JPH044900A - カンピロバクタｒＲＮＡのためのハイブリダイゼーション評価分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、−船釣にはオリゴヌクレオチドプローブおよ
び免疫化学技術、およびその様なプローブを免疫化学技
術と組み合わせて診断および他の応用目的に使用する方
法に関する。さらに詳しくは、本発明は、一つ以上のカ
ンピロバクタ（ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）の存在を
検出し、拡張した評価分析形式では試料中の一つ以上の
標的核酸を検出するだめの、サンドイッチハイブリダイ
ゼーションからなる。

（従来の技術） カンピロバクタ属は現在、急性細菌性腸炎の主要な原因
と見なされている。これらのらせん状の病原体は、人間
の腸管表面で繁殖することが分かっており、この病気は
自己限定性であるが、早期に抗生物質で治療することに
より、病気の期間を短縮し、便の排泄をすくなくする。

腸炎の一原因がカンピロバクタであることが発見されて
以来、生物化学的方法により、この細菌の多数の菌株が
識別されているが、これらの種族が病気を引き起こす機
構については分かっていない。カンピロバクタに帰せら
れる発病力の決定因子を調べる研究には、転移増殖、付
着、侵入、および細胞毒素および内性毒素生産が含まれ
る。ラビンーラッセル（Ｌａｂｉｇｎｅ−Ｒｏｕｓｓｅ
ｌ）　　ら、　１７０（４）Ｉ）、１７０４　　−１７
０８゜（１９８８）。

医学的に重要な腸炎の主な病原体は、Ｃ，ジェジュニ（
ｊｃｊｕｎｉ）、　Ｃ，：Ｉす（ｃｏｌｉ）、およびＣ
，ラリディス（ｌａｒｉｄｉｓ）である。

試料中に存在するカンピロバクタ、その他の微生物は、
一般に培養技術により検出している。

その様な技術には、適切に調製した、生育できる試料を
適切な微生物学的な媒体上に堆積させ、その生物の発育
を促進するのに好ましい環境条件下におくことが必要で
ある。次いで、得られたコロニーの形態学的および生物
化学的特性を調べる。

１９７０年代の初期から中期にかけて、さらに研究およ
び洗練することによって、医療、特に診断評価分析にお
ける著しい進歩を約束する二つの新しい技術が開発され
た。これらの技術の一つは、特定の種類の巨大分子に依
存し、その特性により限定される免疫学的機構（モノク
ローナル抗体の開発および使用）に基づいている。他の
技術は、遺伝物質の操作に基づき、その様な部分を分析
するための物質および方法を含む。遺伝学的な方法は、
遺伝物質、ＤＮＡおよびＲＮＡに含まれるすべての情報
を含む。ＤＮＡはヌクレオチドの、２つの相補的なヌク
レオチドの鎖からなる。６鎖はその変性した形で、多数
の無関係なヌクレオチド列があっても、その相補的な鎖
をハイブリッド（アニール）化する能力を有する。核酸
のハイブリダイゼーションは、溶液または固体の支持体
上でＤＮＡ／ＤＮＡ　。

ＤＮＡ／ＲＮＡ、　ＲＮＡ／ＲＮＡの各種の組み合わせ
で実行することができる。ハイブリダイゼーション用の
旧型の固体支持体には、ニトロセルロースおよヒ化学的
に処理した紙がある。サザーン、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｌｏ。

９８　ｐ、５０３−５１７（１９７５）。その様なハイ
ブリダイゼーション技術の用途には、異常核酸分子およ
び病因学的な病原体に対して特異的な天然または合成の
、標識をつけた核酸分子（プローブ）の使用が関与する
。

デオキシリボヌクレオチドまたはりボヌクレオチトの連
鎖からなる核酸ハイブリダイゼーシヨンプローブを合成
する技術はこの分野では良く知られている。−船釣に、
プローブを造るには、細胞から標的ＤＮＡを分離し、変
性して一重のストランドを形成し、そのストランドのあ
る部分のコピーを分離、あるいは実験室で合成し、標識
をつける。

試料中にある標的ＤＮＡまたはＲＮＡの相補的なストラ
ンドにさらすと、その標識をつけたプローブがその相補
的な標的ＤＮＡまたはＲＮＡ列をハイブリッド化する。

プローブは、放射性同位元素、蛍光性分子、発光性分子
、酵素または免疫化学性分子を使用して標識をつけるこ
とができる。次いで、プローブ上の標識を検出し、問題
とする標的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出する。

ラシュチアン（Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎ）のヨーロッパ特
許出願第８７３ＤＯ５［ｉ９．８号は、カンピロバクタ
ＩＧＳ　ｒＲＮＡをハイブリッド化するオリゴヌクレオ
チド連鎖を記載している。標識（アビジン）をつけた固
体の支持体（プラスチック管）定量評価分析か記載され
ているが、そこではカンピロバクタ１６Ｓ　ｒＲＮＡに
対してハイブリッド化した、標識（ビオチン）を付けた
ＤＮＡプローブを、その固体支持体上の結合していない
標識をａ＋＋＋定することによって検出している（管に
結合したビオチンの量は、その管をアビジンで処理した
後の吸光度から推定する）。

グッドソンのヨーロッパ特許出ＭＭ第８７３０２３５４
．３号は、少なくとも２つの標識をつけたオリゴヌクレ
オチドを使用し、核酸連鎖を検出するための比色による
液体ハイブリダイゼーンヨン評価分析、およびそれに続
く分離のための固体支持体（微量滴定容器）へのハイブ
リッド複合体の捕獲を記載している。組状赤血球貧血の
制限場所特性およびＮ、ゴルアエ（ｇｏｎｏｒｒｈｅａ
ｅ）に対する毛表面抗原を検出するための方法を記載し
ている。

ホーガンらのヨーロッパ特許出願第８７３１０３６３．
４号は、非ウィルス性生物に対して特異性を示すために
選択した、ｒＲＮＡの可変領域に対して相補的なオリゴ
ヌクレオチドプローブを調製するための方法を記載して
いる。カンピロバクタ１６ｓ　ｒＲＮＡに対して特異性
を示すプローブを開示している。

ラシュチアン（Ｒａｓｈｔｅｈｉａｎ）らの米国特許第
４，７８５．０８０号は、カンピロバクタジェジュニ種
の細菌の少なくとも８０％のＤＮＡをハイブリッド化で
きるＤＮＡプローブ（９００−１５００個のヌクレオチ
ド）を記載している。変性した細菌性ＤＮＡを結合支持
体上に固定し、次いで、その細菌性ＤＮＡを標識プロー
ブでハイブリッド化する。標識を付けないプローブを使
用するもう一つの方法が記載されているが、そこでは接
触および検出工程をサンドイッチハイブリダイゼーショ
ンにより行っている。

ロウ（Ｌａｗ）らの米国特許第４，７４５，１８１号は
、免疫評価分析または核酸ハイブリダイゼーション評価
分析の様な特異的結合評価分析における化学発光標識の
使用を記載している。多置換アリールアクリジニウムエ
ステルが記載されている。

ジョセフソンの米国特許第４，６７２，０４０号は、核
酸ハイブリダイゼーション評価分析における磁気的に応
答する粒子の使用を記載している。核酸に結合した磁性
粒子を、遊離すべき分子を含む反応混合物に分散させ、
ハイブリダイゼーションさせ、その分子が結合した粒子
を反応混合物から分離する。次いで、ハイブリッド化し
た分子をその磁性粒子から分離する。

ヒルらの国際出願ＰＣＴ／ＣＢ８６１００１７０は、分
離目的に、−重ストランドＤＮＡまたはｌ？ＮＡに封管
できる物質で被覆した、磁性の、または磁化し得る材料
を使用することを記載している。分離の後、その磁性ま
たは磁化し得る材料に結合した物質をプローブに接触さ
せ、ハイブリダイゼーションにより単一ストランド物質
の存在を検出する。

ラシュチアン（Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎ）ら、Ｃｌ１ｎ、
　Ｃｈｅｍ、３３／９ｐ、１５２６−１５３０（１９８
７）は、核酸ハイブリッドのための免疫学的捕獲方法、
およびその非放射性標識ＤＮＡプローブ評価分析への応
用を記載している。カンピロバクタ１６Ｓ　ｒＲＮＡに
対して相補的な合成りＮＡプローブにビオチンで標識を
っけ、細菌性細胞の溶解質から得たりボッマールＲＮＡ
にハイブリッド化する。ハイブリダイゼーションの後、
そのハイブリッドを固定した抗ＤＮＡ：ＲＮＡ抗体で捕
獲し、ビオチン基化したプローブをストレプトアビジン
ホースラデイツシュペルオキシダーゼ共役で検出してい
る。この評価分析は純培養試料から７０，０００のカン
ピロバクタを検出している。

ヘラ−らのヨーロッパ特許出願第８２３０３７０１．５
号は、光放射ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション
評価分析を記載している。固体支持体方法を記載してい
るが、この方法は、標的のｍｍストランドポリヌクレオ
チドを適当な支持体上に固定し、固定した試料を、標的
のｍｍストランドポリヌクレオチドに対して相補的な、
標識（ペルオキシダーゼまたは鉄ポルフイリン誘導体）
をつけた−重ストランドボリヌクレオチド部分と接触さ
せ、ハイブリッド化していないｍｍストランドポリヌク
レオチド部分を分離し、固定したハイブリッドを光標識
を励起させる手段に露出し、その光応答を検出する工程
からなる。

ハンセンのヨーロッパ特許出願第８４３０６５１３．７
号は、アビジン被覆した固体支持体に結合した、ビオチ
ン基化した核酸プローブを形成し、固体の支持体に結合
したプローブを、酵素で標識をつけた核酸と標的の核酸
とのハイブリダイゼーション生成物と反応させる、サン
ドイッチハイブリダイゼーション評価分析を記載してい
る。

ランキらの米国特許第４，５６３，４１９号は、標的の
微生物性核酸を検出するための、競合−段階サンドイッ
チハイブリダイゼーション評価分析を記載している。固
体の支持体に固定した第一の核酸プローブを標的の核酸
試料および標識をつけた第二の核酸プローブとハイブリ
ッド化する。ハイブリダイゼーションに続いて、固体の
支持体に結合したハイブリッド複合体に関連する標識を
検出する。

マルコルムの国際出願ＰＯＴ／ＧＢ８５１００５９１号
は、固定した核酸部分および固定していない第二の標識
核酸のための担体として固体支持体（ポリマービーズ）
を使用する、サンドイッチハイブリダイゼーション反応
（２晩培養）を記載している。

ソダーランド（Ｓｏｄｃｒｌｕｎｄ）の英国特許第２，
１６９゜４０３号は、核酸を同定するための溶液ハイブ
リダイゼーション方法を開示している。検出（放射線標
識）核酸プローブおよび捕獲核酸プローブを、固体支持
体（親和力クロマトグラフィー）に捕獲する前に、標的
核酸列でハイブリッド化する。

