JPH044873B2

JPH044873B2 -

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Publication number: JPH044873B2
Application number: JP60000452A
Authority: JP
Priority date: 1985-01-08
Filing date: 1985-01-08
Publication date: 1992-01-29
Also published as: CN1010104B; SU1512488A3; DE3689196D1; FI860058L; EP0188316A3; CN86100062A; JPS61162193A; FI87579B; EP0188316A2; FI87579C; FI860058A0; EP0188316B1; DE3689196T2

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、微生物の作用により、炭素数２〜６
のニトリル類を水和して対応するアミドを製造す
る方法に関する。従来の技術近年、微生物、酵素またはそれらを固定化して
種々の単位化学反応や複合化学反応の触媒として
利用しようとする動きが盛んになつてきている。ニトリル類を水和して相当するアミド類を生成
させる酵素はニトリラーゼ（またはニトリルヒド
ラターゼ）として知られており、その代表的な反
応例として、例えば、特開昭51−86186号公報に
はバチルス（Bacillus）属、Prevotの意味でのバ
クテリジユーム（Bacteridium）属、ミクロコツ
カス（Micrococcus）属、およびブレビバクテリ
ウム（Brevibacterium）属の細菌が、特公昭56
−17918号公報にはコリネバクテリウム
（Corynebacterium）属およびノカルジア
（Nocardia）属の細菌が、特公昭59−37951号公
報にはシユードモナス（Pseudomonas）属の細
菌がニトリラーゼ活性を有し、ニトリル類を水和
して相当するアミド類を生成すること、特に、ア
クリロニトリルを水和してアクリルアミドを生成
せしめることが記載されている。発明の概要本発明者らは、ニトリラーゼ活性を有する微生
物を求めてさらに種々探索検討を続けた。その結
果、ロドコツカス（Rhodococcus）属およびミ
クロバクテリウム（Microbacterium）属に属す
る細菌が、ニトリラーゼ活性を有し、炭素数２〜
６のニトリル類を水和して相当するアミドを生成
する能力を有することを見出し本発明を完成し
た。すなわち、本発明は、ロドコツカス
（Rhodococcus）属またはミクロバクテリウム
（Microbacterium）属に属し、炭素数２〜６の
ニトリルを水和して対応するアミドに変換する能
力を有する微生物の培養液、菌体、または菌体処
理物を、水性媒体中該ニトリルに作用せしめるこ
とを特徴とする微生物によるアミド類の製造法で
ある。本発明の方法は、アクリロニトリルよりアクリ
ルアミドを製造する方法において、特に有効であ
る。本発明で使用される微生物は、ロドコツカス属
またはミクロバクテリウム属に属するニトリラー
ゼ活性を有する細菌であり、例えばロドコツカス
エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）
IFM155、ロドコツカスロドクラウス
（Rhodococcus rhodochrous）IFM153、ロドコ
ツカスsp.s−６（Rhodococcus sp.s−６）および
ミクロバクテリウムフラバム
（Microbacterium flovum）IAM1642などをあげ
ることができる。これらのうち、IFMおよびIAMの記号を付し
たものは公知の微生物であり、各々、千葉大学生
物活性研究所（IFM）および東京大学応用微生
物研究所（IAM）の菌株保存機関（JFCC）を通
じて容易に入手することができる。また、ロドコ
ツカス、sp.s−６は本発明者らが自然界より分離
した、特にニトリラーゼ活性の高い菌株であり微
工研条寄第687号として寄託されており、その菌
学的性質は以下の通りである。ロドコツカス sp.s−６菌株 (a) 形態 (1) 小桿状0.5〜0.8μ×１〜5μ (2) 培養初期に長桿状を呈し、不規則な分枝が
認められ、特に球状ないし短桿状に断裂す
る。（多形性） (3) 運動性なし (4) 芽胞の形成なし (5) グラム染色＋ (6) 抗酸性 − (b) 各培地における生育状態（30℃） (1) 肉汁寒天平板培養において、コロニーは円
