JPH044889A - Ｌ‐フェニルアラニンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＬ−フェニルアラニンアンモニア・リアーゼを
用いて、桂皮酸とアンモニア供与体からしフェニルアラ
ニンを製造する方法に関する。

Ｌ−フェニルアラニンは人間の必須アミノ酸の一種であ
り、医薬品あるいは飼料に添加されるなどその用途は非
常に広い。また、Ｌ−フェニルアラニンはジペプチド甘
味料であるアスパルテームの製造原料として近年、その
需要は高まりつつあり産業上有用なものである。

〔従来技術〕

従来、Ｌ−フェニルアラニンの該当技術分野での公知の
製造方法は、英国特許第１４８９４６８号公報、特公昭
６１−４４４７４号公報、特開昭５９−９１８９０号公
報、特開昭６０−１３３８９３号公報、特開昭６１−２
４７３９５号公報、特開昭６１−１２２９７号公報等に
開示されている。

これらの方法は、Ｌ−フェニルアラニンアンモニア・リ
アーゼ（以下ＰＡＬと略す）が触媒するしフェニルアラ
ニンと桂皮酸、アンモニアとの平衡反応における逆反応
を利用したものである。

桂皮酸からＬ−フェニルアラニンへ・の転換率を高める
ため、英国特許第１４８９４６８号公報においては過剰
のアンモニアの存在下で酵素反応を行うことにより、従
来知られていなかったＰＡＬによる桂皮酸からＬ−フェ
ニルアラニンへの生成を可能にした。

さらに、特公昭６１−４４４７４号公報においては反応
条件として、アンモニア濃度が約３″［−ル／ｌ以−ト
、桂皮酸濃度が約０．０５〜０．２モル／ｌである、よ
り有利な反応方法を教示している。

１−２かし、該特許等には酵素の安定性についての記載
はない。酵素の安定性に関しては、ホジンス（ＩＩＯＤ
ＧＩＮｓ　）らがアーカイブス・オブ・バイオケミスト
す・アンド　ハイオフィジクス（Ａｌ？Ｃ旧νｌ！ＳＯ
Ｆ　ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲ’ｌ’　ＡＮＤ　ＢＩＯＰ
ＨＹＳＩＣ３）　（Ｖｏｌ、１４９９１９６１９７２）
において、ハロゲン類がＰＡＬの酵素活性部位に結合す
ることにより酵素活性を阻害することを報告り、ている
。

こわと同様のこ２−が特開昭５９−９１８９０号公報に
開示されており、アンモニア供与体に非ハロゲンアンモ
ニア供、！−Ｉ体を使用し実施することを開示している
。該１）許においては′３［ハロゲンアン干ニア供与体
と１−７で好ましいものは硫酸アンモニウムであり、ア
ンモニア濃度が１〜５モル／βで実施されるのが好ま（
７いとしている。

同様に、特開昭６０−１３３８９３号公報は炭酸アンモ
ニウムをアンモニア供与体として用いることで精製を容
易に行えることを開示している。

特開昭６１−２４７３９５号公報では、反応の終期に反
応温度を下げることにより桂皮酸の１．−フェニルアラ
ニンへの転換率を＋げることができること、そ（］て、
その際の最も好ましいアンモニウム塩として炭酸アン士
ニウムを用い、反応条件は桂皮酸濃度が約０．０１−１
．０モル／β、好ましくは０．１へＱ　、　５モル／ｆ
であり、アンモニア濃度は約０．１〜ｌ０１０モル／ｌ
、好ましくは１．０から８，０モル／ｆであると教示し
ている。