スニットマンの国際出願ＰＣＴ／ＬＩＳ８６１０１２８
０号は、得られたハイブリッド複合体を固体支持体上に
固定し、続いて標的核酸連鎖の第二のハイブリダイゼー
ションを含む、溶液ハイブリダイゼーションを記載して
いる。改良方法は、固体支持体への捕獲を増加させるた
めに、第一のハイブリダイゼーション工程中に、はっき
りと識別できる第二のプローブを使用する。

コーンの米国特許第４，８５１．３３０号は、ハイブリ
ダイゼーション評価分析により、非ウィルス性生物のグ
ループを検出、同定、および定量するための方法を記載
している。

重要と思われる他の特許を以下に示す。

シスウェル（Ｃｈｉｓｖｅｌ　１）の米国特許第４，７
１６，１０６号、［ポリヌクレオチド連鎖の検出」、ダ
ルタグブタ（Ｄａｌ　ｔａｇｕｐｔａ）の米国特許第４
，６７０゜３８０号、［標識核酸プローブを使用する評
価分析」、 ジンジエラス（Ｇｉｎｇｅｒａｓ）らの国際出願ＰＣＴ
／ＵＳ８７１０Ｌ９Ｇ６号、「核酸プローブ評価分析方
法および組成物」、 ヘラ−のヨーロッパ特許出願第１１Ｂ１１１１１９１．
５号、「核酸ハイブリダイゼーション評価分析の感度を
増加させるための方法」、 コウリルスキーらの米国特許第４．５８１，３３３号、
「核酸の検出方法あるいはこの方法を応用するための反
応物」、 ミラーのヨーロッパ特許出願第８５３０９２２４．５号
、「触媒による発光を使用するポリヌクレオチドハイブ
リダイゼーション評価分析」、 ノゲイラ（Ｎｏｇｕｅｉｒａ）らの米国特許第４．８０
１，５３０号、「原生動物寄生体のためのヌクレオチド
ハイブリダイゼーション評価分析」、 ラボニらのヨーロッパ特許出願第８５１０５１３０．０
号、［遺伝物質検出のためのハイブリダイゼーション方
法」、 スタビンスキーの米国特許第４．７９７，３５５号、「
支持体にポリヌクレオチドを付着させるための方法」、 テーパーらの米国特許第４．６１１１９．２９５号、「
サルモネラのための試験」。

この技術においては、液体ハイブリダイゼーションの急
速な速度論を利用し、ハイブリッド化した生成物をハイ
ブリッド化していないプローブおよび試料混合物から分
離できる、一つ以上の細菌の属または種を検出するため
の、適時に行える、簡単で感度の良い方法がなお必要と
されている。

定義 下記の用語は、本明細書および請求項で使用する際は、
次のように定義する。

１、細菌　　動物界、植物界、および鉱物界の内の一つ
と考えられる、系統発生学的群真正細菌の構成員。

２、相補性　　それぞれのストランド上でワトソンーク
リック塩基対間の水素結合によりハイブリッド二重スト
ランドＤＮＡ：ＤＮＡ、　ＲＮＡ：ＲＮＡまたはＤＮＡ
：ＲＮＡを形成し得る、ＤＮＡまたはＲＮＡのｍｍスト
ランドの塩基連鎖により与えられる特性。アデニン（＾
）は通常チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）と相補する
のに対し、グアニン（Ｇ）は通常シトシン（Ｃ）と相補
する。

３、ハイブリッド　　相補的塩基間でワトソンークリッ
ク塩基対形成または非標準塩基対形成により、二つのｍ
ｍストランド状核酸連鎖間で形成される複合体。

４、ハイブリダイゼーション　　少なくとも二つの相補
的な核酸のストランドが結合（アニール）して二重スト
ランド状分子（ハイブリッド）を形成する過程、環境お
よび条件。

５、キット　　試料中の一つ以上の標的核酸連鎖の存在
を検出するだめのサンドイッチハイブリダイゼーション
方法を行うのに必要な評価分析構成要素を保持する容器
の組み合わせ包装物。評価分析を行うのに必要な装置、
機器および標準試薬類は、キットの構成要素に含まれる
ことも、含まれないこともある。

６、液体ハイブリダイゼーション　　固体の支持体が存
在しない、液体媒体における一つ以上の核酸プローブお
よび標的核酸列のハイブリダイゼーションを意味する。

７、相互に排除する領域　　好ましい実施形態のノ１イ
ブリダイゼーション条件下で、一つのプローブのハイブ
リダイゼーションが他のプローブのハイブリダイゼーシ
ョンを阻止する程度に、二つのプローブが、標的上の同
じヌクレオチド塩基連鎖を求めて競合しない事を意味す
る。

８、核酸プローブ　　相補的なｍｍストランド状標的核
酸連鎖と結合（アニール）して二重ストランド状分子（
ハイブリッド）を形成する一重ストランド状核酸連鎖。

９、ヌクレオチド　　５°リン酸塩基、５炭素糖および
窒素含有塩基からなる、核酸の下部単位。ＲＮＡでは、
５炭素等はリボースである。ＤＮＡでは５炭素糖は２−
デオキシリボースである。

１０、オリゴヌクレオチド　　−船釣に約１０〜５０個
のヌクレオチドが繋がったヌクレオチド重合体。

１１、プローブ特異性　　標的と非標的核酸列を区別す
る能力を示すプローブの特性。プローブ特異性は絶対的
である（すなわちプローブが標的生物と非標的生物とを
区別できる）場合もあるし、あるいは機能的である（す
なわちプローブが標的生物と試料中に通常存在する他の
生物とを区別できる）場合もある。評価分析条件に応じ
て多くのプローブ連鎖を広い、または狭い範囲で使用す
ることができる。

１２、サンドイッチ免疫評価分析　　第一の抗原決定因
子用の抗体を固体の支持体に結合させ、その固体の支持
体に結合した抗体を、第一および第二の抗原決定因子を
有する物質を含む試料にさらす。

これによって、支持体に結合した主要抗体−抗原複合体
の形成により、試料から抗原物質が除去される。次いで
、この複合体を、抗原物質上の第二の抗原決定因子に向
けられた、第二の標識をつけた抗体にさらして抗原抗体
サンドイッチを形成し、これを、分離、検出することが
できる。サンドイッチ評価分析は、変形して、相補的な
分子の他の対を使用することもできる。

１３、標的核酸　　試料中のその存在を検出すべき遺伝
要素に対応する、ヌクレオチド塩基連鎖を有する一重ス
トランド状ポリヌクレオチドの部分を意味する。

１４、試料　　一つ以上の標的核酸を含む、精製した、
または未精製の形の試料を意味する。試料は、どの様な
生理学的または実験室的供給源、例えば細胞、生物組織
抽出物、ウィルス等を含むあらゆる供給源から得たＤＮ
ＡまたはＲＮＡ　　（合成または天然）からでも得るこ
とができる。

（発明が解決しようとする課題） 本発明の主目的は、試料中に存在する一つ以上のカンピ
ロバクタ種を検出、定量するための、培養技術よりも適
時に行うことができ、より特異的でより感度が高い評価
分析方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、試料中に存在する一つ以上
の細菌の属または種を検出および定量するだめの試験キ
ットを提供することである。

本発明の他の目的は、カンピロバクタ１ＢＳ　ｒＲＮＡ
に対して相補的で特異的な複数のオリゴヌクレオチドプ
ローブを提供することである。

本発明の別の目的は、放射性物質を使用する必要がない
、オリゴヌクレオチドプローブ評価分析を提供すること
である。

本発明のさらに別の目的は、約１０，０００細胞／ｍｌ
の細菌を有する試料中のカンピロバクタを定量できる評
価分析を提供することである。

本発明の他の目的は、化学発光標識を付けた部分、特に
化学発光標識をつけたオリゴヌクレオチドプローブの検
出を改良することである。

本発明のさらに他の目的は、試料中に存在する一つ以上
の核酸連鎖を検出するための、より適時に行うことがで
き、より特異的で、より感度が高い評価分析方法を提供
することである。

（課題を解決するための手段および作用効果）−殻内に
、本発明はカンピロバクタ種用のサンドイッチハイブリ
ダイゼーション評価分析からなる。この評価分析は２段
階方式であり、第一段階は、標的核酸連鎖および少なく
とも２つの標識を付けたオリゴヌクレオチドプローブを
含み、それぞれのプローブが相補的であり、少なくとも
一つのプローブが標的核酸連鎖の領域に対して特異的で
ある様なハイブリッド複合体を形成する、溶液ハイブリ
ダイゼーションが関与する。第二の段階では、ハイブリ
ッド複合体が固体の支持体により捕獲される。少なくと
も一つのプローブ（すなわち検出プローブ）の標識は標
的核酸列の検出に使用され、少なくとも一つのプローブ
（すなわち捕獲プローブ）の標識は固体の支持体に結合
するのに使用される。検出プローブおよび捕獲プローブ
の両方とハイブリッド化し、固体の支持体に結合した標
的核酸だけが上記の評価分析形態で検出できる。

評価分析の形態は、拡張して、各単位が少なくとも一つ
の捕獲プローブおよび少なくとも一つの検出プローブを
含む、複数のオリゴヌクレオチドプローブの単位を取り
入れることができる。各単位の捕獲および検出プローブ
は相補的であり、少なくとも一つは試料からの標的核酸
連鎖の領域に対して特異的である。試料中の、一つ以上
の標的核酸連鎖、例えば一つ以上の細菌属または種の検
出および定量は、上記のカンピロバクタ評価分析と同様
に行う。

好ましい評価分析形態では、検出プローブの標識として
化学発光分子を使用し、この化学発光分子はアクリジニ
ウムエステルである。この化学発光分子は適当な反応試
薬と反応して光信号を発生し、それによって、評価分析
が、試料１ｍｌあたり約１ｘｌＯ’個の細菌細胞を含む
試料から標的核酸列を検出するための感度水準を与える
ことができる。

本発明の好ましい評価分析は、さらに固体の支持体、標
識、およびマジック１ライト評価分析システム（チバ　
コーニングディアグノスティックス　コーポレーション
）の装置を使用するが、セファ０−ズ（Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）　６Ｂ−ＣＬを含む他の固体支持体、捕獲または
検出標識、および装置を使用することもできる。その様
な変形により、本発明の原理にしたがって、検出感度を
向上させることもてきる。

好ましい実施形態の説明 オリゴヌクレオチドプローブは、合成により、準合成に
より、組み替え−ＤＮＡ技術により、あるいは精製した
標的核酸連鎖試料から遊離した核酸から調製できる。ま
た、プロメガ　コーポレーション、マディソン、Ｗｌ、
米国を含む幾つかの供給源から入手可能である。

