JPH0445510B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0445510B2 JPH0445510B2 JP62081357A JP8135787A JPH0445510B2 JP H0445510 B2 JPH0445510 B2 JP H0445510B2 JP 62081357 A JP62081357 A JP 62081357A JP 8135787 A JP8135787 A JP 8135787A JP H0445510 B2 JPH0445510 B2 JP H0445510B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phenyl
- reaction
- carboxyl
- measuring
- tetrazolium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D257/00—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
- C07D257/02—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
- C07D257/04—Five-membered rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
- C12Q2326/90—Developer
- C12Q2326/92—Nitro blue tetrazolium chloride, i.e. NBT
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/805—Test papers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
産業上の利用分野
本発明は基質又は酵素活性を、測定反応として
酸化還元反応を使用して定量的に測定する方法に
関する。 従来の技術 臨床及び製薬化学、生化学及び食品化学におい
て基質又は酵素活性を測定するために多数の指示
薬法が使用される。しかし例えば酸化還元色素指
示薬系の吸光の変化又は電位又は電流の変化が特
に重要であり、これは好適な電極により測定する
ことができる。この種の酸化還元反応は特に臨床
化学で広く使用される。 測定反応として酸化還元反応を使用することに
基づく特定の基質又は酵素の光度測定法的測定に
使用される試薬系で有利な酸化還元成分の他にな
おその他の還元作用を有する物質が存在する場合
には、測定反応が妨害されることを考慮せねばな
らない。この種の妨害は周知の如く特に、内因及
び外因起源の還元作用を有する物質を著量に含有
しうる生物学的試料、例えば尿、血漿又は血清を
使用する場合に考慮せねばならない。その際内因
性妨害物質としては特にビリルビンが挙げられ
る。外因性の還元作用を有する妨害物質は例えば
アスコルビン酸塩、種々の薬剤又はその代謝物質
である。生物学的試料中にしばしば存在し、その
還元性特性により障害となる薬剤は例えばα−メ
チルド−パ又はカルシウムドベシレートである。
妨害作用を有する代謝物質は例えばホモゲンチシ
ン酸が公知である。 還元作用を有する物質による妨害は特に、試料
中の測定すべき基質又は酵素の濃度又は活性が比
較的低く、十分な測定精密度を達成するために比
較的高い試料−／試薬容量比が必要である場合
に、著しい。このことは例えば血清又は血漿中の
尿酸、クレアチニン又は蓚酸塩を測定する場合に
該当する。その際測定すべき基質は酵素と反応し
て過酸化水素を生成するが、その際生じる過酸化
水素はペルオキシダーゼの存在で例れば２つのカ
ツプリング成分の酸化縮合のような化学量論的色
素生成反応で使用される。 これまで還元作用を有する物質による妨害を同
時に迅速かつ効果的にかつ測定に必要な還元反応
を更に妨害しないで除去することは不可能であつ
た。このために化学では強力な酸化作用を有する
物質が一般的である。しかしこれらは基質及び酵
素を攻撃し破壊するので、臨床及び製薬化学、生
化学又は食品化学では使用することができない。
更にそれらはしばしば、試薬盲検値吸光度を高め
る副反応を惹起する。 多くの金属塩及びその錯体も還元作用を有する
物質と反応して相応する２価又は２価のイオンを
生じる。これらは指示薬反応に必要な酵素を阻止
する。更に生じる還元作用を有する金属イオンは
試料中に存在する妨害物質と同様に妨害しうる。
金属イオンの付加的な欠点は、それらの酸化が強
酸性条件下で最適であるということである。これ
らの条件下では酵素は大抵破壊される。 これら慣用の方法の他に、特にアスコルビン酸
に対しては空中酵素を用いるアスコルビン酸塩の
急速な酸化分解が挙げられる。しかしこれは酵素
が変性されるか又は不活性化される強アルカリ性
条件下にのみ可能である。 代りに、この反応用の触媒としてアスコルベー
トオキシダーゼ使用が提案された（西ドイツ特許
公開公報第2625834号明細書）。この方法は酵素ア
スコルビン酸酸化酵素の特異性によりアスコルビ
ン酸塩用の外にその他の還元作用を有する妨害物
質には使用することができない。酵素の最適PHは
PH５〜６であり、従つて多くの臨床試験で重要な
酵素の最適PHから遥かに離れている。例えばクレ
アチニン又は尿酸の測定はPH８で行われる。この
PH値ではアスコルベート−オキシダーゼの活性は
迅速に妨害を除去するために十分ではない。更に
この酵素は常用の試験成分、例えばアジド又はキ
レート化剤、例えばEDTAにより妨害される。 発明が解決しようとする問題点 従つて酸化還元反応で還元作用を有する物質に
よる妨害は除去するが測定反応に不利な影響を与
えない基質又は酵素活性の測定用に一般に使用可
能な方法及び試薬が必要とされていた。更に試薬
は取扱いが簡単であり、安価であるべきである。
本発明の課題はこの要求を満たすことであつた。 問題点を解決するための手段 この課題は、酸化還元反応が測定反応として役
立ち、１種又は数種の付加的に添加したテトラゾ
リウム塩の存在で行なわれる基質又は酵素活性の
測定用の本発明による方法によつて解決される。
この方法の利点は、該当する基質−又は酵素試験
で一般的な条件下で妨害作用を行う還元作用を有
する物質を一般的に不可逆に、簡単で迅速に除去
することである。これによつて妨害されない測定
が可能である。 テトラゾリウム塩及びそのホルマザンへの還元
は既に前世紀終りに公知である。それらは主とし
て化学、生化学及び組織化学で還元作用を有する
物質を検出するために使用される〔比較：ベルグ
メイヤー（Bergmeyer）、メソツズ・オブ・エン
ジマテイツク・アナリシス（Methods of
Enzymatic Analysis）第１巻、199頁以降（1984
年）又はアルトマン（Altmann）、F.P.、プログ
レス・イン・ヒストケミストリー（Progress in
Histochemistry）第９巻、１頁以降（1976年）〕。
しかしこれまで、テトラゾリウム塩のホルマザン
へのこの還元を検出反応としてではなく妨害を排
除する反応として使用する目的で、色素指示薬と
して作用する酸化還元反応をテトラゾリウム塩還
元と組合せることは考慮されなかつた。これまで
の関心は還元に際して出来る限り有色のホルマザ
ンを生じ、従つて酸化還元反応で色素指示薬とし
て使用されるテトラゾリウム塩を見出すことにあ
つた。 測定反応として使用され、光度測定的に実施可
能な酸化還元反応で色素指示薬系を妨害しないた
めに、還元作用を有する妨害物質を除去するため
に使用されるテトラゾリウム塩は、光を全くか又
は無視しうる程度でしか固有な色素指示薬系の測
定波長で吸収しないようなホルマザンを生成すべ
きである。従つて特に最高吸収波長500〜600nｍ
を有する臨床化学で常用の色素指示薬系用には本
発明により原則的にはこの波長で全くか又は無視
しうる程度にしか吸収しない任意のテトラゾリウ
ム塩を使用することができる。 本発明では、特に一般式： ［式中R1は水素、カルボキシル−、アルキル−、
フエニル−、ニトロフエニル−、ジニトロフエニ
ル−、カルボキシル置換されたフエニル−又はト
リアルキルアンモニウムフエニル基を表わし、
R2はフエニル−、ニトロフエニル−、ビフエニ
リル−又はナフチル基を表わし、R3はフエニル
−、カルボキシル置換されたフエニル−、カルボ
キシル置換されたヒドロキシフエニル−又はジメ
チルアゾリル基を表わし及びA-は普通の反対イ
オンを表わす〕のテトラゾリウム塩の使用が有利
である。 定義R1のアルキル基は炭素原子１〜10個、有
利には１〜７個から成る。特に有利にはメチル
−、エチル−及びｎ−ブチル基である。 定義R1及びR2のニトロフエニル基として特に
有利にはパラ−ニトロフエニル基である。 定義R1で記載したジニトロフエニル基は特に
２，４−ジニトロフエニル基である。 定義R1及びR3のカルボキシル置換フエニル基
はフエニル基が４位でカルボキシル基により置換
されている場合に有利である。更に定義R3でフ
エニル基が２位にカルボキシル置換分を有する場
合に特に有利である。 定義R1のトリアルキルアンモニウムフエニル
基は、フエニル基が４位にトリアルキルアンモニ
ウム置換分を有する場合に特に有利であると判明
した。アンモニウム置換分のアルキル基はR1の
アルキルと同じ定義に相応し、同一であつても良
いし異なるものであつても良い。 定義R2のビフエニリル基は有利にはその４位
でテトラゾリウム塩に結合している。 定義R2のナフチル基は有利にはその２位でテ
トラゾリウム塩に結合している。 定義R3のカルボキシル置換ヒドロキシフエニ
ル基は特に、２位にカルボキシル置換分を有しそ
の４位でテトラゾリウム塩に結合しているような
ヒドロキシフエニル基である。 定義R3のジメチルチアゾリル基はその２位で
テトラゾリウム塩に結合している。有利なジメチ
ルアゾリル基は４−及び５位にメチル基を有す
る。 定義A-の普通の反対イオンは特に１価の陰イ
オンである。このために一般に無機陰イオン、例
えばハロゲンイオンを使用する。この有利なハロ
ゲンイオンは塩素−及び臭素イオンである。カル
ボキシル置換基R1又はR3の場合には反対陰イオ
ンA-はカルボキシレートイオンであつても良い。 次の表に記載の化合物が特に有利である。
酸化還元反応を使用して定量的に測定する方法に
関する。 従来の技術 臨床及び製薬化学、生化学及び食品化学におい
て基質又は酵素活性を測定するために多数の指示
薬法が使用される。しかし例えば酸化還元色素指
示薬系の吸光の変化又は電位又は電流の変化が特
に重要であり、これは好適な電極により測定する
ことができる。この種の酸化還元反応は特に臨床
化学で広く使用される。 測定反応として酸化還元反応を使用することに
基づく特定の基質又は酵素の光度測定法的測定に
使用される試薬系で有利な酸化還元成分の他にな
おその他の還元作用を有する物質が存在する場合
には、測定反応が妨害されることを考慮せねばな
らない。この種の妨害は周知の如く特に、内因及
び外因起源の還元作用を有する物質を著量に含有
しうる生物学的試料、例えば尿、血漿又は血清を
使用する場合に考慮せねばならない。その際内因
性妨害物質としては特にビリルビンが挙げられ
る。外因性の還元作用を有する妨害物質は例えば
