
位に外来DNAが挿入可能であり、したがつて、
この部位はクローンされるべきDNAの挿入のた
めに有用な部位であることが判明している（Ｍ項
参照）。欠失型のうちの２つはPstＩ部位を手つけ
ずに残している。これらのDNA分子はクローン
されるべきDNAの挿入のために格別に有用であ
る。PstＩのための部位以外の他の部位もまた
DNAのクローニングのために役立つとが判明す
る可能性は大きい。 【0045】Ｊ Streptomyces cattleya MA4297ト
ランスフエクシヨン トランスフエクシヨンは下記方法で実施される。 遠心分離によつて菌を採集し、そして約1010
cfu／mlで2.0mlのPMC20に懸濁する。PMC20は
スクロース200g，K2SO40.25g，MgCl2・6H2Ｏ
2.0gおよび微量元素液2.0mlを最終体積が1.0リ
ツトルとなるよう水に溶解し、オートクレーブ後
に2.5モルCaCl210mlおよびKOHでPH6.0に調整し
た1.0モル２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン
酸と0.5％（ｗ／ｖ）KH2PO4の溶液10mlを１リ
ツトルにつき添加することによつて調整される。
微量元素液は１リツトルにつきZnCl2を40mg，
FeCl3・6H2Ｏを200mg，CuCl2・2H2Ｏを10mg，
MnCl2・2H2Ｏを10mg，Na2B4O7・10H2Ｏを10
mg，（NH4）6Mo7O24・4H2Ｏを10mg含有する。 上記の菌懸濁物にニワトリ卵白リゾチーム2.0ml
（２mg／mlPMC20）を加える。この混合物を37℃
で90分間培養し、その後で2500×ｇの遠心分離に
５分間かけてプロトプラストを集める。このペレ
ツトをPMC20の4.0mlに再懸濁して氷上に保持す
る。DNAのサンプル、たとえばベクターDNAを
１マイクロリツトル当り0.25μgを含有している
DNAサンプル20μを等容量のヘパリン溶液
（シグマ、ナトリウム塩、２倍濃縮したPMC20の
１mlにつき５mg）と混合し、そしてPMC20の
240μを添加し、次いでPMC20に溶解した28％
（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（シグマ、平
均分子量1000）1.50mlを添加する。この混合物を
室温で10分間培養する。0.7mlの試料を取つて
RM軟寒天10mlおよびPMC20の１ml当り107cfuの
濃度のＳ．cattleyaの芽胞0.20mlと混合し、そし
て直ちに四角（100×15mm）のペトリ皿に注入す
る。この皿にはRM寒天約60mlが入つている。な
お、RMはスクロース200g，K2SO4 0.25g，
MgCl2・6H2O10g，Ｄ−グルコース10g、デイフ
コカサミノ酸類0.1g，デイフコオートミール寒天
3.5g、微量元素液2.0ml，Ｌ−プロリン3g、デイ
フコイースト抽出物2gおよび２−（Ｎ−モルホリ
ノ）エタンスルホン酸1.95gを含有しており、こ
れらは水の中で十分に混合され、KOHでPH6.0に
調整され、1.0リツトルまで希釈されてオートク
レーブで煮られた。オートクレーブで煮たのち、
１リツトルにつき8.0mlの2.5モルCaCl2と10mlの
0.5％（ｗ／ｖ）KH2PO4が添加された。RM寒天
は2.0％（ｗ／ｖ）のデイフコ寒天で固めたRM
のことである。RM軟寒天とは温度46℃で0.6％
（ｗ／ｖ）溶融デイフコ寒天を含んでいるRMで
ある。軟寒天の上掛けが固まつたのち、皿を28℃
で２日間培養する。フアージは菌溶解域から単離
され、そして増殖される。 【0046】Ｋ Escherichia coli Ｋ−12RR−１の
トランスフオーメーシヨン DNAの取込みにコンピテントとなつたＥ．coli
細胞が下記方法によつて得られる。 Escherichia coli Ｋ−12RR−１［F.
Bolivar，R.L.Rodriquerz，M.C.Betlach，H.W.