本発明は、カンピロバクタｒＲＮＡのノ＼イブリダイゼ
ーション評価分析で使用するための、ＤＮＡオリゴヌク
レオチドプローブを合成により調製するための方法を含
む。応用バイオシステムモデル３８０Ｂ　ＤＮＡシンセ
サイザー　ユーザーズ　マニュアル、１．０版、１９８
５年７月。応用バイオシステムモデル３８１Ａ　ＤＮＡ
シンセサイザー　ユーザーズ　マニュアル、１．１１版
、１９８５年１１月。Ｂｅａｕｃａｇｅら、テトラヘド
ロン　１．ｅｌｌｓ、　２２：１８５９−１８８２（１
９８１）　、　ＭａＬＬｅｕｃｃｉ　およびＣａｒｕｔ
ｈｅｒｓ、　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　　１０
３：３１８５−３１９１（１９８１）　、シンカら、テ
トラヘドロンＬｅｔｔｓ、　２４＋５８４３−５８４６
（１９８３）。これらの方法を使用して、評価分析の拡
張形態において試験する細菌の様々な属または柱を含む
、他の標的核酸列のためのオリゴヌクレオチドプローブ
を調製することができる。

第１表は、カンピロバクタ１６Ｓ　ｒＲＮＡに対して特
異的で、相補的な１３種類のオリゴヌクレオチドプロー
ブを示す。最初の欄は、各プローブに対して指定された
（プロメガ　コーポレーションにより指定）番号であり
、第二の欄は、ハイブリッド化するＥ９コリ（ｃｏｌｔ
）１６Ｓ　ｒＲＮＡに対応するプローブの位置を示し、
第三の欄は、プローブの塩基の長さを示し、第四の欄は
、プローブの順序を示す。

プローブＰＭ７８．　ＰＨ１２２およびＰＨ１３８はＥ
、コリ１６Ｓ　ｒＲＮＡの同じ領域に対応している事が
分かる。

第１表のプローブは、ハイブリダイゼーション方法によ
り種の特異性を試験した。カンピロバクタ（ｎ−１３３
）および非カンピロバクタ生物（ｎ−７３）がら遊離し
た各種の精製ＲＮＡ試料に対するプローブの特異性を評
価分析するために、スロットプロットハイブリダイゼー
ション方法を使用した。

カファトスら、Ｎｕｃ　ｌ。Ａｃ４ｄ　Ｒｅｓ、７（６
）　ｐ、１５４１−１５５２　（１９７０）およびトル
ステイら、コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ
−（１？、Ｃ，５ｃｈｊＩｌｌｋｅ、　ｅ（１，）＋）
、２３１−２３８（１９８２）参照。ＲＮＡ試料は、第
２表に示す方法により遊離した。

第３表は、各プローブおよび分析した微生物の各菌株に
関する詳細なハイブリダイゼーション結果を示す。ゼロ
（０）は、ハイブリダイゼーションが無いことを示し、
（２）は、強いｌ＼イブリダイゼーションを示し、（１
）は弱いハイブリダイゼーションを示し、空白は、その
特定の菌株に関して、ハイブリダイゼーションデータが
得られなかった事を示す。第３表の記号を参照する。第
３表に含まれるデータを第４表にまとめる。第３表の結
果の解析に基づいて、少なくとも二つの該プローブを選
び、好ましい実施形態のカンピロバクタ評価分析に使用
することができる。例えば、プローブＰＭ７８は、その
Ｃ，フィツス（ｆｅｔｕｓ）を検出する能力により、一
つの評価分析形態に選定することがてきる。プローブＰ
Ｍ１２２およびＰＨ１３８は、ＰＨ１０と同じ１６Ｓ　
ｒＲＮＡ領域を求めて競合することがあるので、同じ評
価分析形態に選定すべきではない。

無論、第３表におけるプローブ特異性に関して分析した
微生物の同じ菌株の多くは、以下に説明するような拡張
評価分析形態に取り入れるべきオリゴヌクレオチドプロ
ーブ単位のための標的を含む。その様なオリゴヌクレオ
チドプローブを拡張形態に取り入れる前に、類似の、種
に対して特異的な試験が必要になろう。

種特異性に関してオリゴヌクレオチドプローブを試験し
た後、個々のプローブの末端を、類似の化学基と安定し
た複合体を形成できる化学基により変性する。Ｎｕｃｌ
、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１３（７）ｐ、２３９９−２４１
１（１９８Ｂ）およびＩｌａｒａｌａｍｂｉｄｌｓら、
Ｎｕｃｌ、Ａｅｌｄ　Ｒｃｓ。

１５（１２）Ｉ）、４８５７−４８６４（１９８７）参
照。化学基は、評価分析のハイブリダイゼーション段階
を妨害しないように選択する。記載する実施例および好
ましい実施形態では、共有結合を含む、この分野で公知
の技術により、少なくとも一つのプローブを一つ以上の
第一の支持体に結合する相手で標識を付け、少なくとも
一つのプローブを一つ以上の検出分子で標識を付ける。

支持体に結合する相手の機能は、ハイブリッド複合体を
固体の支持体に捕獲（分Ｎ）し易くすることである。固
体支持体のの目的および機能は、以下に説明する。ハイ
ブリッド複合体は、少なくとも２つの異なったオリゴヌ
クレオチドプローブでアニールした標的核酸連鎖からな
り、該プローブの少なくとも一つは、そこに結合した、
一つ以上の第一の支持体に結合する相手を有する。次に
、その固体の支持体は、その上に固定した、該第一の支
持体に結合する相手に対して特異的な新和性を有する、
一つ以上の第二の支持体に結合する相手を含む。

アビジンまたはストレブアビジンに対するビオチンの高
い特異性は、本発明における支持体に結合する相手とし
て使用するのに非常に適している。

米国特許節４，５８２．８１０号は、固体の支持体粒子
との結合による、診断組成物におけるアビジン−ビオチ
ンブリッジの形成を記載している。ムラスギらの、ＤＮ
Ａ３（３）　ｐ、　２Ｅｉ９−２７７（１９８４）は、
ハイブリダイゼーションプローブとしてビオチンで標識
を付けたオリゴヌクレオチドを記載している。

免疫評価分析は、一般に、試料中のある物質の存在また
は量を、その物質に対して特異的な抗体を使用して決定
する方法を意味する。この評価分析反応は、抗原物質（
ハプテン）とそのそれぞれの抗体との間の免疫化学的複
合体の形成を必要とし、この反応は、抗原を含む試料で
抗体を単に培養すれば起こる。

その免疫化学的複合体の反応物のどれかを本発明の実施
形態の一つで提供するような固体の支持体上に固定すれ
ばよい。ハプテンを、下記の、実施例１のジニトロフェ
ノール（ＤＮＰ）の様な第一の支持体に結合する相手と
して使用する場合、ＤＮＰに対する抗体（好ましいモノ
クローナル）、および特に好ましい実施形態における抗
−ＤＮＰ（５１１１）が相補的な第二の支持体に結合す
る相手として役立つ。

ハイブリッド化した複合体の検出には、数多くの非放射
性および放射性標識技術および検出方法が公知である。

検出体分子は一般に、オリゴヌクレオチドプローブと標
的核酸連鎖との間の塩基対形成（ワトソンークリック）
をほとんど妨害しないように選択する。その様な分子の
例としては、放射性、発光性または蛍光性物質、発光性
、蛍光性または比色用物質を作り出す酵素、その他がこ
の技術で公知である。

好ましい実施形態では、検出分子は、化学発光性分子で
あり、さらに詳しくは、アクリジニウムエステルまたは
多置換アクリジニウムエステルである。多置換アリール
アクリジニウムエステルの調製および化学的性質は、参
考として含める米国特許節４．７４５．１８１号に記載
されている。化学発光分子の活性化により発生する光の
放射（信号）は市販の機器、例えばＭＬＡ器械（チバ　
コーニングディアグノスティック　コーポレーション）
により検出できる。

検出感度を高くするために、オリゴヌクレオチドプロー
ブに一つ以上の検出体分子を結合させることができる。

検出体分子で標識を付け、たプロブには第一の結合する
相手は結合しない事が必要である。一つ以上の検出体分
子で標識を付けた少なくとも一つのオリゴヌクレオチド
プローブが、本発明の拡張評価分析形態におけるオリゴ
ヌクレオチドプローブ単位の一成分を含む。複数のオリ
ゴヌクレオチドプローブ単位を望ましい評価分析形態に
取り入れる場合、検出体分子の活性化により発生する信
号または反応を識別するには、プローブ当たり２種類以
上の検出体分子が必要になることがある。２個以上の検
出体分子を使用する場合、以下の実施例１に示すような
方法により、あるいは異なった波長で表示信号を有する
化学発光標識を使用することにより、連続的に検出する
ことができる。あるいは、複数の検出体分子を同時に検
出することもできる。

これで、標的核酸連鎖のためのハイブリダイゼーション
評価分析において、標識を付けたオリゴヌクレオチドプ
ローブを使用することができる。

試料の調製には、問題とする生物の溶菌、および放出さ
れたＲＮＡをその試料中にあるヌクレアーゼから保護す
ることが必要である。試料中の細胞をすべて溶解する必
要なしに、望ましい腸の病原体を溶解する溶菌方法が最
適である。

カンピロバクタ細胞は、ＳＤＳを０．０５％〜０．５％
の範囲で含むＴｒｌｓ、　ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８−９
）中で、室温で溶解することが分かった。細胞は、ＳＤ
Ｓが存在しなければ、Ｔｒｌｓ、　ＥＤＴＡ緩衝液中で
生存できる。

シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌ　Ｉａ）およびサルモネラ（Ｓａ
ｌｍｏｎｃｌ　Ｉａ）細胞はカンピロバクタよりも耐性
が高い。これらの生物を定量的に溶菌するには、ＳＤＳ
　ａ度を高くする（０．２５％）か、あるいは温度を高
くすることが必要であった。

Ｔｒｉｓ、　ＥＤＴＡ緩衝液（ｐｕ　８−９）中、０．
２５％のＳＤＳで、室温で１０分間溶菌するのが、培養
したシゲラ、サルモネラおよびカンピロバクタ細胞に対
して好ましい方法であった。しかし、この方法は、便試
料において放出されたＲＮＡを保護しない。

便試料から放出されたＲＮＡを回収するには、他の工程
が必要である。好ましい方法は、ＳＤＳ溶菌を熱不活性
化工程（７５℃で１０分間）と組み合わせ、続いて濾過
（ＬＩＤ／ｘ（Ｇｅｎｅｘ）２５　μｍポリエチレン）
を行うことである。

