JPH044873A - ペプチドｃ末端アミド化酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ペプチドＣ末端アミド化酵素の製造方法に関
し、より詳しくは対応するｃＤＮＡを利用する前記酵素
の製造方法に関する。

〔従来の技術〕

生体内酵素反応によるペプチドＣ末端グリシン付加体の
Ｃ末端アミド化に関与する酵素は、ペプチジルグリシン
−α−アミデーティングモノオキシゲナーゼ（ペプチド
Ｃ末端アミド化酵素）（ＥＣ。

１．１４．１７．３）と呼ばれており　（Ｂｒａｄｂｕ
ｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ。

２９８、６８６．１９８２　：　Ｇｌｅｍｂｏｔｓｋｉ
ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　＋％ｉ９．６３８５．
１９８４）、次のような反応を触媒していると考えられ
ている ＣＨＣＯＮＨＣＨｚＣＯＯＨ→−ＣＨＣｏＮ）１．＋グ
リオキシル酸体体内でのアミド化機構の解明、ならびに
組換えＤＮＡ技術によって生産されるペプチドでＣ末端
がアミド化されて初めて生理活性を示すペプチド類、例
えばカルシトニン、ガストリンなどへ生体外で転化する
方法に利用すべく、本酵素を精製する試みがなされてお
り、例えば、ウシ脳下垂体中葉（Ｍｕｒｔｈｙら、Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、、　２６１，１８１５．１９８６
）、ブタ脳下垂体０［１ｚｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ、１１Ｂ、　２２６２゜１９８６　：　Ｂｒａ
ｄｂｕｒｙら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　　１
６９＋　５７９＋１９８７）　、ブタ心房（Ｋｏｊｉｍ
ａら、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、、　１０５＋４４０、
１９８９）、アフリカッメガエル体皮（Ｍｉｚｕｎｏら
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ
ｕｎ、＋　１３７＋　９８４＋　１９８６）、ラット甲
状腺腫瘍（Ｍｅｈｔａら、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏ−ｐｈｙｓ、、　２６Ｌ　４４．１９８Ｂ）由来
のものが報告されている。

しかしながら、これらの精製酵素を利用して前述のＣ末
端アミド化ペプチドを生産することは可能であるとはい
え、生物体組織等からこれらを抽出し、分離精製するこ
とが前提となるため、これらを工業的製造工程に利用す
るには各種の難点が存在した。

そこで、一般に行われるようになった組換えＤＮＡ技術
を用いるペプチドＣ末端アミド化酵素の大量生産に供す
べく、その発現に必要な対応するｃＤＮＡの単離および
それらを利用した酵素の製造が試みられている。例えば
、Ｅｉｐｐｅｒ　Ｂ、Ａ、らは、Ｍｏ１．Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌ　Ｌ　７７７〜７９０．１９８７　で０ｈｓｕ
ｙｅ、　Ｋらは、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ
ｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１５０＋　１２７５〜１２８１、
１９８８で、そして５ｔｏｆｆｅｒｓ、　Ｄ、Ａ、らは
、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８６．７３５
〜７３９．１９８９で、それぞれウシの下垂体、カエル
の皮膚およびラットの心房由来のペプチドＣ末端アミド
化酵素ｃＤＮＡを公表しており、また、必ずしもその生
産性において満足できるものでないが、カエル由来およ
びウシ由来のｃＤＮＡを利用した組換えＤＮＡ技術を用
いたペプチドＣ末端アミド化酵素の生産例も知られてい
る（例えば、それぞれ特開平１−１０４１６８号および
国際公開−ｏ　８９１０２４６０号公報参照）。

