JPH0445797A - Ｌ―α―アラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はＬ−α−アラニンの製造法に関する。

Ｌ−α−アラニンは、医薬品、食品添加物および各種工
業薬品の合成中間体として重要な化合物である。

従来の技術 Ｌ−α−アミノ酸は、−１１１ｉ）に直接発酵法または
有機化学合成法により製造されたＤＬ−α−アミノ酸を
光学分割を行うことにより得られている。

ＤＬ−α−アミノ酸の光学分割を行う方法としては、例
えばＤＬ−α−アミノ酸のＮ−アシル誘導体に微生物の
生産するアシラーゼを作用させる方法（特公昭４１−２
２３８０号公報）およびＤＬ−αアミノ酸のヒダントイ
ン誘導体に微生物の生産するヒダントイナーゼを作用さ
せる方法（特公昭５４２２７４号公報）などが知られて
いる。

また、ＤＬ−アミノ酸アミドに、微生物が生産するし一
アミダーゼを作用させ、対応するＬ−アミノ酸を得る方
法として、バチルス属、バタテリジウム属、ミクロコツ
カス属およびブレビバクテリウム属に属する微生物が生
産するし一アミダーゼを用いる方法（公表時５６−５０
０３１９号公報）、種々の酵母、細菌類が生産するし一
アミダーゼを用いる方法（特開昭５７−１３０００号公
報、特開昭５９−１５９７８９号公報、特開昭６０−３
６４４６号公報）、エンテロバクタ−・クロアッセイ　
１ｌ−７９０１またはシュードモナスｓｐ、　Ｎ−７１
３１またはｌｌ−２２１１の微生物が生産するし一アミ
ダーゼを用いる方法（特開昭６２−５５０９７号公報）
、ミコプラナ属またはプロタミノバクタ−属に属する細
菌が生産するし一アミダーゼを用いる方法（特開平１−
２７７４９９号公報）などが知られている。

ラフネラ属に属する微生物が有する、Ｌ−α−アラニン
アミドを不斉加水分解する能力を利用してＬ−α−アラ
ニンアミドからＬ−α−アラニンを製造する方法は知ら
れていない。

発明が解決しようとする課題 本発明は、微生物が生産するし一α−アラニンアミドを
不斉加水分解する作用を利用することにより、Ｌ−α−
アラニンアミドから光学純度の高いＬ−α−アラニンを
工業的により効率よく安価に製造する方法を提供するこ
とを目的としている。

ＲＨを解決するための手段 本発明はラフネラ属に属し、Ｌ−α−アラニンアミドを
不斉加水分解する能力を有する微生物の培養物、菌体ま
たはそれらの処理物の存在下、ＤＬ−α−アラニンアミ
ドまたはＬ−α−アラニンアミドを含有する水性媒体中
で光学選択的に加水分解を行わせ水性媒体中にＬ−α−
アラニンを生成させ、該水性媒体よりＬ−α−アラニン
を採取することを特徴とするＬ−α−アラニンの製造法
を提供する。

本発明で用いる微生物としては、ラフネラ属に属Ｌ、Ｄ
Ｌ−α−アラニンアミドまたはＬ−α−アラニンアミド
を不斉加水分解してＬ−α−アラニンを生成する能力を
有する微生物であればいずれでもよいが、例えばラフネ
ラ・エスピー（Ｒａｈｎｅｌｌａｓｐ、）　Ｈ−７２４
６があげられる。

上記微生物の菌学的性質を以下に述べる。

（ａ）形態 ■　細胞の形および大きさ、桿状、直径０．７−１．０
μｍ１長さ　２．０−４．０μｍ ■　細胞の多形性：な　し ■　運動性；２５℃では側鞭毛で運動性があるが、３６
℃では運動性がない。

■　胞　子；形成しない。

０　ダラム染色性；陰　性 ■　抗酸性；はとんど認められない。

（ｂ）　　各培地における生育状態 ■　肉汁寒天平板培養；アイポリ−色のなめらかな集落
を形成する。拡散性色素は生成しない。

■　肉汁寒天斜面培養；十分に生育し、アイポリ−色の
滑らかな集落を形成する。

■　肉汁液体培養；混濁状に生育し、表面には生育しな
い。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養；液化しない。