特開昭６１−１２２９７号公報では１０モル／ｒ以上の
アンモニアと、該アンモニア量に対し０．０５＝０．５
当量の炭酸イオンからなる反応液を用い、０．０５モル
／β以下の桂皮酸濃度で反応する方法を示し、その中で
炭酸アンモニウムを用いることの利点として、Ｐ　Ａ　
Ｌ、の活性は炭酸アンモニウムからなる反応液中では高
アンモニア濃度の条件下でも安定に持続されることを開
示している。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明者らは、アンモニア供与体として炭酸アンモニウ
ムを使用した反応についてさらに検オ・１を重ねた結果
、 ■該酵素を用いＬ−フェニルアラニンを生成する際に平
復１を１．−フェニルアラニン側に大きく傾けるためＣ
，工高アン士ニア濃度が必要であり、炭酸アン干ニウム
を用いた反応では、ｐ旧０．０、アンモニア濃度１０千
ル／ｐ以−トの条件で行うことが好ましい。

しかし、この反応液中ではＰ　Ａ　Ｌが塩析を起こし、
酵素反応に寄与出来なくなる。（同様に、硫酸アンモニ
ウム、酢酸アンモニウム、蟻酸アンモニウムをアンモニ
ア供与体とした反応釜イ１でもＰ　Ａ　Ｌが塩析を起こ
ｔ５、でしまい酵素反応は進まない。）■ＰＡＬが塩析
を起こさない５モル／ｌ以下のアンモニア濃度での反応
速度は、炭酸アンモニウムをアンモニア供与体として用
いると、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、蟻酸ア
ンモニウム等をアンモニア供〜１体として用いた場合に
比べ極端に小さい。

という反応８トの問題点を見いだした。

この炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムから成る反
応液中での反応において、反応速度が遅く、Ｐ　Ａ　Ｌ
の塩析が起こることは反応上の重要な欠点である。

〔課題を解決するための手段］ 前述したこれらの問題点について改良すべく鋭意検耐し
た結果、蟻酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の低級
カルボン酸のアンモニウム塩と炭酸アンモニウム及び水
酸化アンモニウムからなる反応液中で反応を行うことに
より、炭酸アンモニウムと水酸化アンモニア量、からな
る反応液中での反応に比べ反応速度を有意に上関しうろ
こと、ｐＨ１０，０〜１Ｏ０６、アンモニア濃度１０モ
ル／で以上であってもＰＡＬの塩析が起こらないことを
見いだし、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、し−フェニルアラニンアンモニア・リ
アーゼ存在下に、桂皮酸とアンモニア供与体から１、−
フェニルアラニンを酵素的に生成させるに際して、アン
モニア供与体が低級カルボン酸のアンモニウム塩、炭酸
アンモニウム及び水酸化アンモニウムから成る１、−フ
ェニルアラニンの製造方法である。

本発明の方法は亮アンモニア濃度に於いてもＰＡＬの塩
析が起こらない状態で反応を行うことができる。このこ
とは、反応に非常に有利な条件を与え、いままで知られ
ている炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムとからな
る反応液中での反応よりも更に良好な反応が実施できる
。

これらは文献未載の効果であり、また従来の知見からは
容易に推測しえない。

本発明において使用するＰＡＬは、桂皮酸とアンモニア
供与体からＬ−フェニルアラニンを生成せしめる酵素で
あり、ロドスポリジウム属などの酵母、カビ等の微生物
のほかに、ジャガイモ、パセリ等の植物にも分布してい
ることが知られており、これらの生物を直接利用するか
、もしくは、これらの生物からＰＡＬの構造遺伝子を取
り出し遺伝子操作により大腸菌などの微生物を該酵素住
産能を有する形質転換体とし利用することができる。

更に、ＰＡＬ生産能を有する微生物の培養液・該培養液
から遠心分離等により得られる菌体、または該菌体の処
理物（例えば、洗浄菌体、固定化菌体、菌体破砕物、菌
体の自己消化物、菌体の超音波処理物、凍結融解物）等
を用いることができる。

