JPH0440662B2 - - Google Patents
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- JPH0440662B2 JPH0440662B2 JP15066881A JP15066881A JPH0440662B2 JP H0440662 B2 JPH0440662 B2 JP H0440662B2 JP 15066881 A JP15066881 A JP 15066881A JP 15066881 A JP15066881 A JP 15066881A JP H0440662 B2 JPH0440662 B2 JP H0440662B2
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Description
本発明は抗核抗体のエンザイムイムノアツセイ
に関する。 抗核抗体、なかでも抗二本鎖DNA抗体は代表
的自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス
（以下SLEという）の発症と密接な関連性が予測
されている。また抗二本鎖DNA抗体の他に抗ポ
リADP−リボース抗体の存在が明らかにされ
SLE患者などに高頻度に検出されることが実証さ
れた（Y.Kanai et al：Nature，269，175−177，
1977）。ポリADP−リボースはDNA合成の調節、
細胞の分化及びDNAの修復と密接に関連してい
ることが知られている。ポリADP−リボースに
対する自然抗体がSLEに高頻度で出現することは
抗ポリADP−リボース抗体がSLEの病態及びそ
の修飾に密接に関係していることを示唆する。し
たがつてこれら抗核抗体の測定方法が開発されて
いる。 抗核抗体の測定方法としてはその感度および定
量性の点よりラジオイムノアツセイ（以下RIAと
いう）が多く用いられている。しかしRIAによる
測定は放射性物質を取扱うため法的に許可された
施設以外ではこれを行なうことができずその普及
を妨げている。 このように使用に制約のあるRIAに代えて、標
識剤としてラジオアイソトープの代りに酵素を用
いるエンザイムイムノアツセイ（以下EIAとい
う）が開発され各分野で普及しつつある。しかし
抗核抗体の測定、特に抗ポリADP−リボース抗
体の測定はその事例がなく、EIAによる分析方法
の開発が望まれている。 RIAおよびEIAは標識剤を異にする以外は同じ
原理に基ずきその方法は大別すれば競争法とサン
ドイツチ法に分れるが、抗核抗体の分析には後者
の方法が適している。またこれらの方法におい
て、抗核抗体反応により生成した結合物を反応系
より分離することを容易にするため試薬として抗
原又は抗体を固担体に結合させた固相試薬を用い
る固相法が操作の簡便さの点で勝れている。本発
明者はかかる見地より固相試薬を用いるサンドイ
ツチ法による抗核抗体の測定について研究し本発
明に到達した。 即ち本発明はヒト血清中の抗核抗体をエンザイ
ムイムノアツセイ（EIA）により測定する方法に
おいて、測定対象である抗核抗体の産生を惹起す
る抗原をプラスチツク担体に接触させついで蒸発
乾固することにより結合せしめた不溶化抗原に測
定対象である抗核抗体を反応させ、ついで該抗原
には特異反応をせず測定対象である抗核抗体と特
異反応をする第二の抗体又はプロテインＡに酵素
を結合せしめた標識試薬を反応させ、反応した標
識試薬量により抗核抗体を測定する方法に関す
る。 さらに詳細に説明すれば、本発明においては抗
ポリADP−リボース抗体、抗二本鎖DNA抗体な
どの抗核抗体のEIAによる測定において、測定対
象である抗核抗体と免疫反応すべき相手方試薬と
して該抗核抗体産生を惹起するポリADP−リボ
ース、DNAなどの抗原をポリ−Ｌ−リジン処理
したポリスチレンなどのプラスチツク担体に接触
させついで蒸発乾固することにより結合せしめた
不溶化抗原をその試薬とし、さらに通常のサンド
イツチ法で採用される該抗原を酵素で標識した標
識抗原に代え、該抗原とは特異反応をせず測定対
象である抗核抗体とは特異反応をする第二の抗体
又はプロテインＡを酵素で標識した試薬を標識試
薬として使用する。 なおプロテインＡとは黄色ブドウ球菌細胞由来
の分子量42000のタンパク質である。 ポリADP−リボースなどの抗原は価なもので
あるためその効果的な使用が好ましい。プラスチ
ツクは固相担体として特に結合剤を用いなくても
抗原と結合る能力があり、本発明者は既に動物諸
器内のポリADP−リボースの定量を行うための
方法を生化学、第53巻、第８号、昭和56年８月25
日発行、第658頁に発表したが、その中でng以下
のポリADP−リボースを直接定量できるEIA法
開発の際、検量線作成のため0.1−1ngのポリ
ADP−リボースをポリＬ−リジンを介してマイ
クロプレートに付着させた。しかし、本発明の抗
核抗体、特に抗ポリADP−リボース抗体の測定
のためには、より多量の、即ち５−1000ng好ま
しくはできるだけ節約した量の、20−500ngのポ
リADP−リボースの一層の効率の良いマイクロ