Boyerの論文、2Gene、第75〜93頁（1977年）参
照］は、培地LB250ml中、37℃の温度で指数関数
的に増殖する。LBは蒸留水１リツトル中にバク
トートリプトン10g、バクトーイースト抽出物5g
およびNaCl5gを含有するものである。細胞濃度
が２×108cfu／mlに達したらその培養物を氷の温
度まで15分間冷却し、しかるのち４℃で遠心分離
（6000xg，５分間）により細胞を集める。上澄み
液を傾瀉し、そして細胞を氷冷した0.1モルCaCl2
溶液125mlで懸濁する。この細胞懸濁物を15分間
氷の上に保持する。再び遠心分離によつて細胞を
集め、氷冷0.1モルCaCl225mlに懸濁し、そしてさ
らに15分間氷上に保持する。この細胞懸濁物に
0.1モルCaCl中40％（ｗ／ｖ）グリセリンを含む
氷冷溶液（15ml）を混合する。これは−70℃で貯
蔵しておくこともできるし、また直接使用するこ
ともできる。 DNA（TE30μ中約0.1乃至1.0μg）を、50ミリモ
ルNaCl，５ミリモル クエン酸ナトリウム、67
ミリモルCaCl2を含有する溶液100μと混合す
る。次に細胞懸濁物（0.20ml）を加え、そしてこ
の混合物を45分乃至１時間氷上においておく。培
養液LB（4.0ml）を加え、振盪しながら37℃で３
時間細胞を培養する。この培養期間中にプラスミ
ドの確立と変換DNAによつて授与された選択可
能な特性の表現が可能である。遠心分離によつて
細胞を集め、そして種々の量でこれを寒天培養皿
の上に拡げる。これらの培養皿には付加された
DNAによつて授与された特性を獲得した菌のみ
の成長を許容する培養培地を入れておく。たとえ
ば、1.5％（ｗ／ｖ）のデイフコ寒天で固められ、
そして抗生物質たとえば50μg／mlの濃度のカナ
マイシンを添加したLBを培養培地とする。 【0047】Ｌ E.coli Ｋ−12からのプラスミド
DNAの製造 プラスミドDNAはＥ．coli Ｋ−12のプラスミ
ド含有誘導体から標準的技法、たとえばDavis等
（前掲）の第116〜119頁に記載された方法によつ
て単離することができる。純度はやや低いが、し
かしトランスフオーメーシヨン、トランスフエク
シヨンまたは制限分析のために使用するのに適当
なDNAが下記方法によつてより早く単離するこ
とができる。 選択性培地、通常は抗生物質を加えたLBの５ml
中で細胞を静止相になるまで一晩増殖させる。こ
れらの細胞を遠心分離（3000xg，５分間）によ
つて採集し、そして下記成分を含み全体がKOH
でPH８に調整された溶液0.45mlに懸濁する。８％
（ｗ／ｖ）スクロース、５％（ｗ／ｖ）Triton
Ｘ−100，50ミリモルのエチレンジアミンテトラ
酢酸二ナトリウムおよび50ミリモルのトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン、リゾチーム
（TEの１ml中10mgの新しく調整した溶液25μ）
を加える。この混合物を沸騰水中で60秒間インキ
ユベートし、そしてその後直ちに室温で遠心分離
する（12000xg，10分間）。上澄み液の100μを
取り、そして100μのイソプロパノールと混合
する。−20℃で30分間培養後、DNA沈殿を遠心分
離（12000xg、10分間）により回収し、100μの
TEに溶解して４℃で貯蔵する。制限分析、トラ
ンスフエクシヨンまたはトランスフオーメーシヨ
ンのためには５乃至20μで十分である。 【0048】Ｍ フアージTG２DNA内へのプラス
ミドpACYC177の挿入 この実験は、このベクター内への外来DNAのク
ローニングが実行可能であることを実証するもの
である。 プラスミドpACYC177はA.C.Y.ChangとS.N.