本発明に係る反応方法は、例えば上記微生物の培養液、
該反応液から遠心分離等により得られる菌体、あるいは
該菌体処理物を用いて行う。

反応液を調製するために用いる低級カルボン酸のアンモ
ニウム塩としては、例えば、蟻酸アンモニウム、酢酸ア
ンモニウム、プロピオン酸アンモニウム、酪酸アンモニ
ウム等が挙げられる。

本発明に係る反応に用いる反応液の最も容易な調製法は
、炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムからなる液と
、低級カルボン酸のアンモニウム塩と水酸化アンモニウ
ムからなる液を、それぞれ同じｐｏ、アンモニア濃度に
調製し混合する方法である。詳しくは、炭酸アンモニウ
ムを水あるいはアンモニア水に熔解し、さらにアンモニ
ア水を加えるか、あるいは必要に応じてアンモニアガス
を吹き込みｐｌｌを調整する。その液のアンモニア濃度
を測定し所望の濃度に水で希釈することにより炭酸アン
モニウムと水酸化アンモニウムからなる液を調整する。

また、低級カルボン酸のアンモニウム塩を水あるいはア
ンモニア水に溶解し、さらにアンモニア水を加えるか、
あるいは必要に応じてアンモニアガスを吹き込みｐＨを
調整する。そして、その液のアンモニア濃度を測定し、
所望の濃度に水で希釈することにより、低級カルボン酸
のアンモニウム塩と水酸化アンモニウムからなる液を調
整する。このようにして得られた両液を好ましい混合比
で混合することにより反応液を得る。混合により得られ
た反応液の９Ｎ、アンモニア濃度は混合前と全（変わら
ない。

他の調整法、例えば炭酸アンモニウムと水酸化アンモニ
ウムからなる液に低級カルボン酸のアンモニウム塩を添
加しながらｐＨの調整をする方法、低級カルボン酸の塩
と水酸化アンモニウムからなる液に炭酸アンモニウムを
添加しなからｐＨを調整する方法等では、炭酸アンモニ
ウム、低級カルボン酸ノアンモニウム塩及び水酸化アン
モニウムからなる任意のｐＨ、アンモニア濃度の反応液
を調整することは煩雑、困難であり、実施上好ましくな
い。前述した方法により反応液を調整する場合において
は、全反応液量に対しての低級カルボン酸のアンモニウ
ム塩と水酸化アンモニウムからなる液の割合（Ｖ／Ｖ）
が５〜９０％、好ましくは５０〜８０％で反応速度が上
昇する。５％以下では炭酸アンモニウムと水酸化アンモ
ニウムからなる反応液中と同じ反応速度しか得られず、
また９０％以上では反応速度は著しく低下する。

反応液のアンモニア濃度は５〜１２モル／！、好ましく
は１０〜１２モル／ｌで行う。高アンモニア濃度は平衡
をＬ−フェニルアラニン側に傾けるために有利である。

反応温度は】０〜４０°Ｃ１好ましくは２５〜３５°Ｃ
で行う。１０°Ｃ以下では反応速度が遅＜、４０″Ｃ以
上ではＰＡＬの酵素活性が低下する。

ｐｌ（は９，６〜１１．０、好ましくは１０．０〜１０
．６で行う。

反応に用いる桂皮酸は一般に工業的に製造されるものを
用いることができる。

反応液からのＬ−フェニルアラニンの精製法は、■反応
液を遠心分離することにより菌体を除去し、■その反足
、液を加熱して過剰Ｃご存在するアンモニアを除去し、 ■さらに、酸を加えｐＨを酸性にし、その液を遠心、あ
るいは濾過することにより残存する桂皮酸を除去し、 ■その液をイオン交換樹脂に通液し、Ｌ−フェニルアラ
ニンを吸着・ン容離さセ、 ■溶離液を濃縮し、１．−フェニルアラニンの等電点（
５，５＞にｐＨを調製し、析出したＬ−フェニルアラニ
ンを濾過等により回収する。