プレートへの結合方法が望まれる。そこで本発明
者は鋭意研究の結果実施例１により詳述するよう
にプラスチツク表面をポリＬ−リジンで前処理し
た後抗原溶液と接触させ、更にこれを従来行われ
たことのない蒸発乾固によりプラスチツク表面に
抗原を結合させる方法を用いてより一層の強力な
抗原の結合というその目的を達成することができ
た。この方法により製造した不溶化抗原は測定の
妨害となる非特異反応が少なく良好な測定結果が
得られる。非特異反応を防止するためには通常牛
血清アルブミンを用い後処理を行なうが本発明の
不溶化抗原においては通常使用される１〜２％の
濃度に比して0.005〜0.1％程度の極めて低い濃度
の牛血清アルブミン処理で非特異反応を防止する
ことができる。 本発明の不溶化抗原に用いる固相担体として
は、ポリスチレン等のポリビニル系樹脂、ポリア
ミド、ポリオレフイン、ポリエーテル、ポリエス
テル、ポリカーボネート、ポリウレタンなど各種
のプラスチツクを用い得る。担体の形状としては
ビーズ、ロツド、チユーブなど任意の形状のもの
を用い得る。近時、測定の微量化を図る目的でマ
イクロタイトレーシヨンプレートが良く用いられ
るが本発明においても好適なものである。実施例
１で示すように300μl／穴の容量のマイクロタイ
トレーシヨンプレートを使用し１測定当り僅かに
100ng（2μg／mlの溶液50μl）のポリADP−リボー
スの使用で測定が可能である。 通常のサンドイツチ法では標識試薬として不溶
化抗原に使用する抗原に標識剤を結合したものを
用いるが、本発明においては、ポリADP−リボ
ースなどの抗原に代えて測定対象である抗核抗体
とは特異的に反応するが該抗原とは特異反応を示
さない物質に酵素を結合させたものを標識試薬と
して用いる。このような物質としては、抗免疫グ
ロブリン抗体などの第二の抗体やプロテインＡな
どを用いることができる。 本発明の標識試薬は高価な抗原を使用しないの
で経済的であるとともに標識剤である酵素の試薬
中の結合量が多く極めて高い活性を示し感度を向
上させることができる利点を有する。酵素として
は一般にEIAで使用されるものより選定して差支
えないが仔牛小腸から得たアルカリフオスフアタ
ーゼが活性が高く酵素基質との反応が迅速であり
酵素反応時間を10分間にまで短縮することができ
極めて好適である。本発明の標識試薬は第二の抗
体又はプロテインＡを使用するため検体中にある
測定対象以外の抗体とも結合する可能性がある。
そのため不溶化抗原に非特異反応があり目的外の
抗体が結合する場合は測定が妨害される。しかし
前述のように本発明の不溶化抗原は非特異反応が
少なく、これを組み合わせて使用することにより
良好な測定を行なうことができる。 本発明の測定試薬を使用する抗核抗体の測定に
よりSLE等の迅速な診断が可能であるのみなら
ず、例えばリンパ系細胞の培養により抗体を生産
する過程において、培養液を濃縮することなく容
易に抗体を測定することも可能であり極めて有益
である。前記のように、本発明者は先に、動物諸
臓器内のポリADP−リボースを微量測定する方
法、ELISAを開示した。しかしこの方法では測
定対象の動物諸臓器内のポリADP−リボース濃
度を直接測定すること、即ち臓器抽出液をそのま
まEIAの系にかけ、測定しようとしても妨害物質
のため、測定は不可能である。そこで種々の処理
を行い、ポリADP−リボース画分を単離するこ
とによりはじめて、諸臓器が含有するポリADP
−リボースの量を測定できるのであるが、このこ
とについては何も言及していない。またヒト血清
中のポリADP−リボースは自然抗体と複合体等
を形成していることなどにより、ヒト血清中のポ
リADP−リボース含量を直接測定することはで
きない。ところが本発明においては、ポリADP
−リボース抗原を測定する場合と異なり、動物、
特にヒト血清中の抗核抗体、特に抗ポリADP−
リボース抗体を、直接、何の処理過程をはさむこ
となく測定する方法を開示する点で、測定対象の
違いだけでなく、本発明者の先の記載と大いに異
なる。先の記載は、抗原を測定する際、固相法を
用いる点で、本発明と共通であるが、反応系には
予め実験的に調製された、たとえば特異性の高い
Ig型のモノクローナル抗体で当該抗原以外の抗原
とは全く反応しないような抗体、あるいはポリク
ロ−ナル抗体でもプラスチツク担体に非特異的に
付着しないようにした抗体を用いるのが一般であ
る。しかるに本発の目的のヒト血清中、特に患者
血清中、なかんずく膠原病等患者血清中の抗核抗
体を測定する系においては、膠原病等患者の血清
が対象である目的の抗体の測定を妨害する多量の
他の免疫グロブリンや免疫複合体を含有し、それ
らが固相プレートへの非特異的吸着をきたすた
め、抗核抗体特異的に測定が妨害されるのが一般
である。ところが本発明においては、これらの妨
害があるにもかかわらず、測定対象の当該抗原に
対する特異的抗体とのみ特異反応をする第２の抗
体またはプロテインＡと酵素とが結合した標識試
薬を用いるために、測定対象の抗核抗体を特異的
に測定することが達成された。 また既に発表した本発明者のポリADP−リボ