■　リドマス・ミルク；弱酸性。１日目で凝固はみられ
ない。

（Ｃ）　　生理学的性質 ■　硝酸塩の還元；陽　性 ■　脱窒反応；ガスは生成せず、生育する。

ＭＲテスト；陰　性 ＶＰテスト；陽　性 インドールの生成；陽　性 硫化水素の生成；陰　性 デンプンの加水分解；陰　性 クエン酸の利用（シモンズの培地）、陽性無機窒素源の
利用；硝酸塩＜１ａ性） アンモニウム塩（陽性） 色素の生成；水溶性色素を生成しない ウレアーゼ；陰　性 オキシダーゼ；陰　性 カタラーゼ；陽　性 生育の範囲 （１）ｐＨ；ρ１１４．０−９．０　　＜最適ρｌＩニ
ア、［１）（２）温度；　１５−４２℃　（最適温度：
３０℃）酸素に対する態度、好気性ないし通性嫌気性０
−Ｆテスト、発　酵 糖類から酸、ガスの生成 Ｌ−アラビノース Ｄ−キシロース Ｄ−グルコース Ｄ−マンノース Ｄ−フラクトース Ｄ−ガラクトース 麦芽糖 シ　　Ｂ　　＠ 乳　　　　糖 トレハロース Ｄ−ソルビット Ｄ−マンニット イノシット グリセリン デンプン ０　塩化ナトリウム耐性；要求性はない。

１６００＋ｎｋｌで生育阻害を受ける。

１！ｉｌｌ　　ＤＮＡ（Ｄ分Ｍｒ１ｍ　　性■　アルギ
ニンの分解；陰　性 ■　リジンの脱炭酸反応；陰　性 ■　オルニチンの脱炭酸反応；陰　性 ■　イエローピグメント；陰　性 （６）化学的組成 ■　ｍｏ１％Ｇ　十Ｃ（ＨＰＬＣ）　；　５３．０以上
の菌学的性質ををする菌について、パージエイズ・マニ
ユアル・才ブ・システマチック・バタテリオロジー（日
ｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａ
ｔｉｃｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　ｖｏｌ、　１　（
１９８６年〉の記載と照合すると、本菌株はダラム陰性
桿菌で、運動性があり、好気性ないし通性嫌気性であり
、グルコースから著しく酸およびガスを生成し、オキシ
ダーゼに陰性で、鞭毛の着性は側鞭毛であり、ナ）　Ｉ
Ｊウムイオンの要求性がないことから、本菌株はＥｎｔ
ｅｒｏ−ｂａｃｔｅｒ　１ａｃｅａｅ科に属する細菌に
分類される。さらにＶＰ反応に１性を示し、クエン酸を
利用し、硫化水素の生成、ウレアーゼ、ＤＮＡの分解、
アルギニンの分解、リジンの脱炭酸反応およびオルニチ
ンの脱炭酸反応に陰性で、ＤＮＡのｍｏ１％Ｇ＋Ｃが５
３．０であることに基づいて検索した結果、本菌株をラ
フネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）属に属する細菌と同定し、
ラフネラ・エスピー（Ｒａｈｎｅｌｌａ　ｓｐ、）　Ｈ
−７２４６と命名した。

本菌株は平成２年４月１６日付で工業技術院微生物工業
技術研究所にＦＢＲＭ　ＢＰ−２８７１として寄託され
ている。

本発明の微生物を培養する培地は、用いる微生物が資化
し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有シ、ＤＬ−
α−アラニンアミドまたはＬ−α−アラニンアミドから
Ｌ−α−アラニンを生成する能力を有する微生物の培養
を効率的に行なえる培地であれば、天然培地、合成培地
のいずれでも良い。

炭酸源としては、グルコース、フラクトース、シニーク
ロース、糖蜜、廃糖蜜、デンプン加水分解物などの炭水
化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、およびエタノ
ール、プロパツールなどのアルコール類が用いられる。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、ｆｆ
１ｉ！アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモ
ニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、各
種硝酸塩ならびにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コ
ーン・スチープ・リカーカゼイン加水分解物、大豆粕加
水分解物、各種発酵菌体およびその消化物プニどの窒素
含有有機物など種々のものが用いられる。

無機物としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩
化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅およ
び炭酸カルシウムナよどが用いられる。

培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養ブよどの好気
的条件下で行う。培養温度は１５〜４５℃、培養時間は
通常１２〜７２時間である。培養中ｐｌ（は５．０〜９
．０に保持する。ｐｌｌの調整は塩酸、硫酸などの無機
あるいは酢酸などの有機の酸、炭酸カルシウムなどの塩
、アンモニアなどのアルカリ溶液を用いて行う。

培養の際、高い酵素活性を誘導させるために、Ｌ−α−
アラニンアミド、Ｄ−α−アラニンアミドあるいはＤＬ
−α−アラニンアミドを培地に添加することは効果的で
あり、その添加量は培地に対して０，０１〜２．０％程
度が好ましい。

このようにして培養した培養物、菌体またはそれらの処
理物が本発明のＤＬ−α−アラニンアミドの不斉加水分
解反応に用いられる。

培養物、菌体の処理物としては、乾燥物、界面活性剤処
理物、酵素処理物、超音波処理物、溶媒処理物、固定化
物などがあげられる。

水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホ
ウ酸塩、クエン酸塩およびトリス塩酸などの緩衝液、メ
タノール、エタノールおよびプロパツールなどのアルコ
ール類などがあげられる。

