JPH0440896A - 新規な組み換え体ｄｎａ及びシュークロース・ホスホリラーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 そしてシュークローズ・ホスホリラーゼは、無機リンの
定量に用いられる等極めて有用なものである。

従来、シュークローズ・ホスホリラーゼは、例えば、ロ
イコノストック属又はシュードモナス属の細菌を培養し
、菌体よりシュークローズ・ホスホリラーゼを分離、精
製することにより製造されており〔アドバ・アブル・マ
イクロパイオル（Ａｄｖ。

ＡｐｐＬ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）第３２巻、第１６
３〜２０１頁（１９８７年）〕、また、近年虫歯菌の一
種であるストレブトコッカス属の細菌がシュークローズ
・ホスホリラーゼを産生ずることも確認されている〔イ
ンフエクション・アンド・イミユニティ（Ｉｎｆｅｃｔ
ｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ−ｉｔｙ）、第５６巻、第
２７６３〜２７６５頁（１９８８年）〕。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしなから、これらの細菌を用いて、シュークローズ
・ホスホリラーゼを製造する場合には、該酵素の収率が
著しく低い等の問題点があった。

そこで本発明者等は、上記問題点を解決すべく鋭意研究
を行った結果、シュークローズ・ホスホリラーゼ遺伝子
を含有するＤＮＡを調製し、これをベクターＤＮＡに挿
入し、該組み換え体ＤＮＡにより形質転換された微生物
を用いることによりシュークローズ・ホスホリラーゼを
高収率で生産できることを見い出し、本発明を完成する
に至ったものである。

〔課題を解決するための手段〕

すなわち、本発明は、下記の制限酵素地図を存し、かつ
分子量の１８００ｋｄを有するシュークローズ・ホスホ
リラーゼ遺伝子ＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した新規
な組み換え体ＤＮＡにある。

（式中、ＥはＥｃｏＲＩ、　ＨはＨｉｎｄＩ［［、Ｐは
ＰｓｔｌＳＴはＥｃｏＴ１４１を示す） 更に本発明は、上記１記載の組み換え体ＤＮＡを含み、
シュークロース・ボスホリラーゼ生産能を有する微生物
を培地に培養し、培養物よりシュークローズ・ホスホリ
ラーゼを採取することを特徴とするシュークローズ・ホ
スホリラーゼの製造法にある。

先ず、シュークローズ・ホスホリラーゼ遺伝子を含有す
るＤＮＡの調製について述べる。

シュークローズ・ホスホリラーゼ遺伝子を含有するＤＮ
Ａのドナーとしては、いかなるものでもよく、例えば、
乳酸菌ロイコトスドック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃ
ｏｎｏｓｔｏｃ　　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴ
ＣＣ１２２９１等が挙げられ、この微生物をメソッズ・
イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ）ｖｏｌ、　１第２２７〜第２２８頁
（１９５５）記載の方法と同様にして培養し、培養菌体
を得る。

この菌体より、例えばカレント・プロトコールズ・イン
・モレキュラー・バイオロジー（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ）　ｕｎｉｔ　２．４．３、（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｌ
ｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、　１９８７）記載の方
法により、培養物を集菌し、ＳＤＳ存在下でブロティナ
ーゼに処理を行い、その後ヘキサデシルメチルアンモニ
ウムブロマイド、クロロホルム処理後エタノール沈澱を
行って染色体ＤＮＡを得ることかできる。

次いで、この染色体ＤＮＡに、突出末端を生じさせる制
限酵素、例えばＥｃｏＲＩ（ベーリンガー・マンハイム
・山之内社製）を、温度３０’Ｃ以上、好ましくは３７
°Ｃで１〜２時間作用させて消化し、染色体ＤＮＡ断片
混合物を得る。この染色体ＤＮＡ断片混合物の中から、
精製蛋白質のＮ末端アミノ酸配列により推測されるＤＮ
Ａ混合配列を基にしたＤＮＡプローブを用いて、コロニ
ー・ハイフリダイゼーション法〔モレキュラー・クロー
ニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第３
７２〜３２８．　：７−ルド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２年）〕により、目的
のシュークローズ・ホスホリラーゼ遺伝子を得ることが
できる。

一方、本発明において用いることのてきるベクターＤＮ
Ａはいかなるものでもよく、例えば、プラスミドベクタ
ーＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ等が挙げられるか
、具体的には例えばプラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ
　（宝酒造社製）等が好ましい。