〔発明が解決しようとする課題〕

前述のｃＤＮＡを利用した技術は、ペプチドＣ末端アミ
ド化酵素の大量生産への端緒となり得るものであるが、
いまだその大量生産に成功したものとはいえない。

そこで、本発明の目的は対応するｃＤＮＡをより有効に
利用した組換えＤＮＡ技術を用いてさらに効率よくペプ
チドＣ末端アミド化酵素の生産手段を提供するにある。

〔課題を解決するための手段］ 本発明者らも、ラットおよびウマ由来のペプチドＣ末端
アミド化酵素の単離ならびにそれらのｃＤＮＡの調製に
成功しているが、これらの一連の研究においてペプチド
Ｃ末端アミド化酵素ｃＤＮＡはその膜貫通領域に相当す
る部分を除いた断片を利用すれば、驚くべきことに、生
産する酵素を宿主細胞外に分泌するだけでなく全体的な
生産量も著しく増大することを見い出した。従って、前
記課題は、本発明の膜貫通領域に相当する部分を除いた
ペプチドＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡを含んでなり、そ
してこれを発現せしめることができるプラスミドにより
形質転換された宿主細胞を培養することにより前記酵素
またはその前駆体を生成蓄積せしめた培養物より、これ
を採取することを特徴とするペプチドＣ末端アミド化酵
素の製造方法によって解決される。

以下、本発明をより具体的に説明する。

本発明で用いることができるＣ末端アミド化酵素ｃＤＮ
Ａは、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ
、ラット、マウス等の哺乳類、ニワトリ、シチメンチョ
ウ等の鳥類、カエル等の両生類、ヘビ等のハ虫類、イワ
シ、サバ、ウナギ、サケ等の魚類などに存在するペプチ
ドＣ末端アミド化酵素のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａに由来し、それらの膜貫通領域に相当するＤＮＡ部分
を除いたものであればその起源を問わないが、好ましい
ものとしては哺乳類由来のものが挙げられる。より具体
的には、現在知られているペプチドＣ末端アミド化酵素
のアミノ酸配列をアミノ酸の１文字表示で、しかも種間
での相同性を高くするように欠落部分（−で示す）を任
意に挿入して第１図に示されるようなアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ断片であって、それらのＣ末端近傍の疎
水性アミノ酸領域に相当する部分を除いたｃＤＮＡが有
利に使用できる。なお、各ｃＤＮＡは、ウマ、ウシ、ラ
ット、カエル■およびカエル■について、それぞれ特願
平２−Ｔ６Ｂ’３１号明細書；　Ｍｏ１．Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎａ］、　１＋　７７７〜７９０ページ、１９８７　
；　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ　、　Ｓｃ　ｉ　、
　ＵＳＡ’８６．７３５〜７３９ページ、１９８９　；
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

１？ｅｓ、Ｃｏｍｍｕｍ、、　１４８．５４６〜５５２
ページ、１９８７　；およびＢｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｎ＋＋＋＋ｕｍ、＋　１５０＋　
１２７５〜１２８１ページ、１９８８に記載されている
。これらのうち例えば、第１図のウマの配列によれば８
８０番目の■（バリン）から９０１番目のＩ　（イソロ
イシン）までの領域が前記疎水性アミノ酸領域に該当す
る。

従って、本発明でいう膜貫通領域とは目的とするｃＤＮ
Ａの前記疎水性アミノ酸領域をいう。このような領域に
相当する部分を除いたペプチドＣ末端アミド化酵素ｃＤ
ＮＡは、既知の当該ｃＤＮＡからそれ自体公知の制限酵
素を用いその部分を切除して調製されたものでもよく、
また当該ｃＤＮＡのクローニング段階でｍＲＮＡのスプ
ライシングの差異により生じる各種ｃＤＮＡから選ふこ
ともできる。例えば、本発明で利用されるｃＤＮＡのク
ローニングは、それ自体公知の方法により、前述した各
種動物の諸組織を用いて実施することができる。具体的
には、＋。