ースの如き抗原の定量には、実験的に産生した特
異性が充分ある抗体を用いるので、プロテインＡ
−酵素結合標識試薬を用いるまでもなく、単なる
抗IgG−酵素結合標識試薬を用いるだけで充分な
結果を得ることができる。一方本発明において
は、抗核抗体の産生を惹起する抗原とは特異反応
をせず測定対象である抗核抗体と特異反応をする
第２の抗体又はプロテインＡと酵素が結合した標
識試薬を用いる。 そして、プロテインＡと酵素が結合した標識試
薬を用いる場合、一般的に固相支持体に対する抗
体の非特異的吸着をブロツクするため牛胎児血清
のような高価なあるは高濃度の牛血清アルブミン
のようなブロツカーが通常使われているのに対
し、本発明においては前記のような低濃度の牛血
清アルブミンや脱脂粉乳の如き安価なブロツカー
を用いるだけで充分であるという点が特徴的であ
る。以下実施例及び試験例により本発明をさらに
詳細に説明するが、本発明は例に示した抗ポリ
ADP−リボース抗体及び抗二本鎖DNA抗体に限
定されるものでなく孔ヒストン抗体、抗Sm抗体、
抗RNP抗体などの他の種類の抗核抗体に関して
もこれを包含する。 製造例 １ 不溶化ポリADP−リボース（不溶化抗原）の
製造 (i) 固相担体の前処理 １穴あたり300μlの容量を有する96穴のプラ
スチツク製のマイクロタイトレーシヨンプレー
ト（Dynatech社、PolyvinylplateU型）を固相
担体として用いた。強陽電荷電のポリＬ−リジ
ン（分子量：４×105、シグマ社）を蒸留水に
溶解し濃度50μg／mlに調製した液を各穴100μl
ずつ加え室温で１時間放置した後トリスー食塩
緩衝液（25mMトリ、140mM食塩、PH7.4以下
TBSと略称する）を用い４回洗浄した。 (ii) ポリADP−リボースの結合 金井らの方法（Kanai，Y.et al，J.
Biochem.，88，917〜920，1980）により製造
したポリADP−リボースをTBSを用い2μg／
mlとなるよう濃度を調整した溶液を(i)で得たマ
イクロタイトレーシヨンプレートの各穴に50μl
ずつ加え37℃で一を要して蒸発乾固させた後
TBSで４回洗浄した。 (iii) 後処理 (ii)で得たプレートの抗原で満たされていない
表面を遮閉する目的で0.01％の牛血清アルブミ
ンを添加したTBSを各穴300μlずつ加え１時間
放置後TBSで３回洗浄し不溶化ポリADP−リ
ボース（不溶化抗原）を得た。このものは加湿
下４℃で１ケ月は安定である。 製造例 ２ 不溶化二本鎖DNA（不溶化抗原）の製造 市販の仔牛胸線DNAをマーマーの方法
（Marmur，J.Mol.Biol.，３，208，1961）に従つ
て除蛋白質精製した後、ストラー・パパリアンの
方法（Stollar，B.D.and Papalian，M.，J.Clin.
Invest.，66，210〜219，1980）に従つてS1−ヌ
クレアーゼ処理し、一本鎖DNAの部分を完全切
断する。次いでこのDNを金井らの方法（Kanai，
Y.et al，J.Biochem.，88，917〜920，1980に従
つてハイドロキシアパタイトカラムにかけ0.2M
のリン酸緩衝液（PH6.8）で溶出される二本鎖
DNAのみを採取した。この二本鎖DNAをさらに
S1−ヌクレアーゼ処理し、この段階ではもはや
S1−ヌクレアーゼで切断されないことを260nm
における紫外吸収で確かめた。その後、またハイ
ドロキシアパタイトカラムにかけ上記の方法で溶
出させた二本鎖DNAを採取した。 このようにして得た二本鎖DNAをポリADP−
リボースの代りに用いその他は製造例１と同様の
方法に従い、二本鎖DNAをマイクロタイトレー
シヨンプレートに結合せしめ不溶化二本鎖DNA
（不溶化抗原）を得た。 製造例 ３ アルカリフオスフアターゼ・プロテインＡ結合
物（標識試薬）の製造 仔牛小腸由来のアルカリフオスフアターゼ（シ
グマ社製品、Type）1.9mgとプロテインＡ（フ
アルマシア社製品）0.75mgを食塩加リン酸緩衝液
（リン酸10mM、食塩140mM，PH7.4、以下PBS
と略記する）１mlに溶解した溶液をPBSに対し
て透析した後、グルタルアルデヒド（シグマ社
製；濃度25％）を終濃度0.2％となるように加え
室温で２時間かきまぜ結合を行つた後、ゲルロ過
装置（Uetrogel AcA 34充填1.1×54cm）にかけ
アルカリフオスフアターゼとプロテインＡとの結
合物を分離し蛋白質として220μg／mlの標識試薬
10mlを得た。 この結合物の酵素比活性は蛋白色１mgあたり
200U（基質2.5mMパラニトロフエニルフオスフエ
ート、PH9.5，37℃の測定条件下にて）であり、
酵素単独のそれが900〜1100Uであることから極
めて活性の高い標識試薬である。このものは牛血
清アルブミン0.5％及び窒化ソーダ0.02％の存在
下４℃で４ケ月以上安定であつた。 製造例 ４ アルカリフオスフアターゼ・抗マウス免疫グロ
ブリン抗体結合物（標識試薬）の製造 抗マウス免疫グロブリン（IgG＋IgM）抗体
（Tufts大学、Stollar教授より供与された）をプ