CohenによつてJ.Bacteriol.134（1978年）第1141
〜1156頁に記載さている。これはＥ．Coliから得
られたものであり、サイズは約3.6キロ塩基対で
ある。これはアムピシリンおよびカナマイシンに
対する耐性を与え、そしてアムピシリンに対する
耐性をコードしているDNAシーケンス内に単一
PstＩ部位を持つている。共有結合的に閉環して
いるpACYC177プラスミドDNAとフアージTG
２DNAとは、下記組成の反応混合物0.25ml中で
37℃で８時間インキユベートすることによつて
別々に開裂された。反応混合物はTE0.20ml中の
DNA50μgに５×KC［0.1モルのトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン、50ミリモルのMgCl2，
0.1モルのKClを含み、HClでPH7.7に調整した溶
液］0.05mlとPstエンドヌクレアーゼ15μ（150
単位、Bethesda Researoh Laboratories製品）
とを混合してなるものであつた。４時間インキユ
ベートしたのち、さらに100単位のエンドヌクレ
アーゼをフアージDNA含有反応混合物に添加し
た。各混合物を70℃に10分間加熱し、しかるのち
ジエチルピロカーボネート1.0μを添加し、そし
てさらに37℃で１時間インキユベートしてエンド
ヌクレアーゼを不活性化した。前記のごとく、こ
のDNAをエタノールを添加して沈殿させ、そし
てTEの0.20mlに再溶解する。各開裂されたDNA
試料（75μ）を、次のものをプラスして互いに
混合したTE75μ，LM［0.66モルのトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン、66ミリモルの
MgCl2を含み、HClでPH7.5に調整したもの］28μ
，4.0ミリモルのアデノシン−5′−三リン酸塩
（二ナトリウム塩）25μ，0.10モルのジチオスレ
イトール25μおよびT4DNAリガーゼ3μ（６
単位、Bethesda Research Laboratories）。こ
の混合物を3.5℃で24時間インキユベートした。
エタノールでDNAを沈殿させ、そしてTE75μ
に再溶解した。このDNA調整物の数部量がＪ項
に記載したようにＳ．cattleyaのプロトプラスト
のトランスフエクトのために使用された。フアー
ジが単離されて、それらのDNAが制限分析によ
つて調べられた。挿入によつて親のフアージとは
異なつたDNAを持つフアージが得られた。この
挿入は、プラスミドpACYC177のサイズと制限
特性を有するDNAが単一PstＩ部位に挿入された
ものであり、PstＩの消化によつて線形に切り出
すことができた。第４図に示すように、互いに反
対の配位（orientation）で挿入された
pACYC177を持つ２種のフアージ、TG６とTG
７とが得られた。これらフアージのDNAがＫ項
に記載したようにＥ．coli −12RR １のトラン
スフオームのために使用された形質転換体（トラ
ンスフオーマツト）は1.5％（ｗ／ｖ）デイフコ
寒天で固められ、そして50μg／mlのカナマイシ
ンを補足されたLBを含有するペトリ皿上で選択
された。 【0049】 上記のペトリ皿を37℃で一晩培養し
た。カナマイシン耐性菌の多数のコロニーがフア
ージTG６とTG７のDNAにさらされた細胞から
得られた。このような菌を再精製した。そしてフ
アージTG６から得られたプラスミドpTG６を含
有する菌は菌株ATCC39079（MB4540）として、
そしてフアージTG７からのプラスミドpTG７を
含有するものは菌株ATCC39082（MB4543）とし
て寄託されている。Ｌ項に記載したように、これ
ら菌株からプラスミドDNAが単離され、そして
Hindの制限分析によつて検査された。そのプ
ラスミドは付着末端が結合されている点を除き対
