JPH0447648B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規抗腫瘍剤、より詳しくは下記構造
式〔〕で示されるトリコスタチンＡを有効成分
として含有する抗腫瘍剤に関する。 これまでトリコスタチンＡが抗腫瘍活性を示す
ことは知られていなかつたが、本発明者は、トリ
コスタチンＡが、フレンドウイルス（Friend
virus）でトランスフオームしたマウス赤芽球細
胞Friend細胞、ムリンザルコーマウイルス
（Murine Sarcoma virus）のモロニー株
（Moloney）でトランスフオームしたマウスの線
維芽細胞Ｍ−MSV・Balb3T3、ヒト子宮頚癌細
胞ヘラ（HeLa）細胞、ヒト白血病細胞、HL−
60細胞およびML−１細胞に対し強い生育阻害作
用を有していることを初めて見い出し、この発見
に基づき本発明を完成するに至つた。 前記構造式〔〕で示されるトリコスタチンＡ
は特にFriend細胞、Ｍ−MSV・Balb3T3細胞、
HeLa細胞、HL−60細胞及びML−１細胞に対し
て強い生育阻害作用を有しており、抗腫瘍剤とし
て利用できるものである。 前記構造式で示されるトリコスタチンＡは本発
明者が見い出した方法で製造することができる。
すなわち本発明において使用する微生物は、トリ
コスタチンＡを生産する能力を有する微生物であ
り、具体的には土壌中より分離された微生物が使
用される。本微生物をバージイーズ・マニアル・
オブ・デイタミネイテイブ・バクテリオロジー８
版（1974）に従つて同定したところストレプトミ
セス・シオイアエンシスFERM・Ｐ−7296と同
定した。 本発明においては上記菌株およびその人工なら
びに自然変異株は勿論のこと、ストレプトマイセ
ス属に属するトリコスタチンＡ生産菌のすべてが
使用され得る。 本微生物を用いてトリコスタチンＡを生産する
にあたつて用いられる倍地は炭素源、窒素源及び
無機塩類、更に必要に応じて有機微量栄養素を適
宜含有する通常の液体倍地が用いられる。 炭素源としては、例えばグルコース、フラクト
ース、マルトース、シユークロース、スターチ、
デキストリン、澱粉加水分解物、廃糖蜜等の炭水
化物、クエン酸、コハク酸、フマール酸、酢酸等
の有機酸類及びグリセリン等のアルコール類が用
いられる。窒素源としては例えば硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニ
ウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸
塩、尿素、アンモニア水、アンモニアガス、アミ
ノ酸類、さらにペプトン、大豆ホエー、大豆フレ
ーク及びそれらの加水分解物等の蛋白質、米糠等
が用いられる。その他無機塩としては例えばマン
ガン塩、リン酸塩が適宜用いられ、又有機微量栄
養素としてはアミノ酸、ビタミン及これらを含有
するペプトン、酵母エキス等が適宜用いられる。
培養条件は、倍地組成その他により異なるが、例
えば通常PH4.0〜9.0、温度15〜40℃で振盪培養、
通気撹拌培養等好気的条件下に培養が行われる。 本発明のトリコスタチンＡはこのようにして培
養して得られる培養液中及び菌体内に存在し、培
養液よりトリコスタチンＡを分離・採取する方法
は酢酸エチル等の有機溶媒抽出法、順相及び逆相
シリカゲル、セルロース等の吸着剤を用いる吸着
クロマトグラフイー、ゲル過法、各種溶媒に対
する溶解度の差を利用する方法等の公知の分離・
精製法を適宜組み合せて行われる。一方、菌体内
に生成されたトリコスタチンＡはクロロホルム等
の有機溶媒で抽出した後上記の方法に従つて精製
分離される。 次に製造例を示す。 第１表に示した倍地（PH7.2）100mlを分注した
500ml容フラスコを120℃20分間殺菌して、これに
ストレプトミス・シオイアエンシスFERM・Ｐ
−7296の培養液１mlを接種し、27℃で４日間培養
した。一方30容のステンレス・ジヤーフアーメ
ンターの中に前記の倍地を18入れ殺菌したもの