ロテインＡの代りに用い、製造例３と同様の方法
に従い、アルカリフオスフアターゼ・抗マウス免
疫グロブリン抗体結合物（標識試薬）を得た。
（収量10ml、蛋白質として140μg／ml）。 参考製造例 対照プレート 製造例１の(ii)におけるポリADP−リボースの
TBS溶液の代りにTBSのみを用い、その他は製
造例１と同様の方法によりポリADP−リボース
（抗原）を結合しないマイクロタイトレーシヨン
プレートを得、対照プレートとして用いた。 実施例 １ 抗ポリADP−リボース抗体の測定SLE患者お
よび正常人の各血清中の抗ポリADP−リボー
ス抗体を測定した。 (i) 第１反応（不溶化抗原と抗体との反応） 製造例１の方法により製造した不溶化ポリ
ADP−リボース（不溶化抗原）の各穴に0.01
％の牛血アルブミンを加えたTBSで20倍に希
釈した非動化血清即ち加熱により補体活性をこ
わした血清100μlを加え、微振とう下、室温に
て60分間インキユベートした。反応液を除去し
た後、プレートをTBSで４回洗浄した。 (ii) 第２反応（標識試薬との反応） 製造例３の方法で得たアルカリフオスフター
ゼ・プロテインＡ結合物（標識試薬）をTBS
で100倍に希釈した液を第１反応を終つたプレ
ートの各穴に100μl加え、室温で60分間インキ
ユベートした。反応液を除去し、プレートを
TBSで４回洗浄した。 (iii) 第３反応（酵素基質反応）及び測定 2.5mMのパラニトロフエニルフオスフエー
トを２ｍＭのMgCl2を添加した50mMカーボネ
ート緩衝液（PH9.5）10mlに溶解した液を基質
とし、第２反応を終つたプレートの各穴に
100μl加え、37℃で10分間反応させた後、この
溶液100μlを取り出し0.1Nのカセイソーダ水溶
液400μlに加えて酵素反応を止めた。得られた
各穴の反応液500μlのうちそれぞれ5μlの410nm
における紫外吸収を測定した。 非特異反応に基ずく酵素活性を補正するため、
参考製造例の方法で製造した対照プレートを不溶
化抗原の代りに用いその他は前記と同様にして第
１、第２及び第３反応を行い紫外吸収を測定し
た。 各血清について不溶化抗原を用いたときの紫外
吸収より対照プレートを用いたときの紫外吸収を
減じたものを真の抗体活性とし、これを表１に示
す。 SLE患者と正常人との測定値の間には有意差検
定であるｔ−検定（スチユーデントのｔ−検定）
で、0.001＜Ｐ＜0.01の有意差が認められた。 対照プレートを用いたときの紫外吸収を表２に
示す。SLE患者と正常人との間には差はなく、ま
た非特異反応も極めて少ないことが表１の正常人
の測定値との比較より明らかである。 これらのことから本発明の方法によれば抗
ADP−リボース抗体の測定が可能であること、
従つてSLE患者等の診断が可能であることがわか
る。 実施例 ２ 抗二本鎖DNA抗体の測定 SLE患者及び正常人の各血清中の抗二本鎖
DNA抗体の測定を行なつた。 実施例１の不溶化ポリADP−リボースに代え
て製造例２の方法により製造した不溶化二本鎖
DNAを不溶化抗原に用い、その他は実施例１と
同様の測定方法により血清中の抗二本鎖DNA抗
体を測定した。 測定結果を表３に示す。 SLE患者と正常人との測定値の間にはｔ−検定
で、0.001＜Ｐ＜0.01の有意差が認められ、抗二
本鎖DNA抗体の測定が可能であることが分つた。 参考例 ハイブリドーマの産生する抗ポリADP−リボ
ースの測定 マウス骨髄腫細胞SP2／Ｏ−Ag−14とポリ
ADP−リボースで免疫したC3H／Heマウス脾細
胞をアンドレジユルフスキーらの方法
（Andrzejervski，C.Jr.et al，J.Immunol.，124，
1499〜1502，1980）によつて細胞融合を行つた。
得られたハイブリドーマ11株について、その培養
上清をとり濃縮せずに抗ポリADP−リボース抗
体を、標識試薬として製造例４の標識試薬を用
い、その他は実施例１と同様の方法により測定し
た。 測定結果を表４にす。表４に示すようにハイブ
リドーマの産生する抗ポリADP−リボース抗体
を培養上清を濃縮することなく直接に測定するこ
とができた。
に関する。 抗核抗体、なかでも抗二本鎖DNA抗体は代表
的自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス
（以下SLEという）の発症と密接な関連性が予測
されている。また抗二本鎖DNA抗体の他に抗ポ
リADP−リボース抗体の存在が明らかにされ
SLE患者などに高頻度に検出されることが実証さ
れた（Y.Kanai et al：Nature，269，175−177，
1977）。ポリADP−リボースはDNA合成の調節、
細胞の分化及びDNAの修復と密接に関連してい
ることが知られている。ポリADP−リボースに
対する自然抗体がSLEに高頻度で出現することは
抗ポリADP−リボース抗体がSLEの病態及びそ
の修飾に密接に関係していることを示唆する。し
たがつてこれら抗核抗体の測定方法が開発されて
いる。 抗核抗体の測定方法としてはその感度および定