アスコルビン酸塩、種々の薬剤又はその代謝物質
である。生物学的試料中にしばしば存在し、その
還元性特性により障害となる薬剤は例えばα−メ
チルド−パ又はカルシウムドベシレートである。
妨害作用を有する代謝物質は例えばホモゲンチシ
ン酸が公知である。 還元作用を有する物質による妨害は特に、試料
中の測定すべき基質又は酵素の濃度又は活性が比
較的低く、十分な測定精密度を達成するために比
較的高い試料−／試薬容量比が必要である場合
に、著しい。このことは例えば血清又は血漿中の
尿酸、クレアチニン又は蓚酸塩を測定する場合に
該当する。その際測定すべき基質は酵素と反応し
て過酸化水素を生成するが、その際生じる過酸化
水素はペルオキシダーゼの存在で例れば２つのカ
ツプリング成分の酸化縮合のような化学量論的色
素生成反応で使用される。 これまで還元作用を有する物質による妨害を同
時に迅速かつ効果的にかつ測定に必要な還元反応
を更に妨害しないで除去することは不可能であつ
た。このために化学では強力な酸化作用を有する
物質が一般的である。しかしこれらは基質及び酵
素を攻撃し破壊するので、臨床及び製薬化学、生
化学又は食品化学では使用することができない。
更にそれらはしばしば、試薬盲検値吸光度を高め
る副反応を惹起する。 多くの金属塩及びその錯体も還元作用を有する
物質と反応して相応する２価又は２価のイオンを
生じる。これらは指示薬反応に必要な酵素を阻止
する。更に生じる還元作用を有する金属イオンは
試料中に存在する妨害物質と同様に妨害しうる。
金属イオンの付加的な欠点は、それらの酸化が強
酸性条件下で最適であるということである。これ
らの条件下では酵素は大抵破壊される。 これら慣用の方法の他に、特にアスコルビン酸
に対しては空中酵素を用いるアスコルビン酸塩の
急速な酸化分解が挙げられる。しかしこれは酵素
が変性されるか又は不活性化される強アルカリ性
条件下にのみ可能である。 代りに、この反応用の触媒としてアスコルベー
トオキシダーゼ使用が提案された（西ドイツ特許
公開公報第2625834号明細書）。この方法は酵素ア
スコルビン酸酸化酵素の特異性によりアスコルビ
ン酸塩用の外にその他の還元作用を有する妨害物
質には使用することができない。酵素の最適PHは
PH５〜６であり、従つて多くの臨床試験で重要な
酵素の最適PHから遥かに離れている。例えばクレ
アチニン又は尿酸の測定はPH８で行われる。この
PH値ではアスコルベート−オキシダーゼの活性は
迅速に妨害を除去するために十分ではない。更に
この酵素は常用の試験成分、例えばアジド又はキ
レート化剤、例えばEDTAにより妨害される。 発明が解決しようとする問題点 従つて酸化還元反応で還元作用を有する物質に
よる妨害は除去するが測定反応に不利な影響を与
えない基質又は酵素活性の測定用に一般に使用可
能な方法及び試薬が必要とされていた。更に試薬
は取扱いが簡単であり、安価であるべきである。
本発明の課題はこの要求を満たすことであつた。 問題点を解決するための手段 この課題は、酸化還元反応が測定反応として役
立ち、１種又は数種の付加的に添加したテトラゾ
リウム塩の存在で行なわれる基質又は酵素活性の
測定用の本発明による方法によつて解決される。
この方法の利点は、該当する基質−又は酵素試験
で一般的な条件下で妨害作用を行う還元作用を有
する物質を一般的に不可逆に、簡単で迅速に除去
することである。これによつて妨害されない測定
が可能である。 テトラゾリウム塩及びそのホルマザンへの還元
は既に前世紀終りに公知である。それらは主とし
て化学、生化学及び組織化学で還元作用を有する
物質を検出するために使用される〔比較：ベルグ
メイヤー（Bergmeyer）、メソツズ・オブ・エン
ジマテイツク・アナリシス（Methods of
Enzymatic Analysis）第１巻、199頁以降（1984
年）又はアルトマン（Altmann）、F.P.、プログ
レス・イン・ヒストケミストリー（Progress in
Histochemistry）第９巻、１頁以降（1976年）〕。
しかしこれまで、テトラゾリウム塩のホルマザン
へのこの還元を検出反応としてではなく妨害を排
除する反応として使用する目的で、色素指示薬と
して作用する酸化還元反応をテトラゾリウム塩還
元と組合せることは考慮されなかつた。これまで
の関心は還元に際して出来る限り有色のホルマザ
ンを生じ、従つて酸化還元反応で色素指示薬とし
て使用されるテトラゾリウム塩を見出すことにあ
つた。 測定反応として使用され、光度測定的に実施可
能な酸化還元反応で色素指示薬系を妨害しないた
めに、還元作用を有する妨害物質を除去するため
に使用されるテトラゾリウム塩は、光を全くか又
は無視しうる程度でしか固有な色素指示薬系の測
定波長で吸収しないようなホルマザンを生成すべ
きである。従つて特に最高吸収波長500〜600nｍ
を有する臨床化学で常用の色素指示薬系用には本
発明により原則的にはこの波長で全くか又は無視
しうる程度にしか吸収しない任意のテトラゾリウ
ム塩を使用することができる。 本発明では、特に一般式： ［式中R1は水素、カルボキシル−、アルキル−、
フエニル−、ニトロフエニル−、ジニトロフエニ
ル−、カルボキシル置換されたフエニル−又はト
リアルキルアンモニウムフエニル基を表わし、
R2はフエニル−、ニトロフエニル−、ビフエニ
リル−又はナフチル基を表わし、R3はフエニル
−、カルボキシル置換されたフエニル−、カルボ
キシル置換されたヒドロキシフエニル−又はジメ
チルアゾリル基を表わし及びA-は普通の反対イ
オンを表わす〕のテトラゾリウム塩の使用が有利
である。 定義R1のアルキル基は炭素原子１〜10個、有
利には１〜７個から成る。特に有利にはメチル
−、エチル−及びｎ−ブチル基である。 定義R1及びR2のニトロフエニル基として特に
有利にはパラ−ニトロフエニル基である。 定義R1で記載したジニトロフエニル基は特に
２，４−ジニトロフエニル基である。 定義R1及びR3のカルボキシル置換フエニル基
はフエニル基が４位でカルボキシル基により置換
されている場合に有利である。更に定義R3でフ
エニル基が２位にカルボキシル置換分を有する場
合に特に有利である。 定義R1のトリアルキルアンモニウムフエニル
基は、フエニル基が４位にトリアルキルアンモニ
ウム置換分を有する場合に特に有利であると判明
した。アンモニウム置換分のアルキル基はR1の
アルキルと同じ定義に相応し、同一であつても良
いし異なるものであつても良い。 定義R2のビフエニリル基は有利にはその４位
でテトラゾリウム塩に結合している。 定義R2のナフチル基は有利にはその２位でテ
トラゾリウム塩に結合している。 定義R3のカルボキシル置換ヒドロキシフエニ
ル基は特に、２位にカルボキシル置換分を有しそ
の４位でテトラゾリウム塩に結合しているような
ヒドロキシフエニル基である。 定義R3のジメチルチアゾリル基はその２位で
テトラゾリウム塩に結合している。有利なジメチ
ルアゾリル基は４−及び５位にメチル基を有す
る。 定義A-の普通の反対イオンは特に１価の陰イ
オンである。このために一般に無機陰イオン、例
えばハロゲンイオンを使用する。この有利なハロ
ゲンイオンは塩素−及び臭素イオンである。カル
ボキシル置換基R1又はR3の場合には反対陰イオ
ンA-はカルボキシレートイオンであつても良い。 次の表に記載の化合物が特に有利である。
【表】
【表】
シフエニル シフエニル
特に有利な化合物は化合物T1、T2、T3、T4、
T5、T6及びT8である。 測定反応の妨害を除去するために添加されるテ
トラゾリウム塩の濃度は試料中の予期される還元
作用を有する妨害物質の量による。一般にテトラ
ゾリウム塩0.001〜100ミリモル／、有利には
0.01〜20ミリモル／、特に有利には0.05〜５ミ
リモル／を使用する。 測定反応として酸化還元反応を用い、還元作用
を有する妨害物質を除去するために１種又は数種
のテトラゾリウム塩を添加して基質又は酵素活性
を測定するための本発明による方法は、その都度
の方法に必要な酵素によりPH値３〜11で実施する
ことができる。範囲6.5〜９が有利である。緩衝
剤としては所望されるPH範囲で十分な緩衝能を有
するような任意の物質を使用することができる。
しかし有利には燐酸塩−又はトリス緩衝剤が使用
される。緩衝剤の濃度は0.01〜１モル／、有利
には0.05〜0.2モル／である。 妨害除去用に添加されるテトラゾリウム塩から
生じるホルマザンの溶解度を改良し、妨害の除去
された反応の反応速度を高めるために、測定すべ
き試料に場合により非イオン性清浄剤、例えばト
リトン（Triton）Ｘ−100、ツイ−ン（Tween）
８０又はホリビニルピロリドンを添加することが
できる。場合により添加されるこの種の清浄剤の
濃度は各清浄剤の臨界ミセル濃度による。一般に
0.01〜５％、特に0.05〜0.5％である。 この方法の有利な態様では、妨害を除去するテ
トラゾリウム塩作用を１種又は数種の電子伝達体
を添加することによつて促進させる。妨害除去反
応を促進するために及び妨害物質の酸化の際の助
剤として若干の電子伝達体を使用することができ
る。例えばフエナジン−メトスルフエート、フエ
ナジン−エトスルフエート、８−ジメチルアミノ
−２，３−ベンゾフエノキサジン、１−メトキシ
−５−メチルフエナジニウム−メチルスルフエー
ト又はジアホラーゼが挙げられる。このうちフエ
ナジン−エトスルフエート又はジアホラーゼが特
に有利である。 測定反応として酸化還元反応を用いて基質又は
酵素活性を測定する際に、付加的なテトラゾリウ
ム塩なしでも一定の妨害除去効果が電子伝達体だ
けを用いても確認することができる。しかし前記
電子伝達体の作用は酸化還元反応の十分であるか
又は全く完全な妨害除去用には十分ではない。こ
のために本発明によるテトラゾリウム塩との組合
せが必要である。 妨害除去すべき試料に添加する電子伝達体の濃
度は有利には0.005〜100ミリモル／、特に有利
には0.05〜５ミリモル／である。ジアホラーゼ
の場合には有利には0.001〜100U／mlの量を使用
するが、その際0.1〜20U／mlの範囲が特に有利
である。 本発明のその他の目的は基質又は酵素活性の光
度測定法的測定用の試薬であるが、これは測定反
応として酸化還元反応を用いて基質又は酵素を測
定するための系統及び付加的に、当該基質−又は
酵素試験で一般的な条件下で還元作用を有する妨
害物質を不可逆的に容易にかつ迅速に除去し、そ
れによつて妨害されない測定を可能にする１種又
は数種のテトラゾリウム塩を含有する。 原則的にはこの種の試薬用に、測定反応を行う
波長範囲で全くか又は無視しうる程度にしか吸収
しないような全てのテトラゾリウム塩を使用する
ことができる。この波長範囲は臨床化学で重要な
多数の基質又は酵素の場合に500〜600nｍであ
る。従つて特に一般式のテトラゾリウム塩が有
利である。測定に必要な残りの試薬成分と組合せ
て化合物T1〜T17が特に有利である。この為に
テトラゾリウム塩T1、T2、T3、T4、T5、T6及
びT8が特に有利であると判明した。 本発明による試薬は１種又は数種のテトラゾリ
ウム塩を含有するが、その濃度は還元作用を有す
る妨害物質の予想すべき量による。一般に濃度は
テトラゾリウム塩0.001〜100ミリモル／、有利
には0.01〜20ミリモル／、特に有利には0.05〜
５ミリモル／である。 測定反応として酸化還元反応を使用し、還元作
