JPH04504203A - 増幅された標的核酸へのレポーター部位の取り込みによる迅速な核酸検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 増幅された標的核酸へのレポータ一部位の取り込みによる迅速な核酸検出方法 発明の技術分野 本発明は核酸配列の検出、そしてより詳細には標的核酸配列の増幅を該標的核酸 配列に特異的に取り込まれたレポーター基の検出と組み合わせる方法に関する。

発明の背景 関心ある核酸配列の検出に使用できる実用的な核酸ハイブリダイゼーション法の 開発はいくつかの要因から制限されてきた。これらには感度不足、手順の複雑さ 、および検出方法を放射線測定によるものからよらないものに転換したいという 要望が含まれる。非放射線測定法の感度を上げるために様々な方法が研究されて きた。一般的アプローチの一つとしてトータル・アッセイ（ｔｏｔａｌａｓｓａ ｙ）法の改良が、それに伴う複雑さおよび非放射線測定式検出という問題に対す る効果と共に検討されてきた。

もう一つのアプローチとして、かかるアッセイにより検出されるべき核酸量を高 める方法も追求されている。

Ｆａｌｋｏｗに交付された米国特許第４．３５８．５３５号は細胞培養してそれ らの数、従って存在すると思われる生物の核酸の量を増大させ、そのサンプルを 固定支持体に沈着させた後そのサンプルを標識プローブと接触させ、次いでその 支持体を洗浄しそしてその標識を検出するという方法を記載している。この方法 の一つの欠点は、まず生物を培養しないとアッセイの感度が十分でない点である 。

しかしながら培養工程を加えることは時間がかかるということであり、また常に うまくいくとは限らない。

Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：＾ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ｐｐ、３９０−４０１（１９８２）は目的の核酸を それを適宜の宿主系にクローン化することにより増幅する方法を記載している。

その場合、宿主生物が培養中に複製すれば目的の核酸も複製される。

この方法もまた培養工程を行わなければならないという煩しさがあり、従って時 間のかかる複雑な手順となる。

生物の核酸量を高めるためのもう一つのアプローチは米国特許第４．６８３．２ ０２号および同第４．６８３．１９５号に記載されている。これらの特許は“核 酸またはその混合物に含まれる標的核酸配列の増幅および検出方法”を開示して いる。この方法は各サイクル完了後に増幅対象核酸配列を倍化する試験管内サイ クリング機構を用いている。これは増幅すべき核酸配列の相補鎖を分離し、これ らポリヌクレオチド鎖を過剰のオリゴヌクレオチド・プライマーと接触させそし てそれらプライマーを酵素処理により延長させて各プライマーと共にアニールさ れた核酸に対し相補的なプライマー延長生成物を形成させることにより行われる 。この工程はさらに必要な回数だけ繰り返すことができる。この方法の長所の一 つは、目的とする生物の核酸配列の小部分を多量に速やかに生産できることであ る。この方法の欠点の一つは、直接アッセイ法を用いる生成される核酸の検出が 複雑なことである。というのはその増幅法ではコピーされるべきものと核酸の忠 実でないコピーである核酸配列を生成し得るからである。

これら誤った核酸配列はバックグランド・ノイズを高め従って方法全体の感度を 低める誤った陽性例をアッセイにもちこむことになり得る。

過去多くのＤＮＡプローブ・アッセイが目的とする核酸の検出のために報告され ている。（前述の）　Ｆａｌｋｏｗ法はまず標的核酸を一本鎖化した後それを固 体支持体に固定している。次にその固定支持体に標的核酸に対し相補的な標識プ ローブを接触させる。過剰のプローブを洗い流しそして生成ハイブリッド中の標 識の存在を測定する。

この方法の欠点の一つは時間がかかりかつ煩瑣なことである。このアッセイの工 程、すなわち、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程は膜（固体支持体）およ び緩衝溶液を含むシールされた小袋（パウチ）内で行われる。

Ｈｉｌｌら（１０８６１０５８１５）は前記アッセイ方式の一変形を記載してい るがこれはニトロセルロース被覆磁性粒子を用いてこれに標的ＤＮＡを付着させ 、次いでビオチニル化プローブで直接ハイブリダイズしそしてストレプトアビジ ン接合レポーターを用いて検出するというものである。