法、ハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法など一般に用
いられている方法（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、１５２　；　Ｇｕｉｄｅ
　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１゜ｎｉｎｇ　Ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ＋　Ｓ、Ｌ、Ｂｅｒｇｅｒおよび八、　
Ｒ、Ｋ　ｉ　ｍｍｅ　１編、　１９８７．　　八ｃａｄ
ｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、　　ＩＮＣ，；　　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ
、　　ｖｏｌ、４　　；　　Ｎｅｗ　　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　　Ａｃ１ｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　Ｊ、Ｍ、Ｗａｌ
ｋｅｒｌｉ、１９８８．　Ｔｈｅ　ＨｕｍａｎａＰｒｅ
ｓｓ　　Ｉｎｃ、　　；　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ　　Ａ　　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌ　２ｎｄ　Ｅｄ、　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｅ、
Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ　　Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓｉｉ、　１９８９．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒ
ｅｓｓ参照）に従って行い、得られたｃＤＮＡクローン
の塩基配列を決定することにより蛋白質をコードするｃ
ＤＮＡ領域を決定し、前述の膜貫通領域に相当する部分
が除去されているものがら選べばよい。

ラットを例に説明すると、ペプチドＣ末端アミド化酵素
を多く生産する組織、例えば、ラットの下垂体をグアニ
ジルチオシアネートと共にホモジナイズすることにより
細胞を破砕し、塩化セシウム平衡密度勾配超遠心分離に
よりＲＮＡ分画を得る。続いてオリゴｄＴセルロースを
担持したアフィニティークロマトグラフィーにより、前
記ＲＮＡ分画からポリＡをもつＲＮＡ　（ポリＡ”ＲＮ
Ａ）を単離する。

このポリＡ″ＲＮＡを鋳型として使用し、公知の方法、
好ましくは岡山−Ｂｅｒｇの方法（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ。

２、１６Ｌ　１９８２）によって、ｃＤＮＡライブラリ
ーを得る。これらのライブラリーから適当なプローブを
使用してポジティブなりローンをスクリーニングし、増
幅したｃＤＮＡライブラリーから適当なプローブを使用
して再スクリーニングして得たポジティブなｃＤＮＡク
ローンを単離し、これらの制限酵素マツピングおよびシ
ーフェンシングなどによって目的のｃＤＮＡを構造決定
することができる。また、前記ｃＤＮＡを発現ベクター
に組込み、このもので形質転換した宿主のペプチドＣ末
端アミド化酵素の生産性を評価することにより目的のｃ
ＤＮＡを含むプラスミドを選択することもできる。

このｃＤＮＡを発現させる宿主は、大腸菌、枯草菌、酵
母などの微生物、昆虫、動物など由来の培養細胞系など
通常用いられる細胞でよい。発現プラスミドは、これら
の細胞中でｃＤＮＡを効率良く発現できるプラスミドで
あれば、何でも良い。例えば、次に示す底置に記載のも
のなどから適当に選ぶことができる。

枝体化学実験講座１、遺伝子研究法■、−組換えＤＮＡ
技術−第７章組換え体の発現、（１９８６）、日本生化
学会編、東京化学同人；　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｄ
ＮＡ。

Ｐａｒｔ　Ｄ＋　５ｅｃｔｉｏｎ　ＩＩ　、　Ｖｅｃｔ
ｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆＣｌｏｎ
ｅｄ　Ｇｅｎｅｓ＋　（１９８７）　ＲａｙＷｕおよび
Ｌａｗｒｅｎｃｅ　Ｇｒ。

ｓｓｍａｎ　　編、　八ｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐ、ｒｅｓ
ｓ、　　ＩＮＣ，；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ
、　　Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ　
　２ｎｄ　　Ｅｄ、Ｂｏｏｋ　　３＋（１９８９）　Ｊ
、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈおよび
Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓｉｉｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　１（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓ
ｓなど。

例えば、動物培養細胞として常用されているＣＶ−１が
宿主として使用される場合は、ｐＳＶ、　ｐＬ２ｎ。

ｐＣｏ　ｌ型のプロモーターおよび必要により選択マー
カーを配したものが使用できる。また、大腸菌について
はｐＧｌ（、ｐＫＹＰ、　ｐｌ（ＵＢ型のベクターが、
酵母についてはＹＲｐ、　ＹＥｐ型のものが使用できる
。これらのベクターのｃＤＮＡによる組換え、および組
換えプラスミドによる宿主細胞の形質転換、形質導入は
それぞれ前述の文献等に記載されるそれ自体公知の手順
によって行うことができる。こうしで得られる形質転換
された細胞は、由来する細胞を増殖するのに通常使用さ
れる培地および培養条件で培養することができる。