他のヌクレアーゼ抑制剤も試験したが、ＳＤＳと熱不活
性化以外は必要無かった。例えば、５〜１０ｍＭ　ＶＲ
Ｃ（ｖａｎｄｙｌリボヌクレオシド複合体）を含み、６
５℃で溶菌しても、ＶＲＣを含まずに７５℃で溶菌して
もＲＮＡを安定化させる。

本発明では、オリゴヌクレオチドのそれぞれが特異的で
相補的であり、その中の少なくとも一つが、試料中に存
在すると思われる標的核酸連鎖に対して特異的である。

合成オリゴヌクレオチドプローブは、例えば、５Ｓ、　
１６Ｓまたは２３Ｓ　ｒＲＮＡを含むｒＲＮＡの可変領
域のどれに対しても相補的であり、且つ、特異的であり
得る。試料中のカンピロバクタ種の存在を検出および定
量するための上記の方法では、第１表に挙げるように、
カンピロバクタ１６８　ｒＲＮＡの相互に排除する領域
に対して特異的、且つ相補的である。

標的核酸連鎖のアニーリングを達成するのに必要なハイ
ブリダイゼーション条件、ただしそれが存在すればだが
、および少なくとも二つの異なったオリゴヌクレオチド
プローブが、その多くは評価分析の効率を高めるために
調節可能である数多くの変数により決定される。その変
数には、プローブに付けた標識の性質、プローブの連鎖
、プローブの大きさ（塩基対）、標的核酸連鎖の解放／
調製方法、およびハイブリダイゼーションの期間および
温度が含まれる。技術的な経験が試験評価分析の効率に
影響することも確かである。−組になった評価分析構成
要素を使用する試験キットを提供し、その様なキット構
成要素を自動化した機器（ＭＬＡシステム、チバ　コー
ニング　ディアグノスティック　コーポレーション）と
組み合わせて使用することにより、これらの変数を少な
くする、またはより規則正しくすることも本発明の特徴
の一つである。

固定、および試料混合物および過剰のハイブリッド化し
ていないプローブからのハイブリッド複合体の分離は、
固体の支持体を使用して行う。固体の支持体の利点の一
つは、その上に複数の結合する相手を固定できることで
ある。ハイブリダイゼーション評価分析で使用されてい
る固体の支持体には、プラスチック管、微量滴定容器、
架橋デキストラン、多孔質ケイ酸塩ガラス、セルロース
誘導体で被覆した磁性粒子、ニトロセルロースフィルタ
ーおよび評価分析構成要素に対して不活性な公知の材料
がある。

好ましい実施形態では、常磁性粒子（ＰＮＰ）を固体の
支持体として使用する。この常磁性粒子の種類は米国特
許節４．５５４．０８８号に記載されている。

第二の支持体に結合する相手は、その性質に応じて、数
多くの技術によりＰＭＰ上に固定することができる。第
二の支持体に結合する相手が抗体である場合、その抗体
は、結合剤としてグルタルアルデヒドを使用することに
よって、ＰＮＰに結合させることができる。ライヒリン
、Ｍｅｔｈｏｄ　ｏ「Ｅｎｚｙ、　、７０ｐ、１５９−
１［１５（１９８０）参照。

好ましい実施形態では、第二の支持体に結合する相手は
ハイブリッド複合体を固体の支持体に捕獲する機能を果
たす。対で、その複合体は試料混合物および過剰のハイ
ブリッド化していないプローブから磁界を使用して分離
される。（ＭＬＡラック、チバ　コーニング　ディアグ
ノスティックス　コーポレーション）サンドイッチハイ
ブリッド複合体を分離するためのその他の方法もこの技
術では紹介されているが、ＭＬＡラックには、複数の試
料を同時に処理できる利点がある。

（実　施　例） 実施例１ 公知の供給源、ＡＴＣＣ１ｔ２９４２８から得た、容量
のカンピロバクタジェジュニ細胞（１ｘｌＯ〜４ｘ１０
６）を、５０ｇＭ　Ｔｒｌｓ（シグマケミカル社）、　
ｐＨ９，０，０，６ＭＮａＣＩ（シグマケミカル社）、
　６０ａ＋Ｍクエン酸ナトリウム（マリンクロット）　
、ｐｌ＋　７．５および０．０５％５ＤＳ（シグマケミ
カル社）を含む糞便の１：５０希釈液１００　ｕｌに加
えた。試料調製用の細胞は、９５℃に５分間加熱して溶
解した。放出されたｒＲＮＡは、０．９ピコモル（ｐＩ
ｌｏｌ）の標識を付けたオリゴヌクレオチドプローブ（
ＤＮＰ−ＰＭ７　ｇ　、その５°末端で標識を付けたＤ
ＮＰ）および化学発光物質（アクリジニウムエステル（
八Ｅ））でその５°末端および３２Ｐでその３°末端に
標識を付けた０、２　ｐｍｏｌの標識を付けたオリゴヌ
クレオチドプローブ（ＰＭ２３Ｂ）で、５８℃で２．０
時間／１イブリッド化した。

ＰＭ７８のヌクレオチド連鎖は、５°−ＴＣＴ　ＧＣＣ
ＴＣＴＣＣＣＴＣＡ　ＣＴＣＴＡＧ　ＡＣＴ　ＡＴＧ　
ＡＧＴ　Ｔ−３°からなる。

ＰＭ２３８のヌクレオチド連鎖は、５°−ＧＣＣＴＴＣ
ＧＣＡＡＴＧ　ＧＧＴ　ＡＴＴ　ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＧＡ
Ｔ−３°からなる。

ハイブリダイゼーションに続いて、１０　ｕｌのアリコ
ートを、抗−ＤＮＰ抗体（マウス　モノクローナル）を
共有結合させた常磁性粒子（ＰＮＰ）５０　ｕｇに加え
た。室温（２３℃）で０．５０時間培養した後、ＰＮＰ
をマジックドライト　ラック（チバ　コーニングディア
グノスティックス　コーポレーション）中で分離するこ
とによって、結合したサントイ・ソチハイブリッドを過
剰のハイブリッド化していないプローブおよび試料から
分離し、次いで上澄みを除去した。ＰＭＰを０．８　Ｍ
　ＮａＣ１，［ｉｏ　ｍＭクエン酸ナトリウム、１０　
ａＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，０，５０ｄ　ＥＤＴ＾。

（シグマケミカル社）　、０．１％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）　　（フィルス、画分■）および０．０２Ｔ
ｗｅｅｎ−２（１（シグマケミカル社）で２回洗い、次
いで、１００ｕｌの蒸留水に再分散させた。固体の支持
体は、捕獲分子で標識を付けたハイブリッド化していな
いプローブも捕獲するが、検出体分子で標識を付けたハ
イブリッド化していないプローブは捕獲しないことが分
かる。結合したサンドイッチハイブリッドは、マジック
ドライト分析計（チバ　コーニング　ディアグノスティ
ックス　コーポレーション）で、相対的光単位（ＲＬＵ
）で表される化学発光反応により、変性反応試薬（試薬
１は Ｈ２Ｏ２の０，５％溶液中に１．０　Ｎ　）ＩＮＯ３を
含み、試薬２は界面活性剤（Ａｒｑｕａｄ）の０．５％
溶液中に２．５Ｎ　ＨＮＯ３を含む）（実施例６も参照
）（チバ　コーニング　ディアグノスティックス　コー
ポレーション）を使用し、並びに試料の液体シンチレー
ション計数 （アトム　ライト　リキッド　シンチレーションコツク
チイル、ニュー　イングランド　ニュークリア）により
検出した。カンピロバク、りｒＲＮＡは、試料中にＩＱ
、ＯＯＯカンピロバクタ細胞のオーダーの細胞係数で背
景上で検出した。第１図は、２つの標識と試料中のカン
ピロバクタ細胞の濃度との関係を示す。比較用として、
精製したＥ、コリ　ｒＲＮＡ（ファーマシア）を同様に
してハイブリッド化し、捕獲し、検出した（糞便は加え
ずに）が、背景信号上で光信号を与えなかった。

背景信号は、同様に処理したが、ＰＮＰ標識を付けるべ
き結合をベーターアナリンＤＮＰで閉鎖した試料から観
察される（ＲＬυ表示）化学発光反応であった。信号の
細胞計数への変換は下記の式により計算した。

分散液中のカンピロバクタジェジュニ細胞の濃度は、定
量培養またはビベンズイミダゾール染料（ヘキスト３３
２５８）を使用して蛍光評価分析により測定した。細胞
分散液を氷冷した殺菌水中に１０６および１０８倍に希
釈した。希釈液の試料（１０および１００　ｕｌ）を５
％の馬の血液を含むプルセラ　アガ−ルまたは１０％の
羊の血液を含むトリプソイ　アガール上に接種した。板
を微好気性環境（５％０□、ｔｏｘｃｏ　　オヨび８Ｈ
Ｎ２）中テ３７℃で培養した。

コロニーは４８時間培養の後で計数した。カンビロバタ
タジエジュニのＤＮＡ濃度の蛍光測定は、ベキスト３３
２５８染料を使用して行った。この分散液中のＤＮＡ濃
度は、細胞分散液および染料を暗所で、室温（２３℃）
で０．５０時間培養することによって測定した。蛍光の
読みをラムダＤＮＡ標準曲線と比較した。細胞／ｕｌの
数の計算は、Ｃ，ジェジュニのゲノムの大きさを基にし
て行った。

実施例２ 容量のカンピロバクタｒＲＮＡ（１００アトモル（ａＩ
Ｉｌｏｌ）−１００フエントモル（ｆｍｏｌ）を５００
　ｕｌの０，６Ｍ塩化ナトリウム、６０　ｍＭのクエン
酸ナトリウム、１０　ｍＭのＴｒｉｓ、　ｐＨ８，０，
５０ｍＭのＥＤＴＡおよび０，０５％のＳＤＳに分散さ
せ、５６℃で２．０時間、５°末端を化学発光分子（Ａ
Ｅ）で標識を付けた、０．２５　ｐｉｏｌのオリゴヌク
レオチドプローブ（ＡＰ−ＰＨ１０）　、および５°末
端を化学発光分子（ＡＥ）で標識を付けた、０．５　ｐ
ｍｏｌのオリゴヌクレオチドプローブ（ＡＥ−ＰＭ２３
８）および第一の支持体に結合する相手で標識を付けた
、１．０　ｐｏｏｌのオリゴヌクレオチドプローブ（５
°末端で標識を付けたビオチン−ＰＨ１０）　（ビオチ
ンの供給源はアルドリッチ　ケミカル）でハイブリッド
化した。ＰＨ１０（７）ヌクレオチド連鎖は、５′−Ｇ
ＴＡ　ＣＣＧ　ＴＣＡ　ＧＡＡ　ＴＴＣＴＴＣＣＣＴ　
ＡＡＧ　ＡＡＡ−３°である。