形、不規則、表面平滑、淡ピンク色 (2) 肉汁寒天斜面培養において、生育良好、断
面台状で光沢なし、淡ピンク色 (3) 肉汁液体培養において菌膜を形成し旺盛に
生育、液は透明で生育にしたがつて沈んでん
する。 (c) 生化学的性状 (1) 硝酸塩還元＋ (2) 尿素分解＋ (3) インドール産生 − (4) デンプン分解 − (5) ゼラチン分解 − (6) セルロース分解 − (7) オキシダーゼ − (8) カタラーゼ＋ (9) 遊離酸素の要求性＋ (10) 嫌気下での生育 − (11) Ｏ／Ｆテスト０ (12) 37℃での生育＋ (13) ビタミン要求性 − (14) グルコースよりガスの産生 − (15) グルコースより酸の産生＋ (d) 細胞の化学分析 (1) メソ−ジアミノピメリン酸、アラビノー
ス、ガラクトースを含む。〔B.ベツカー（B.Becker）ら：アプライド
マイクロバイオロジー（Applied
Microbiology）第12巻 421頁（1964）、H.
A.ルシエバリエ（H.A.Lechevalier）ら：ジ
アクチノキセターレス（The
Actinomycetales）311頁（1970）〕 (2) 主なる脂肪酸としてC₁₆（ｎ、F₁）、C₁₈
（F₁）、C₁₉（10−CH₃）の脂肪酸を含む。〔駒形ら：インターナシヨナルジヤーナル
スオブシステマチツクバクテリオロジ
ー（International Journals Systematic
Bacteriology）第33巻 188頁（1983）〕 (3) ミコール酸タイプとしてC₃₂〜C₄₆のミコー
ル酸を含む。〔M.グツドフエロー（M.Goodfellow）：マ
イクロバイオジカルクラシフイケイシヨン
アンドアイデンチフイケイシヨン
（Microbiological Classification and
Identification（1980）〕以上の菌学的性質をバージエーの分類書（Be
−rgy′s Manual of Determinative
Bacteriology）第８版（1974）、シユレーゲルか
らの分類書ザプロカリオーテス〔The
Prokaryotes Vol.（1981）〕および微生物の化
学分類に関する上記(d)記載の諸文献などにより調
べると、ｓ−６菌株はグラム（＋）、胞子形成
（−）、好気性の桿菌で多形性が認められ、抗酸性
（−）である。また、本菌は菌体内にメソージア
ミノピメリン酸、アラビノース、ガラクトースを
含み、脂肪酸タイプとしてC₁₆（ｎ、F₁）、C₁₃
（F₁）、C₁₉（10−CH₃）、ミコール酸タイプとして
C₃₂〜C₄₆のミコール酸を含む。以上の菌学的性質より本菌株をロドコツカス
（Rhodococcus）属に属する細菌と同定した。本発明に使用されるこれら細菌の培養にはグル
コース、グリセロール、マルトースなどの炭素
源、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの
窒素源、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、大豆
タンパク加水分解物、コーステイープリカー
（CSL）などの有機栄養源、およびリン酸塩、マ
グネシウム、カリウム、亜鉛、鉄、マンガンなど
の無機栄養源などを適宜含有する通常の培地が用
いられる。培養のPHは６〜８、温度は20〜35℃、
好ましくは25〜30℃で１〜３日間通気撹拌下に行
われる。本発明の方法を実施するに当つては、例えば前
記した細菌のうちの一種を選び、これを前述の方
法で２〜３日間培養した培養液、培養液から分離
した菌体、または菌体処理物（粗酵素、固定化菌
体など）を水、緩衝液または生理食塩水に懸濁
し、これにニトリル化合物を共存させればよい。本発明において、ニトリル化合物に前記菌体類
を作用させる条件としては、菌体使用量0.01〜10
重量％、ニトリル化合物0.1〜10重量％を含む水
性懸濁液を温度氷点〜30℃、好ましくは氷点〜15
℃、PH６〜10、好ましくはPH７〜９で0.5〜10時
間反応させればよい。なお、反応に際して、基質
であるニトリル化合物はいずれも生物毒性の強い
化合物であり、本酵素反応の阻害作用が大きい。
従つて、系内の基質濃度は好ましくは５％以下、
より好ましくは２％以下になるようコントロール
しつつ逐次添加する。また、反応中のPHは上記範
囲からはずれると、生成蓄積したアミドがさらに
化水分解を受けたり、菌体酵素の安定性低下をも
たらすので苛性アルカリ（例；NaOH、KOH）
を逐次添加するか、系内に予め緩衝液を加える等