上記ベクターＤＮＡに突出末端を生じさせる制限酵素、
例えばＥｃｏＲ［（ベーリンガー・マンハイム・山之内
社製）を温度３０°Ｃ以上好ましくは３７°Ｃで１時間
以上、好ましくは１〜３時間作用させて消化し、切断さ
れたベクターＤＮＡを得る。

次いで、上記のようにして得た、乳酸菌Ｌｅｕｃｏ−ｎ
ｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　ＡＴＣＣ１
２２９１由来で、シュークローズ・ホスホリラーゼをコ
ードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片混合物及び切断さ
れたベクターＤＮＡを混合したものに、例えば、大腸菌
ＤＮＡリガーゼ（二ニー・イングランド・バイオ・ラプ
ス社製）又はＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マン
ハイム山之内社製）等、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼ
を温度４〜３７°Ｃ１好ましくは４〜１６℃で１時間以
上、好ましくは６〜２４時間作用させて組み換え体ＤＮ
Ａを得る。

この組み換え体ＤＮＡを用いて適当な宿主微生物、例え
ば大腸菌に−１２、好ましくは大腸菌ＪＭ１０１（ＡＴ
ＣＣ３３８７６）　、大腸菌ＨＢ　１０１（ＡＴＣＣ３
３６９４）、大腸菌Ｄ　Ｈ１（ＡＴＣＣ３３８４９）等
を形質転換して夫々の菌株を得る。この形質転換は、常
法により行えば良く例えばデイ−・エム・モーリソン（
Ｄ、　Ｍ、　Ｍａｒ−ｒｉｓｏｎ）の方法〔メンズ・イ
ン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｘ
ｙｍｏｌｏｇｙ）　、第６８巻、第３２１〜３２６頁（
１９７９年）〕等により行うことができる。

次いて、上記形質転換に供した微生物よりシュークロー
ズ・ホスホリラーゼ生産能を有する菌株をスクリーニン
グすることにより、シュークローズ・ホスホリラーゼを
コードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに
挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、シュークローズ・ホ
スホリラーゼ生産能を有する微生物を得ることかできる
。

このようにして得られた微生物より純化された新規な組
み換え体ＤＮＡを得るには、例えば、エイッチ・シー・
バーンボイム（Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）等の方法〔
ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ）　、第７巻、第１５１３〜
１５２３頁（１９７９年〕等により培養菌体を集菌し、
リゾチーム溶菌後、アルカリ処理し、中和してエタノー
ル沈澱処理して得ることができる。　上記のようにして
得られたシュークローズ・ホスホリラーゼをコードする
遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組
み換え体ＤＮＡを含みシュークローズ・ホスホリラーゼ
生産能を有する微生物、特にエッシェリヒア属に属する
菌株を用いてシュークローズ・ホスホリラーゼを生産す
るには、下記のように培養し、培養物を得る。

すなわち、上記微生物を培養するには、通常の固体培養
法で培養してもよいが、なるべく液体培養法を採用して
培養するのが好ましい。

また、上記微生物を培養する培地としては、例えば酵母
エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスイープリカーあ
るいは大豆もしくは小麦麹の浸出液等の１種以上の窒素
源に、例えばリン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム
、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウ
ム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の
無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料
、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。

なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調整するのが適当で
ある。また培養は３０〜４２°Ｃ１好ましくは３７°Ｃ
前後で４〜２４時間、好ましくは６〜２４時間、通気攪
拌深部培養、振どう培養、静置培養により実施するのか
好ましい。

培養終了後、該培養物よりシュークローズ・ホスホリラ
ーゼを採取し、分離精製するにはメンズ・イン・エンザ
イモロジー（（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ。

１ｏｇｙ）第１巻、第２２５〜２２９頁（１９５５年）
〕記載の方法即ち、培養物を集菌及び溶菌処理し、プロ
タミン処理して除核酸を行い、硫安分画後ゲルろ過及び
イオン交換クロマトグラム処理を行うことにより精製可
能である。

上記精製手段により得られる精製シュークローズ・ホス
ホリラーゼの理化学的性質は、〔アドバ・アブルーｖイ
クロバイオル（Ａｄｖ、　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ）、第３２巻、第１６３〜２０１頁（１９８７年）
〕記載のシュークローズ・ホスホリラーゼの理化学的性
質と全く同様である。