ハイブリッド複合体は、第二の支持体に結合する相手（
アビジン）を固定した５０　ｕｇのＰＮＰで捕獲した。

このＰＮＰを、実施例１に記載するようにして、分離、
洗浄した。捕獲したハイブリッド化複合体の検出では、
最高の感度を得るために、化学発光反応試薬を、実施例
１および６に記載するように変性した。結果は、ＲＬＵ
実験／ＲＬＵ背景として表示したが、ここでＲＬＵ背景
は、添加したカンピロバクタｒＲＮＡが存在しない状態
で観察した化学発光反応であり、約１００　ａｍｏｌの
カンピロバクタｒＲＮＡが検出されたことを示している
。第２図参照。

容量のカンピロバクタｒＲＮＡ（１００ａｍｏｌ−１０
０ｆａｇｏｆ）を、６５℃で１．０時間、５００　ｕｌ
の緩衝液（実施例２と同じ緩衝液）中で、ＤＮＰが第一
の支持体に結合する相手として作用する１、０　ｐｆｌ
ｌｏｌの標識オリゴヌクレオチドプローブ（ＤＮＰ−Ｐ
Ｍ２３８）　、およびビオチンが第二の支持体に結合す
る分子として作用する０、８　ｐａ＋ｏｌの標識オリゴ
ヌクレオチドプローブ（ビオチン−ＰＨ１０）でハイブ
リッド化した。ハイブリダイゼーションに続いて、ハイ
ブリッドをまずＰＭＰ上に捕獲し、次いで標識を付けた
化学発光分子（アビジン−ＡＥ）で標識をつけた（前進
形態）、あるいはまず標識を付けた化学発光物質（アビ
ジン−ＡＥ）で標識を付け、次いでＰＭＰ上に捕獲した
（逆転形Ｈ）。別の形態では、第二の支持体に結合する
分子で標識を付けたオリゴヌクレオチドプローブ（ビオ
チン−ＰＨ１０）に、標識を付けた化学化学発光分子（
アビジン−ＡＥ）で予め標識を付けた。この付加物、標
識を付けた化学発光分子および標識を付けたオリゴヌク
レオチドプローブ（アビジン−ＡＥ／ビオチン−ＰＭ７
Ｂ＞を、カンピロバクタｒＲＮＡ並びに第一の支持体に
結合する分子（ＤＮＰ−ＰＭ２３８）で標識を付けたプ
ローブによりハイブリッド化した。前進形態では、５０
ｕｇの標識を付けた固体の支持体（５Ｈ１−ＰＮＰ）　
テ室温（２３℃）　７０．５０時間培養することにより
、ハイブリッドを捕獲した。次いで、ＰＮＰを分離し、
実施例１に記載するようにして洗浄し、約５．Ｂｘ１０
６ＲＬＩＩの標識を付けた化学発光分子（アビジン−Ａ
Ｅ）を含む１００　ｕｌの緩衝液中に分散させた。

２．０時間後、ＰＮＰを再び分離、洗浄、再分散させ化
学発光分子を活性化した。

逆転形態では、約５．０ｘ１０７ＲＬの標識を付けた化
学発光分子（アビジン−ＡＥ）を各ハイブリッド溶液に
加え、６５℃で０，２５時間培養した。次いで、標識を
付けたハイブリッドを、５０　ｕｇの標識を付けたＰＮ
Ｐ（５１１１−ＰＮＰ）テ室温（２３℃）　７０．５０
時間培養することにより、捕獲した。実施例１および２
と同様にして試料を処理し、化学発光分子を活性化させ
た。これらの評価分析の結果は、合量のｒＲＮＡに対す
る信号／背景として表したが、ここで背景は第３図に示
すように、ｒＲＮＡが存在しない状態で観察した信号で
ある。

実施例４ カンピロバクタジェジュニｒＲＮＡおよび一つは捕獲用
で、一つは検出用の、二つの誘導し、標識を付けたオリ
ゴヌクレオチドプローブからなるサンドイッチハイブリ
ッドを、ｌ口Ｏｕｔの６０ｍＭクエン酸ナトリウム、１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　０．６Ｍ塩化ナトリウム、５０
　ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．０５％ＳＤＳ　　（ハイブ
リダイゼーション緩衝液）中に存在する合量のカンピロ
バクタｒＲＮＡと、１６０ｆｎ＋ｏｌの検出用の二重に
標識を付けたプローブ（５°−ＡＥ、　３’−”２Ｐ−
ＰＨ２３８）および捕獲用の、２．Ｏｐｆｉｌｏｌの第
一の支持体に結合する分子（５°−ＤＮＰ−ＰＨ１０）
で標識を付けたオリゴヌクレオチドプローブまたは２．
ＯｐＩＩｌｏｌの第二の支持体に結合する分子（５゛−
ビオチン−ＰＭ７ｇ）で標識を付けたプローブとを組み
合わせ、次いで５６℃で２．０時間培養することによっ
て調製した。ハイブリダイゼーションに続いて、１０ｕ
１のアリコートを、９０ｕ１の６０ロＨクエン酸ナトリ
ウム、１６ｆｆ１Ｍのリン酸ナトリウム、０．７２　Ｍ
の塩化ナトリウム、０．０８％ＢＳＡ　、　０．０２％
Ｔｖｅｅｎ−２０、および０．０４％アジ化ナトリウム
中に入れた５０　ｕｇの捕獲プローブ特異性固体支持体
（ＰＭ円に、ｐＨ７，２（リン酸塩評価分析緩衝液）で
加えた。捕獲特異性は、標識を付けたオリゴヌクレオチ
ドプローブ（ＤＮＰ−ＰＨ１０またはビオチン−ＰＭ７
ｇ）をそれぞれ含むサンドイッチハイブリッドを捕獲す
るために、標識を付けたＰＮＰ　、　５旧抗−ＤＮＰ−
Ｐ）ＩＰまたはアビジン−ｐｉｐに共有的に付けた結合
分子により求めた。固体の支持体（ＰＮＰ）に対する検
出体分子の非特異的結合は、サンドイッチハイブリッド
を加える前に、すべての結合場所を閉鎖するために、過
剰のベーターアナリン−ＤＮＰまたはビオチンをそれぞ
れＰＮＰに加える、平行反応で査定した。

室温（２３℃）で０．５０時間培養した後、結合したサ
ンドイッチハイブリッドを、実施例１に記載するように
、過剰のハイブリッド化していないプローブおよび試料
から分離した。

ＰＮＰをリン酸塩緩衝液で２回洗浄し、１００　ｕｌの
蒸留水に再分散した。結合したサンドイッチハイブリッ
ドを、標準マジックドライト試薬および液体シンチレー
ション計数を使用し、化学発光反応により検出した。こ
れらの評価分析の結果を第５表に示す。

実施例５ 実施例４に記載するサンドイッチハイブリッド（ＰＮＰ
に結合していない）を、０．Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌ、　１０
．ＯｔｎＭ　Ｔｒｉｓ、　１．ＯｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐ
Ｈ７，５を含む緩衝液ｐＨ７，５で平行にしたセファロ
ーズＣＬ−６Ｂ　　（ファーマシア）カラム（パスツー
ル　ピペット）上でクロマトグラフィーにより分析した
。カンピロバクタｒＲＮ＾に対してハイブリッド化した
オリゴヌクレオチドプローブは空間中に溶離し、ノルイ
ブリッド化していないオリゴヌクレオチドプローブはカ
ラム中に保持された。このカラム画分、まず化学発光反
応により、続いて液体シンチレーション計数により分析
した。これらの評価分析の結果を第６表に示す。

これらのデータは、化学発光反応あるいは液体シンチレ
ーション計数のどちらで評価し、でも、ハイブリダイゼ
ーションの程度は同様であることを示している。ＰＭＰ
上に捕獲されたサンドイッチハイブリッドの検出に対す
る感度が、クロマトグラフィーで分析した場合、化学発
光反応よりも、液体シンチレーション計数による方が著
しく良い実施例４と対照的に、これら二つの検出方法の
感度は同等であるか、または化学発光反応の方が僅かに
良い事が分かった。

実施例６ ０．５ｐ［ｌ１ｏ１のカンピロバクタｒＲＮＡ、　２．
Ｏｐｍｏｌの標識を付けたオリゴヌクレオチドプローブ
（ビオチン−ＰＨ１０）および１．０　ｐｍｏｌの標識
を付けたオリゴヌクレオチドプローブ（５’−ＡＥ−Ｐ
Ｈ２３８）を１００　ｕｌのハイブリダイゼーション緩
衝液中で組み合わせ、５６℃で２．０時間培養すること
によって、カンピロバクタｒＲＮＡでサンドイッチハイ
ブリッドを形成した。

得られたハイブリッド複合体および標識を付けたＰＭＰ
（アビジン−ＰＭＰ）を、５．Ｏｆｍｏｌのハイブリッ
ド複合体対２５０　ｕｇの標識ＰＭＰの比率で混合し、
室温（２３℃）で０．５０時間培養し、固体の支持体上
にハイブリッドを捕獲した。結合したサンドイッチノー
イブリッドを、実施例１に記載するようにして、過剰の
ハイブリッド化していないプローブおよび試料から分離
した。Ｐ）ＩＰは、リン酸塩評価分析緩衝液で２回洗浄
し、１００　ｕｌの蒸留水に再分散させた。化学発光分
子（ＡＥ）、標識オリゴマーＤＮＡプローブ（ＡＥ−Ｐ
Ｈ２３８）およびサンドイッチハイブリッドを含む溶液
を蒸留水中に分散させ、１００　ｕｌアリコートに分割
した。

化学発光反応に関連する下記のパラメータを、ハイブリ
ダイゼーション評価分析の検出効率を高めるために、実
施例４および５に記載するようにして試験した。上記の
溶液に対する化学発光反応の時間依存性を、標準ＭＬＡ
条件下で、ＭＬＡ装置の光電子増倍管の出力を監視する
ことによって測定した。各試料において、活性は化学発
光反応開始１秒間以内に最高値に達し、次いで２秒間以
内に背景水準読みに低下し、利用できる光信号のすべて
が標準積分中にＭＬＡにより記録されることが分った。

化学発光反応における第一段階は、化学発光分子（ＡＥ
）に対するヒドロペルオキシドイオンの攻撃が関与し、
電子的に励起した分子を形成するが、これは反応試薬１
の添加に続いて起こり、その反応試薬中の固定したサン
ドイッチハイブリッドの培養期間増加の影響を、ＭＬＡ
順序における反応試薬の注入間の遅れを標準値の０．１
秒間から１０分間に変えることによって測定した。これ
らの評価分析の結果を第７表にまとめるが、単位時間の
変化に対して信号は無視できる程度に増加しただけであ
った。