Ｄｕｎｎら（Ｃｅ１１．　Ｖｏｌ、　１２．２３−３６（１９７７））は異なる ハイブリダイゼーション方式を記載しているが、これは固体支持体に付着した第 一のまたは捕捉プローブを含有する溶液と標的核酸を混合するというポリヌクレ オチド・プローブを用いた二段階式サンドイッチ・アッセイを用いている。ある 時間の経過後、支持体を洗浄しそしてやはり標的核酸に対して相補的ではあるが 捕捉プローブに対しては相補的ではない第二のまたはレポーター（標識）プロー ブを添加しそして捕捉ブローブー標的核酸複合体とハイブリダイズさせる。ハイ ブリダイズされなかったレポータープローブを洗浄除去後、標的核酸にハイブリ ダイズされたレポーター・プローブの存在を検出するというものである。

Ｒａｎｋｉら（米国特許第４．５６３．４１９号）はＥＰＡＯ１５４５０５，１ ０８６１０３７８２およびＥＰＡ　０２００１１３を開示している。認識される べきは、これらすべてが第一のまたは捕捉プローブを固体支持体に固定してから ハイブリダイゼーションを行うアッセイ手順を用いていることである。

もう一つの変形が独出願公開第３．５４６．３１２＾１号に記載されている。こ の方法はＲａｎｋｉらの記載したものと同じく標的核酸の区別された部分にハイ ブリダイズする捕捉プローブおよびレポータープローブを用いている。標的核酸 は溶液中でそれら二つのプローブによる接触を受ける。第一のプローブまたは捕 捉プローブは固体支持体に付着させたレセプター成分、例えばストレプトアビジ ンと結合できる結合成分、例えばビオチンを含有する。捕捉プローブ−標的核酸 −レポータープローブ複合体の形成後、ストレプトアビジン変性固体支持体を添 加する。

ハイブリダイズしなかったレポータープローブを洗い流した後、固体支持体に結 合した複合体に取り込まれた標識を検出する。Ｒａｎｋｉらの開示した方法に比 してこの方法が有利なのは、溶液中で行われるハイブリダイゼーシヨンの方が反 応速度論的に有利な点である。標的核酸長が標的核酸長が大きい程小さくなる全 体としての反応効率に影響するという短所もいくつかある。さらに、サンドイッ チ核酸プローブアッセイはへテロジニアス型一段階または二段階方式の如何にか かわらずあるいは溶液ハイブリダイゼーシヨンを用いようと直接アッセイ法はど の感度はない。

本発明の開示 所定の核酸配列を含む核酸を含むと思われる検体中の前記所定の核酸配列を検出 および／または測定するための本発明の核酸アッセイは、以下の工程、すなわち 、（＾）標的核酸を一本鎖化する； （Ｂ）所定の核酸配列内に含まれる少（とも一つの特定の核酸配列を、相当する ｄＮＴＰをすべて置換する量販下の量のレポータ一部分を含有する少くとも一種 のデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートの存在下に、下記の工程（１）〜 （４）により増幅する：（１）前記−重鎖を、増幅される各々異なる特定配列に ついて、二種類のオリゴヌクレオチドブライマーを用いて、増幅される各々異な る配列について各核酸鎖に対して相補的な各プライマーの延長生成物が合成され るような条件下に処理し、その際前記プライマーは各々特定配列を有する異なる 核酸鎖に対しそれらとハイブリダイズするのに十分相補的であるように選択して 、一方のプライマーから合成される延長生成物が、その相補体から分離されたと きに他方のプライマーの延長生成物の合成のための鋳型として役立ち得るように する： （２）プライマー延長生成物をそれらの合成の基礎とされた鋳型から分離して一 本鎖化された分子を生成させる； （３）工程（２）で生成させた一本鎖化された分子を、工程（１）のプライマー を用いて、プライマー延長生成物が工程（２）で生成させた一本鎖の各々を鋳型 として用いて合成される条件下に処理する：そして（４）工程（２）および（３ ）を繰り返して検出および／または測定に十分なプライマー延長生成物を生成さ せる： （Ｃ）工程（Ｂ）（４）の生成物を一本鎖化する：（Ｄ）工程（Ｃ）の生成物を 、固体支持体に結合しそして両プライマーにより規定される核酸配列を含まない プライマー延長生成物の一部分に対して相補的なオリゴヌクレオチドと接触させ る： （Ｅ）ハイブリダイズしなかった物質を除去する；および （Ｆ）固体支持体に固定されたレポータ一部分を検出および／または測定する より成る。