〔発明の効果〕

本発明の新規な組み換え体ＤＮＡにより形質転換された
微生物のシュークローズ・ホスホリラーゼの生産能は極
めて高く、該微生物を培地に培養することにより、該酵
素を高収率で得ることか可能となり、本発明は産業上極
めて有用なものである。

以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

〔実施例〕

（１）染色体ＤＮＡの調製 乳酸菌ロイコノストック・メセンテロイデスＡＴＣＣ１
２２９１を培地〔１％トリプトン（デイフコ社製）。

１％イースト・エキストラクト（デイフコ社製）、０，
５％に！ＨＰＯ，，１％シュークロース、　　０．００
１％チアミン・塩酸、０．０４％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０
，０，００１％Ｆｅ５０．−７ＨｚＯ，０，０２％Ｍｎ
ＳＯ４’　４ＨｚＯ，０，００５％アスコルビン酸〕　
１１に接種し、温度３０°Ｃで２日間静置培養して、培
養物を得た、この培養物を５．００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、
で１５分間遠心分離処理した後、該菌体からカレント・
プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（
Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＢｉｏｌｇｙ）　ｕｎｉｔ２．４．３　（Ｊ
ｏｈｎ　Ｗｉｌｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　ｉｎｃ。

１９８７）記載の方法により、染色体ＤＮＡ　１００μ
ｇを抽出して得た。

次いで、この染色体ＤＮＡｌ０μｇおよび制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ　（ベーリンガー・マンハイム山之内社製）’ｌ
Ｑ　に”／トを、５０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（１０
０ｍＭＮａＣ１，１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　１ｍＭジチ
オスレイトール含有、ｐＨ７，４）に夫々混合し、温度
３７℃で１時間反応させた。反応終了液を常法により、
フェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理して、Ｅｃ
ｏＲＩで消化された乳酸菌ロイコノストック・メセンテ
ロイデスＡＴＣＣ１２２９１株の染色体ＤＮＡ断片８μ
ｇを得た。

（２）プラスミドベクターｐＢＲ３２２を利用した乳酸
菌染色体ＤＮＡライブラリーの作製 プラスミドベクターｐＢＲ３２２（全酒造社製）１０μ
ｇ及び制限酵素ＥｃｏＲ１（ベーリンガー・マンノ＼イ
ム山之内社製）２０ユニツトを５０ｍＭ　トリス−塩酸
緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏｔ
、　１　ｍＭジチオスレイトール含有、ｐＨ７，４）に
混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得、該
液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理
した後、このＥｃｏＲＩで消化されたＤＮＡ断片が再結
合することを防止するするために、モレキュラー・クロ
ーニング（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、
第１３３〜１３４頁（１９８２年）コールド・スプリン
グ・ノへ−バーラボラトリー）記載の方法で、バクチリ
アル・アルカリフォスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理に
より、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常法によりフェ
ノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理して、Ｅｃ
ｏＲｌで消化されたプラスミドベクターｐＢＲ３２２Ｄ
　Ｎ　Ａ　８μｇを得た。

次いで、このＥｃｏＲＩで消化されたプラスミドベクタ
ーｐＢＲ３２２２μｇ、上記項目（１）で得られた膿Ｒ
１で消化された乳酸菌ロイコノストック・メセンテロイ
デスＡＴＣＣ１２２９１株の染色体ＤＮＡ断片４μｇ及
び２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マ
ンハイム山之内社製）を、６６ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０
ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭ　ＡＴＤを含有す
る６６ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に添加し
て、温度１６°Ｃで１６時間反応させてＤＮＡの連結反
応を行った。

この反応液を用い、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
）、第１１９巻、第１０７２〜１０７４頁（１９７４年
）記載の形質転換法により、大腸菌Ｄ　ＨＩ　（ＡＴＣ
Ｃ３３８４９）を形質転換し、ＬＢ−ａｎｐ培地〔バク
トドリプトン１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ
／ｖ）、　ＮａＣ１Ｏ，５％（Ｗ／Ｖ）、アガー１．２
％（ｗ／ｖ）、及びアンピシリン５０（μｇ／ｍｊ））
プレート上で生育するコロニーを約６．０００個を得、
これをライブラリーとして使用した。