標準試薬に等しい、または１０倍の成分濃度を有する反
応試薬のマトリックスについて、それらのＡＣ標識オリ
ゴヌクレオチドプローブ溶液の化学発光反応を引き出す
能力を試験した。試験したすべての変性反応試薬は化学
発光活性を増加させたが、標準反応試薬に対して酸およ
び塩基の規定度を１０倍（変性試薬）に増加さけ、過酸
化水素および界面活性剤の濃度は変えない場合に、信号
は最大値になった。これらの条件下で、光増倍管により
溶液中のサンドイッチハイブリッドから検出される化学
発光信号は、標準試薬で観察される信号の２倍に増加し
、１３倍の増加が捕獲されたサンドイッチハイブリッド
に対して観察された。第８表に示すこれらの評価分析の
結果は、常磁性粒子に結合したＡＥ−オリゴマーサンド
イッチハイブリッドから化学発光応答を引き出す条件が
、溶液中の同じ複合体に対して観察される条件と同等で
あることを示している。

実施例７ 実施例４でビオチン−ＰＨ１０により形成した二重標識
サンドイッチハイブリッドのアリコートを捕獲し、化学
発光反応を検出するために実施例６で記載したような変
性試薬をＭＬＡで使用した以外は、前に記載したように
して処理した。化学発光反応に続いて、試料を上記のよ
うに液体シンチレーションにより検出した。これらの評
価分析の結果を第９表にまとめるが、変性試薬による化
学発光反応の検出感度が標準試薬に比べて著しく増加し
、液体シンチレーション計数による検出はあまり変わら
なかった。

実施例８ １．０　ｐｍｏｌのカンピロバクタｒＲＮＡ、　１．０
　ｐｍｏｌの標識を付けたオリゴヌクレオチドプローブ
（ビオチン−ＰＨ１０）および２．０　ｐｍｏｌの標識
を付けたオリゴヌクレオチドプローブ（ＤＮＰ−ＰＭ２
３ｇ）を１００　ｕｌのハイブリダイゼーション緩衝液
中で組み合わせ、６５℃で１．０時間培養することによ
って、カンピロバクタｒＲＮＡでサンドイッチハイブリ
ッドを形成した。

０．０５％のＳＤＳと共に、６０　ｍＭクエン酸ナトリ
ウム、１０．０　ＩＩＩＭ　Ｔｒｉｓ、　１．０　ｍＭ
　ＥＤＴＡ　、　０．６　Ｍ塩化ナトリウム、０．１％
ＢＳＡ、　０．０１％アジ化ナトリウムおよび０．０２
％Ｔｗｅｅｎ−２０で、ｐＨ７，４（Ｔｒｊｓ評価分析
緩衝液）で、このサンドイッチハイブリッドの希釈液を
最終濃度２．２ｘｌＯ〜２．２ｘｌＯ”’　Ｍで調製し
た。希釈したハイブリッドの試料（０，４５ｍｌ）　、
１０−”〜１０−１６モルを、５０１のＴｒ１ｓ評価分
析緩衝液中５０ｕｇの標識ＰＭＰ（５１１１−ＰＮＰ）
と組み合わせた。ＰＮＰに対する非特異的結合を、サン
ドイッチノーイブリッドを添加する前にすべての結合場
所を閉鎖するために過剰のベーターアラニン−Ｄ’Ｎ　
ＰをＰＭＰに加える反応と平行して評価した。室温（２
３℃）で０．５０時間培養した後、上記のようにして、
結合したサンドイッチハイブリッドを過剰のハイブリッ
ド化していないオリゴヌクレオチドプローブおよび試料
から分離した。ＰＭＰをＴｒｉｓ評価分析緩衝液中で１
回洗浄し、次いてそのＰＭＰを、６．６ｘ１０６ＲＬＬ
Ｉの化学発光分子を共有結合した第二の結合相手（アビ
ジン−ＡＥ）を含む１００　ｕｌのＴｒｉｓ評価分析緩
衝液中に再分散させ、室温（２３℃）で２．０時間培養
することによって、固定したサンドイッチハイブリッド
に標識を付けた。このＰＭＰをＴｒｉｓ評価分析緩衝液
中で２回洗浄し、結合していないアビジン−ＡＥを除去
し、次いで１００　ｕｌの蒸留水に再分散させた。

折り重ねた試料をＭＬＡ装置で、標準および変性試薬に
より処理した。これらの評価分析の結果を第１０表に示
す。

実施例４および５の結果を組み合わせることにより、化
学発光標識オリゴヌクレオチドプローブを含む固体の支
持体に結合したサンドインチは、標準反応試薬を使用し
た場合、溶液中の同じｌ＼イブリッドよりも検出効果が
低い、すなわち、固体の支持体上に捕獲されたハイブリ
ッド化された化学発光標識オリゴヌクレオチド全体の一
部しか標準反応試薬により活性化されないことが分かる
。

実施例４では、液体シンチレーション計数で検出するこ
とにより、標準反応試薬を使って化学発光反応により行
う検出に対して、２のＳ／Ｂ値を生じるのに必要なハイ
ブリッド入力として任意に定義される感度が著しく改良
される。しかし、実施例５では、ハイブリッド化プロー
ブとハイブリッド化していないプローブを溶液相分離で
きるクロマトグラフィー溶離に続いて、同じハイブリッ
ドを分析する場合、雨検出方法による感度は同等である
。

化学発光反応順序の第一段階で、ある量の反応試薬１を
短時間（１，２秒間）で注入し、溶液に含まれる過酸化
水素が化学発光分子（ＡＥ）と反応し、電子的に励起さ
れた分子（Ｎ−メチルアクリドン）を形成する。次いで
、短時間（０，１秒間）の後、同量の第二の試薬を短時
間（１，２秒間）で注入し、ｐＨが塩基性になると、励
起した分子が光の放出を含む可逆反応を起こす。この放
出された光信号を、試料に物理的に近い光増倍管で検出
し、ＭＬＡ装置のマイクロプロセッサ−が光増倍管の出
力を、第二の試薬の添加から開始しである時間（２，０
秒間）積分する。実施例６の結果は、化学発光信号は２
秒間以内に背景に低下し、利用できるすべての信号を記
録したことを示している。これは、化学発光分子単独の
化学発光反応、オリゴヌクレオチドプローブに共有的に
結合した化学発光分子、溶液中の化学発光オリゴヌクレ
オチドプローブで標識を付けたサンドイッチハイブリッ
ド、および固体の支持体に結合した化学発光オリゴヌク
レオチドプローブ標識サンドイッチに当てはまる。した
がって、標準反応試薬で観察される固体相に結合した化
学発光オリゴヌクレオチドプローブ標識サンドイッチハ
イブリッドの検出効率が低いことは、その複合体中の化
学発光分子（ＡＥ）の活性化が遅れるためではなかった
。

ＭＬＡ工程中、第一の反応試薬中で、固体の支持体に結
合した化学発光オリゴヌクレオチドプローブ標識サンド
イッチハイブリッドから発生する励起分子（Ｎ−メチル
アクリドン）の量を増加させ、それによって第二の反応
試薬を加えるときに発生する信号を増加させる試みにお
いて、第一の反応試薬における試料の培養時間は、第一
および第二の反応試薬の注入間の遅延を変えることによ
って、６０００倍（０，１秒間から１０分間に）まで増
加した。しかし、発生した信号の増加は僅かしか観察さ
れず、化学発光対液体シンチレーション計数による検出
感度の強度差のオーダーを説明していない。

最後に、固体の支持体に結合した化学発光オリゴヌクレ
オチドプローブ標識ｒＲＮＡサンドイッチハイブリッド
から発生する信号は、反応試薬の規定度を１０倍に上げ
た場合、すなわち変性試薬で著しく高くなった。

無論、当業者には、本発明の範囲および材料から逸脱す
ることなく、各種の他の変形が明らかであり、実行する
ことができる。しかし、請求項の範囲は上記の説明に限
定されるものではなく、請求項は、当業者が同等のもの
として取り扱うすべての特徴を含めて、本発明中にある
特許権を与えられる新規性のすべての特徴を包含するも
のである。また、実施例は説明のためにここに記載した
のであり、本発明を限定するものではない。

第　　１ 表 しＩＩ　　ＬｉＵＩ’　ＬｉＡ’１ 第２表 ＲＮ＾精製方法 ｌ、湿重量０．１ｇの細胞をビードビータ−管　に加え
る。

２、上澄みを捨てる。細胞を７００　ｕｌの緩衝液１に
烏巻きにより再分散させる。

３．５０ｕｌの２０％　ＳＤＳおよび０．１−０．１５
　ｍｍガラスピーズを管の約４分の１まで加える。

４、平衡化したフェノールを加えて管５を満たす。

５、栓をして、ビードビータ−で、室温で４分間叩く。

６、管を水浴（６０℃）に１５分間浸し、蛋白質を除き
、ＤＮＡを分解する。

７、管の外側を乾燥させ、さらに２分間叩く。

８、マイクロフユージ中で３００ＯＲＰＭ（７３５ｘｇ
）で５分間回転させる。マイクロフユージを高速度で使
用してはならない。あるいは、スピード　グアツク中で
、真空を掛けずに１０分間回転させる。

９、はとんどすべての水相（最上部の相）およびを除去
し、新しい無菌１．５　ｍｌマイクロフユージ管への界
面を除去する（すなわち、ビーズとフェノールを後に残
す）。

１０、フェノールを満たし、次いで１．５分間渦巻き回
転させる。

１１、マイクロフユージをＬＯＯＯＲＰＭ（５２２０ｘ
ｇ）で５分間作動させる。水相を新しい管に除去し、必
要であれば少量のフェノールを取る。

１２、フェノール抽出（工程ＩＯおよび１１）をさらに
２回行う。

１３、工程１０および１１と同様にしてフェノール／ク
ロロホルム（フェノール／クロロホルム／イソアミルア
ルコール２５：２４：ｌ　　）抽出を２回行うが、最後
の抽出の後、界面および最下層を必ず後に残す。

１４、残った水相に、０．１倍量の３８酢酸ナトリウム
、ｐＨ５，２を加える。

１５、管に分別する（背当たり５０　ｕｌ）。

１６．２容積の冷たいエタノールを加える。短時間渦巻
き回転させる。−７０℃で一装置き、沈殿させる。調製
物の長期保存はこの形態およびこの温度で行うべきであ
る。

１７．−Ｌ９）　−ル沈殿管ノ一ツを１４．００ＯＲＰ
Ｍ（１６０００ｘｇ）で１０分間微ｍ遠心分離する。エ
タノールの上澄みを除き、スピード　グアツク中でベレ
ットを乾燥させる（通常、真空中で５分間）。

１８、光学密度を４１１ｊ定するために、乾燥したペレ
ットを３００　ｕｌのＤＥＰＣ処理した水に再分散させ
る。この試料を１：１０でＤＥＰＣ水に希釈し、２６０
および２８０ｒｉｍで吸光度を測定する。キュベツト内
に入った溶液を捨て、残りを一７０℃で保管する。これ
が作業溶液である。