反応は通常１０〜７０℃で９Ｎ５．　Ｇ〜１１．０で１
〜７２時間行う。反応液中の培養物、菌体またはそれら
の処理物の濃度は、用いるＤＬ−α−アラニンアミドの
量および反応時間により適宜決定すれば良いが、通常乾
燥菌体として反応液当たり０．０１〜１０％（重量）で
ある。反応に用いるＤＬ−α−アラニンアミドおよびＬ
−α−アラニンアミドは、遊離型、塩酸塩、硫酸塩のい
ずれでも良く、濃度は、ＤＬ−α−アラニンアミドおよ
びＬ−α−アラニンアミドの飽和濃度以下であれば一般
に制限はないが、好ましくは反応液当たり０．１〜４０
％（重量）である。なお、ＤＬ−α−アラニンアミドお
よびＬ−α−アラニンアミドは市販（バッケム社）され
ていて、容易に入手することができる。

反応において、Ｄ−α−アラニンの生成を極力おさえる
ために、光学活性なアラニンのラセミ化を触媒する酵素
であるアラニンラセマーゼ活性を抑制する公知の方法を
用いることができる。例えば、通常の変異処理によりア
ラニンラセマーゼ活性がないかあるいは活性が低下した
変異株を取得し反応に用いる〔モレキユラー・アンド・
ジェネラル・ジエネテイツクス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅ
ｎａｔ、）　１９８　。

３１５−３２２（１９８５）　〕、熱処理などによりア
ラニンラセマーゼ活性を失活させる〔日本化学会誌９゜
１３６９　（１９８３）　〕あるいはアラニンラセマー
ゼ阻害剤を反応時添加する〔化学と生物２０．７７０−
７７２（１９８６）；生化学実験講座１１　　、２７５
−２９６コなどの方法を適宜用いることにより、光学純
度の高いＬ−ｃｒ−アラニンを得ることができる。

反応が終了した時点で、反応生成液を加熱あるいはｐＨ
を低下させるなどの常法により速やかに反応を停止させ
た後、反応生成液から目的物質であるＬ−α−アラニン
と未反応のＤ−α−アラニンアミドとをそれぞれ分離、
回収する。分離方法としては、イオン交換樹脂などを用
いるカラムクロマトグラフィーあるいは晶出法など通常
の分離方法が用いられる。

未反応のＤ−α−アラニンアミドは、公知の方法、例え
ば、酸またはアルカリで加水分解することによりＤ−α
−アラニンに変換することができる。また、Ｄ−α−ア
ラニンアミドをラセミ化した後、反応系へ循環させるこ
止もできる。

以下、実施例により本発明を説明する。

実施例１ ペプトン１０ｇ／ｆ、イーストエキス５ｇ／ｆおよび塩
化す）　＋Ｊウム５ｇ／Ｉｌを含む培地（ｐ）１７．２
）４０−を２５０ｍ１容三角フラスコに分注し、１２０
℃、２０分間オートクレーブにかけて滅菌し種培養ｊ＠
地とした。この培地にラフネラ・エスピーＨ−７２４６
を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間振盪培養し、種培
養液として用いた。

グルコース１０ｇ／β、ペプトン１０ｇ／Ｌ肉エキス５
ｇ／ｌ、　リン酸三水素カリウム２ｇ／ｌ、硫酸マグネ
シウム０．５ｇ／ｌ、硫酸第一鉄１■／β、硫酸マンガ
ン１ｍｇ／ｆおよびＤＬ−α−アラニンアミド５ｇ／ｆ
を含む培地（ｐＨ７，０）１１を２１容量のミニジャー
ファーメンタ−に分注し、１２０℃、３０分間オートク
レーブにかけて滅菌し主培養培地とした。この培地に種
培養液１ｍｌを無菌的に接種し、３０℃で４８時間通気
攪拌培養（通気量１．　ＯＶＶＭ）した。なお、培養中
、４規定アンモニア水により培地のｐＩｌを７，０±０
．１に調整した。この主培養液５００−を遠心分離（１
０，００Ｏｒｐｍ、　１０分間）し、生菌体を得た。

ＤＬ−α−アラニンアミド（バッケム社製）５０ｇを含
む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　　１１に、生
菌体５ｇ　　（乾燥菌体重量換算）を加え、４０℃で１
時間振盪し、反応を行った。反応終了後、反応液を遠心
分離（１０，０００ｒｐ１１１．１０分間）して得られ
た上澄液をイオン交換樹脂ダイヤイオン５Ｋ−ＩＢ（Ｈ
型）（三菱化成社製）１１に通塔し、Ｌ−α−アラニン
を吸着させた。該樹脂を水洗後、２規定アンモニア水で
Ｌ−α−アラニンを溶出した。溶出液を減圧濃縮し、結
晶を析出させ、ろ取し、乾燥した結果、Ｌ−α−アラニ
ン１７ｇ　（光学純度９９．８ｅｅ％以上）を得た。