（３）シュークローズ・ホスホリラーゼ（以下、ＳＰＬ
と略す。）遺伝子Ｎ末側を含む組み換え体プラスミドｐ
ｓＰＬＯ２Ｄ　Ｎ　Ａの作製乳酸菌ロイコノストック・
メセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１株のシュークロー
ズ・ホスホリラーゼの精製方法はメンズ・イン・エンザ
イモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ）、第１巻、第２２５〜２２８頁（１９５５年）に
記載されている。この方法により、電気泳動的に均一に
精製された蛋白を気相プロティン・シークエンサー（ア
プライド・バイオ・システムズ社製、３７型）により、
Ｎ末端アミノ酸配列３０残基を決定した。この中にＭｅ
ｔ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ〜Ｌｙｓというア
ミノ酸配列が存在し、このアミノ酸ＡＡであり、この２
４通りのミックスオリゴＤＮＡをプローブとして、ＳＰ
Ｌ遺伝子のスクリーニングを行った。

この１７塩基の２４通りのミックスオリゴヌクレオチド
をＤＮＡ合成機〔バックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）社製〕
を用いて合成し、この２Ｏｔｇのオリゴヌクレオチドの
５′末端を（２２Ｐ）　ＡＴＰ（アマジャム社製）を用
いて、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃ１゜ｎｉｎｇ）　、第１２２〜１２６頁、コール
ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（
１９８７年）記載の方法に従って標識した。

上記の方法で調製した３２Ｐで標識したＳＰＬ蛋白Ｎ末
端アミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列に相当するオリゴ
ヌクレオチドをプローブとして用い、項目（２）で作製
したプラスミドベクターｐＢＲ３２２をベクターとする
乳酸菌ロイコノストック・メセンテロイデスＡＴＣＣ１
２２９１株染色体ＤＮＡライブラリーをコロニー・ハイ
ブリダイゼーション法〔モレキュラー・クローニング（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第３１２〜
３２８Ｌコールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ
−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）（１９８２年）〕で検索し、ＳＰＬ遺伝
子Ｎ末端を存するコロニーを得た。該コロニーからモレ
キュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ）　、第８６〜９４頁、コールド・スプリング
・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２年）
〕記載の方法に従って、組み換え体プラスミドを３５０
μｇ／ｌ得、この組み換え体プラスミドＤＮＡをｐＳＰ
ＬＯ２と命名した。

このｐｓＰＬＯ２の５ａｕ３ＡＩ消化物の１％アガロー
スゲル電気泳動後、ニトロセルロースフィルターへ転写
し、前記Ｎ末端アミノ酸配列に対応する２４通リすック
ス合成オリゴヌクレオチドＤＮＡをプローブとして用い
、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バ
イオロジー（ＣＰ　ｉｎ　Ｍ　Ｂ）（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌ
ｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ）記載の方法に従い、サザン・プ
ロット・ハイブリダイゼーションを行った。

その結果、Ｈｉｎｄ　Ｉ［［−５ａｕ３ＡＩ　２５０ｂ
ｌ）中にＳＰＬ構造遺伝子のＮ末端が存在することが判
明した。そこでこの２５０ｂｐ　Ｈｉｎｄ　ｍ−３ａｕ
３ＡＩ断片の塩基配列をシーケネースキット（東洋紡社
製）により行い、Ｎ末端ｌＯアミノ酸配列に対応するＤ
ＮＡ塩基配列が存在することを確認した。

（４）シュークローズ・ホスホリラーゼ遺伝子Ｃ末端側
を含む組み換え体プラスミドｐｓＰＬＯ９の作製 前項目（３）で得られた組み換え体プラスミドｐＳＰＬ
０２ＤＮＡは、サザン・プロット・ハイブリダイゼーシ
ョン及び塩基配列の解析からＳＰＬ遺伝子Ｎ末端側約１
．１ｋｂを含むＤＮＡ挿入断片を有している。

ＳＰＬ遺伝子は分子量５５０００より換算して約１．６
ｋｂてあり残り約０．５ｋｂが必要である。

ｐｓＰＬＯ２Ｄ　Ｎ　ＡのＳＰＬ構造遺伝子の一番Ｃ末
側５ａｕ３ＡＩ−ＥｃｏＲＩ　３５０ｂｐ断片をプロー
ブとして用い、再度コロニー・ハイブリダイゼーション
を〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ）第３１２〜３２８頁、コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃ，Ｓ、　Ｈ，Ｌ
、　）（１９８２年）〕記載の方法により行い、５株ポ
ジティブ・クローンを得た。