このような培養物から産生蓄積せしめたペプチドＣ末端
アミド化酵素の採取は、例えば動物培養細胞を用いる場
合には産生酵素が細胞外に分泌されるので、細胞を除去
した後の培養液から容易に採取できるが、必要により細
胞溶解物から採取してもよい。この採取・精製は通常の
酵素精製法、例えば沈殿による分画、ヘパリン親和性ク
ロマトグラフィーおよび透析等を組み合わせて実施する
ことができ、さらに本発明者らによって開発されたＣ末
端グリシン付加体をリガンドとする基質親和性クロマト
グラフィーを組み合わせて使用することが好ましい（国
際公開−０８９／１２０９６号公報参照）。このクロマ
トグラフィーのりガントとしては、グリシンを含め２〜
６個のアミノ酸残基からなるペプチド類、特にＤ−Ｔｙ
ｒ　−Ｔｒｐ　−Ｇｌｙ。

Ｐｈｅ　−Ｇｌｙ　−Ｐｈｅ−ＧｌｙおよびＧｌｙ　−
Ｐｈｅ　−Ｇｌｙを使用するものが好ましい。精製手順
の具体例は、前記公報の記載に従って行うことができる
。

〔実施例〕

以下の例で、ラット下垂体由来のペプチドＣ末端アミド
化酵素ｃＤＮＡを利用する該酵素の生産について説明す
るが、本発明はこれによって限定されるものでない。

３す」ユ　　　プラスミドの゛告＋１ ラット下垂体由来のポリＡ”ＲＮＡを用いてｃＤＮＡク
ローニングをおこなったところ、分子量の異なる５本の
ｃＤＮＡが得られた（第２図、第３図、生化学、６Ｌ　
８４２　（１９８９）参照）　、　ｃＤＮＡクローン２
０５のＥｃｏＲｌ　−Ｘｍａ　Ｉで切断される２、５８
ｋｂｐ（キロベースベア）のＤＮＡ断片を、動物培養細
胞系発現ベクターｐＳＶ２ベクター［Ｓ、Ｓｕｂｒａｍ
ａｎｉ、　Ｒ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｐ、Ｂｅｒｇ。

＋１ｏ１．ｃｅｌｌ、Ｂｉｏｌ、　１　、　８５４　　
（１９８１））のＨｉｎｄ　ｍ　−Ｂ）ｌ　１１部位に
合成リンカ−を介して挿入し、このプラスミドをＳシー
２０５と命名した。次いで、ＳＶ　−２０５のＮｓｉ　
Ｉ　（７００）　−Ｘｍａ　Ｉ断片を、ｃＤＮＡクロー
ン２０１゜２０２、２０３．２０４それぞれのＮｓｉ　
Ｉ　（７００）　−Ｘｍａ　Ｉ断片と置換した。これら
の発現プラスミドを５ｖ−２０１、５Ｖ−２０２，５Ｖ
−２０３，５Ｖ−２０４とした。このうち、ＳＶ　−２
０３がｃＤＮＡの膜貫通領域に相当する部分が除かれて
いることを確認した。従って、５ｖ２０３が本発明に係
るプラスミドであり、その他は比較例である。

貫避　　　立　　　　での 培養細胞ＣＯ３−７は、１０％牛脂児血清を含む合成培
地（ＤＭＥＭ）中で生育させ、公知の方法により例１の
発現プラスミドを用い形質転換した（Ｃ，Ｃｈｅｎａｎ
ｄ　Ｈ，Ｏｋａｙａｍａ、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏ
ｌ、ユ、　２７４５　（１９８７）参照）。このとき、
細胞５Ｘ１０’個に対し、２０ｐｇの発現プラスミドを
使用した。３％二酸化炭素、３５°Ｃの条件下で２４時
間培養した後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）０．２％
含むＤＭＥＭ培地１０ｍで２回細胞を洗浄した後、０．
２％ＢＳ八を含むＤＭＥＭ培地１０ａｆ中、５％二酸化
炭素、３７°Ｃの条件下で４８時間さらに培養した。