用を有する妨害物質を除去するために１種又は数
種のテトラゾリウム塩を添加して基質又は酵素活
性を測定する際に必要な酵素に応じて一定のPH値
を保持するために、本発明による試薬は緩衝剤を
含有することができる。本発明による試薬のPHは
PH３〜11の範囲であり、有利にはPH6.5〜９の範
囲である。この種の値に調整することのできる緩
衝剤は原則的にはそれらのpK値が前記PH範囲で
あるような全てのものである。本発明による試薬
はこれらのうちの任意の緩衝剤を含有することが
できる。本発明による試薬は有利な緩衝剤として
燐酸塩−又はトリス緩衝剤を含有する。試薬中の
緩衝剤の濃度は0.01〜１モル／、有利には0.05
〜0.2モル／であつて良い。 妨害除去用に添加されるテトラゾリウム塩から
生じるホルマザンの溶解性を改良し、妨害除去反
応の反応速度を高めるために、本発明による試薬
は場合により非イオン性清浄剤、例えばトリトン
Ｘ−100、ツイーン80又はポリビニルピロリドン
を含有することができる。この種の清浄剤の濃度
は各々の清浄剤の臨界ミセル濃度による。それは
一般に0.01〜５％、特に0.05〜0.5％である。 特に有利な本発明による試薬は、１種又は数種
のテトラゾリウム塩の他に１種又は数種の電子伝
達体を含有することを特徴とする。この種の電子
伝達体としては例えばフエナジン−メトスルフエ
ート、フエナジン−エトスルフエート、８−ジメ
チルアミノ−２，３−ベンゾフエノキサジン、１
−メトキシ−５−メチルフエナジニウム−メチル
スルフエート又はジアホラーゼが挙げられる。 特に好適な電子伝達体は特定の基質又な酵素活
性の測定に必要な残りの反応成分と組合せてフエ
ナジン−エトスルフエート及び／又はジアホラー
ゼであると判明した。 試薬中の電子伝達体の濃度は0.005〜100ミリモ
ル／、有利には0.05〜５ミリモル／である。
ジアホラーゼの場合に試薬は有利には酵素0.001
〜100U／mlを含有する。濃度範囲0.1〜20U／ml
が特に有利である。 本発明による試薬は、測定反応として酸化還元
反応言用いて基質又は酵素を測定するための系と
して、例えばグルコース測定用に：グルコース−
オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノフ
エナゾン及びフエノール、尿酸測定用に：ウリカ
ーゼ、ペルオキシダーゼ、２−ヒドラゾノ−２，
３−ジヒドロ−３−メチル−６−スルホベンゾチ
アゾール及びＮ−エチル−Ｎ−β−スルホエチル
−ｍ−トルイジン又はコレステリン測定用に：コ
レステリン−エステラーゼ、コレステリン−オキ
シダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノフエナ
ジン及びフエノールを含有することができる。 前記の例に挙げた基質の測定用のこれらの系は
全て公知である。これらの代わりに本発明による
試薬で基質又は酵素の測定用のその他の公知の系
を使用することもできる。 本発明による試薬は、還元作用を有する妨害物
質を除去するために１種又は数種のテトラゾリウ
ム塩及び基質又は酵素測定系の成分としてH2O2
生成酵素、例えば前記したグルコース−オキサダ
ーゼ、ウリカーゼ又はコレステリン−オキシダー
ゼを含有する場合に特に有効であると判明した。
同様に本発明による試薬が測定反応用にフエノー
ル、例えばフエノールそれ自体又は２，４，６−
トリブロムヒドロキシ安息香酸又はアニリン誘導
体、例えばＮ−エチル−Ｎ−β−スルホエチル−
ｍ−トルイジン（これは試薬例えば４−アミノフ
エナゾン、４−アミノ−アンチピリン又は２−ヒ
ドラゾノ−２，３−ジヒドロ−３−メチル−６−
スルホンベンゾチアゾールと酸化的に結合しう
る）を含有する場合に特に有利であると判明し
た。測定反応としてこの種の酸化還元反応の例は
グルコース−、尿酸−又はコレステリン測定用に
既に記載されている。 本発明は迅速診断薬の分野でも使用することが
できる。この種の迅速診断薬は一般に方法実施に
必要な種々の試薬を吸収性の不溶性支持体、例え
ば紙、フリース等に含浸してか又は好適な結合剤
を用いて支持体シート又は膨化性フイルム上に被
覆として塗布して含有する。 １態様では、還元作用を有する妨害物質を除去
するために１種又は数種のテトラゾリウム塩を含
有する本発明による試薬を吸収性支持体、例えば
紙上に含浸させる。この様にして例えばグルコー
ス、尿酸又はコレステリン検出用の例えばアスコ
ルビン酸により事実上妨害されない試験紙が得ら
れる。 しかし本発明によれば、テトラゾリウム塩を別
の支持体上に塗布し、これを残りの試薬の支持体
と例えばその上に置くか貼り着けるか又は一緒に
封入するかして合することもできる。この種の実
施例では例えば水溶性の紙（例えば西ドイツ特許
公開公報第2436598号明細書）をテトラゾリウム
塩で含浸することができ、一方基質又は酵素活性
の測定用に必要な系は水に不溶性の吸収性の支持
体材料上に含浸されている。２つの支持体材料を
有利には、測定すべき試料が先ずテトラゾリウム
塩と接し次いで水に不溶性の支持体材料に接する
ように相互に積層する。 有利な１態様では、支持体材料の別々の帯域を
テトラゾリウム塩及び試験試薬で含浸しても良
い。この場合に、有利には支持体を検査すべき溶
液と、溶液が先ずテトラゾリウム塩含有の帯域と
接触し、そこから残りの必要に試験試薬を含有す
る帯域へ吸収されるように接触させる。この種の
態様を説明するために第１図に、装置の例を横断
面で図示するが、この装置により、西ドイツ特許
出願公告第3029579号明細書によれば、一方では
全血から試験に必要な血清又は血漿を分離し、他
方では試薬−及び助剤層の特別に形成された構造
により温度調整、前反応及び主反応の目的とされ
る開始が可能となる。 第１図による装置は次のような構成である：不
活性の支持体フイルム８上にガラス繊維から成る
移送フリース７が固定されている。この移送フリ
ースを部分的に被つて同様にガラス繊維から成る
フリース５が固定網６により固定されている。フ
リース５と移送フリース７の間には、測定反応を
妨害する還元作用を有する物質を除去することが
できる物質を含浸してある妨害除去織物４が配置
されている。移送フリース７の側面には接着部９
を介して透明なプラスチツクから成る透明なシー
ト１が固定されている。この透明なシート１の下
には、測定反応に必要な物質が混入されている膨
張性又は吸収性のフイルムから成る試薬層２が付
与されている。試薬層２の下には一般に、強力な
反射作用を有する物質例えば硫酸バリウム、二酸
化チタン又は類似物と混合してあり光学的に白色
背景として役立つプラスチツク−又はゼラチンフ
イルムから成る被覆層３が設けられている。観察
用に照射される光は十分完全に軽減され、フリー
ス７の場合による変色は顕著ではない。試薬層２
及び被覆層３は共通して試験層と称される。 固定網６上に全血を載せると、これはガラス繊
維フリース５中で血清と赤血球で分離され、その
際赤血球が固持される。妨害除去織物４を通過す
る際に測定反応を妨害する還元作用を有する内容
物質は除去されるので、移送フリース７の左側部
分に測定を妨害する物質を含まない血清だけが移
る。透明シート１を押した後測定反応は、血清が
移送フリース７を完全に満たした後に開始する。
血清は圧縮接触に依つて被覆層３を通つて試薬層
２に浸透し、この層を均一に完全に湿らす。反応
は透明シート１を通して試薬層２の変色により観
察される。 本発明による方法及び試薬に使用することがで
きるテトラゾリウム塩５−カルボキシ−３−（２
−カルボキシフエニル）−２−フエニル−２−Ｈ
−テトラゾリウムヒドロキシド、分子内塩
（T1）、３−（２−カルボキシフエニル）−２，５
−ジフエニル−２−Ｈ−テトラゾリウムヒドロキ
シド、分子内塩（T2）、２，３−ジフエニル−５
−（２，４−ジニトロフエニル）−２−Ｈ−テトラ
ゾリウムクロリド（T3）、２，３−ジフエニル−
５−〔４−（トリメチルアンモニオフエニル）〕−２
−Ｈ−テトラゾリウム−ジクロリド（T5）及び
３−（２−カルボキシフエニル）−５−（４−カル
ボキシフエニル）−２−フエニル−２−Ｈ−テト
ラゾリウムヒドロキシド、分子内塩（T16）及び
３，５−ビス−（２−カルボキシフエニル）−２−
フエニル−２−Ｈ−テトラゾリウムクロリド
（T17）は新規化合物であり、同様に本発明の目
的である。これらは一般式′： 〔式中、R1′はカルボキシ基、２−又は４位でカ
ルボキシ基によつて、２−及び４位でニトロ基に
よつて２置換されているか又は４位でトリメチル
アンモニウムにより置換されているフエニル基を
表わし、R2′は非置換のフエニル基を表わし、
R3′は非置換の又は２位でカルボキシル基により
置換されたフエニル基を表わし及びA′-は普通の
反対陰イオンを表わす〕により表わされる。 定義A′-の普通の反対陰イオンは、一般式の
A-に記載したものに相応する。 化合物は良好な水溶性の他に、所望により波長
範囲500〜600nｍで光吸収を行わず、測定反応を
妨害しない。 これらの化合物の製造は、下記文献に記載され
ている自体公知方法により行われる：R.クーン
（Kuhn）、D.イエルヒエル（Jerchel）、ベリヒ
テ・デル・ドイチエン・ヒエミツシエン・ゲゼル
シヤフト（Berichte der Deutschen
Chemischen Gesellschaft）第74巻、94頁（1941
年）；D.イエルヒエル、W.メーレ（Mo¨hle）、ベ
リヒテ・デル・ドイチエン・ヒエミツシエン・ゲ
ゼルシヤフト第77巻、600頁（1944年）；R.ヴイ
ツインゲル（Wizinger）、V.ビスロ（Bisro）、ヘ
ルベチカ・ヒミカ・アクタ（Nelvetica Chimica
Acta）第32巻、909頁（1949年）。 その際、一般式： 〔式中Ｒはエステル化されたカルボキシル基、非
置換のフエニル基又は２−又は４位でカルボキシ
ル基によつて、２−及び４位でニトロ基によつて
２置換されているか又は４位でトリメチルアンモ
ニウムによつて置換されたフエニル基を表わし及
びR2′は非置換のフエニル基を表わす〕の文献公
知のアルデヒドフエニルヒドラゾンを一般式： 〔式中R3′は非置換又は２位でカルボキシル基に
より置換されているフエニル基を表わし及びA′-
は普通の反対陰イオンを表わす〕のジアゾニウム
塩とアルカリ性カツプリングによつて一般式： 〔式中Ｒ及びR2′は一般式に記載したものを表
わし及びR3′は一般式に記載したものを表わす〕
のホルマザンに変える。 その際、定義Ｒのエステル化されたカルボキシ
ル基は有利には低級アルキルエステル化されたカ
ルボキシル基であり、その際低級アルキルはC1
〜C4炭化水素基を表わす。特に有利にはメチル
−又はエチルエステルである。 定義A′-の普通の反対陰イオンは、一般式の
A-に記載したものと同じものである。 アルカリ性アゾカツプリング用の塩基性反応媒
体として例えばジメチルホルムアミド及び／又は
アルコール又はアルコール性アルカリ溶液に溶解
したピリジン、酢酸ナトリウムを使用することが
できる。 アルコールは低級脂肪族アルコール、有利には
メタノール又はエタノールである。 一般式のホルマザンを一般式′のテトラゾ
リウム塩に変えることは、アルコール性塩酸中の
亜硝酸イソペンチルを用いて、D.イエルヒエル、
H.フイツシヤー（Fischer）著、Liebigs Ann.