ａ、細胞を調製するために、板上で細菌の融合用を生育
させる。各板で菌株により０．１−０．２　ｇの細胞が
得られる。

１）板を殺菌した剃刀の刃で「剃り」、その細胞を予め
計量した５０１のプラスチック製の円錐形の遠心管に移
す。

２）約１０１のＬＢ培地を加え、渦巻き回転させて細胞
を再分散させる。

３）ベックマンＴＪ−６Ｒテーブルトップ遠心分離機中
で、ＴＨ−４０−ターで２４００　ＲＰＭ（１２００ｘ
ｇ）で１０分間回転させる。

４）上澄みを除く。

５）管および細胞を測定し、湿細胞重量を求める。

６）湿細胞１グラム当たり１ｍｌのＬＢ培地を加える。

７）ＲＮＡを分離するために、０．１　ｍｌの湿細胞（
すなわちｏ、１ｇ）をビードビータ−管に移す。マイク
ロフユージ中て３．００ＯＲＰＭ（７３５ｘｇ）で５分
間回転させる。上澄みを捨てる。この試料を上記の様に
処理する。

８）残りをテーブルトップ遠心分離機中で、Ｔｌ＋−４
０−ターで、２４０ＯＲＰＭ（＋２００ｘｇ）で回転さ
せる。

９）液体を除く。細胞をづ０°Ｃで保管する。

細菌を得るための別の方法として、 １）１〜２ｎ＋ｌのＬＩ３を各板に加える。「ペット操
作により、あるいはまがったガラス棒で細胞を取り出す
ことにより、細胞をＬＢ中に再分散させる。

２）細胞を予め計量した５０ｍ１のプラスチック製円錐
形の遠心管に移す。ＬＢ培地で１０　ｍｌまで満たす。

３）上記の工程３〜９を行う。

ｂ、フェノールを平衡化するために、等体積の望ましい
緩衝液を加え、約３０分間強く混合し、テーブルトップ
遠心分離機で、ＴＨ−４０−ターで５０ＯＲＰＭ（５０
ｘｇ）で５分間回転させて相を分離する。二度平衡化し
たフェノールに対して、平行化したフェノールから水相
を除去し、繰り返す。

Ｃ，フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール
には、糖体積の平行化したフェノールおよび２４：１に
予め混合したクロロホルム／イソアミルアルコールを混
合する。

ＴＡＢＬＥ　　３　　（５ｏｆ　　５）最初の欄は、プ
ロメガ　コーポレーションで使用している各菌株番号を
示す。第二の欄は、各微生物の属および種の名称を示す
。第三の欄は、各菌株から精製したｒＲＮＡの状態のア
ガロースゲル電気泳動後の評価を示す。各試料に対して
２つの主なバンドが予想され、上側のバンドは２３Ｓ　
ｒＲＮＡと考えられ、下側の１８３　ｒＲＮＡと考えら
れる。

下記の指針により、その他のバンドか観察されることも
あり、バンドかないこともある。

■−両方のバンドが存在し、通常の強度である２−上側
バンドがあまり現れていない ３−上側バンドかほとんど現れていない４−上側のハン
ドかない ５−下側のバンドかあまり現れていない６−下側のバン
ドかほとんど現れていない７−下側のバンドがない ８−標本が他のバンドを一つ持っている９−標本が他の
バンドを二つ以上持っているｒＧｅｌ　Ｊの表示を有す
る欄が、大きな数字を持っている場合、上にあげなすへ
ての場合が当てはまる。

表のその他の部分て、（０）はハイブリダイゼションが
ないことを示し、（２）は強いハイブリダイゼーション
を示し、（１）は弱いハイブリダイゼーションを示す。

空欄は試験をしていないか、あるいは特殊な菌株による
特殊なプローブの評礁を示している。

＋＋＋十　１十 十 十　　十 ＋ 偽　　へ　　π大ぢ Ｑ　ω　ωｕ　　ｕｐ　　”＜　　　’″（Ｃ心やギ　
し 駆

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１に記載する、カンピロバクタに対す
る比較標識評価分析の結果を示し、第２図は、実施例２
に記載する、カンピロバクタｒＴＩＮＡに対するマジッ
クピライト　サンドイッチハイブリダイゼーション評価
分析の結果を示し、第３図は、実施例３に記載する、化
学発光標識の形態を変えた、マジックピライト　サンド
イッチ　ハイブリダイゼーション評価分析の結果を示す
。 ト；体　Ｖ− 第 図 第２図 カンし０ロノでフットＲＮＡ１：テ［スるマシ゛１）艮
　ライト計イ１ｈＬｉ竿斤＋　ＲＬＵ ・・・台・・（ｐ カンこ°Ｏ八へり９ｖＲＮＡフエ；）ｔｌレカンヒ・ロ
バ′クタ！ｒ、１ＥＩＷ乞