によりPH７〜９にコントロールすることが好まし
い。反応条件を適正に設定してやれば、ほヾ転換
率100％、副生物のない状態でニトリル化合物か
ら対応するアミドを高濃度に生成蓄積させること
ができる。反応液からのアミドの採取は、一般に知られて
いる任意の方法で行なうことができる。すなわ
ち、例えば、反応液から菌体を遠心分離等によつ
て除き、活性炭、イオン交換樹脂等による処理に
より着色物質、不純物等を除去した後、減圧濃縮
して目的のアミド、例えば、アクリルアミドを得
ることができる。次に、本発明を実施例により説明する。なお、
下記実施例中の部および％は重量に関する。ま
た、各種ニトリルおよび対応するアミドはガスク
ロマトグラフイーで、対応する有機酸は高速液体
クロマトグラフイーにて分析定量した。実施例１グルコース１％、ペプトン0.5％、酵母エキス
0.3％、肉エキス0.3％からなる培地（PH7.2）を用
い、30℃、48時間好気的に培養して得たロドコツ
カスsp.s−６株菌体を遠心分離し、0.05Mリン酸
バツフアー（PH7.7）にて洗浄、遠心分離をくり
返し行つてｓ−６株の洗浄菌体（含水率80％）を
調製した。この洗浄菌体0.5部、0.05Mリン酸バツフアー
（PH8.5）84.5部を混合し、撹拌下に０〜３℃で15
部のアクリロニトリルを反応系内のアクリロニト
リル濃度が２％以上にならないようにコントロー
ルしつつ間歇的に添加して水和反応を行なつた。
アクリロニトリルの添加は約３時間で終了する
が、反応を完結させるためさらに数時間撹拌を続
けた。反応終了後、菌体を遠心分離により除去
し、澄明液を得た。このものは20％のアクリルア
ミドを含み、アクリルアミドの収率は99.9％以上
であり、未反応のアクリロニトリルは全く検出さ
れず、副生アクリル酸は0.1％以下（対アクリル
アミド）であつた。この澄明液を50℃以下で水を留去濃縮し結晶を
析出させ、次いでこの結晶をメタノールから再結
して無色板状の結晶をえた。このものの融点、元
素分析、およびIKから、本品はアクリルアミド
と同定された。実施例２実施例１と同様に培養して得たｓ−６菌株の洗
浄菌体を用い、下記の条件で種々のニトリル類に
対する反応性を検討した。ａ反応条件ニトリル化合物 2.5％リン酸カリウムバツフアー PH7.7／0.05M 菌体５mg（乾燥菌体として）温度 10℃ 反応時間 10min 反応液量 10ml ｂ反応結果供試ニトリルアミド生成活性^* アセトニトリル 30 プロピオニトリル 102 アクリロニトリル 100 メタクリロニトリル 123 ブチロニトリル 51 バレロニトリル 11 ニコチノニトリル 16 ＊アクリロニトリルに対する活性を100とした
時の相対値で表した。実施例３グリセロール１％、KH₂PO₄0.1％、MgSO₄・
7H₂O0.05％、FeSO₄・7H₂O0.001％、大豆タンパ
ク加水分解物0.5％、酵母エキス0.1％（PH7.5）か
らなる培地を殺菌後、無菌イソブチロニトリル
0.5％を加えたもの100mlを500ml三角フラスコに
調製し、これに予め実施例１の培地で48hr前培養
しておいた下記のタイプカルチユアー菌の培養液
１mlを添加し、25℃、48hr振盪培養した。培養終
了後遠心分離により収菌し0.05Mリン酸バツフア
ー（PH7.7）にて洗浄、遠心分離をくり返して洗
浄菌体を得た。得られた各洗浄菌体につき、アク
リロニトリルからアクリルアミドの生成活性を実
施例２記載の方法に準じて測定した。得られた結
果は表−１に示す通りであつた。【表】

Claims

【特許請求の範囲】１ロドコツカス（Rhodococcus）属またはミ
クロバクテリウムウ（Microbacttrium）属に属
し、炭素数２〜６のニトリルを水和して対応する
アミドに変換する能力を有する微生物の培養液、
菌体または菌体処理物を、水性媒体中該ニトリル
に作用せしめることを特徴とする微生物によるア
ミド類の製造法。２温度が氷点〜30℃の水性媒体中で作用せしめ
る特許請求の範囲第１項記載の製造法。３温度が氷点〜15℃の水性媒体中で作用せしめ
る特許請求の範囲第１項記載の製造法。４ PHが６〜10の水性媒体中で作用せしめる特許
請求の範囲第１〜３項記載の製造法。５ PHが７〜９の水性媒体中で作用せしめる特許
請求の範囲第１〜３項記載の製造法。６水性媒体中にニトリルを連続的または間歇的
に添加する特許請求の範囲第１〜５項記載の製造
法。７ニトリルがアクリロニトリルであり、微生物
がロドコツカスsp.s−６株（微工研条寄第687号）
である特許請求の範囲第１〜６項記載の製造法。