などの方法を組み合わせて容易に行うことができる。

〔発明の効果〕

本発明により、Ｐ　Ａ　Ｌが塩析しない有利な反応条件
下での、短時間での反応が可能となりＴ業的に非常に有
利な条件を寄与するものである。

〔実施例〕

以下、実施例、比較例を挙げて本発明方法についてさら
に具体的に説明する。しかし、具体的な例として示すも
のであり発明の範囲を限定するものではない。

実施例においての桂皮酸またはＬ−フェニルアラニンの
定量は、紫外吸収分光光度計を検出器に設置した液体ク
ロマトグラフィー法により行った。

検出波長は２２３ｎｅ＋で行い、カラムは日本分光■の
ＦＩＮＥＩ］Ａｋ　５ＩＬＣ１８を用いて行った。反応
液中の総アンモニア濃度の測定は水蒸気蒸留−逆滴定法
により行った。

実施例１　（混合反応液における反応初速度）炭酸アン
モニウムと水酸化アンモニウムからなる反応液と、蟻酸
アンモニウムあるいは酢酸アンモニウムと水酸化アンモ
ニウムからなる反応液から混合比（ｖ／ｖ）を変えて、
第１表に示ずような構成比とした混合反応液を作成した
。

混合反応液５０ｇにＰ　Ａ　Ｌ産生菌体懸濁液（１００
ｇ乾燥菌体／ｆ）５ａｅを加え、３０°Ｃで１時間振盪
撹拌し、さらにその液に桂皮酸０．３７　ｇを加え反応
を開始した。その９０分後の生成した１、−フチ４ニル
アラニン濃度を測定した。生成した１、−フェニルアラ
ニンの生成量から反応速度を求め、炭酸アンモニウムと
水酸化アンモニウムから成る反応液における速度を１０
０％とした比を第１表に示した。

第１表（混合反応液中の反応速度の比較）（以下余白） 炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムからなる反応液
中の反応速度に比べ、混合反応中では有意に反応速度が
高いことを示している。

実施例２（混合反応液における塩析） ＰＡＬ産生菌体を５０ｇ＃！にまで水で希釈、懸濁させ
、その懸濁液をフレンチプレス（ＳＬＭ　Ｉｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ製）（破砕条件：　８００ｂａｒ
）に給液して菌体を破砕し、破砕液を］、００００ｇで
３０分遠心分離した。その上？Ｒ？ｐｉ、に硫酸アンモ
ニウムを２８％飽和まで加え、再度遠心分離を行った。

その上清液に更に３７％飽和にまで硫酸アンモニウムを
加え、その際に塩析した沈澱を遠心分離により回収し、
その分画成分を粗酵素液として用いた。以上の操作はす
べて１０°Ｃ以下で実施した。粗酵素液２０ｄを分画分
子量１００００の透析チューブにつめ、第２表に示す組
成の反応液（２００ｄ）にひたし、２０’Ｃで６０分振
盪撹拌する。所定時間処理後、チューブ中の酵素液を取
り出し、その酵素液を遠心分離し上清中の活性を測定し
た。活性の測定方法はトリス塩酸緩衝液（１００ミ！ｌ
−１１：　ル／　ｆ　、　ｐＨ８，８）　０．５＃Ｌｉ
！ニ、水０．９９ａ＋ｌ、　Ｌ−フェニルアラニン水？
ｇ？Ｐｊ（１００ミリモル＃り０．５ａｉ！を加え、さ
らに３０゛Ｃで５分間プレインキュヘイジョンする。そ
して酵素液１０ｕｌを加えて反応を開始し、３０°Ｃで
１０分間振盪攪拌する。

その反応液中の桂皮酸の濃度を液体クロマトグラフィー
で測定する。生成した桂皮酸の量から活性を求め、塩析
前の酵素液を用いた場合の活性を１００％としたときの
比を第２表に示した。