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）カンピロバクタｒＲＮＡを評価分析するための方法
   において、 イ、一つ以上の細胞種類の細胞からなり、カンピロバク
   タ細胞またはカンピロバクタｒＲＮＡを含むと推測され
   、該カンピロバクタ細胞またはカンピロバクタｒＲＮＡ
   が一つ以上のカンピロバクタ種を含むことができる試料
   を用意すること、 ロ、該試料の細胞からｒＲＮＡを放出させること、ハ、
   存在するとして、該試料中のカンピロバクタのｒＲＮＡ
   を、少なくとも２つの標識を付けたオリゴヌクレオチド
   プローブでハイブリッド化し、ハイブリッド複合体を形
   成するが、該プローブのそれぞれが、相補的であり、且
   つ少なくともその一つがカンピロバクタ１６ＳｒＲＮＡ
   の領域に対して特異的であるヌクレオチド連鎖を有し、
   該プローブの少なくとも一つに、一つ以上の第一の支持
   体に結合する相手で標識を付け、該プローブの少なくと
   も一つに、一つ以上の検出体分子で標識を付けること、 ニ、該ハイブリッド複合体を固体の支持体上に捕獲し、
   サンドイッチ複合体を形成するが、該固体の支持体は、
   その上に固定した、該第一の支持体に結合する相手に対
   して相補的である一つ以上の第二の支持体に結合する粒
   子を有し、該第一の支持体に結合する相手が該第二の支
   持体に結合する相手に結合すること、 ホ、該サンドイッチ複合体を、該試料および過剰のハイ
   ブリッド化していないプローブから分離すること、およ
   び ヘ、該サンドイッチ複合体に結合している検出体分子の
   活性化により、カンピロバクタの存在を検出すること を特徴とする方法。 ２）前記第一の支持体に結合する相手がハプテンである
   こと、および前記第二の支持体に結合する相手が抗体で
   あることを特徴とする請求項１記載の方法。 ３）前記オリゴヌクレオチドプローブが、 ａ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｂ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｃ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｄ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｅ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｆ、５′−【遺伝子配列があります】−３′、または ｇ、５′−【遺伝子配列があります】−３′、または ｈ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｉ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｊ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｋ、５′−【遺伝子配列があります】−３′、または ｌ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｍ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′ からなるグループの少なくとも２つの異なったヌクレオ
   チド連鎖を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。 ４）前記検出体分子が化学発光分子であることを特徴と
   する請求項１記載の方法。 ５）前記化学発光分子がアクリジニウムエステルである
   ことを特徴とする請求項４記載の方法。 ６）前記化学発光分子がジメチルアクリジニウムエステ
   ルであることを特徴とする請求項４記載の方法。 ７）前記固体の支持体が常磁性粒子であることを特徴と
   する請求項１記載の方法。 ８）前記検出体分子を、第一の試薬溶液を加え、次いで
   、培養期間に続いて、第二の試薬溶液を加えて活性化さ
   せ、検出可能な光反応を開始させること、および該第一
   の試薬溶液がＨ＿２Ｏ＿２の０．５％溶液中の１．０Ｎ
   ＨＮＯ＿３であること、および該第二の試薬溶液が界面
   活性剤０．５％溶液中の２．５ＮＮａＯＨであることを
   特徴とする請求項１記載の方法。 ９）前記界面活性剤がアークァッド（Ａｒｑｕａｄ）で
   あることを特徴とする請求項８記載の方法。 １０）さらに、前記試料中のカンピロバクタ細胞の数を
   定量する工程を含み、該試験評価分析の感度が、試料１
   ミリリットル当たり約１×１０＾４個の細菌細胞を定量
   できることを特徴とする請求項１記載の方法。 １１）それぞれ、前記第一の支持体に結合する相手がア
   ビジン／ストレプアビジンまたはビオチンであること、
   および前記第二の支持体に結合する相手がビオチンまた
   はアビジン／ストレプアビジンであることを特徴とする
   請求項１記載の方法。 １２）前記第一の支持体に結合する相手がジニトロフェ
   ノールであること、および前記第二の支持体に結合する
   相手が抗ジニトロフェノール抗体であることを特徴とす
   る請求項２記載の方法。 １３）前記検出分子が酵素であることを特徴とする請求
   項１記載の方法。 １４）それぞれ、前記第一の支持体に結合する相手が抗
   体または抗原であること、および前記第二の支持体に結
   合する相手が抗原または抗体であることを特徴とする請
   求項１記載の方法。 １５）前記ｒＲＮＡを、糞便が存在しない場合は、Ｔｒ
   ｉｓ、ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８−９）中０．２５％ＳＤ
   Ｓ中で、室温で１０分間溶菌することにより細胞から放
   出させること、および糞便が存在する場合は、ｒＲＮＡ
   をＴｒｉｓ、ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８−９）中０．２５
   ％ＳＤＳ中で、７５℃で１０分間溶菌し、次いで濾過す
   ることにより細胞から放出させることを特徴とする請求
   項１記載の方法。 １６）イ、カンピロバクタ細胞からｒＲＮＡを放出させ
   るための溶液、 ロ、カンピロバクタｒＲＮＡに対して相補的であり、標
   識が第一の支持体に結合する相手である、第一の標識を
   付けたオリゴヌクレオチドプローブ、ハ、カンピロバク
   タｒＲＮＡに対して相補的であり、標識が検出分子であ
   り、該第一プローブまたは該第二プローブがカンピロバ
   クタ１６ＳｒＲＮＡの領域に対して特異的である、第二
   の標識を付けたオリゴヌクレオチドプローブ、 ニ、該第一の支持体に結合する相手に対して相補的であ
   る、第二の支持体に結合する相手を結合した固体の支持
   体 からなる試料中のカンピロバクタを検出および定量する
   のに適した試験キット。 １７）カンピロバクタ１６ＳｒＲＮＡに対して相補的、
   且つ特異的であり、５′−【遺伝子配列があります】−
   ３′からなるヌクレオチド連鎖を有する オリゴヌクレオチドプローブ。 １８）カンピロバクタ１６ＳｒＲＮＡに対して相補的、
   且つ特異的であり、５′−【遺伝子配列があります】−
   ３′からなるヌクレオチド連鎖を 有するオリゴヌクレオチドプローブ。 １９）カンピロバクタ１６ＳｒＲＮＡに対して相補的、
   且つ特異的であり、５′−【遺伝子配列があります】−
   ３′からなるヌクレオチド連鎖を有する オリゴヌクレオチドプローブ。 ２０）カンピロバクタ１６ＳｒＲＮＡに対して相補的、
   且つ特異的であり、 ａ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｂ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｃ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｄ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｅ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｆ、５′−【遺伝子配列があります】−３′、または ｇ、５′−【遺伝子配列があります】−３′、または ｈ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｉ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｊ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｋ、５′−【遺伝子配列があります】−３′、または ｌ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｍ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′ からなるグループのヌクレオチド連鎖からなるオリゴヌ
   クレオチドプローブ。 ２１）試料中の一つ以上の標的核酸連鎖の存在を評価分
   析するための方法において、 イ、一つ以上の細胞種類の細胞からなり、一つ以上の標
   的核酸連鎖を含むと推測される試料を用意すること、 ロ、該試料の細胞から標的核酸連鎖を放出させること、 ハ、試料中に存在するとして、標的核酸連鎖を、複数の
   異なったオリゴヌクレオチドプローブ単位でハイブリッ
   ド化し、複数のハイブリッド複合体を形成するが、該プ
   ローブ単位のそれぞれが少なくとも２つの標識を付けた
   オリゴヌクレオチドプローブを含み、それぞれが、標的
   核酸の領域に対して相補的であり、且つ少なくともその
   一つが標的核酸の領域に対して特異的であるヌクレオチ
   ド連鎖を有し、該単位のプローブの少なくとも一つに、
   一つ以上の第一の支持体に結合する相手で標識を付け、
   該単位の該プローブの少なくとも一つに、一つ以上の異
   なった検出体分子で標識を付けること、 ニ、該ハイブリッド複合体を固体の支持体上に捕獲し、
   サンドイッチ複合体を形成するが、該固体の支持体は、
   その上に固定した、該第一の支持体に結合する相手に対
   して相補的である一つ以上の第二の支持体に結合する粒
   子を有し、該第一の支持体に結合する相手が該第二の支
   持体に結合する相手に結合すること、 ホ、該サンドイッチ複合体を、該試料および該単位のハ
   イブリッド化していないプローブから分離すること、お
   よび ヘ、該サンドイッチ複合体に結合していて、それぞれが
   識別できる活性化反応を与える検出体分子の活性化によ
   り、一つ以上の標的核酸連鎖の存在を検出すること を特徴とする方法。 ２２）前記第一の支持体に結合する相手がハプテンであ
   ること、および前記第二の支持体に結合する相手が抗体
   であることを特徴とする請求項２１記載の方法。 ２３）前記検出分子が化学発光分子であることを特徴と
   する請求項２１記載の方法。 ２４）前記化学発光分子がジメチルアクリジニウムエス
   テルであることを特徴とする請求項２３記載の方法。 ２５）前記固体の支持体が常磁性粒子であることを特徴
   とする請求項２１記載の方法。 ２６）化学発光分子を、第一の試薬溶液を加え、次いで
   、培養期間に続いて、第二の試薬溶液を加えて活性化さ
   せ、検出可能な光反応を開始させること、および該第一
   の試薬溶液がＨ＿２Ｏ＿２の０．５％溶液中の１．０Ｎ
   ＨＮＯ＿３であること、および該第二の試薬溶液が界面
   活性剤０．５％溶液中の２．５ＮＮａＯＨであることを
   特徴とする請求項２１記載の方法。 ２７）前記界面活性剤がアークァッド（Ａｒｑｕａｄ）
   であることを特徴とする請求項２６記載の方法。 ２８）前記化学発光分子がアクリジニウムエステルであ
   ることを特徴とする請求項２１記載の方法。 ２９）それぞれ、前記第一の支持体に結合する相手がビ
   オチンまたはアビジン／ストレプアビジンであること、
   および前記第二の支持体に結合する相手がビオチンまた
   はアビジン／ストレプアビジンであることを特徴とする
   請求項２１記載の方法。 ３０）前記第一の支持体に結合する相手がジニトロフェ
   ノールであること、および前記第二の支持体に結合する
   相手が抗ジニトロフェノール抗体であることを特徴とす
   る請求項２２記載の方法。 ３１）前記検出分子が酵素であることを特徴とする請求
   項２１記載の方法。 ３２）前記標的核酸連鎖が、細菌の属または種のリボソ
   ームの５Ｓまたは１６Ｓまたは２３Ｓ小単位からなるこ
   とを特徴とする請求項２１記載の方法。 ３３）前記単位の一つがヌクレオチド連鎖 ａ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′′、または ｂ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｃ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｄ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｅ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｆ、５′−【遺伝子配列があります】−３′、または ｇ、５′−【遺伝子配列があります】−３′、またｈ、
   ５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｉ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｊ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｋ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｌ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′、または ｍ、５′−【遺伝子配列があります】 −３′ からなるグループの少なくとも２つの構成員からなり、
   前記ヌクレオチド連鎖がカンピロバクタ１６ＳｒＲＮＡ
   に対して特異的であり、且つ相補的であり、カンピロバ
   クタ細胞が試料中に存在すると考えられることを特徴と
   する請求項２１記載の方法。 ３４）さらに、前記試料中の一つ以上の属または種の細
   菌細胞の数を定量する工程を含み、該試験評価分析が、
   試料１ミリリットル当たり約１×１０＾４個の細菌細胞
   を定量できることを特徴とする請求項２１記載の方法。 ３５）前記の異なった検出体分子が連続的に、または同
   時に活性化されることを特徴とする請求項２１記載の方
   法。 ３６）前記ｒＲＮＡを、糞便が存在しない場合は、Ｔｒ
   ｉｓ、ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８−９）中０．２５％ＳＤ
   Ｓ中で、室温で１０分間溶菌することにより細胞から放
   出させること、および糞便が存在する場合は、ｒＲＮＡ
   はＴｒｉｓ、ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８−９）中０．２５
   ％ＳＤＳ中で、７５℃で１０分間溶菌し、次いで濾過す
   ることにより細胞から放出させることを特徴とする請求
   項２１記載の方法。 ３７）イ、細胞から標識核酸連鎖を放出させるための溶
   液、 ロ、それぞれ標的核酸連鎖に対して相補的であり、標識
   が第一の支持体に結合する相手である、少なくとも２つ
   の異なった第一の標識を付けたオリゴヌクレオチドプロ
   ーブ、 ハ、それぞれが識別できる標識を持ち、第一のプローブ
   と同様に標的核酸連鎖に対して相補的であり、標識が検
   出分子であり、該第一プローブまたは第二プローブの少
   なくともどちらかが、同じ標的核酸連鎖に対して相補的
   であり、標的核酸連鎖の領域に対して特異的である、少
   なくとも２つの異なった第二の標識を付けたオリゴヌク
   レオチドプローブ、 ニ、該第一の支持体に結合する相手に対して相補的であ
   る、第二の支持体に結合する相手である標識を付けた固
   体の支持体 からなる試料中の一つ以上の標的核酸連鎖の存在を検出
   および定量するのに適した試験キット。 ３８）前記オリゴヌクレオチドプローブが、イ、Ｅ．コ
   リ１６ＳｒＲＮＡの塩基０１６３−０２１４、またはロ
   、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩基０１７６−０２０５、
   またはハ、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩基０１６３−０
   ２０４、またはニ、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩基０４
   ３７−０４６３、またはホ、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの
   塩基０６４１−０６７１、またはヘ、Ｅ．コリ１６Ｓｒ
   ＲＮＡの塩基０８２１−０８４５、またはト、Ｅ．コリ
   １６ＳｒＲＮＡの塩基０１９５−０２１５、またはチ、
   Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩基０１５６−０１８５、ま
   たはリ、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩基０８２９−０８
   ５４、またはヌ、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩基１１０
   ７−１１４０、またはル、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩
   基０７０６−０７３２からなる領域に相当することを特
   徴とする請求項１記載の方法。 ３９）前記オリゴヌクレオチドプローブが、イ、Ｅ．コ
   リ１６ＳｒＲＮＡの塩基０１６３−０２１４、またはロ
   、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩基０１７６−０２０５、
   またはハ、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩基０１６３−０
   ２０４、またはニ、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩基０４
   ３７−０４６３、またはホ、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの
   塩基０６４１−０６７１、またはヘ、Ｅ．コリ１６Ｓｒ
   ＲＮＡの塩基０８２１−０８４５、またはト、Ｅ．コリ
   １６ＳｒＲＮＡの塩基０１９５−０２１５、またはチ、
   Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩基０１５６−０１８５、ま
   たはリ、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩基０８２９−０８
   ５４、またはヌ、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩基１１０
   ７−１１４０、またはル、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩
   基０７０６−０７３２からなる領域に相当することを特
   徴とする請求項２１記載の方法。 ４０）前記オリゴヌクレオチドプローブが、イ、Ｅ．コ
   リ１６ＳｒＲＮＡの塩基０１６３−０２６８、またはロ
   、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩基０３９１−０４５０、
   またはハ、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩基０６３１−０
   ８６８、またはニ、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩基１１
   ０２−１１４５からなる領域に相当することを特徴とす
   る請求項１記載の方法。 ４１）前記オリゴヌクレオチドプローブが、イ、Ｅ．コ
   リ１６ＳｒＲＮＡの塩基０１６３−０２６８、またはロ
   、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩基０３９１−０４５０、
   またはハ、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩基０６３１−０
   ８６８、またはニ、Ｅ．コリ１６ＳｒＲＮＡの塩基１１
   ０２−１１４５からなる領域に相当することを特徴とす
   る請求項１６記載の方法。 ４２）前記プローブのそれぞれが、カンピロバクタ１６
   ＳｒＲＮＡの相互に排除する領域に対して特異的、且つ
   相補的であることを特徴とする請求項１記載の方法。 ４３）前記プローブのそれぞれが、カンピロバクタ１６
   ＳｒＲＮＡの相互に排除する領域に対して特異的、且つ
   相補的であることを特徴とする請求項１６記載の方法。 ４４）前記プローブのそれぞれが、標的核酸連鎖の相互
   に排除する領域に対して特異的、且つ相補的であること
   を特徴とする請求項２１記載の方法。 ４５）前記プローブのそれぞれが、標的核酸連鎖の相互
   に排除する領域に対して特異的、且つ相補的であること
   を特徴とする請求項３７記載の方法。