Chem.第563巻、200頁（1949年）と同様にしてか
又は四酢酸鉛を用いてR.クーン、D.イエルヒエ
ル著ベリヒテ・デル・ドインチエン・ヒエミツシ
エン、ゲゼルシヤフト第74巻、941頁（1941年）
又はD.イエルヒエル、H.フイツシヤー著Liebigs
Ann.Chem.第563巻、200頁（1949年）と同様に
してクロロホルム中で、酸化により行われる。 その際、亜硝酸アミル法は、費用のかかるカラ
ムクロマトグラフイーによる後精製を省略しうる
という利点を有する。しかしこの方法は亜硝酸塩
の酸化力が僅かであるために一般的に使用するこ
とができない。 窒素系中でテトラゾリウム環の二重結合及び陽
電荷は局在性でないので、本発明による一般式
′の化合物を製造するために勿論同様に一般式
′： 〔式中Ｒ、R2′及びR3′は一般式の定義と同じも
のを表わす〕のホルマザンから出発することもで
きる。 一般式′のホルマザンは前記方法と同様にし
て一般式′： のアルデヒドフエニルヒドラゾン及び一般式
′： のジアゾニウム塩から製造することができる。前
記の基は一般式及びに記載したものと同じも
のを表わす。 実施例 次に本発明を実施例につき詳説する。 例 １ テトラゾリウム塩T1、T2、T3、T5、T16及
びT17の製造 (a) 出発ホルマザンの製造 アミン0.1モルを水100mlに懸濁し、12N塩酸
0.3モルの添加亜硝酸ナトリウム1.04モルの濃
水溶液を０〜５℃で滴加することによつてジア
ゾ化する。30分以内に冷却したジアゾニウム塩
溶液を撹拌下及び10℃以下に冷却下にエタノー
ル180ml及びジメチルホルムアミド100ml中のア
ルデヒドフエニルヒドラゾン0.1モル及び酢酸
ナトリウム0.35モル（又はピリジン100ml）の
溶液に滴加し、１時間後撹拌する。生じた晶泥
を吸引濾過し、水で良く洗浄し、次いで少量の
メタノールで洗浄し、引続き乾燥する。こうし
て得られるホルマザンの精製は、氷酢酸、メタ
ノール／水からか又はジメチルホルムアミド／
水から再結晶することによつてか又は溶離剤と
して塩化メチレン／メタノール５：１又は塩化
メチレンを用いて珪酸ゲル60（メルク）でのカ
ラムクロマトグラフイーにより行うことができ
る。この方法により次のホルマザンが得られ
た。
特に有利な化合物は化合物T1、T2、T3、T4、
T5、T6及びT8である。 測定反応の妨害を除去するために添加されるテ
トラゾリウム塩の濃度は試料中の予期される還元
作用を有する妨害物質の量による。一般にテトラ
ゾリウム塩0.001〜100ミリモル／、有利には
0.01〜20ミリモル／、特に有利には0.05〜５ミ
リモル／を使用する。 測定反応として酸化還元反応を用い、還元作用
を有する妨害物質を除去するために１種又は数種
のテトラゾリウム塩を添加して基質又は酵素活性
を測定するための本発明による方法は、その都度
の方法に必要な酵素によりPH値３〜11で実施する
ことができる。範囲6.5〜９が有利である。緩衝
剤としては所望されるPH範囲で十分な緩衝能を有
するような任意の物質を使用することができる。
しかし有利には燐酸塩−又はトリス緩衝剤が使用
される。緩衝剤の濃度は0.01〜１モル／、有利
には0.05〜0.2モル／である。 妨害除去用に添加されるテトラゾリウム塩から
生じるホルマザンの溶解度を改良し、妨害の除去
された反応の反応速度を高めるために、測定すべ
き試料に場合により非イオン性清浄剤、例えばト
リトン（Triton）Ｘ−100、ツイ−ン（Tween）
８０又はホリビニルピロリドンを添加することが
できる。場合により添加されるこの種の清浄剤の
濃度は各清浄剤の臨界ミセル濃度による。一般に
0.01〜５％、特に0.05〜0.5％である。 この方法の有利な態様では、妨害を除去するテ
トラゾリウム塩作用を１種又は数種の電子伝達体
を添加することによつて促進させる。妨害除去反
応を促進するために及び妨害物質の酸化の際の助
剤として若干の電子伝達体を使用することができ
る。例えばフエナジン−メトスルフエート、フエ
ナジン−エトスルフエート、８−ジメチルアミノ
−２，３−ベンゾフエノキサジン、１−メトキシ
−５−メチルフエナジニウム−メチルスルフエー
ト又はジアホラーゼが挙げられる。このうちフエ
ナジン−エトスルフエート又はジアホラーゼが特
に有利である。 測定反応として酸化還元反応を用いて基質又は
酵素活性を測定する際に、付加的なテトラゾリウ
ム塩なしでも一定の妨害除去効果が電子伝達体だ
けを用いても確認することができる。しかし前記
電子伝達体の作用は酸化還元反応の十分であるか
又は全く完全な妨害除去用には十分ではない。こ
のために本発明によるテトラゾリウム塩との組合
せが必要である。 妨害除去すべき試料に添加する電子伝達体の濃
度は有利には0.005〜100ミリモル／、特に有利
には0.05〜５ミリモル／である。ジアホラーゼ
の場合には有利には0.001〜100U／mlの量を使用
するが、その際0.1〜20U／mlの範囲が特に有利
である。 本発明のその他の目的は基質又は酵素活性の光
度測定法的測定用の試薬であるが、これは測定反
応として酸化還元反応を用いて基質又は酵素を測
定するための系統及び付加的に、当該基質−又は
酵素試験で一般的な条件下で還元作用を有する妨
害物質を不可逆的に容易にかつ迅速に除去し、そ
れによつて妨害されない測定を可能にする１種又
は数種のテトラゾリウム塩を含有する。 原則的にはこの種の試薬用に、測定反応を行う
波長範囲で全くか又は無視しうる程度にしか吸収
しないような全てのテトラゾリウム塩を使用する
ことができる。この波長範囲は臨床化学で重要な
多数の基質又は酵素の場合に500〜600nｍであ
る。従つて特に一般式のテトラゾリウム塩が有
利である。測定に必要な残りの試薬成分と組合せ
て化合物T1〜T17が特に有利である。この為に
テトラゾリウム塩T1、T2、T3、T4、T5、T6及
びT8が特に有利であると判明した。 本発明による試薬は１種又は数種のテトラゾリ
ウム塩を含有するが、その濃度は還元作用を有す
る妨害物質の予想すべき量による。一般に濃度は
テトラゾリウム塩0.001〜100ミリモル／、有利
には0.01〜20ミリモル／、特に有利には0.05〜
５ミリモル／である。 測定反応として酸化還元反応を使用し、還元作
用を有する妨害物質を除去するために１種又は数
種のテトラゾリウム塩を添加して基質又は酵素活
性を測定する際に必要な酵素に応じて一定のPH値
を保持するために、本発明による試薬は緩衝剤を
含有することができる。本発明による試薬のPHは
PH３〜11の範囲であり、有利にはPH6.5〜９の範
囲である。この種の値に調整することのできる緩
衝剤は原則的にはそれらのpK値が前記PH範囲で
あるような全てのものである。本発明による試薬
はこれらのうちの任意の緩衝剤を含有することが
できる。本発明による試薬は有利な緩衝剤として
燐酸塩−又はトリス緩衝剤を含有する。試薬中の
緩衝剤の濃度は0.01〜１モル／、有利には0.05
〜0.2モル／であつて良い。 妨害除去用に添加されるテトラゾリウム塩から
生じるホルマザンの溶解性を改良し、妨害除去反
応の反応速度を高めるために、本発明による試薬
は場合により非イオン性清浄剤、例えばトリトン
Ｘ−100、ツイーン80又はポリビニルピロリドン
を含有することができる。この種の清浄剤の濃度
は各々の清浄剤の臨界ミセル濃度による。それは
一般に0.01〜５％、特に0.05〜0.5％である。 特に有利な本発明による試薬は、１種又は数種
のテトラゾリウム塩の他に１種又は数種の電子伝
達体を含有することを特徴とする。この種の電子
伝達体としては例えばフエナジン−メトスルフエ
ート、フエナジン−エトスルフエート、８−ジメ
チルアミノ−２，３−ベンゾフエノキサジン、１
−メトキシ−５−メチルフエナジニウム−メチル
スルフエート又はジアホラーゼが挙げられる。 特に好適な電子伝達体は特定の基質又な酵素活
性の測定に必要な残りの反応成分と組合せてフエ
ナジン−エトスルフエート及び／又はジアホラー
ゼであると判明した。 試薬中の電子伝達体の濃度は0.005〜100ミリモ
ル／、有利には0.05〜５ミリモル／である。
ジアホラーゼの場合に試薬は有利には酵素0.001
〜100U／mlを含有する。濃度範囲0.1〜20U／ml
が特に有利である。 本発明による試薬は、測定反応として酸化還元
反応言用いて基質又は酵素を測定するための系と
して、例えばグルコース測定用に：グルコース−
オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノフ
エナゾン及びフエノール、尿酸測定用に：ウリカ
ーゼ、ペルオキシダーゼ、２−ヒドラゾノ−２，
３−ジヒドロ−３−メチル−６−スルホベンゾチ
アゾール及びＮ−エチル−Ｎ−β−スルホエチル
−ｍ−トルイジン又はコレステリン測定用に：コ