応する増殖能力のあるフアージ、TG６とTG７
のDNAと同じであつた。さらに、未消化のDNA
調整物をＪ項に記載した仕方と同様な仕方で
Streptomyces cattleyaMA4297のプロトプラス
トをトランスフエクトするために使用した。その
結果、同様判定によつてはフアージTG６および
TG７から区別不能なフアージが生じた。 【0050】Ｎ 交配フアージの欠失突然変異体の単
離 プラスミドpACYC177を欠失フアージTG２に挿
入すると、そのゲノム（核酸）が元のフアージ
TG１のそれよりも4.7％長いフアージが生じる。
このフアージにパツケージされたDNAのその余
分な長さは、元のTG１よりもキレート剤に対し
てそのDNAをより敏感にする。この特性は、次
のようにして欠失突然変異体の単離のために利用
することができる。注目すべきは、元の単離物の
ゲノムよりも大きいゲノムサイズをもたらすこと
になるフアージTG１のいずれの誘導体内へのい
ずれのDNAの挿入も類似の特性を示すであろう
ことである。 フアージTG６およびTG７の欠失突然変異体を
単離するため、単一プラークから調整された管ス
トツクの10μを、二価陽イオンを添加されてい
ないそして25ミリモルのピロリン酸ナトリウムが
補足され且つNaOHでPH6.0に調整されたYC肉汁
0.10mlと混合する。35℃で30分間培養したのち
（この時点で生き残つているフアージ個体数は最
初の濃度の約10-3である）、YC肉汁い菌を懸濁し
た懸濁物0.20mlを加える。室温で10乃至20分間経
過させたのち、YC軟寒天4.0mlを加え、その混合
物をYC寒天皿の上に注ぎ、そして30℃で一晩培
養する。これにより１皿のフアージストツクが得
られる。ピロリン酸塩によるフアージ処理を続け
て２回以上くり返す。 【0051】 第２回目、第３回目の処理後に生き残
るフアージの割合は、実質的に段々と大きくな
る。このようなピロリン酸塩耐性フアージから単
離された単一プラークのDNAは、通常その挿入
されたプラスミドの領域が欠失されている。この
欠失の平均サイズは４乃至6kbpである。挿入さ
れたプラスミドの領域とは別の領域に欠失を持つ
突然変異体を選択するため、上記のピロリン酸塩
耐性フアージ皿ストツクの試料0.10mlから直接的
に調製されたフアージ管ストツクからDNAを単
離する。このようなストツクは混合集団であり、
そのうちのいくつかのメンバーが所望の欠失を持
つフアージである。そのDNAをＥ．coliＫ−
12RR1をカナマイシン耐性にするために使用す
る。かかる形質転換（トランスフオーマント）の
プラスミドDNAは再生機能と挿入された
pACYC177プラスミドのカナマイシン耐性遺伝
子とを保持しているはずである。二者択一的に選
択可能な特質を授与する挿入DNAを持つ誘導体
は同じような方法で利用することができる。も
し、その特質がＥ．coliではなくてＳ．cattleya
の中で発現されるならば、そのピロリン酸塩耐性
フアージ混合集団をＳ．cattleya菌に直接感染さ
せることによつて、これら欠失突然変異体を得る
ことができる。そのフアージを吸着させたのち、
菌を２乃至４時間増殖させれば、選択的培地に移
す前にそのベクター分子の確立とその選択可能な
特質の発現とがなされる。 【0052】 ベクターDNAを形質転換細胞から
（或は場合によつては溶原菌から放出されたフア
ージから）単離し、そして欠失の有無を調べる。
フアージTG６とTG７のピロリン酸塩耐性集団
からのDNAで得られたカナマイシン耐性形質転
換体は増殖性フアージDNA制限地図の左端（第
４図）と挿入プラスミドのカナマイシン耐性遺伝
子との間の位置に欠失を持つプラスミドを含有し
ていた。フアージTG６とTG７の制限地図に関
する位置およびそれら欠失のサイズは第４図に示
されている。制限酵素Hidn，SphＩ，PstＩ，