本発明の詳細な説明 本発明の核酸アッセイは所定の配列を有する標的核酸を検出するための以下の全 体プロセスから成る。

ａ）米国特許第４．６８３．２０２号（その開示を引用により本発明の開示の一 部に含める）に記載されたポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｃｔ？）核酸増幅法を用い て、特定の核酸配列を検体中に存在する変性標的核酸を該標的に対し特異的なプ ライマーと共にアニーリングしそして延長生成物を形成することにより増幅する 。このプロセスにおいては、レポーター基（部分）を含むデオキシリボヌクレオ チドトリホスフェート、ｄＮＴＰ−Ｒ，を用いて、使用された相当するデオキシ リボヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）のうちの少くとも一種の一部ま たは全部を置き換える。

形成される各延長生成物は標的核酸内に含まれる所定の核酸配列の一部に対して 相補的であり、またさらなるプライマー結合のための鋳型となる。検出および／ または測定のために所望される量のプライマー延長生成物を生成させるには、こ のプロセスを次いで必要なだけ繰り返す。

ｂ）得られた核酸は既知の方法、例えば熱処理、カオトロピック（ｃｈａｏｔｒ ｏｐｉｃ）剤などにより、あるいはｐＨを高くまたは低くすることにより一本鎖 化される。そのようにして生成させた一本鎖核酸を次に、固体支持体に結合した 捕捉プローブと接触させ、そしてそれとハイブリダイズさせる。

Ｃ）増幅された核酸−捕捉プローブ複合体を適当な緩衝液で洗浄してハイブリダ イズしなかった前工程よりの生成物および取り込まれなかったｄＮＴＰ−Ｒを除 去する。レポーター基の存在および量は検出および／または測定され、また増幅 された標的核酸量に比例する。さらに、増幅された標的核酸の存在量は検体中に もとから存在する未増幅標的核酸に比例する。

別の検出法においては、増幅プロセスの工程で取り込まれたレポーター基に対す る標識抗体が用いられる。増幅された生成物の捕捉の前または後に、それを増幅 された生成物と接触させる。その場合、抗体の標識を用いて増幅生成物の存在を 検出することができる。

プライマー・オリゴヌクレオチドを用い標的核酸配列を増幅して酵素的手段によ り、標的核酸の小部分の大幅に増大した数のコピーを生成させる方法に言及する 上で本明細書に用いられる用語“ＰＣＲ”は米国特許第４、６８３．２０２号に 記載されている。

本明細書に用いられる「捕捉プローブ」という用語は、標的核酸の所定の配列の 一部分に対して相補的であって固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドのこと である。

捕捉プローブはプライマーに対し、あるいはその核酸配列がプライマーにより規 定されるプライマー延長生成物の部分に対して相補的であってはならない。

レポーター基含有デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートは既知物質である 。重要なレポーター基にはフルオレセインなどの蛍光化合物が包含される。別の 検出方法においては、レポーター基は抗体と安定複合体を形成することができる 部分でなければならない。

本発明において有用なレポーター基には、フルオレセイン、ローダミン、および その他の色素原性または蛍光原性化合物が包含される。

以後のハイブリダイゼーションに対し十分な量の増幅標的核酸を生成させるには 、ＰＣＲ標的増幅反応は約２０〜３０リピート・サイクルを必要とする。増幅核 酸の変性はアルカリ、酸、カオトロピック剤、または熱による処理によって行う ことができるが、好ましい方法は増幅標的核酸を少くとも１０分間沸騰水浴に入 れた後生くとも２分間冷水浴（４℃）に入れる方法である。