に上記の種母２を接種しかく拌（350rpm）、通
気（1/2vvm）し27℃で３日間培養を続けた。更
にその20を２次種母として300容のステンレ
スタンク中に上記組成の倍地280を入れ殺菌し
たものに接種しかく拌（310rpm）、通気（1/2
vvm）し、27℃で３日間培養した。 第１表 グルコース 1.0％ 酵母エキス 0.2％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7aq 0.1％ バクトソイトン 0.7％ バクトペプトン 0.5％ デンプン 2.0％ アデカノール 0.05％ （PH7.2） 280の培養液を遠心分離し、菌糸13Kgと除菌
液260を得た。菌糸よりトリコスタチンＡを含
む区分を取得するには、以下の方法に従えばよ
い。 この菌糸13Kgに、クロロホルム：メタノール
（１：１）の混合液60を加え室温で４時間撹拌
した後、過により菌糸を除去した。トリコスタ
チンＡを含むクロロホルム−メタノール混合液を
濃縮し、油状物質を得た。 除菌液260中よりトリコスタチンＡを含む区
分を取得するには以下の方法に従えばよい。 吸着クロマトグラフイーカラム（オルガノ社製
「アンバーライトXAD−７」）（15cmφ×67cm）に
該除菌液260を注ぎ込み、吸着クロマトグラフ
イーカラムに吸着しない物質を除去した。その
後、吸着クロマトグラフイーカラムに100％メタ
ノール75を注ぎ込み100％メタノールで溶離さ
れるトリコスタチンＡを含む溶液を採取した。該
区分をエバポレーターを用い常温で濃縮し、3.1
の濃縮液を得た。菌糸をクロロホルム−メタノ
ール抽出して得られた油状物質と除菌液中の吸着
クロマトグラフイーカラムに吸着される物質で
100％メタノールに溶離される区分については、
以下に述べる共通のトリコスタチンＡの単離精製
工程を用いることができる。 以下、除菌液より得たトリコスタチンＡを含む
濃縮液中からのトリコスタチンＡの単離精製工程
について説明する。 上記濃縮液3.1に酢酸エチル６を加え常温
で20分間激しく振盪後静置し、酢酸エチル区分５
を分取した。次いで残液中に酢酸エチルを６
加え、再び常温で20分間激しく振盪後静置し、酢
酸エチル区分５を分取した。これら酢酸エチル
区分を合せた後に、エバポレーターを用い常温下
で酢酸エチル区分を濃縮・乾固した。この濃縮・
乾固したトリコスタチンＡを含む区分を100％メ
タノール200mlに溶解させた。次にゲル過クロ
マトグラフイー（「LH−20」フアルマシヤ社製）
カラム（30cmφ×800cm）に上記トリコスタチン
Ａを含む100％メタノール液を注いだ後、新たに
100％メタノールを30注ぎ、ゲル過を行ない、
液を各々100ml毎に分取した。これらの液中
からフレンド白血病細胞に対して生育阻害作用を
有する画分１を採取した。この画分を濃縮後、
酢酸エチルとメタノールの混合溶媒（7.5：１）
10mlに溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフ
イーを行なう。酢酸エチル・メタノール（7.5：
１）で展開後フレンド白血病細胞に対して生育阻
害作用を有する画分100mlを採取した。この画分
を濃縮し約500mgのトリコスタチンＡの粗物質を
得た。さらにこの粗物質をシリカゲルの薄層クロ
マトグラフイーで分離精製しトリコスタチンＡ約
200mgを得た。 トリコスタチンＡの物理化学的性状は以下の通
りである。この性状から本物質は辻ら、ジヤーナ
ル・オブ・アンテイバイオテイツクス19，１
（1979）（J.Antibiotics，N.Tsuji et al 19，
１（1976））の報告するトリコスタチンＡと同一で
あると確認できる。 融点 m.p150〜151℃ 分子量 302（FD−MASS法による） 元素分析 Ｃ，67.28％、Ｈ，7.40％、Ｎ，
9.43％、 紫外線吸収スペクトル λ^EtOH _nax 253nｍ，267nｍ，341nｍ 溶剤に対する溶解性 クロロホルム、酢酸エチル、アセトン、ベン