先ずバンクの作製方法を以下に述べる。

プラスミドベクターＤＮＡ　ｐＵｃｌ１９（宝酒造社製
）５μｇ及び制限酵素ＢａｍＨＩ　（宝酒造社製）１０
ユニツトを２０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ
　ＫＣｌ、　１０ｍＭＭｇＣ１２，１ｍＭジチオスレイ
トール、ｐＨ８，５）＋：混合し、温度３７°Ｃて２時
間反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール
抽出及びエタノール沈澱処理した後、このＢａｍＨＩで
消化されたＤＮＡ断片か再結合することを防止するため
に、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１３３〜１３４頁コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２年）記載
の方法でバクチリアル・アルカリ・フォスファターゼ（
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａ
ｔａｓｅ）処理によりＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、
常法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱
処理して、ＢａｍＨＩで消化されたプラスミドベクター
ｐｔｌｃ１１９Ｄ　Ｎ　Ａを３μｇ得た。

次に（１１で得られた乳酸菌ロイコノストック・メセン
テロイデスＡＴＣＣ１２２９１染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　１０
Ｐｇ・及び制限酵素５ａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）２０ユ
ニツツを５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ　Ｎ
ａＣ１，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２゜１ｍＭジチオスレイト
ール、ｐＨ７，５）に混合し、温度３７℃２時間反応さ
せたのち、常法により、フェノール抽出及びエタノール
沈澱処理して５ａｕ３ＡＩで消化された乳酸菌ロイコノ
ストック・メセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１株の染
色体ＤＮＡ７μｇを得た。

次いで、ＢａｍＨｒで消化されたプラスミド・ベクター
ｐＵｃ１１９Ｄ　Ｎ　Ａ　３μｇ、畢３ＡＩで消化され
た乳酸菌ロイコノストック・メセンテロイデスＡＴＣＣ
１２２９１株染色体ＤＮＡ５μｇ、及び２ユニツツのＴ
４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンノ＼イム・山之内
社製）を６６ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、　１０ｍＭジチオスレ
イトール及び１０ｍＭ　ＡＴＰを含有する６６ｍＭ　）
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に添加し、温度１６°
Ｃで２時間反応し、ＤＮＡの連結反応を行った。

この反応液を用い、項目（２）と同じようにして大腸菌
ＪＭＩＯＩ　ＡＴＣＣ３３８７６を形質転換し、コロニ
ーを約１０．０００個を、このライブラリーの中よりｐ
ｓＰＬＯ２ＤＮＡのＳＰＬ構造遺伝子の一番Ｃ末側５ａ
ｕ３Ａ　Ｉ−Ｅｃ。

ＲＩ　３５０ｂｐ断片をプローブとして用い、再度コロ
ニー・ハイブリダイゼーションを〔モレキュラー・クロ
ーニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）第３
１２〜３２８頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリ−（Ｃ，Ｓ、　Ｈ，Ｌ、　Ｘ１９８２年）〕記
載の方法により行い、５株ポジティブ・クローンを得た
。

該コロニーから、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第８６〜９４頁、
コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９
８２年）記載の方法に従って、組み換え体プラスミドを
ｉｌ培養より、７００μｇを得、この組み換え体プラス
ミドＤＮＡをｐｓＰＬＯ９と命名した。

この組み換え体プラスミドｐｓＰＬＯ９は、ｐｓＰＬＯ
２ｃ末側約３５０ｂｐの５ａｕ３Ａ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断
片を重複し、ＳＰＬ遺伝子Ｃ末側約８５０ｂｐを含有す
る、挿入断片的２．Ｏｋｂの組み換え体プラスミドであ
る。

（５）　　シュークローズ・ホスホリラーゼ遺伝子全領
域を含む組み換え体プラスミドｐｓＰＬ１０Ｄ　Ｎ　Ａ
の作製 項目（３）で得られた組み換え体プラスミドＤＮＡｐｓ
ＰＬＯ２Ｄ　Ｎ　Ａ　２０μｇ、制限酵素胞ＲＩ及び里
Ｉ（共に宝酒造社製）夫々３０ユニツツを５０ｍＭ　）
リス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　
ＭｇＣ１ｚ、　１ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７，５
）に混合し、温度３７°Ｃ３時間反応させたのち、〔モ
レキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）　、第１５６〜１６１頁、コールド・スプ
リング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２ＩＥ））記
載の方法により０．７％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気
泳動処理を行い、約４．９ｋｂＤＮＡ断片を含むゲル部
分をゲルより切り出して透析チューブに入れ、２−のＴ
Ｅ緩衝液（１０ｍＭ　）リス・塩酸、　１ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ７，５）を加えた後、透析チューブをシールし
、電気泳動により、ゲル中から緩衝液中にＤＮＡを溶出
した。この溶液をフェノール抽出及びエタノール沈澱を
行い、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ４．Ｏｋｂ断片約８μｇを
得た。