レステリン−エステラーゼ、コレステリン−オキ
シダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノフエナ
ジン及びフエノールを含有することができる。 前記の例に挙げた基質の測定用のこれらの系は
全て公知である。これらの代わりに本発明による
試薬で基質又は酵素の測定用のその他の公知の系
を使用することもできる。 本発明による試薬は、還元作用を有する妨害物
質を除去するために１種又は数種のテトラゾリウ
ム塩及び基質又は酵素測定系の成分としてH2O2
生成酵素、例えば前記したグルコース−オキサダ
ーゼ、ウリカーゼ又はコレステリン−オキシダー
ゼを含有する場合に特に有効であると判明した。
同様に本発明による試薬が測定反応用にフエノー
ル、例えばフエノールそれ自体又は２，４，６−
トリブロムヒドロキシ安息香酸又はアニリン誘導
体、例えばＮ−エチル−Ｎ−β−スルホエチル−
ｍ−トルイジン（これは試薬例えば４−アミノフ
エナゾン、４−アミノ−アンチピリン又は２−ヒ
ドラゾノ−２，３−ジヒドロ−３−メチル−６−
スルホンベンゾチアゾールと酸化的に結合しう
る）を含有する場合に特に有利であると判明し
た。測定反応としてこの種の酸化還元反応の例は
グルコース−、尿酸−又はコレステリン測定用に
既に記載されている。 本発明は迅速診断薬の分野でも使用することが
できる。この種の迅速診断薬は一般に方法実施に
必要な種々の試薬を吸収性の不溶性支持体、例え
ば紙、フリース等に含浸してか又は好適な結合剤
を用いて支持体シート又は膨化性フイルム上に被
覆として塗布して含有する。 １態様では、還元作用を有する妨害物質を除去
するために１種又は数種のテトラゾリウム塩を含
有する本発明による試薬を吸収性支持体、例えば
紙上に含浸させる。この様にして例えばグルコー
ス、尿酸又はコレステリン検出用の例えばアスコ
ルビン酸により事実上妨害されない試験紙が得ら
れる。 しかし本発明によれば、テトラゾリウム塩を別
の支持体上に塗布し、これを残りの試薬の支持体
と例えばその上に置くか貼り着けるか又は一緒に
封入するかして合することもできる。この種の実
施例では例えば水溶性の紙（例えば西ドイツ特許
公開公報第2436598号明細書）をテトラゾリウム
塩で含浸することができ、一方基質又は酵素活性
の測定用に必要な系は水に不溶性の吸収性の支持
体材料上に含浸されている。２つの支持体材料を
有利には、測定すべき試料が先ずテトラゾリウム
塩と接し次いで水に不溶性の支持体材料に接する
ように相互に積層する。 有利な１態様では、支持体材料の別々の帯域を
テトラゾリウム塩及び試験試薬で含浸しても良
い。この場合に、有利には支持体を検査すべき溶
液と、溶液が先ずテトラゾリウム塩含有の帯域と
接触し、そこから残りの必要に試験試薬を含有す
る帯域へ吸収されるように接触させる。この種の
態様を説明するために第１図に、装置の例を横断
面で図示するが、この装置により、西ドイツ特許
出願公告第3029579号明細書によれば、一方では
全血から試験に必要な血清又は血漿を分離し、他
方では試薬−及び助剤層の特別に形成された構造
により温度調整、前反応及び主反応の目的とされ
る開始が可能となる。 第１図による装置は次のような構成である：不
活性の支持体フイルム８上にガラス繊維から成る
移送フリース７が固定されている。この移送フリ
ースを部分的に被つて同様にガラス繊維から成る
フリース５が固定網６により固定されている。フ
リース５と移送フリース７の間には、測定反応を
妨害する還元作用を有する物質を除去することが
できる物質を含浸してある妨害除去織物４が配置
されている。移送フリース７の側面には接着部９
を介して透明なプラスチツクから成る透明なシー
ト１が固定されている。この透明なシート１の下
には、測定反応に必要な物質が混入されている膨
張性又は吸収性のフイルムから成る試薬層２が付
与されている。試薬層２の下には一般に、強力な
反射作用を有する物質例えば硫酸バリウム、二酸
化チタン又は類似物と混合してあり光学的に白色
背景として役立つプラスチツク−又はゼラチンフ
イルムから成る被覆層３が設けられている。観察
用に照射される光は十分完全に軽減され、フリー
ス７の場合による変色は顕著ではない。試薬層２
及び被覆層３は共通して試験層と称される。 固定網６上に全血を載せると、これはガラス繊
維フリース５中で血清と赤血球で分離され、その
際赤血球が固持される。妨害除去織物４を通過す
る際に測定反応を妨害する還元作用を有する内容
物質は除去されるので、移送フリース７の左側部
分に測定を妨害する物質を含まない血清だけが移
る。透明シート１を押した後測定反応は、血清が
移送フリース７を完全に満たした後に開始する。
血清は圧縮接触に依つて被覆層３を通つて試薬層
２に浸透し、この層を均一に完全に湿らす。反応
は透明シート１を通して試薬層２の変色により観
察される。 本発明による方法及び試薬に使用することがで
きるテトラゾリウム塩５−カルボキシ−３−（２
−カルボキシフエニル）−２−フエニル−２−Ｈ
−テトラゾリウムヒドロキシド、分子内塩
（T1）、３−（２−カルボキシフエニル）−２，５
−ジフエニル−２−Ｈ−テトラゾリウムヒドロキ
シド、分子内塩（T2）、２，３−ジフエニル−５
−（２，４−ジニトロフエニル）−２−Ｈ−テトラ
ゾリウムクロリド（T3）、２，３−ジフエニル−
５−〔４−（トリメチルアンモニオフエニル）〕−２
−Ｈ−テトラゾリウム−ジクロリド（T5）及び
３−（２−カルボキシフエニル）−５−（４−カル
ボキシフエニル）−２−フエニル−２−Ｈ−テト
ラゾリウムヒドロキシド、分子内塩（T16）及び
３，５−ビス−（２−カルボキシフエニル）−２−
フエニル−２−Ｈ−テトラゾリウムクロリド
（T17）は新規化合物であり、同様に本発明の目
的である。これらは一般式′： 〔式中、R1′はカルボキシ基、２−又は４位でカ
ルボキシ基によつて、２−及び４位でニトロ基に
よつて２置換されているか又は４位でトリメチル
アンモニウムにより置換されているフエニル基を
表わし、R2′は非置換のフエニル基を表わし、
R3′は非置換の又は２位でカルボキシル基により
置換されたフエニル基を表わし及びA′-は普通の
反対陰イオンを表わす〕により表わされる。 定義A′-の普通の反対陰イオンは、一般式の
A-に記載したものに相応する。 化合物は良好な水溶性の他に、所望により波長
範囲500〜600nｍで光吸収を行わず、測定反応を
妨害しない。 これらの化合物の製造は、下記文献に記載され
ている自体公知方法により行われる：R.クーン
（Kuhn）、D.イエルヒエル（Jerchel）、ベリヒ
テ・デル・ドイチエン・ヒエミツシエン・ゲゼル
シヤフト（Berichte der Deutschen
Chemischen Gesellschaft）第74巻、94頁（1941
年）；D.イエルヒエル、W.メーレ（Mo¨hle）、ベ
リヒテ・デル・ドイチエン・ヒエミツシエン・ゲ
ゼルシヤフト第77巻、600頁（1944年）；R.ヴイ
ツインゲル（Wizinger）、V.ビスロ（Bisro）、ヘ
ルベチカ・ヒミカ・アクタ（Nelvetica Chimica
Acta）第32巻、909頁（1949年）。 その際、一般式： 〔式中Ｒはエステル化されたカルボキシル基、非
置換のフエニル基又は２−又は４位でカルボキシ
ル基によつて、２−及び４位でニトロ基によつて
２置換されているか又は４位でトリメチルアンモ
ニウムによつて置換されたフエニル基を表わし及
びR2′は非置換のフエニル基を表わす〕の文献公
知のアルデヒドフエニルヒドラゾンを一般式： 〔式中R3′は非置換又は２位でカルボキシル基に
より置換されているフエニル基を表わし及びA′-
は普通の反対陰イオンを表わす〕のジアゾニウム
塩とアルカリ性カツプリングによつて一般式： 〔式中Ｒ及びR2′は一般式に記載したものを表
わし及びR3′は一般式に記載したものを表わす〕
のホルマザンに変える。 その際、定義Ｒのエステル化されたカルボキシ
ル基は有利には低級アルキルエステル化されたカ
ルボキシル基であり、その際低級アルキルはC1
〜C4炭化水素基を表わす。特に有利にはメチル
−又はエチルエステルである。 定義A′-の普通の反対陰イオンは、一般式の
A-に記載したものと同じものである。 アルカリ性アゾカツプリング用の塩基性反応媒
体として例えばジメチルホルムアミド及び／又は
アルコール又はアルコール性アルカリ溶液に溶解
したピリジン、酢酸ナトリウムを使用することが
できる。 アルコールは低級脂肪族アルコール、有利には
メタノール又はエタノールである。 一般式のホルマザンを一般式′のテトラゾ
リウム塩に変えることは、アルコール性塩酸中の
亜硝酸イソペンチルを用いて、D.イエルヒエル、
H.フイツシヤー（Fischer）著、Liebigs Ann.