例２で発現させた細胞培養液を遠心分離により細胞と上
清（培地）に分けた。

上清について酵素活性を測定した。アミド化酵素活性の
測定は、文献（Ｔｏｈｏｋｕ　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　
１５６゜１９１　（１９８Ｂ））に記載される方法に従
った。すなわち、反応基質として、４０ピコモルのＤ−
チロシルし一バリルグリシンおよび＋２５１　　ｐ−チ
ロシル−し−バリルグリジンを用い、ｐＨ８，５の５０
ｍＭヘペスー苛性カリ緩衝液中に１００■／１１１カタ
ラーゼ、１ｎＰＩのアスコルビン酸、５０禮の銅イオン
を含む反応液中、３７°Ｃで５〜１０時間反応させた。

イオン交換カラムを用いて生産された”５ｌ−Ｄ−チロ
シル−し−バリンアミドおよびＤ−チロシル−しバリン
アミドを分離し、その放射活性をＴ−カウンターで測定
することにより酵素活性を測定した。

測定結果を第１表に示す。

分泌画分 ＳＶ　−２０３（本発明）　　　　　　　２１４１００
ＳＶ　−２０１（比較例）　　　　　　　４６８００Ｓ
Ｖ　−２０２（同上）３８７００ ＳＶ　−２０４（同上）　　　　　　　　３９７００Ｓ
Ｖ　−２０５（同上）　　　　　　　　　４７３００ｐ
ＳＶ２　　（対照”）　　　　　　　　　７４００本発
明に係るプラスミドＳＶ　−２０３を利用する動物培養
細胞により注量されるペプチドＣ末端酵素は、その酵素
レベルで比較例の約５倍以上であり、対応するｃＤＮＡ
の膜貫通領域部分を除（ことにより著しく増大すること
がわかる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ペプチドＣ末端アミド化酵素を対応す
るｃＤＮＡの特定の組換えプラスミド−宿主系で極めて
効率よく製造することができる。

【図面の簡単な説明】 第１図はウマ、ウシ、ラット、カエルよりクロニングさ
れたペプチドＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡより推定され
たアミノ酸配列を一文字表示で示したものである。 第２図はラット下垂体ｍＲＮＡよりクローニングしたＣ
末端アミド化酵素ｃＤＮＡの塩基配列およびそれにより
推定されたアミノ酸配列を示したものである。 第３図はラット下垂体ｍＲＮＡよりクローニングされた
５つのＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡを模式的に示したも
のである。推定される酵素をコードされる領域をボック
スで示した。数字は翻訳開始点を１とした塩基数（ｂｐ
）を示す。ＴＭは膜貫通領域に対応する部分を示す。制
限酵素はそれぞれ次の略号で示した。 Ｂ　　（ＢａｍＨｌ）　、　　Ｎ　（Ｎｓｉ？）　、　
　ＲＩ　　（ＥｃｏＲＩ）　。 ＲＶ　（膿ＲＶ）、Ｓ　　（鋤１）、　　Ｘ　　（勘！
■）ｒｅｇｉｏｎＡ　％　Ｃは第２図に塩基配列を示し
た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、膜貫通領域に相当する部分を除いたペプチドＣ末端
   アミド化酵素ｃＤＮＡを含んでなり、そしてこれを発現
   せしめることができるプラスミドにより形質転換された
   宿主細胞を培養することにより前記酵素またはその前駆
   体を産生蓄積せしめた培養物より、これを採取すること
   を特徴とするペプチドＣ末端アミド化酵素の製造方法。 ２、前記ｃＤＮＡが哺乳動物由来のものである請求項１
   記載の方法。 ３、前記哺乳動物がラットである請求項２記載の方法。 ４、前記宿主細胞が動物培養細胞である請求項１から３
   のいずれかに記載の方法。