量性の点よりラジオイムノアツセイ（以下RIAと
いう）が多く用いられている。しかしRIAによる
測定は放射性物質を取扱うため法的に許可された
施設以外ではこれを行なうことができずその普及
を妨げている。 このように使用に制約のあるRIAに代えて、標
識剤としてラジオアイソトープの代りに酵素を用
いるエンザイムイムノアツセイ（以下EIAとい
う）が開発され各分野で普及しつつある。しかし
抗核抗体の測定、特に抗ポリADP−リボース抗
体の測定はその事例がなく、EIAによる分析方法
の開発が望まれている。 RIAおよびEIAは標識剤を異にする以外は同じ
原理に基ずきその方法は大別すれば競争法とサン
ドイツチ法に分れるが、抗核抗体の分析には後者
の方法が適している。またこれらの方法におい
て、抗核抗体反応により生成した結合物を反応系
より分離することを容易にするため試薬として抗
原又は抗体を固担体に結合させた固相試薬を用い
る固相法が操作の簡便さの点で勝れている。本発
明者はかかる見地より固相試薬を用いるサンドイ
ツチ法による抗核抗体の測定について研究し本発
明に到達した。 即ち本発明はヒト血清中の抗核抗体をエンザイ
ムイムノアツセイ（EIA）により測定する方法に
おいて、測定対象である抗核抗体の産生を惹起す
る抗原をプラスチツク担体に接触させついで蒸発
乾固することにより結合せしめた不溶化抗原に測
定対象である抗核抗体を反応させ、ついで該抗原
には特異反応をせず測定対象である抗核抗体と特
異反応をする第二の抗体又はプロテインＡに酵素
を結合せしめた標識試薬を反応させ、反応した標
識試薬量により抗核抗体を測定する方法に関す
る。 さらに詳細に説明すれば、本発明においては抗
ポリADP−リボース抗体、抗二本鎖DNA抗体な
どの抗核抗体のEIAによる測定において、測定対
象である抗核抗体と免疫反応すべき相手方試薬と
して該抗核抗体産生を惹起するポリADP−リボ
ース、DNAなどの抗原をポリ−Ｌ−リジン処理
したポリスチレンなどのプラスチツク担体に接触
させついで蒸発乾固することにより結合せしめた
不溶化抗原をその試薬とし、さらに通常のサンド
イツチ法で採用される該抗原を酵素で標識した標
識抗原に代え、該抗原とは特異反応をせず測定対
象である抗核抗体とは特異反応をする第二の抗体
又はプロテインＡを酵素で標識した試薬を標識試
薬として使用する。 なおプロテインＡとは黄色ブドウ球菌細胞由来
の分子量42000のタンパク質である。 ポリADP−リボースなどの抗原は価なもので
あるためその効果的な使用が好ましい。プラスチ
ツクは固相担体として特に結合剤を用いなくても
抗原と結合る能力があり、本発明者は既に動物諸
器内のポリADP−リボースの定量を行うための
方法を生化学、第53巻、第８号、昭和56年８月25
日発行、第658頁に発表したが、その中でng以下
のポリADP−リボースを直接定量できるEIA法
開発の際、検量線作成のため0.1−1ngのポリ
ADP−リボースをポリＬ−リジンを介してマイ
クロプレートに付着させた。しかし、本発明の抗
核抗体、特に抗ポリADP−リボース抗体の測定
のためには、より多量の、即ち５−1000ng好ま
しくはできるだけ節約した量の、20−500ngのポ
リADP−リボースの一層の効率の良いマイクロ
プレートへの結合方法が望まれる。そこで本発明
者は鋭意研究の結果実施例１により詳述するよう
にプラスチツク表面をポリＬ−リジンで前処理し
た後抗原溶液と接触させ、更にこれを従来行われ
たことのない蒸発乾固によりプラスチツク表面に
抗原を結合させる方法を用いてより一層の強力な
抗原の結合というその目的を達成することができ
た。この方法により製造した不溶化抗原は測定の
妨害となる非特異反応が少なく良好な測定結果が
得られる。非特異反応を防止するためには通常牛
血清アルブミンを用い後処理を行なうが本発明の
不溶化抗原においては通常使用される１〜２％の
濃度に比して0.005〜0.1％程度の極めて低い濃度
の牛血清アルブミン処理で非特異反応を防止する
ことができる。 本発明の不溶化抗原に用いる固相担体として
は、ポリスチレン等のポリビニル系樹脂、ポリア
ミド、ポリオレフイン、ポリエーテル、ポリエス
テル、ポリカーボネート、ポリウレタンなど各種
のプラスチツクを用い得る。担体の形状としては
ビーズ、ロツド、チユーブなど任意の形状のもの
を用い得る。近時、測定の微量化を図る目的でマ
イクロタイトレーシヨンプレートが良く用いられ
るが本発明においても好適なものである。実施例
１で示すように300μl／穴の容量のマイクロタイ
トレーシヨンプレートを使用し１測定当り僅かに
100ng（2μg／mlの溶液50μl）のポリADP−リボー
スの使用で測定が可能である。 通常のサンドイツチ法では標識試薬として不溶
化抗原に使用する抗原に標識剤を結合したものを
用いるが、本発明においては、ポリADP−リボ
ースなどの抗原に代えて測定対象である抗核抗体
とは特異的に反応するが該抗原とは特異反応を示
さない物質に酵素を結合させたものを標識試薬と
して用いる。このような物質としては、抗免疫グ
ロブリン抗体などの第二の抗体やプロテインＡな