旋光度〔α：］２ｏ＝＋１４．５°（ｃ＝ｌｏ、　６規
定塩酸）実施例２ 粉末ブイヨン２０ｇ／ｆ、イーストエキス５ｇ／ｌおよ
び塩化す）ＩＪウム２．５ｇ／βを含む培地（ｐＨ７，
２）　４０ｍを２５０ｍ１用三角フラスコに分注し、１
２０℃、２０分間オートクレーブにかけて滅菌して種培
養培地とした。この培地にラフネラ・エスピーＨ−７２
４６を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間振動培養し、
種培養液として用いた。

シュークロースＬｏｇ／ｉ、ペプトン５ｇ／ｌ。

イーストエキス５ｇ／Ｉｔ、　硫酸アンモニウム５ｇ＃
！。

リン酸二水素カリウム２ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム０．
５ｇ／ｌ、硫酸第一鉄１■／ｉ、硫酸マンガン１■／１
およびＤＬ−α−アラニンアミド（バッケム社製）５ｇ
／ｌを含む培地（ｐ）１７．０）　　１１を２１容量の
ミニジャーファーメンタ−に分注し、１２０℃、３０分
間オートクレーブにかけて滅菌して主培養培地とした。

この培地に、種培養液１−を無菌的に接種し、３０℃で
４８時間通気攪拌培養（通気量１．ＯＶＶＭ）　した。

なお、培養中、４規定アンモニア水により培地のｐｈを
７．０±０．１に調整した。

この主培養液５００ｍ１を遠心分離（１０，００Ｏｒｐ
ｍ、　１０分間）し、得られた湿菌体９ｇを生理食塩水
で洗浄し、遠心分ＩＦ！　（１０，００（ｌｒｐｍ、　
１０分間）した後、ＩＴｎＭ２−メルカプトエタノール
を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁し、
超音波処理（５℃、２０分間）により菌体破砕を行った
。菌体破砕液を遠心分離（１５，ＯＯＯｒｐｍ、　３０
分間）して得られた上清をＬ−ａ−アミダーゼ粗酵素液
として４５−得た。

ＤＬ−α−アラニンアミド２５ｇを含む５０ｍＭリン酸
緩衝液（ρ）１７．０）　５００−に、Ｌ−α−アミダ
ーゼ粗酵素液２５−を加え、３０℃で２時間振盪し、−
反応を行った。以下実施例１と同様に行った結果、Ｌ−
α−アラニン９−ｇ　　（光学純度９９．８ｅｅ％以上
）を得た。

旋光度〔α〕２ｏ＝＋１４．６°（ｃ＝ＩＯ，６規定塩
引実施例３ Ｌ−α−アラニンアミド（バッケム社製）５０ｇを含む
５０ｆｆｌ＆ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　１１に、
実施例１と同様に行って得たラフネラ・エスピーＨ−７
２４６の生菌体５ｇ　（乾燥菌体重量換算）を加え、４
０℃で４時間振盪し、反応を行った。反応終了後、反応
液を遠心分１（１０，ＯＯＯｒｐｍ、　１［１分間）し
て得られた上澄液をイオン交換樹脂ダイヤイオンＳに一
１日（Ｈ型）　（三菱化成社製）１１に通塔し、Ｌ−α
−アラニンを吸着させた。該樹脂を水洗後、２規定アン
モニア水でＬ−α−アラニンを溶出した。溶出液を減圧
濃縮し、結晶を析８させ、ろ取し、乾燥した結果、Ｌ−
α−アラニン３２ｇ（光学純度９９．８ｅｅ％以上）を
得た。

旋光度〔α）２ｏ＝＋１４．５°（ｃ＝１０．６規定塩
酸）発明の効果 本発明により、医薬品、食品添加物および各種工業薬品
の合成中間体として重要なアミノ酸であるＬ−α−アラ
ニンを安価にかつ効率よく製造することができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ラフネラ属に属し、Ｌ−α−アラニンアミドを不
   斉加水分解する能力を有する微生物の培養物、菌体また
   はそれらの処理物の存在下、ＤＬ−α−アラニンアミド
   またはＬ−α−アラニンアミドを含有する水性媒体中で
   光学選択的に加水分解を行わせ水性媒体中にＬ−α−ア
   ラニンを生成させ、該水性媒体よりＬ−α−アラニンを
   採取することを特徴とするＬ−α−アラニンの製造法。
2. （２）微生物がラフネラ・エスピー（Ｒａｈｎｅｌｌａ
   　ｓｐ．）Ｈ−７２４６（ＦＥＲＭＢＰ−２８７１）で
   ある請求項１記載の製造法。