SmaＩおよびBamHＩについてそれらプラスミ
ドを分析した。 【0053】 TG６から下記のプラスミドが誘導さ
れた： pTG８：これは3.1kbpのDNA欠失を持ち、これ
によつて6.38kbp位置のPstＩの部位および
7.27kbp位置のBamHＩ部位が取り去られてい
る； pTG９：これは4.7kbpのDNA欠失を持ち、その
結果4.75kbp位置のSphＩ部位、6.38kbp位置の
PstＩ部位および7.27kbp位置のBamHＩ部位が
取り除かれている； pTG１０：これは3.0kbpのDNA欠失を持ち、そ
の結果1.66位置のHidn部位が除去されてい
る； pTG１１：これは2.0kbpのDNA欠失を持ち、こ
れにより6.38kbp位置のPstＩの部位と7.27kbp位
置のBamHＩ部位が除去られている； pTG１２：これは6.0kbpのDNA欠失を持ち、
4.75kbp位置のSphＩ部位、6.38kbp位置のPstＩ
部位および7.2kbp位置のBamHＩ部位が除去さ
れている； pTG１３：これは2.8kbpのDNA欠失を持ち、そ
の結果6.38kbp位置のPstＩの部位と7.27kbp位置
のBamHＩ部位とが取り去られている； pTG１４：これは4.1kbpのDNA欠失を持ち、そ
のため4.75kbp位置のSphＩ部位が取り去られて
いる。 【0054】 TG７からは下記のプラスミドが誘導
された： pTG１５：これは3.1kbpの欠失を持ち、これに
より4.75kbp位置のSphＩ部位が除去られてい
る； pTG１６：これは4.6kbpのDNA欠失を持ち、そ
の結果4.75kbp位置のSphＩ部位が除去られてい
る。 これらのプラスミド誘導体のいくつかを含む代表
的誘導体は以下の菌株番条をもつて委託されてい
る。 プラスミドpTG１２を含む菌株ATCC39080
（MB4541）； プラスミドpTG１６を含む菌株ATCC39081
（MB4542）； プラスミドpTG８を含む菌株NRRLB−15027
（MB4544）； プラスミドpTG９を含む菌株NRRLB−15028
（MB4545）； プラスミドpTG１０を含む菌株NRRLB−15029
（MB4546）； プラスミドpTG１１を含む菌株NRRLB−15030
（MB4547）； プラスミドpTG１３を含む菌株NRRLB−15031
（MB4548）； プラスミドpTG１４を含む菌株NRRLB−15032
（MB4549）； プラスミドpTG１５を含む菌株NRRLB−15033
（MB4550）。 【0055】 これらのプラスミドはＳ．cattleyaの
プロトプラストをトランスフエクトするために使
用され、そしてそのDNAが、付着末端が分離さ
れうる点を除き、対応するプラスミドDNAと同
じであつたフアージを生じた。プラスミドpTG
８はフアージTG８を、pTG９はフアージTG９
を与えた。他についても同様であつた。 【0056】実施例 ２ チエナマイシン遺伝子のクローニング この実施例はTG１ベクターの誘導体がどのよう
にしてチエナマイシン遺伝子の同定およびクロー
ニングのために使用しうるかを示すものである。 実験は種々の方法で実施可能であり、ここに記載
するのはその一例を示すにすぎない。したがつ
て、本実施例は目的を達成するためにTG１およ
びその誘導体を用いる方法を例示するだけであ
り、なんら限定的なものではない。 【0057】Ａ チオストレプトン耐性遺伝子を担持
するTG１誘導体の構成 薬剤に対する耐性の遺伝子を担持するTG１誘導
体を構成する事は、溶原菌の直接的選択を可能に
する。これはチエナマイシン遺伝子のためのハイ
ブリツドベクタークローンをスクリーニングする
ために役立つ（本実施例のＢ項参照）。
Streptomycesでは抗生物質チオストレプトンに
対する耐性を与える遺伝子がすでにクローンされ
ている［C.J.Ward，J.M.およびHopwood.D.