どを用いることができる。 本発明の標識試薬は高価な抗原を使用しないの
で経済的であるとともに標識剤である酵素の試薬
中の結合量が多く極めて高い活性を示し感度を向
上させることができる利点を有する。酵素として
は一般にEIAで使用されるものより選定して差支
えないが仔牛小腸から得たアルカリフオスフアタ
ーゼが活性が高く酵素基質との反応が迅速であり
酵素反応時間を10分間にまで短縮することができ
極めて好適である。本発明の標識試薬は第二の抗
体又はプロテインＡを使用するため検体中にある
測定対象以外の抗体とも結合する可能性がある。
そのため不溶化抗原に非特異反応があり目的外の
抗体が結合する場合は測定が妨害される。しかし
前述のように本発明の不溶化抗原は非特異反応が
少なく、これを組み合わせて使用することにより
良好な測定を行なうことができる。 本発明の測定試薬を使用する抗核抗体の測定に
よりSLE等の迅速な診断が可能であるのみなら
ず、例えばリンパ系細胞の培養により抗体を生産
する過程において、培養液を濃縮することなく容
易に抗体を測定することも可能であり極めて有益
である。前記のように、本発明者は先に、動物諸
臓器内のポリADP−リボースを微量測定する方
法、ELISAを開示した。しかしこの方法では測
定対象の動物諸臓器内のポリADP−リボース濃
度を直接測定すること、即ち臓器抽出液をそのま
まEIAの系にかけ、測定しようとしても妨害物質
のため、測定は不可能である。そこで種々の処理
を行い、ポリADP−リボース画分を単離するこ
とによりはじめて、諸臓器が含有するポリADP
−リボースの量を測定できるのであるが、このこ
とについては何も言及していない。またヒト血清
中のポリADP−リボースは自然抗体と複合体等
を形成していることなどにより、ヒト血清中のポ
リADP−リボース含量を直接測定することはで
きない。ところが本発明においては、ポリADP
−リボース抗原を測定する場合と異なり、動物、
特にヒト血清中の抗核抗体、特に抗ポリADP−
リボース抗体を、直接、何の処理過程をはさむこ
となく測定する方法を開示する点で、測定対象の
違いだけでなく、本発明者の先の記載と大いに異
なる。先の記載は、抗原を測定する際、固相法を
用いる点で、本発明と共通であるが、反応系には
予め実験的に調製された、たとえば特異性の高い
Ig型のモノクローナル抗体で当該抗原以外の抗原
とは全く反応しないような抗体、あるいはポリク
ロ−ナル抗体でもプラスチツク担体に非特異的に
付着しないようにした抗体を用いるのが一般であ
る。しかるに本発の目的のヒト血清中、特に患者
血清中、なかんずく膠原病等患者血清中の抗核抗
体を測定する系においては、膠原病等患者の血清
が対象である目的の抗体の測定を妨害する多量の
他の免疫グロブリンや免疫複合体を含有し、それ
らが固相プレートへの非特異的吸着をきたすた
め、抗核抗体特異的に測定が妨害されるのが一般
である。ところが本発明においては、これらの妨
害があるにもかかわらず、測定対象の当該抗原に
対する特異的抗体とのみ特異反応をする第２の抗
体またはプロテインＡと酵素とが結合した標識試
薬を用いるために、測定対象の抗核抗体を特異的
に測定することが達成された。 また既に発表した本発明者のポリADP−リボ
ースの如き抗原の定量には、実験的に産生した特
異性が充分ある抗体を用いるので、プロテインＡ
−酵素結合標識試薬を用いるまでもなく、単なる
抗IgG−酵素結合標識試薬を用いるだけで充分な
結果を得ることができる。一方本発明において
は、抗核抗体の産生を惹起する抗原とは特異反応
をせず測定対象である抗核抗体と特異反応をする
第２の抗体又はプロテインＡと酵素が結合した標
識試薬を用いる。 そして、プロテインＡと酵素が結合した標識試
薬を用いる場合、一般的に固相支持体に対する抗
体の非特異的吸着をブロツクするため牛胎児血清
のような高価なあるは高濃度の牛血清アルブミン
のようなブロツカーが通常使われているのに対
し、本発明においては前記のような低濃度の牛血
清アルブミンや脱脂粉乳の如き安価なブロツカー
を用いるだけで充分であるという点が特徴的であ
る。以下実施例及び試験例により本発明をさらに
詳細に説明するが、本発明は例に示した抗ポリ
ADP−リボース抗体及び抗二本鎖DNA抗体に限
定されるものでなく孔ヒストン抗体、抗Sm抗体、
抗RNP抗体などの他の種類の抗核抗体に関して
もこれを包含する。 製造例 １ 不溶化ポリADP−リボース（不溶化抗原）の
製造 (i) 固相担体の前処理 １穴あたり300μlの容量を有する96穴のプラ
スチツク製のマイクロタイトレーシヨンプレー
ト（Dynatech社、PolyvinylplateU型）を固相
担体として用いた。強陽電荷電のポリＬ−リジ
ン（分子量：４×105、シグマ社）を蒸留水に
溶解し濃度50μg／mlに調製した液を各穴100μl
ずつ加え室温で１時間放置した後トリスー食塩
緩衝液（25mMトリ、140mM食塩、PH7.4以下
TBSと略称する）を用い４回洗浄した。 (ii) ポリADP−リボースの結合 金井らの方法（Kanai，Y.et al，J.