比較例１　（遠心上清中のＰＡＬの塩析）用いる反応液
を第２表に示すものに変更した以外は実施例２と同様の
操作を行った。結果を第２表に示す。さらに、遠心した
沈澱物中のＰＡＬ活性の存無は、沈澱を水に懸濁させ、
その懸濁液を酵素液として実施例Ｉで述べた活性測定の
方法により測定した。

（以下余白） 第２表（各７ンｔニア濃度における遠心上清中の活性）
第２表は炭酸アンモニウム−蟻酸アンモニウム水酸化ア
ンモニアからなる反応液あるいは、炭酸アンモニウム−
酢酸アンモニウム−水酸化アンモニウムからなる反応液
中では上清液中の活性の低下は見られず、このような反
応液中では塩析が起こっていないことを示している。

ＩＪ６１２アンモニウム−アンモニア反応液、Ｉｌｆア
ンモニウム−アンモニア反応液、蟻酸アンモニウム−ア
ンモニア反応液ではアンモニア濃度が高くなるにつれ酵
素液を遠心した上清液中の活性は減少した。このことは
高アンモニア濃度の反応液中ではＰＡＬの塩析が起こっ
ていることを示している。また、５モル／ｌのアンモニ
ウム濃度中の酵素液の遠心上清液中の活性は元の酵素液
中の活性と変わらないことから、これらの反応液の５モ
ル／ｌ以下のアンモニウム濃度においてはＰＡＬの塩析
が起こっていない、また、塩析した沈澱を活性測定に用
いるトリス塩酸緩衝液に再透析すると有意な活性が認め
られた。このことは、ＰＡＬが塩析していることをさら
に明確にした。

また、炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムからなる
反応液中においても」二清液中の活性の減少が見られ、
また沈澱物を活性測定に用いるトリス塩酸緩衝液Ｃ１二
再透析するとその液中にも有意な活性４コ３．めた。こ
のことは、炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムから
なる反応液中においても同様にＰ　Ａ　ｉ、の塩析がお
こり反応に不利な状態Ｇこあることを示している。

比較例２（各反応液における反応速度）１ゝＡ　１．産
生菌体を含む懸濁液（１００ｇ乾燥菌体／ｐ）ｓａｌに
、第３、第４表に示す各アンモニア濃度に調整したアン
モニア反応′ｌ＆、５０ｇを加え、３０’Ｃｒ　１時間
振盪撹拌を行い菌体を均一・に懸濁さセ−た後、桂皮酸
０．３７　ｇを加えることにより反応を開始した。６０
分後の反応液中のＬ−フェニルアラニン生成濃度を液体
りｌコマトゲラフイーで分析（７た。

結果を第３表、第４表に示す。

（以下余白） 第３表（アンモエフ１０モル濃度での反応速度の比較）
第４表（アンモエフ５モル濃度での反応速度の比較）＊
二６０分後の１．−フェニルアラニンの生成濃度＃：（
）内は炭酸７ンモニウム一アンモーー７反応液中の反応
速度を１００としたときの割合を示す。

第３表はアンモニア濃度１０モル／ｌの蟻酸アンモニウ
ム−アンモニア反応液、酢酸アンモニウムアンモニア反
応液、硫酸アンモニウム−アンモニア反応液中では反応
が進まないことを示している。

第４表はアンモニア濃度５モル／７！の炭酸アンモニウ
ム−アンモニア反応液中では、アンモニア濃度５モル／
ｌの酢酸アンモニウム−アンモニア反応液、硫酸アンモ
ニウム−アンモニア反応液中に比べて反応速度が著しく
少ないことを示している。

特許出願人　三井東圧化学株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １）Ｌ−フェニルアラニンアンモニア・リアーゼ存在下
   に、桂皮酸とアンモニア供与体からＬ−フェニルアラニ
   ンを酵素的に生成させるに際して、アンモニア供与体が
   低級カルボン酸のアンモニウム塩、炭酸アンモニウム塩
   及び水酸化アンモニウムから成ることを特徴とするＬ−
   フェニルアラニンの製造方法。