Chem.第563巻、200頁（1949年）と同様にしてか
又は四酢酸鉛を用いてR.クーン、D.イエルヒエ
ル著ベリヒテ・デル・ドインチエン・ヒエミツシ
エン、ゲゼルシヤフト第74巻、941頁（1941年）
又はD.イエルヒエル、H.フイツシヤー著Liebigs
Ann.Chem.第563巻、200頁（1949年）と同様に
してクロロホルム中で、酸化により行われる。 その際、亜硝酸アミル法は、費用のかかるカラ
ムクロマトグラフイーによる後精製を省略しうる
という利点を有する。しかしこの方法は亜硝酸塩
の酸化力が僅かであるために一般的に使用するこ
とができない。 窒素系中でテトラゾリウム環の二重結合及び陽
電荷は局在性でないので、本発明による一般式
′の化合物を製造するために勿論同様に一般式
′： 〔式中Ｒ、R2′及びR3′は一般式の定義と同じも
のを表わす〕のホルマザンから出発することもで
きる。 一般式′のホルマザンは前記方法と同様にし
て一般式′： のアルデヒドフエニルヒドラゾン及び一般式
′： のジアゾニウム塩から製造することができる。前
記の基は一般式及びに記載したものと同じも
のを表わす。 実施例 次に本発明を実施例につき詳説する。 例 １ テトラゾリウム塩T1、T2、T3、T5、T16及
びT17の製造 (a) 出発ホルマザンの製造 アミン0.1モルを水100mlに懸濁し、12N塩酸
0.3モルの添加亜硝酸ナトリウム1.04モルの濃
水溶液を０〜５℃で滴加することによつてジア
ゾ化する。30分以内に冷却したジアゾニウム塩
溶液を撹拌下及び10℃以下に冷却下にエタノー
ル180ml及びジメチルホルムアミド100ml中のア
ルデヒドフエニルヒドラゾン0.1モル及び酢酸
ナトリウム0.35モル（又はピリジン100ml）の
溶液に滴加し、１時間後撹拌する。生じた晶泥
を吸引濾過し、水で良く洗浄し、次いで少量の
メタノールで洗浄し、引続き乾燥する。こうし
て得られるホルマザンの精製は、氷酢酸、メタ
ノール／水からか又はジメチルホルムアミド／
水から再結晶することによつてか又は溶離剤と
して塩化メチレン／メタノール５：１又は塩化
メチレンを用いて珪酸ゲル60（メルク）でのカ
ラムクロマトグラフイーにより行うことができ
る。この方法により次のホルマザンが得られ
た。
【表】
媒体Ａ：ジメチルホルムアミド／酢酸ナトリウム
Ｂ：ジメチルホルムアミド／ピリジン
Ｃ：エタノール性アルカリ溶液（KOH又は
NaOH） F1 ２−（３−カルボキシエチル−５−フエニル
−１−ホルマザノ）安息香酸 F2 ２−（３，５−ジフエニル−１−ホルマザ
ノ）安息香酸 F3 １，５−ジフエニル−３−（２，４−ジニト
ロフエニル）ホルマザン F5 ４−（１，５−ジフエニル−３−ホルマザ
ノ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニオクロ
リド F16 ２，4′−（５−フエニル−１，３−ホルマザ
ンジリル）ビス−安息香酸 F17 ２，2′−（５−フエニル−１，３−ホルマザ
ンジリル）ビス−安息香酸 (b) ホルマザンの酸化 (A) 四酢酸鉛法 ホルマザン0.1モルを無水クロロホルムに
溶解し、四酢酸鉛0.12モルを加える。30分間
撹拌し、その後不溶物を吸引濾過する。濾液
を蒸発濃縮し、残渣を水の添加後に吸引濾過
し、濾液を2N塩酸で酸性にする。こうして
沈澱した塩化鉛を吸引濾過し、濾液を濃縮
し、残渣をエタノールから再結晶するか又は
溶離剤としてクロロホルム／メタノール19：
１、クロロホルム／塩化メチレン５：１又は
塩化メチレン／メタノール５：１を用いて珪
酸ゲル60（メルク）でカラムクロマトグラフ
イーにかけることによつて精製する。 (B) 亜硫酸イソペンチル法 ホルマザン0.1モルを10〜20倍量のエタノ
ールに懸濁し、亜硝酸イソペンチル0.2モル
を添加し、20分以内にエタノール性塩酸0.15
モルを撹拌下に滴加する。引続き１時間後撹
拌する。次いで反応混合物がまだ褐色しない
場合には、完全に褐色するまで40℃に加熱す
る。テトラゾリウム塩をエーテル添加により
沈澱させ、吸引濾過し乾燥する。精製するた
めに生成物をメタノール又はイソプロパノー
ルと混合し、吸引濾過し、乾燥する。再結晶
はメタノール、メタノール／水又は氷酢酸か
ら行うことができる。有利にはテトラゾリウ
ム塩を精製するために、クロロホルム／メタ
ノール19：１、クロロホルム／塩化メチレン
５：１又は塩化メチレン／メタノール＝５：
１を用いて珪酸ゲル60（メルク）のカラムク
ロマトグラフイーを用いる。 ２つの方法(A)又は(B)により下記のテトラゾリウ
ム塩を製造した。
NaOH） F1 ２−（３−カルボキシエチル−５−フエニル
−１−ホルマザノ）安息香酸 F2 ２−（３，５−ジフエニル−１−ホルマザ
ノ）安息香酸 F3 １，５−ジフエニル−３−（２，４−ジニト
ロフエニル）ホルマザン F5 ４−（１，５−ジフエニル−３−ホルマザ
ノ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニオクロ
リド F16 ２，4′−（５−フエニル−１，３−ホルマザ
ンジリル）ビス−安息香酸 F17 ２，2′−（５−フエニル−１，３−ホルマザ
ンジリル）ビス−安息香酸 (b) ホルマザンの酸化 (A) 四酢酸鉛法 ホルマザン0.1モルを無水クロロホルムに
溶解し、四酢酸鉛0.12モルを加える。30分間
撹拌し、その後不溶物を吸引濾過する。濾液
を蒸発濃縮し、残渣を水の添加後に吸引濾過
し、濾液を2N塩酸で酸性にする。こうして
沈澱した塩化鉛を吸引濾過し、濾液を濃縮
し、残渣をエタノールから再結晶するか又は
溶離剤としてクロロホルム／メタノール19：
１、クロロホルム／塩化メチレン５：１又は
塩化メチレン／メタノール５：１を用いて珪
酸ゲル60（メルク）でカラムクロマトグラフ
イーにかけることによつて精製する。 (B) 亜硫酸イソペンチル法 ホルマザン0.1モルを10〜20倍量のエタノ
ールに懸濁し、亜硝酸イソペンチル0.2モル
を添加し、20分以内にエタノール性塩酸0.15
モルを撹拌下に滴加する。引続き１時間後撹
拌する。次いで反応混合物がまだ褐色しない
場合には、完全に褐色するまで40℃に加熱す
る。テトラゾリウム塩をエーテル添加により
沈澱させ、吸引濾過し乾燥する。精製するた
めに生成物をメタノール又はイソプロパノー
ルと混合し、吸引濾過し、乾燥する。再結晶
はメタノール、メタノール／水又は氷酢酸か
ら行うことができる。有利にはテトラゾリウ
ム塩を精製するために、クロロホルム／メタ
ノール19：１、クロロホルム／塩化メチレン
５：１又は塩化メチレン／メタノール＝５：
１を用いて珪酸ゲル60（メルク）のカラムク
ロマトグラフイーを用いる。 ２つの方法(A)又は(B)により下記のテトラゾリウ
ム塩を製造した。
【表】
化メチレン／メタ
ノール＝5：1
酸化方法Ａ：四酢散鉛−クロロホルム Ｂ：亜硝酸イソペンチル−エタノール性
塩酸 T1 ５−カルボキシ−３−（２−カルボキシフエ
ニル）−２−フエニル−２−Ｈ−テトラゾリウ
ムヒドロキシド、分子内塩 T2 ３−（２−カルボキシフエニル）−２，５−
ジフエニル−２−Ｈ−テトラゾリウムヒドロキ
シド、分子内塩 T3 ２，３−ジフエニル−５−（２，４−ジニト
ロフエニル）−２−Ｈ−テトラゾリウムクロリ
ド T5 ２，３−ジフエニル−５−〔４−（トリメチ
ルアンモニオペンチル）〕−２−Ｈ−テトラゾリ
ウム−ジクロリド T16 ３−（２−カルボキシフエニル）−５−（４
−カルボキシフエニル）−２−フエニル−２−
Ｈ−テトラゾリウムヒドロキシド、分子内塩 T17 ３，５−ビス−（２−カルボキシフエニル）
−２−フエニル−２−Ｈ−テトラゾリウムクロ
リド 例 ２ 種々の妨害物質の存在における尿酸測定 層厚１cmのキユベツトＡ、Ｂ及びＣ中に下記の
溶液をピペツトで入れる：
ノール＝5：1
酸化方法Ａ：四酢散鉛−クロロホルム Ｂ：亜硝酸イソペンチル−エタノール性
塩酸 T1 ５−カルボキシ−３−（２−カルボキシフエ
ニル）−２−フエニル−２−Ｈ−テトラゾリウ
ムヒドロキシド、分子内塩 T2 ３−（２−カルボキシフエニル）−２，５−
ジフエニル−２−Ｈ−テトラゾリウムヒドロキ
シド、分子内塩 T3 ２，３−ジフエニル−５−（２，４−ジニト
ロフエニル）−２−Ｈ−テトラゾリウムクロリ
ド T5 ２，３−ジフエニル−５−〔４−（トリメチ
ルアンモニオペンチル）〕−２−Ｈ−テトラゾリ
ウム−ジクロリド T16 ３−（２−カルボキシフエニル）−５−（４
−カルボキシフエニル）−２−フエニル−２−
Ｈ−テトラゾリウムヒドロキシド、分子内塩 T17 ３，５−ビス−（２−カルボキシフエニル）
−２−フエニル−２−Ｈ−テトラゾリウムクロ
リド 例 ２ 種々の妨害物質の存在における尿酸測定 層厚１cmのキユベツトＡ、Ｂ及びＣ中に下記の
溶液をピペツトで入れる：
【表】
載されている。
各々のキユベツトにピペツトで入れた溶液を混
合し、１分間25℃で恒温保持する。次いで下記組
成の尿酸試薬２mlを添加する： 燐酸カリウム 0.1モル／、PH８ ２，４，６−トリブロムヒドロキシ安息香酸
20ミリモル／ ４−アミノアンチピリン 0.1ミリモル／ ナトリウムアジド １ｇ／ ペルオキシダーゼ 4U／ml ウリカーゼ 2U／ml 25℃で５分間恒温保持後、各反応混合物の吸光
を波長546nｍで試薬盲検値（試料なし）に対し
て測定する。検定用に測定すべき試料の代りに水
性尿酸標準物質（６mg／dl）を用いる。 キユベツトＡ（妨害物質なし）中の測定した尿
酸濃度を100％として使用する。妨害物質の存在
における尿酸再現率（Harnsaure
wiederfindungsrate）を次の例２(a)〜(h)で実験的
に測定する。この結果から、キユベツト系列Ｃ
（テトラゾリウム塩添加）中の再現率は添加なし
（キユベツト系列Ｂ）よりも著しく高いことが証
明される。 テトラゾリウム塩及び／又は電子伝達体の下記
に記載した濃度は、この基質及び緩衝剤の添加後
の測定すべき溶液中の最終濃度に関する。 (a) 妨害物質：アスコルビン酸塩３mg／dl T3：0.4ミリモル／ フエナジン−エトスルフエート（PES）：20μ
モル／
各々のキユベツトにピペツトで入れた溶液を混
合し、１分間25℃で恒温保持する。次いで下記組
成の尿酸試薬２mlを添加する： 燐酸カリウム 0.1モル／、PH８ ２，４，６−トリブロムヒドロキシ安息香酸
20ミリモル／ ４−アミノアンチピリン 0.1ミリモル／ ナトリウムアジド １ｇ／ ペルオキシダーゼ 4U／ml ウリカーゼ 2U／ml 25℃で５分間恒温保持後、各反応混合物の吸光
を波長546nｍで試薬盲検値（試料なし）に対し
て測定する。検定用に測定すべき試料の代りに水
性尿酸標準物質（６mg／dl）を用いる。 キユベツトＡ（妨害物質なし）中の測定した尿
酸濃度を100％として使用する。妨害物質の存在
における尿酸再現率（Harnsaure
wiederfindungsrate）を次の例２(a)〜(h)で実験的
に測定する。この結果から、キユベツト系列Ｃ
（テトラゾリウム塩添加）中の再現率は添加なし
（キユベツト系列Ｂ）よりも著しく高いことが証
明される。 テトラゾリウム塩及び／又は電子伝達体の下記
に記載した濃度は、この基質及び緩衝剤の添加後
の測定すべき溶液中の最終濃度に関する。 (a) 妨害物質：アスコルビン酸塩３mg／dl T3：0.4ミリモル／ フエナジン−エトスルフエート（PES）：20μ
モル／
【表】
(b) 妨害物質：ビリルビン
T8：0.4ミリモル／
PES：20μモル／
【表】
(c) 妨害物質：α−メチル−ドーパ20mg／
T3又はT5：0.5ミリモル／
PES：25μモル／
試料：尿酸−標準物質６mg／dl
再現率（％）テトラゾリウム塩 Ｂ Ｃ
T3 62 94
T5 62 94
(d) 妨害物質：カルシウム−ドベシレート25mg／
T3：0.6ミリモル／ PES：25μモル／ 再現率（％） Ｂ Ｃ 90 98 (e) 妨害物質：アスコルビン酸塩３mg／dl テトラゾリウム塩：0.06ミリモル／ PES：25μモル／ 試料：尿酸−標準物質６mg／dl
T3：0.6ミリモル／ PES：25μモル／ 再現率（％） Ｂ Ｃ 90 98 (e) 妨害物質：アスコルビン酸塩３mg／dl テトラゾリウム塩：0.06ミリモル／ PES：25μモル／ 試料：尿酸−標準物質６mg／dl
【表】
【表】
(f) 妨害物質：アスコルビン酸塩３mg／dl
T8：0.4ミリモル／
PES：20μモル／
試料：ヒトの血清
再現率（％）
Ｂ Ｃ
72 93
(g) 妨害物質：アスコルビン酸塩３mg／dl
T8：0.4ミリモル／
ジアホラーゼ 0.4U／ml
再現率（％）試料のヒトの血清 Ｂ Ｃ
62 94
(h) 妨害物質：アスコルビン酸塩17.6mg／dl
PES／25μモル／
試料：尿酸標準物質６mg／dl
再現率（％）
Ｂ Ｃ
６ 53
例 ３
アスコルビン酸の不在におけるグルコース測定
層厚１cmのキユベツトＡ、Ｂ及びＣに下記溶液
をピペツトで入れる：
をピペツトで入れる：
【表】
各キユベツトにピペツトで入れた溶液を混合
し、５分間25℃で恒温保持する。次いで下記組成
のグルコース試薬２mlの添加を行う： トリス−燐酸塩−緩衝剤180ミリモル／、PH7.8 フエノール 11ミリモル／ ３，４−ジクロルフエノール 2.1ミリモル／ 脂肪アルコールポリグリコールエーテル 0.24％ ４−アミノフエナゾン 0.8ミリモル／ ペルオキシダーゼ 1U／ml グルコースオキシダーゼ 15U／ml 25℃で30分間恒温保持後、各反応混合物の吸光
を波長546nｍで試薬盲検値（試料なし）に対し
て測定する。検定用に測定すべき試料の代りに水
性グルコース標準物質（100mg／dl）を用いる。 キユベツトＡ（妨害物質なし）中の測定したグ
ルコース濃度を100％として使用する。妨害物質