ゼンに可溶水に不溶 呈色反応 ドラゲンドルフ反応 陽性 ¹H−NMRスペクトラム 第１図参照 ¹³C−NMRスペクトラム 第２図参照 次にトリコスタチンＡの抗腫瘍活性を示す (1) Friend細胞に対する生育阻害効果 Ham′S Ｆ−12粉末倍地（Gibco社製の細胞
培養用倍地成分）10.4ｇ及びNaHCO₃1.4ｇを
1.0の蒸留水に溶解し、ポアーサイズ0.22μの
ミリポアフイルターで無菌過し、これに無菌
的に調製した牛胎児血清（Flow labo社製）を
100ml添加して細胞培養用倍地を調製した。こ
の倍地に、予め培養したフレンド白血病細胞
（井川洋二、代謝、15，145（1978）参照）を加
え（細胞濃度：１×40⁴／ml）、この細胞懸濁液
をマイクロテストプレート（Nunc社製、96穴）
に0.1ml宛無菌的に分注し、炭酸ガスインキユ
ベーター中（炭酸ガス濃度５％、温度37℃）で
24時間培養した。この培養液に、ストレプトミ
セス・シオイアエンシスFERM・Ｐ−7296の
発酵液より単離・精製されたトリコスタチンＡ
を一定量含有する上記倍地を0.1ml宛添加し、
更に３日間培養を継続し、（トリパンブルーを
用いる細胞染色法により生細胞数を計測し）ト
リコスタチンＡのフレンド白血病細胞に対する
生育阻害作用を調べた。その結果を第２表に示
す。尚、表中（−）は生育阻害のないことを示
し（＋＋＋）は全ての細胞が死滅することを示
す。 【表】 第２表よりあきらかな如く、トリコスタチン
Ａはフレンド白血病細胞に対して顕著な細胞生
育阻害効果を示し、フレンド白血病細胞に細胞
毒性を示すことが明らかになつた。 (2) Ｍ−MSV Balb 3T3細胞に対する効果 次に、Ｍ−MSVウイルスでトランスフオー
ムしたBalb 3T3細胞（Aaronson and Rowe，
Virology.42．９（1970）参照）に対する生育阻
害度を第３表に示す。この実験では倍地として
MEMダルベツコ倍地（Gibco社製）を用いた。 結果は第３表に示した。なお、表中の（−）
は生育阻害がないことを示し、（＋＋＋）はす
べての細胞が死滅することを示す。 【表】 第３表より明らかなごとく、トリコスタチン
ＡはＭ−MSV−Balb3T3細胞に対し顕著な細
胞生育阻害効果を示し、Ｍ−MSV−Balb3T3
細胞に細胞毒性を示すことが明らかになつた。 (3) ヒト子宮頚癌細胞HeLaに対する作用 MEMダルベツコ粉末倍地（Gibco社製）１
ｇを100mlの二段蒸留水に溶解した後、0.14ｇ
のNaHCO₃を加え溶解し、ミリポアフイルタ
ー（0.22μ）で過し、これに牛胎児血清
（Flow Lab.社製）11mlを加えた倍地に、予め、
37℃５％CO₂存在下３日間培養したHeLa細胞
（Gey，Kubicelc and Coffman Cancer Res，
12，264（1952））を５×10⁴cells／mlになる様に
分散させ、その倍地0.2mlずつマイクロプレー
ト（Nunc社製96穴）に分注し、３時間５％
CO₂存在下37℃で培養した。これに０〜500μ
ｇ／mlの濃度になる様にトリコスタチンＡを加
え５日間培養した。その後生育量をトリパンブ
ルー染色法により生存細胞を計測して求めた。
第表４より明らかな如く、トリコスタチンＡは
HeLa細胞に対して顕著な細胞生育阻害効果を
示し、HeLa細胞に細胞毒性を示すことが明ら
かになつた。したがつてトリコスタチンＡは
HeLa細胞に対し、細胞毒性を与えることがわ
かる。 【表】 (4) ヒト白血病細胞HL−60、ML−１に対する
作用 RPMI−1640粉末倍地（Gibco社製）１ｇを
100mlの２段蒸留水に溶解した後、0.14ｇの
NaHCO₃を加え溶解し、ミリポアフイルター
（0.22μ）で過し、これに牛胎児血清（Flow
Lab.社製）11mlを加えた倍地に、予め37℃、
５％CO₂存在下で３日間培養したHL−60細胞
（Collins，et al，Nature，270，347−349
（1977）およびML−１細胞（J.Minowada et