A.：DNA Cloning in Streptomyces：
resistance genes from antibiotic−producing
species.Nature 286（1980）第525〜527頁参照］。
この遺伝子を持つプラスミドDNAを単離し、そ
してBamHＩで開裂する。そのチオストレプト
ン耐性遺伝子を持つ断片（2.0kbp）を、アガロー
スゲル電気泳動により精製する。精製された断片
をBclＩで部分的に消化する。この断片は、その
薬剤性遺伝子の両側にBclＩ部位を持つている。
部分的に開裂されたDNAとBamHＩですでに開
裂されているベクターTG１５のDNAとを混合
し、そして結合する。結合されたDNAを実施例
１、Ｊ項に記載したようにStreptomyces
cattleyaのプロトプラストをトランスフエクトす
るために使用する。ただし今回は、ポリエチレン
グリコールによる処理後にそのプロトプラストを
10mlのRMおよび芽胞と混合し、そして250mlの
エルレンマイヤーフラスコ内30℃の温度でゆつく
りと振り回しながら一晩培養する。細胞を種々の
度合いに希釈し、そして最初濃度５および
10μg／mlでチオストレプトンを追加したYC寒天
を含有するペトリ皿の上に撒く。チオストレプト
ン耐性溶原菌の成長によりコロニーが生じる。こ
れらの溶原菌からのフアージのDNAを分析して
BamHＩ部位の有無を調べる。 【0058】 単一のBamHＩ部位を持つハイブリ
ツドベクターとBamHＩ部位を全く持たないハ
イブリツドベクターとを選択する。BclＩで消化
されて生じた端はBamHＩの消化によつて生じ
た端で連結されうるが、しかしその新規連結はい
ずれの酵素のための部位も再生しないからして、
１端においてBamHＩでそして他端においてBcl
Ｉで開裂されて生じた断片の挿入は単一の
BamHＩ部位を持つベクターを与え、両端にお
いてBclＩで開裂されて生じた断片の挿入は全く
BamHＩ部位を持たないベクターを与える。１
端にBamHＩ部位を持つチオストレプトン耐性
遺伝子を担持する挿入体の長さは約1.5kbpであ
る。BamHＩ部位を全く持たないチオストレプ
トン耐性遺伝子を担持する挿入体の長さは1.1kbp
である。 【0059】 チオストレプトン遺伝子の左側に位置
するフアージおよびpACYC177の欠失は、実質
的に上記した方法（実施例１，Ｉ項およびＮ項参
照）により得られる。所望の欠失により４乃至
4.5kbpのDNAとpACYC177DNAの左端に位置す
るPstＩ部位が除去される。これは、そのフアー
ジをキレート剤で処理し、そして所望の欠失を持
つDNAを有するフアージを放出するチオストレ
プトン耐性溶原菌をスクリーニングすることによ
つて選択される。BamH Ｉ部位のないベクター内へBamHＩ部位
を次のごとくして導入することができる。 プラスミドpBR322のDNAをRsaＩおよびSphＩ
で消化させる。この消化によつて生じた0.4kbpの
断片にNelsonおよびBrutlagによつて記載された
方法に従つて10乃至15のデオキシチジンヌクレオ
チド残分を端付加する［T.NelsonおよびD.
Brutlagの論文“Additcon of homopolymers
to 3′−ends of duplex DNA with terminal
transferase”；Methods in Enzymology.Vol.68
（1979年），S.P.ColdwickおよびN.O.Kaplan編、
第41〜50頁参照］。 【0060】 BamHＩ部位を持たず挿入チオスト
レプトン耐性遺伝子の左側のフアージとプラスミ
ドDNAの１部分が欠失されたベクターのDNA
を、PstＩで開裂する。このベクター内には、挿
入された遺伝子の右側にただ１つのPstＩ部位が
残る。開裂されたベクターDNAに10乃至15のデ
オキシグアノシンヌクレオチド基の尾端を付ける