の存在におけるグルコース再現率を下記実施例３
(a)及び３(b)で実験的に測定する。この結果から、
キユベツト系列Ｃ（テトラゾリウム塩添加）の再
現率が添加なし（キユベツト系列Ｂ）に比して著
しく高いことが証明される。 テトラゾリウム塩T3及び電子伝達体PESの下
記に記載した濃度はこれらの物質及び緩衝剤の添
加後の測定すべき溶液の最終濃度に関する。妨害
物質アスコルビン酸の濃度は各々緩衝剤、T3及
びPES添加前の試料中の濃度に関する。 (a) グルコース濃度：25mg／dl 妨害物質：アスコルビン酸塩 T3：0.25ミリモル／ PES：20μモル／ 再現率（％）アスコルビン酸塩濃度 Ｂ Ｃ ３mg／dl 65 94 ６mg／dl 27 91 12mg／dl ０ 85 (b) グルコース濃度：50mg／dl 妨害物質：アスコルビン酸塩 ３mg／dl T3：0.25ミリモル／ PES：20μモル／ 再現率（％） Ｂ Ｃ 83 94 例 ４ 血中の尿酸測定試薬系 (a) 尿酸検出用試薬層 下記成分から被覆材料を製造し、湿潤フイル
ム厚200μｍで透明シート１上に塗布し、乾燥
する：酢酸ビニル及びプロピオン酸ビニルから
成る共重合体のプラスチツク分散液18ｇ：アル
ギン酸塩1.38ｇ；トリス−クエン酸塩−緩衝剤
PH7.5、0.45ｍ、69ｇ；指示薬２−（３，５−ジ
メトキシ−４−ヒドロキシフエニル）−４−(5)
−（４−ジメチルアミノフエニル）−５−(4)−メ
チル−（1H）−イミダゾール−ヒドロクロリド
0.47ｇ：１−（３−クロルフエニル）−セミカル
バジド0.025ｇ：MgK2EDTA.2H2O0.025ｇ；
トリトンX100 0.5ｇ；ヘキサノール0.6ｇ；ペ
ルオキシダーゼ200KU；ウリカーゼ2KU。 こうして製造した試薬層２上に被覆層３を層
厚200μｍで下記組成の光学的に白色の背景と
して塗布し、乾燥する。0.1ｍトリス−クエン
酸塩−緩衝剤PH7.0 52ml；二酸化チタン5.5
ｇ；珪藻士2.7ｇ；アルギン酸塩0.4ｇ；酢酸ビ
ニル及びプロピオン酸ビニルから成る共重合体
のプラスチツク分散液1.4ｇ；トリトンX100
0.2ｇ。 (b) 妨害除去織物４ ナイロン織物〔チユーリツヒヤー・ボイテル
テウ−フフアブリーク（Firma Zuricher
Beuteltuchfabrik）社のタイプ（Type）
NY75HC〕を下記溶液で含浸し、60℃で乾燥
する： ５−（２，４−ジニトロフエニル）−２，３−
ジフエニル−テトラゾリウム−クロリド（T3）
５mg；フエナジン−エトスルフエート５mg；ジ
オクチルスルホサクシネート−ナトリウム30
mg；0.5ｍ燐酸塩緩衝剤PH7.5で全量100ml。 比較試験用材料として同じ織物を、緩衝剤及
び湿潤剤のみを含有するがテトラゾリウム塩及
びフエナジン−エトスルフエートは含有しない
相応する溶液で含浸する。 (c) 総合系 前記成分を第１図による試薬系に加工する。
この試薬は血液、血漿及び血清からの尿酸の測
定に好適である。 (d) 試験実施 尿酸を測定するために血清30μを固定網６
上にのせ、透明シート１を１分後に押しつけ、
更に２分後に反射度計を用いて生じた色を測定
し、前以つて測定した検量線から尿酸値を求め
る。 尿酸含量6.2mg／dlを有する血清試料を２つ
の部分に分ける。１つの部分にアスコルビン酸
を、含量２mg／dlが生じるように添加する。２
つの血清試料をテトラゾリウム塩を含有する試
薬系及び比較用に役立つテトラゾリウム塩不含
の試薬系を用いて検査する。 下記の尿酸値（mg／dl）が測定される：
し、５分間25℃で恒温保持する。次いで下記組成
のグルコース試薬２mlの添加を行う： トリス−燐酸塩−緩衝剤180ミリモル／、PH7.8 フエノール 11ミリモル／ ３，４−ジクロルフエノール 2.1ミリモル／ 脂肪アルコールポリグリコールエーテル 0.24％ ４−アミノフエナゾン 0.8ミリモル／ ペルオキシダーゼ 1U／ml グルコースオキシダーゼ 15U／ml 25℃で30分間恒温保持後、各反応混合物の吸光
を波長546nｍで試薬盲検値（試料なし）に対し
て測定する。検定用に測定すべき試料の代りに水
性グルコース標準物質（100mg／dl）を用いる。 キユベツトＡ（妨害物質なし）中の測定したグ
ルコース濃度を100％として使用する。妨害物質
の存在におけるグルコース再現率を下記実施例３
(a)及び３(b)で実験的に測定する。この結果から、
キユベツト系列Ｃ（テトラゾリウム塩添加）の再
現率が添加なし（キユベツト系列Ｂ）に比して著
しく高いことが証明される。 テトラゾリウム塩T3及び電子伝達体PESの下
記に記載した濃度はこれらの物質及び緩衝剤の添
加後の測定すべき溶液の最終濃度に関する。妨害
物質アスコルビン酸の濃度は各々緩衝剤、T3及
びPES添加前の試料中の濃度に関する。 (a) グルコース濃度：25mg／dl 妨害物質：アスコルビン酸塩 T3：0.25ミリモル／ PES：20μモル／ 再現率（％）アスコルビン酸塩濃度 Ｂ Ｃ ３mg／dl 65 94 ６mg／dl 27 91 12mg／dl ０ 85 (b) グルコース濃度：50mg／dl 妨害物質：アスコルビン酸塩 ３mg／dl T3：0.25ミリモル／ PES：20μモル／ 再現率（％） Ｂ Ｃ 83 94 例 ４ 血中の尿酸測定試薬系 (a) 尿酸検出用試薬層 下記成分から被覆材料を製造し、湿潤フイル
ム厚200μｍで透明シート１上に塗布し、乾燥
する：酢酸ビニル及びプロピオン酸ビニルから
成る共重合体のプラスチツク分散液18ｇ：アル
ギン酸塩1.38ｇ；トリス−クエン酸塩−緩衝剤
PH7.5、0.45ｍ、69ｇ；指示薬２−（３，５−ジ
メトキシ−４−ヒドロキシフエニル）−４−(5)
−（４−ジメチルアミノフエニル）−５−(4)−メ
チル−（1H）−イミダゾール−ヒドロクロリド
0.47ｇ：１−（３−クロルフエニル）−セミカル
バジド0.025ｇ：MgK2EDTA.2H2O0.025ｇ；
トリトンX100 0.5ｇ；ヘキサノール0.6ｇ；ペ
ルオキシダーゼ200KU；ウリカーゼ2KU。 こうして製造した試薬層２上に被覆層３を層
厚200μｍで下記組成の光学的に白色の背景と
して塗布し、乾燥する。0.1ｍトリス−クエン
酸塩−緩衝剤PH7.0 52ml；二酸化チタン5.5
ｇ；珪藻士2.7ｇ；アルギン酸塩0.4ｇ；酢酸ビ
ニル及びプロピオン酸ビニルから成る共重合体
のプラスチツク分散液1.4ｇ；トリトンX100
0.2ｇ。 (b) 妨害除去織物４ ナイロン織物〔チユーリツヒヤー・ボイテル
テウ−フフアブリーク（Firma Zuricher
Beuteltuchfabrik）社のタイプ（Type）
NY75HC〕を下記溶液で含浸し、60℃で乾燥
する： ５−（２，４−ジニトロフエニル）−２，３−
ジフエニル−テトラゾリウム−クロリド（T3）
５mg；フエナジン−エトスルフエート５mg；ジ
オクチルスルホサクシネート−ナトリウム30
mg；0.5ｍ燐酸塩緩衝剤PH7.5で全量100ml。 比較試験用材料として同じ織物を、緩衝剤及
び湿潤剤のみを含有するがテトラゾリウム塩及
びフエナジン−エトスルフエートは含有しない
相応する溶液で含浸する。 (c) 総合系 前記成分を第１図による試薬系に加工する。
この試薬は血液、血漿及び血清からの尿酸の測
定に好適である。 (d) 試験実施 尿酸を測定するために血清30μを固定網６
上にのせ、透明シート１を１分後に押しつけ、
更に２分後に反射度計を用いて生じた色を測定
し、前以つて測定した検量線から尿酸値を求め
る。 尿酸含量6.2mg／dlを有する血清試料を２つ
の部分に分ける。１つの部分にアスコルビン酸
を、含量２mg／dlが生じるように添加する。２
つの血清試料をテトラゾリウム塩を含有する試
薬系及び比較用に役立つテトラゾリウム塩不含
の試薬系を用いて検査する。 下記の尿酸値（mg／dl）が測定される：
【表】
不含
第１図は本発明を実施する装置の横断面図であ
る。図中、１……透明シート、２……試薬層、３
……被覆層、４……妨害除去織物、５……ガラス
繊維フリース、６……固定網、７……移送フリー
ス、８……支持体シート、９……接着部。
る。図中、１……透明シート、２……試薬層、３
……被覆層、４……妨害除去織物、５……ガラス
繊維フリース、６……固定網、７……移送フリー
ス、８……支持体シート、９……接着部。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 測定反応として光度測定法で検出可能な酸化
還元反応を使用して基質又は酵素活性を測定する
方法において、この方法を、付加的に添加される
１種又は数種のテトラゾリウム塩の存在で操作
し、この際、テトラゾリウム塩及びそのホルマザ
ンは測定反応の波長で光を吸収しないか又は無視
しうる程度にのみ吸収するものであることを特徴
とする、基質又は酵素活性を測定するための方
法。 ２ 付加的なテトラゾリウム塩として、一般式
Ｉ： ［式中R1は水素、カルボキシル−、アルキル−、
フエニル−、ニトロフエニル−、ジニトロフエニ
ル−、カルボキシル置換されたフエニル−又はト
リアルキルアンモニウムフエニル基を表わし、
R2はフエニル−、ニトロフエニル、ビフエニリ
ル−又はナフチル基を表わし、R3はフエニル−、
カルボキシル置換されたフエニル−、カルボキシ
ル置換されたヒドロキシフエニル−又はジメチル
アゾリル基を表わし及びA-は普通の反対イオン
を表わす］を有するようなものを使用する、特許
請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 更に１種又は数種の電子伝達体を使用する、
特許請求の範囲第１項及び第２項のいずれか１項
に記載の方法。 ４ 電子伝達体としてフエナジンメトスルフエー
ト、フエナジンエトスルフエート、８−ジメチル
アミノ−２，３−ベンゾフエノキサジン、１−メ
トキシ−５−メチルフエナジニウム−メチルスル
フエート又はジアホラーゼを使用する、特許請求
の範囲第３記載の方法。 ５ 測定反応として光度測定法で検出可能な酸化
還元反応を用いて、基質又は酵素を測定する系を
含有する基質又は酵素活性の酵素的測定試薬にお
いて、付加的に、還元時に生じる相応するホルマ
ザンと同様に測定反応の波長で光を吸収しないか
又は無視しうる程度にのみ吸収するテトラゾリウ
ム塩１種又は数種を含有することを特徴とする、
基質又は酵素活性を測定するための試薬。 ６ 付加的なテトラゾリウム塩として一般式Ｉ： ［式中R1は水素、カルボキシル−、アルキル−、
フエニル−、ニトロフエニル−、ジニトロフエニ
ル−、カルボキシル置換されたフエニル−又はト
リアルキルアンモニウムフエニル基を表わし、
R2はフエニル−、ニトロフエニル、ビフエニリ
ル−又はナフチル基を表わし、R3はフエニル−、
カルボキシル置換されたフエニル−、カルボキシ
ル置換されたヒドロキシフエニル−又はジメチル
チアゾリル基を表わし及びA-は普通の反対イオ
ンを表わす］を有するようなものを含有する、特
許請求の範囲第５項に記載の試薬。 ７ 付加的に１種又は数種の電子伝達体を含有す
る、特許請求の範囲第１項から第６項までのいず
れか１項に記載の試薬。 ８ 不溶性支持体上に含浸して存在する、特許請
求の範囲第５項から第７項までのいずれか１項に
記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19863611227 DE3611227A1 (de) | 1986-04-04 | 1986-04-04 | Verfahren und reagenz zur bestimmung von substraten oder enzymaktivitaeten |
| DE3611227.5 | 1986-04-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62249979A JPS62249979A (ja) | 1987-10-30 |
| JPH0445510B2 true JPH0445510B2 (ja) | 1992-07-27 |
Family
ID=6297866
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62081357A Granted JPS62249979A (ja) | 1986-04-04 | 1987-04-03 | 基質又は酵素活性を測定するための方法及び試薬 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5013647A (ja) |
| EP (1) | EP0239931B1 (ja) |
| JP (1) | JPS62249979A (ja) |
| AT (1) | ATE73782T1 (ja) |
| DE (2) | DE3611227A1 (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5196314A (en) * | 1986-04-04 | 1993-03-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process and reagent for the determination of substrates or enzyme activities |
| JPS6348457A (ja) * | 1986-08-19 | 1988-03-01 | Fuji Photo Film Co Ltd | 乾式多層分析要素 |
| JP2796150B2 (ja) * | 1989-12-20 | 1998-09-10 | 株式会社ヤトロン | フルクトサミンの測定方法 |