al，International Symposium on New
Trends in Human Immunology and Cancer
Immunotherapy pp188−199（1980））をそれぞ
れ５×10⁴cells／mlになるように分散させその
倍地0.2mlずつマイクロプレート（Nunc社製96
穴）に分注し、３時間５％CO₂存在下37℃で培
養した。これに０〜500μｇ／mlの濃度になる
ようにトリコスタチンＡを添加し５日間培養し
た。その後生産量をトリパンブルー染色法によ
り生存細胞を計測して求めた。第４表に示す基
準により細胞生育阻害度を示したのが第５表で
ある。 【表】 第５表から明らかなごとく、トリコスタチン
ＡはHL−60細胞およびML−１細胞に対して
顕著な細胞生育阻害効果を示し、HL−60細胞
およびML−１細胞に対して細胞毒性を示すこ
とが明らかになつた。 以上の結果よりトリコスタチンＡは癌細胞の生
育を阻害することが明らかになり有効な抗腫瘍剤
となり得る。 本発明の構造式〔〕で示される物質を有効成
分として含有する抗腫瘍剤はヒトに包含される腫
瘍哺乳動物を治療する抗腫瘍剤として有用であ
り、そして経口投与として錠剤、カプセル剤また
はエリキシル剤のような調剤でまたは非経口投与
として無菌溶液剤または懸濁液剤で処方すること
によつて生体中の腫瘍を抑制せしめるために利用
することができる。本発明に使用する前記有効成
分はかかる治療を必要とする患者（動物およびヒ
ト）に対して患者当り0.2〜500mgの用量範囲で一
般に数回に分けて従つて１日当り１〜2000mgの全
日用量で投与することができる。用量は病気の重
さ、患者の体重および当業者が認める他の因子に
よつて変化させる。 本発明に使用する前記物質は生理学的に認めら
れるペヒクル、担体、賦形剤、結合剤、防腐剤、
安定剤、香味剤などとともに一般に認められた製
剤実施に要求される単位用量形態で混和される。
これらの組成物または製剤における活性物質の量
は指示された範囲の適当な用量が得られるように
するものである。 錠剤、カプセル剤などに混和することができる
具体的な薬剤は次に示すものである：トラガン
ト、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチ
ンのような結合剤；微晶性セルロースのような賦
形剤；コーンスターチ、前ゼラチン化デンプン、
アルギン酸などのような膨化剤；ステアリン酸マ
グネシウムのような潤滑剤；シヨ糖、乳糖または
サツカリンのような甘味剤；ペパーミント、アカ
モノ油またはチエリーのような香味剤、調剤単位
形態がカプセルである場合には上記のタイプの材
料にさらに油脂のような液状担体を含有すること
ができる。種々の他の材料は被覆剤としてまたは
調剤単位の物理的形態を別な方法で変化させるた
めに存在させることができる。例えば錠剤はシエ
ラツク、砂糖またはその両方で被覆することがで
きる。シロツプまたはエリキシルは活性化合物、
甘味剤としてシヨ糖、防腐剤としてメチルおよび
プロピルパラペン、色素およびチエリーまたはオ
レンジ香味のような香味剤を含有することができ
る。 注射のための無菌組成物は注射用水のようなベ
ヒクル中の活性物質、ゴマ油、ヤシ油、落花生
油、綿実油などのような天然産出植物油またはエ
チルオレエートなどのような合成脂肪ベヒクルを
溶解または懸濁させる通常の製剤実施に従つて処
分することができる。緩衝剤、防腐剤、酸化防止
剤などが必要に応じて結合することができる。 本発明のトリコスタチンＡの安全性は高く、
ICRマウスにおけるLD₅₀は、腹腔内投与で100
mg／Kg以上である。

【図面の簡単な説明】

第１図はトリコスタチンＡの¹H−NMRスペク
トラムである。第２図はトリコスタチンＡの
¹³CH−NMRスペクトラムである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記構造式で示される物質を含有する抗腫瘍
   剤