Biochem.，88，917〜920，1980）により製造
したポリADP−リボースをTBSを用い2μg／
mlとなるよう濃度を調整した溶液を(i)で得たマ
イクロタイトレーシヨンプレートの各穴に50μl
ずつ加え37℃で一を要して蒸発乾固させた後
TBSで４回洗浄した。 (iii) 後処理 (ii)で得たプレートの抗原で満たされていない
表面を遮閉する目的で0.01％の牛血清アルブミ
ンを添加したTBSを各穴300μlずつ加え１時間
放置後TBSで３回洗浄し不溶化ポリADP−リ
ボース（不溶化抗原）を得た。このものは加湿
下４℃で１ケ月は安定である。 製造例 ２ 不溶化二本鎖DNA（不溶化抗原）の製造 市販の仔牛胸線DNAをマーマーの方法
（Marmur，J.Mol.Biol.，３，208，1961）に従つ
て除蛋白質精製した後、ストラー・パパリアンの
方法（Stollar，B.D.and Papalian，M.，J.Clin.
Invest.，66，210〜219，1980）に従つてS1−ヌ
クレアーゼ処理し、一本鎖DNAの部分を完全切
断する。次いでこのDNを金井らの方法（Kanai，
Y.et al，J.Biochem.，88，917〜920，1980に従
つてハイドロキシアパタイトカラムにかけ0.2M
のリン酸緩衝液（PH6.8）で溶出される二本鎖
DNAのみを採取した。この二本鎖DNAをさらに
S1−ヌクレアーゼ処理し、この段階ではもはや
S1−ヌクレアーゼで切断されないことを260nm
における紫外吸収で確かめた。その後、またハイ
ドロキシアパタイトカラムにかけ上記の方法で溶
出させた二本鎖DNAを採取した。 このようにして得た二本鎖DNAをポリADP−
リボースの代りに用いその他は製造例１と同様の
方法に従い、二本鎖DNAをマイクロタイトレー
シヨンプレートに結合せしめ不溶化二本鎖DNA
（不溶化抗原）を得た。 製造例 ３ アルカリフオスフアターゼ・プロテインＡ結合
物（標識試薬）の製造 仔牛小腸由来のアルカリフオスフアターゼ（シ
グマ社製品、Type）1.9mgとプロテインＡ（フ
アルマシア社製品）0.75mgを食塩加リン酸緩衝液
（リン酸10mM、食塩140mM，PH7.4、以下PBS
と略記する）１mlに溶解した溶液をPBSに対し
て透析した後、グルタルアルデヒド（シグマ社
製；濃度25％）を終濃度0.2％となるように加え
室温で２時間かきまぜ結合を行つた後、ゲルロ過
装置（Uetrogel AcA 34充填1.1×54cm）にかけ
アルカリフオスフアターゼとプロテインＡとの結
合物を分離し蛋白質として220μg／mlの標識試薬
10mlを得た。 この結合物の酵素比活性は蛋白色１mgあたり
200U（基質2.5mMパラニトロフエニルフオスフエ
ート、PH9.5，37℃の測定条件下にて）であり、
酵素単独のそれが900〜1100Uであることから極
めて活性の高い標識試薬である。このものは牛血
清アルブミン0.5％及び窒化ソーダ0.02％の存在
下４℃で４ケ月以上安定であつた。 製造例 ４ アルカリフオスフアターゼ・抗マウス免疫グロ
ブリン抗体結合物（標識試薬）の製造 抗マウス免疫グロブリン（IgG＋IgM）抗体
（Tufts大学、Stollar教授より供与された）をプ
ロテインＡの代りに用い、製造例３と同様の方法
に従い、アルカリフオスフアターゼ・抗マウス免
疫グロブリン抗体結合物（標識試薬）を得た。
（収量10ml、蛋白質として140μg／ml）。 参考製造例 対照プレート 製造例１の(ii)におけるポリADP−リボースの
TBS溶液の代りにTBSのみを用い、その他は製
造例１と同様の方法によりポリADP−リボース
（抗原）を結合しないマイクロタイトレーシヨン
プレートを得、対照プレートとして用いた。 実施例 １ 抗ポリADP−リボース抗体の測定SLE患者お
よび正常人の各血清中の抗ポリADP−リボー
ス抗体を測定した。 (i) 第１反応（不溶化抗原と抗体との反応） 製造例１の方法により製造した不溶化ポリ
ADP−リボース（不溶化抗原）の各穴に0.01
％の牛血アルブミンを加えたTBSで20倍に希
釈した非動化血清即ち加熱により補体活性をこ
わした血清100μlを加え、微振とう下、室温に
て60分間インキユベートした。反応液を除去し
た後、プレートをTBSで４回洗浄した。 (ii) 第２反応（標識試薬との反応） 製造例３の方法で得たアルカリフオスフター
ゼ・プロテインＡ結合物（標識試薬）をTBS
で100倍に希釈した液を第１反応を終つたプレ
ートの各穴に100μl加え、室温で60分間インキ
ユベートした。反応液を除去し、プレートを
TBSで４回洗浄した。 (iii) 第３反応（酵素基質反応）及び測定 2.5mMのパラニトロフエニルフオスフエー
トを２ｍＭのMgCl2を添加した50mMカーボネ
ート緩衝液（PH9.5）10mlに溶解した液を基質
とし、第２反応を終つたプレートの各穴に
100μl加え、37℃で10分間反応させた後、この
溶液100μlを取り出し0.1Nのカセイソーダ水溶
液400μlに加えて酵素反応を止めた。得られた
各穴の反応液500μlのうちそれぞれ5μlの410nm
における紫外吸収を測定した。 非特異反応に基ずく酵素活性を補正するため、
参考製造例の方法で製造した対照プレートを不溶
化抗原の代りに用いその他は前記と同様にして第
１、第２及び第３反応を行い紫外吸収を測定し
た。 各血清について不溶化抗原を用いたときの紫外
吸収より対照プレートを用いたときの紫外吸収を
減じたものを真の抗体活性とし、これを表１に示
す。 SLE患者と正常人との測定値の間には有意差検
定であるｔ−検定（スチユーデントのｔ−検定）
で、0.001＜Ｐ＜0.01の有意差が認められた。 対照プレートを用いたときの紫外吸収を表２に
示す。SLE患者と正常人との間には差はなく、ま
た非特異反応も極めて少ないことが表１の正常人
の測定値との比較より明らかである。 これらのことから本発明の方法によれば抗