（NelsonおよびBrutlagの論文（前掲参照）。尾端
をつけた断片と尾端をつけたベクターとを混合
し、そしてStreptomyces cattleyaのプロトプ
ラストをトランスフエクトとするために使用す
る。生じたフアージのDNAをpBR322からの断
片の挿入のために調べる。このベクターはクロー
ン断片に隣接するPstＩ部位とSphＩ部位を持つ、
Sau3AＩによる部分消化によつて生じた任意断
片のクローニング（Ｂ項参照）に有利である。
PstＩで開裂されたDNAにデオキシグアノシンで
尾端をつけると最終混合成分子内にPstＩ部位が
再生され、他方SphＩで開裂されたDNAにデオ
キシシチジンの尾端をつけるとSphＩ部位が再生
される。これらの余分な部位は、その後のクロー
ン断片の切取りのために有利である。 【0061】Ｂ チエナマイシン遺伝子の単離と同定Streptomyces cattleyaの染色体DNAをSan3A
Ｉで部分的に消化させる。この消化生成物をアガ
ロースゲル電気泳動によつて分割する。長さ３乃
至10kbp範囲の断片をそのゲルから抽出する
（David等、（前掲）参照）。これらの断片を
BamHＩですでに開裂されているベクターTG１
５の誘導体と混合する。この誘導体の構成は上記
した。このDNAを用いてＳ．cattleyaのプロト
プラストのランスフエクシヨンを行ない、そして
チオストレプトンの耐性のある溶原菌を本実施例
のＡ項に記載のように単離する。これらの溶原菌
中のベクターの多くはＳ．cattleya染色体DNA
の挿入体を担持する。これをスクリーニングにか
けて、次のようにしてチエナマイシン合成の途中
がブロツクされているＳ．cattle ya の突然変異体を補足できる挿入体の存在を調
べる。 【0062】 上記溶原菌の混合物からフアージスト
ツクを調製し、そして液体培養基中で各種チエナ
マイシン突然変異体を感染させるために使用す
る。フアージと共に数時間培養したのち、細胞を
チオストレプトンを付加したYC寒天皿の上に撒
く。宿主内に存在する突然変異を補完する能力の
ある遺伝子を担持する雑種ベクターの寄宿してい
る細胞のコロニーを検出する。この検出はチエナ
マイシンに感受性のある菌を接種した軟寒天上掛
けをその培養皿にかけることによつて行なわれる
［J.S.Kahn，F.M.Kahn，R.Goegelman，S.A.
Currie，M.Jackson，E.O.Stapley，T.W.
Miller，A.K.Miller，D.Hendlin，S.Mochales，
S.Hernandez，H.B.WoodruffおよびJ.Birnbanm
の論文、“Thienamycin，ａ new beta−
lactam antibiotic，I.Discovery，taxonomy，
isolation and physical properties”J.Antibiot．
32（1979年）第１〜12参照］。そのような雑種ベク
ターを持つ菌のコロニーは、チエナマイシン感受
性菌の大きい円形溶解域の中央にある。雑種ベク
ターの存在は、その溶原菌によつて産出されたフ
アージからのDNAを分析することによつて確認
される。チエナマイシン遺伝子の存在はその突然
変異体に雑種フアージを再感染させることによつ
て確認される。この新規雑種フアージを用いて得
られたすべての溶原菌はチエナマイシン合成能力
を獲得するはずである。 【0063】実施例 ３ Ｂ型肝炎表面抗原のS.cattleyaへのクローニングＳ ．cattleya内で発現される遺伝子に、Ｂ型肝炎
表面抗原遺伝子のＣ−末端部の大部分を挿入する
ことによつてＳ．cattleya内へＢ型肝炎表面抗原
をクローニングすることができる。もしその表面
抗原挿入が正しい配位と正しい暗号翻訳の読み枠
でなされたならば、Ｂ型肝炎表面抗原の抗原特性
を持つ配合タンパク質が産生されるであろう［J.