| CA2049209C (en) * | 1990-09-19 | 1992-03-20 | Jurgen Kocher | Phenyl-substituted 2-thiazolyl tetrazolium salt indicators |
| US5290536A (en) * | 1990-09-19 | 1994-03-01 | Miles Inc. | Phenyl substituted 2-thiazolyl tetrazolium salt indicators |
| US5126275A (en) * | 1990-09-19 | 1992-06-30 | Miles Inc. | Analytical method using tetrazolium salt indicators having a reflectance plateau |
| CA2049237C (en) * | 1990-09-19 | 1999-10-19 | Gunther Beck | 2-thiazolyl tetrazolium salt indicators |
| US5250695A (en) * | 1992-06-15 | 1993-10-05 | Miles Inc. | Use of specific counteranions to modify the solubility of tetrazolium salts |
| US6352835B1 (en) * | 1998-11-17 | 2002-03-05 | Kyoto Daiichi Kagaku Co. Ltd. | Method of measuring substance in sample using a redox reaction |
| AU2003235973A1 (en) * | 2002-06-07 | 2003-12-22 | Arkray, Inc. | Method of assay by oxidation-reduction reaction with formazan |
| US7153666B2 (en) | 2003-07-17 | 2006-12-26 | General Atomics | Methods and compositions for determination of glycated proteins |
| US7855079B2 (en) | 2006-07-25 | 2010-12-21 | General Atomics | Methods for assaying percentage of glycated hemoglobin |
| US7943385B2 (en) | 2006-07-25 | 2011-05-17 | General Atomics | Methods for assaying percentage of glycated hemoglobin |
| CN101883982B (zh) * | 2008-05-09 | 2013-07-03 | 松下电器产业株式会社 | 肌酸酐浓度的测定方法、测定器件及测定装置和使用这些的尿中盐分量的测定方法、测定器件及测定装置 |
| EP2283149A1 (en) | 2008-05-13 | 2011-02-16 | General Atomics | Electrochemical biosensor for direct determination of percentage of glycated hemoglobin |
| AU2010343091B2 (en) | 2009-12-28 | 2015-01-15 | The Regents Of The University Of California | Mitigation of alternate bearing |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2713581A (en) * | 1949-02-23 | 1955-07-19 | Montclair Res Corp | Certain tetrazolium salts and process for preparing them |
| GB738585A (en) * | 1952-07-17 | 1955-10-19 | May & Baker Ltd | Improvements in or relating to tetrazolium compounds |
| BE615097A (ja) * | 1961-03-14 | |||
| DE2147466C3 (de) * | 1971-09-23 | 1980-06-26 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | 5- (4-N-trimethyl-ammonium-phenyl) tetrazoliumsalze |
| DE2625834B2 (de) * | 1976-06-09 | 1978-10-12 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Bestimmung von Substraten oder Enzymaktivitäten |
| GB1513488A (en) * | 1976-11-11 | 1978-06-07 | Lushina O | Method of preparing 2h-tetrazolium chlorides and 2h-tetrazolium chlorides hydrochlorides |
| JPS5524103A (en) * | 1978-08-08 | 1980-02-21 | Doujin Yatsukagaku Kenkyusho:Goushi | Tetrazolium salt compound and absorption photometry of dehydrogenase using the same |
| DE3012368C2 (de) * | 1980-03-29 | 1982-04-15 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und diagnostische Mittel zum Nachweis von Redox-Reaktionen |
| DE3013371A1 (de) * | 1980-04-05 | 1981-10-15 | Gerd Schulz Fahrzeug- und Container-Technik, 2100 Hamburg | Verriegelung fuer container |
| DE3048662A1 (de) * | 1980-12-23 | 1982-07-22 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Stabilisierte zubereitung von tetrazoliumsalzen |
| US4444880A (en) * | 1982-07-27 | 1984-04-24 | Syva Company | Periodate removal of ascorbate interference in dipsticks for immunoassays |
| JPS59106476A (ja) * | 1982-12-11 | 1984-06-20 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 水溶性テトラゾリウム化合物、およびその化合物を用いて還元性物質を測定する方法 |
| JPS59219270A (ja) * | 1983-05-30 | 1984-12-10 | Wako Pure Chem Ind Ltd | テトラゾリウム塩を含有する溶液の安定化方法 |
| DE3425118A1 (de) * | 1984-07-07 | 1986-01-16 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Neue redox-indikatoren |
| US4683035A (en) * | 1986-02-03 | 1987-07-28 | Nalco Chemical Company | Method for in situ corrosion detection using electrochemically active compounds |
-
1986
- 1986-04-04 DE DE19863611227 patent/DE3611227A1/de not_active Withdrawn
-
1987
- 1987-03-26 EP EP87104466A patent/EP0239931B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-26 DE DE8787104466T patent/DE3777429D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-26 AT AT87104466T patent/ATE73782T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-04-03 JP JP62081357A patent/JPS62249979A/ja active Granted
- 1987-04-03 US US07/035,617 patent/US5013647A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0239931A3 (en) | 1988-05-18 |
| DE3777429D1 (de) | 1992-04-23 |
| US5013647A (en) | 1991-05-07 |
| EP0239931A2 (de) | 1987-10-07 |
| EP0239931B1 (de) | 1992-03-18 |
| JPS62249979A (ja) | 1987-10-30 |
| ATE73782T1 (de) | 1992-04-15 |
| DE3611227A1 (de) | 1987-10-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3001368B2 (ja) | Ｎａｄ（ｐ）ｈを比色検出するための方法および薬剤、ならびにニトロソアニリン化合物 | |
| JPH0445510B2 (ja) | ||
| US4665023A (en) | Imidazole derivatives as redox indicators | |
| US4478942A (en) | Quantitative analysis film and a method for colorimetric analysis using the same | |
| US4418037A (en) | Color indicator composition and film for detecting hydrogen peroxide | |
| JP2825754B2 (ja) | 分析物を比色定量するための方法及び薬剤、及びニトロソアニリン化合物 | |
| US4952495A (en) | Hydrolyzable compounds which release electron transfer agents and analytical use of same | |
| JPH02174695A (ja) | 酵素酸化によるアナライトの比色定量方法および試剤、およびそのための還元発色性電子受容体 | |
| JP6659669B2 (ja) | レドックス指示薬 | |
| JPS5813398A (ja) | 過酸化水素もしくは過酸化水素を形成する基質またはペルオキシダ−ゼもしくはペルオキシダ−ゼのように作用する物質を検出するための剤および方法 | |
| US5292669A (en) | Agents for the detection of substrates with hydrolase activity | |
| JPH10130247A (ja) | レドックス活性化合物およびその使用 | |
| JPH0764986B2 (ja) | 新規な発色試薬 | |
| JPS60256056A (ja) | 過酸化水素定量用組成物および分析要素 | |
| US5196314A (en) | Process and reagent for the determination of substrates or enzyme activities | |
| AU623823B2 (en) | Naphthotriazolium salts | |
| JPH0369520B2 (ja) | ||
| JPS5818077B2 (ja) | グリセリンを測定する方法及び試薬 | |
| JP2590124B2 (ja) | 水溶性テトラゾリウム化合物およびその化合物を用いる還元性物質の測定方法 | |
| JPH04200396A (ja) | 過酸化水素の酵素学的高感度測定法及びそのための試薬 | |
| JP2566790B2 (ja) | ジフェニルアミン誘導体 | |
| US5792619A (en) | Assay using oxidative chromogenic reagent | |
| JPH0662871B2 (ja) | 新規なイミダゾール誘導体 | |
| JPH0324060A (ja) | 新規被酸化性呈色試薬 | |
| JPH0625146B2 (ja) | 新規イミダゾ−ル誘導体及びこれを発色成分として用いる測定法 |