ADP−リボース抗体の測定が可能であること、
従つてSLE患者等の診断が可能であることがわか
る。 実施例 ２ 抗二本鎖DNA抗体の測定 SLE患者及び正常人の各血清中の抗二本鎖
DNA抗体の測定を行なつた。 実施例１の不溶化ポリADP−リボースに代え
て製造例２の方法により製造した不溶化二本鎖
DNAを不溶化抗原に用い、その他は実施例１と
同様の測定方法により血清中の抗二本鎖DNA抗
体を測定した。 測定結果を表３に示す。 SLE患者と正常人との測定値の間にはｔ−検定
で、0.001＜Ｐ＜0.01の有意差が認められ、抗二
本鎖DNA抗体の測定が可能であることが分つた。 参考例 ハイブリドーマの産生する抗ポリADP−リボ
ースの測定 マウス骨髄腫細胞SP2／Ｏ−Ag−14とポリ
ADP−リボースで免疫したC3H／Heマウス脾細
胞をアンドレジユルフスキーらの方法
（Andrzejervski，C.Jr.et al，J.Immunol.，124，
1499〜1502，1980）によつて細胞融合を行つた。
得られたハイブリドーマ11株について、その培養
上清をとり濃縮せずに抗ポリADP−リボース抗
体を、標識試薬として製造例４の標識試薬を用
い、その他は実施例１と同様の方法により測定し
た。 測定結果を表４にす。表４に示すようにハイブ
リドーマの産生する抗ポリADP−リボース抗体
を培養上清を濃縮することなく直接に測定するこ
とができた。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
Claims (1)
- １ ヒト血清中の抗核抗体をエンザイムイムノア
ツセイにより測定する方法において、測定対象で
ある抗核抗体の産生を惹起する抗原をポリーＬ−
リジン処理したプラスチツク担体に接触させ、つ
いで蒸発乾固することにより結合せしめた不溶化
抗原と前記抗核抗体とを反応させ、ついで該抗原
には特異反応をせず前記抗核抗体と特異反応をす
る第二の抗体又はプロテインＡに酵素を結合せし
めた標識試薬を反応させ、反応した標識試薬量に
より前記抗核抗体を測定する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15066881A JPS5856694A (ja) | 1981-09-25 | 1981-09-25 | 抗核抗体測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15066881A JPS5856694A (ja) | 1981-09-25 | 1981-09-25 | 抗核抗体測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5856694A JPS5856694A (ja) | 1983-04-04 |
| JPH0440662B2 true JPH0440662B2 (ja) | 1992-07-03 |
Family
ID=15501862
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15066881A Granted JPS5856694A (ja) | 1981-09-25 | 1981-09-25 | 抗核抗体測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5856694A (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU1070588A (en) * | 1987-01-30 | 1988-08-04 | Diagnostic Products Corporation | Measuring anti-dna antibodies |
| US4962023A (en) * | 1987-06-22 | 1990-10-09 | Louisiana State University, Agricultural And Mechanical College | Single incubation immuno sorbent assay method using particle labels to detect test antigen specific antibodies in presence of other antibodies |
| JPH03167473A (ja) * | 1989-11-08 | 1991-07-19 | Nippon Dpc Corp | 抗ｄｎａ抗体結合活性測定法および測定用キット |
| JP2649100B2 (ja) * | 1990-10-30 | 1997-09-03 | Nitsuhon Deii Pii Shii Corp | 標準曲線における抗原結合率と抗二本鎖ｄｎａ抗体価の比例関係を改善するためのｓｌｅ疾患の検知法及び検知用キット |
| US20070287166A1 (en) * | 2003-10-29 | 2007-12-13 | Eisai Co., Ltd | Diagnostic Method for Alzheimier's Disease |
| CN104007266B (zh) * | 2013-02-27 | 2016-04-20 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 含有6-n-甲基赖氨酸残基的抗原在制备辅助诊断系统性红斑狼疮试剂中的应用 |
-
1981
- 1981-09-25 JP JP15066881A patent/JPS5856694A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5856694A (ja) | 1983-04-04 |
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