C.Edman等の論文、Nature 291（1981年）第503
〜506頁参照］。本実施例ではＢ型肝炎表面抗原
が、ネオマイシンに耐性を授与する遺伝子に挿入
される。Ｓ．cattleyaの中においてＢ型肝炎表面
抗原を発現させるという目的は種々の方法で達成
することができる。ここに記載する方法はTG１
ベクターおよびその誘導体がこの目的達成のため
にどのように使用できるかを例示するだけのもの
であり、なんら限定的なものではない。 【0064】Ａ ネオマイシン耐性遺伝子を担持する
TG１ベクターの誘導体の構成Streptomyces において抗生物質ネオマイシンに
耐性を授与する遺伝子はすでにクローンされてい
る（Thompson等、supra参照）。この遺伝子はネ
オマイシンホスホトランスフエラーゼのコードを
有する。この遺伝子を持つプラスミドDNAを単
離し、そしてSstで開裂させる。ナオマイシン
耐性遺伝子を持つている断片（長さ1.0kbp）をア
ガロースゲル電気泳動で精製する。この断片を
Sstですでに開裂されているベクターTG８の
DNAと混合する。ベクターTG８は、そのDNA
のpACYC177部内のSmaＩ部位とPatＩ部位との
間に位置する単一のSst部位を持つている。こ
のDNAを連結してＳ．cattleyaのプロトプラス
トのトランスフエクシヨンのために使用する。ネ
オマイシンに耐性のある溶原菌を10および
20μg／mlのネオマイシンを補給されたYC寒天皿
の上で単離する（実施例２，Ａ項に記載した方法
と同様にして行なう）。 【0065】Ｂ ネオマイシンホスホトランスフエラ
ーゼーＢ型肝炎表面抗原融解タンパク質を発現す
る誘導体の構成Sst 部位にネオマイシン断片が挿入されたフア
ージのDNAをBamHＩで開裂する。このベクタ
ーはネオマイシン耐性の暗号を持つ遺伝子の中央
付近に位置した単一のBamHＩ部位を持つてい
る。このベクターに約10乃至15のデオキシグアノ
シンヌクレオチド残分の尾端をつける（Nelson
およびBrutlag，spura参照）。クローンされたＢ
型肝炎ウイルスのDNAをHincで消化し、そし
てＢ型肝炎表面抗原の部分を含む744−塩基対断
片（その22アミノ末端アミノ酸は欠けている）を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離する
［J.C.Edman，R.H.Hallewell，P.Valenzuela，
H.M.GoodomanおよびW.J.Rutterの“Synthesis
of hepatitis Ｂ surface and core antigens in
Ｅ．coli”，Nature Vol 291（1981年），503〜
506頁参照］。この断片に約10乃至15のデオキシチ
ジンヌクレオチド残分の尾端をつける（Nelson
およびBrutlag，supra参照）。ついでこの断片を
尾端をつけたベクターと交配し、そしてその混合
物を用いてＳ．cattleyaのプロトプラストにトラ
ンスフエクシヨンを行なう。生じたプラークから
フアージを単離し、そそてそれらのDNAを制限
分析によつてＢ型肝炎表面抗原断片の挿入につい
て調べる。溶原菌を単離し、そして35S−システ
イン標識タンパク抽出物の免疫沈殿によつて
（Edman等、supra参照）、予期したネオマイシン
ホスホトランスフエラーゼーＢ型肝炎表面抗原融
合タンパク質（ネオマイシン遺伝子のアミノ末端
のデオキシグアノシン尾端から由来する短いグリ
シン残分によつて結合されている）の産生の有無
を調べる。挿入されたＢ型肝炎表面抗原断片は正
しい配位と正しい読み枠になければならないか
ら、雑種クローンの６つのうちのわずか１つぐら
いがその融合タンパク質を産生するにすぎないだ
ろう。
【図１】フアージTG１の電子顕微鏡写真を示す
図である。
図である。
【図２】フアージTG１の制限地図を示す図であ
る。
る。
【図３】フアージTG１の欠失突然変異体の制限
地図を示す図である。
地図を示す図である。
【図４】雑種フアージTG６とTG７および欠失
突然変異体を示す図である。
突然変異体を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【１】 アクチノフアージTG１（ATCC39078）
またはその欠失もしくは挿入変異体フアージのゲ
ノムおよびそのゲノム変異体中に付加的DNAを
組み込むための方法であつて、該方法が、 該ゲノムまたは変異体DNAを制限エンドヌクレ
アーゼで切断し、 切断されたDNAに付加的DNAを組み合せ、 このDNA混合物を処理して連結を起こさせ、 該付加的DNAと該バクテリオフアージの双方の
DNAを全部または一部を共に組み込んでいるバ
クテリオフアージ、あるいはその雑種フアージを
形成させることを特徴とする方法。
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