次いで、項目（４）で得られた組み換え体ＤＮＡｐＳＰ
Ｏ９ＤＮＡ２０μｇ、制限酵素胞Ｒ１及び卸【（共に宝
酒造社製）夫々３０ユニツツを５０ｍＭ　）　’Ｊスー
塩酸酸（１００ｍＭ　ＮａＣ１，ｌｏｍＭ　ＭｇＣ１ｚ
、　１ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７，５）に混合し
、温度３７℃３時間反応させたのち、上記の如く、アガ
ロースゲル電気泳動、透析チューブ中てのＤＮＡ断片抽
出及び精製を行い、ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ　１．７ｋｂ
断片約５μｇを得た。

上述のように得られたＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ　４．Ｏｋ
ｂ断片５μｇ、　１．７ｋｂ断片５μｇ及び２ユニツツ
のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム・山
之内社製）を６６ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、　１０ｍＭジチオ
スレイトール及び１０ｍＭ　ＡＴＰを含存する６６ｍＭ
　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に添加し、温度１
６°Ｃで１７時間反応し、ＤＮＡの連結反応を行った。

この反応液を用い、項目（２）と同じようにして大腸菌
ＤＨＩ　ＡＴＣＣ（３３８４９）を形質転換し、該コロ
ニを得、この菌株の含存する組み換え体プラスミドＤＮ
Ａをｐｓｐｔ、ｔｏと命名した。このようにし′て得ら
れた大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＤＨＩ（１）ＳＰＬＩＯ
）は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１
１４２１号（ＦＥＲＭＰ−１１４２１）として寄託され
ている。

また、大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨＩ（ｐｓＰＬｌＯ）を
モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）　、第８６〜９４頁、コールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２
年）記載の方法に従って、１１培養より組み換え体プラ
スミドｐｓＰＬ１０を４３０μｇ得た。この組み換え体
プラスミドｐｓｐｔ、ｔｏは、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ
Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ　２２２０ｋｄとＬｅｕｃｏｎｏｓｆ
ｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｎｏｉｄｅｓ染色体ＤＮＡ１８０
０ｋｄが連結されたものである。組み換え体プラスミド
ｐｓＰＬ１０の制限酵素地図は第１図の通りである。

コノ大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＤＨＩ（ｐｓＯＬＩｏ）
を１ｍＭ　ｒＰＴＧを含むＴ−Ｙ培地〔トリプトン１％
（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）及びＮａＣ
１（ｗ／ｖ））　１０ｒｒＬｌ中で温度３７°Ｃで８時
間振とう培養したのち、遠心分離により集菌し、超音波
処理して得た粗酵素液のシュークローズ・ホスホリラー
ゼ酵素活性は、０．６４ｔＪ／ｒＩＬｌであった。

なお、比較のため、プラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ
（全酒造社製）を有する大腸菌ＤＨＩ（ＡＴＣＣ３３８
４９）を用いた場合は、上記と同様にしてシュークロー
ズ・ホスホリラーゼ活性を測定した結果、酵素活性は検
出されなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、組み換え体プラスミドｐｓＰＬ１０Ｄ　Ｎ　
Ａの制限酵素開裂地図を示す図である。 第 図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の制限酵素地図を有し、かつ分子量１８００ｋ
   ｄを有するシュークローズ・ホスホリラーゼ遺伝子ＤＮ
   ＡをベクターＤＮＡに挿入した新規な組み換え体ＤＮＡ
   。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｅは￥Ｅｃｏ￥Ｒ I 、Ｈは￥Ｈｉｎ￥ｄIII、
   Ｐは￥Ｐｓｔ￥ I 、Ｔは￥Ｅｃｏ￥Ｔ１４ I を示す） ２、請求項１記載の組み換え体ＤＮＡを含み、シューク
   ローズ・ホスホリラーゼ生産能を有する微生物を培地に
   培養し、培養物よりシュークローズ・ホスホリラーゼを
   採取することを特徴とするシュークローズ・ホスホリラ
   ーゼの製造法。