ハイブリダイゼーション工程は、（一つまたは複数の）レポーター基を含む増幅 され一本鎖化された標的核酸を溶液中で、適当な緩衝液中、固体支持体に結合し た捕捉プローブと１−〜３０分間接触させることにより行うことができる。捕捉 プローブ長はその合成のしやすさ、所望の反応キネティクス（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ）　、およびプライマーが何であるかによって決まり、そして好ましくは約２０ 〜３０塩基のオリゴヌクレオチドである。捕捉プローブは既知の手段により糖基 、好ましくは５′−末端または３′−末端糖基を通して、あるいは変性ヌクレオ チド塩基基を通して結合することにより、固体支持体に結合することができる。

様々な固体支持体を用いることができる。固体支持体にはＬａｕら（米国特許第 ４．６６１．４０８号）に開示（その開示は引用により本明細書の開示に含める ）された二酸化クロム粒子などの磁性粒子、微量力価測定（ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅ ｒ）プレートおよび膜が包含される。

ハイブリダイズされなかった増幅標的核酸および取り込まれなかったレポーター 基変性デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートを除去するために、固体支持 体上の固定化標的核酸を次いで数回、例えば２５℃〜３７℃の温度範囲で１洗浄 サイクルあたり約５〜１０分間洗浄することができる。

本発明のアッセイには、増幅生成物に取り込まれたレポーター基の種類に応じて 、様々な既知の検出法を用いることができる。レポーター基が発色団または蛍光 団である場合は、取り込まれたレポーター基を既知の分光技術により検出するこ とができる。別法として、増幅プロセスの過程で取り込まれたレポーター基に対 する標識抗体を捕捉プローブへのハイブリダイゼーションによる増幅生成物の捕 捉の前または後に増幅生成物と接触させる。

抗体上の標識は次いで洗浄工程後に増幅生成物の存在の検出に用いることができ る。

以下の実施例は本発明を例示するものである。

実施例 以下の特定の条件および試薬を用いて米国特許第４、６８３．２０２号およびＧ ｅｎｅ＾ｍｐ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ＲｅａｇｅｎｔＷｉｔ（ ＃　Ｎ　８０１−００４３）の製品解説書に記載の手順に従った。

プラスミド中に取り込まれた■ＩＶ　ＩのＧＡＧ　ｐ１７領域内に位置する１０ ３−ヌクレオチド塩基配列（大部分のｌ’ｌＩＶ　Ｉゲノムを取り込んだプラス ミドはｐｓｎ　１Ｏ−Ｒ３と称する）は下記のようなプライマーＡおよびＢを用 いて増幅され得る。

５’　−ＴＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴＡＧＧプライマーＡ ５’　−ＴＣＴＧＡＡＧＧＧＡＴＧＧＴＴＧＴＡＧＣプライマーＢ プラスミドｐＢｎ　１Ｏ−Ｒ３の連続希釈液アリコート（１×１０４７、Ｉ　Ｘ 　１０”、Ｉ　Ｘ　１０”、Ｉ　Ｘ　１０”、Ｉ　Ｘ　１０”、１×１０４２． １．ＸｌＯ”、および０コピー）をＰＣＲを用いて増幅できる。各アリコートを ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰＳｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの各々について２００ａＭおよ びスクシニル−フルオレセインｄＴＴＰについて１ｈＭ、プライマーＡおよびプ ライマーＢの各々について１．ｈＭであって、ｌａｑヒト胎盤ＤＮＡ／反応およ び２．５単位のＤＮＡポリメラーゼ酵素を含む緩衝液と総反応容量を１０ｈｌと して混合できる。

各反応混合物を次いで前記製品解説書に記載の如り３０回温度循環できる。

この方法により標的分子数の増加見積りは１．Ｘ１０＋ｓ〜Ｉ　Ｘ　１０”にな ると予測される。

Ｂ、　ハイブリダイゼーション １）変性 前記アリコートの各々より得た増幅標的ＤＮＡの１０ｐｌを１、−５ｍ１Ｅｐ、 ｐｅｎｄｏｒｆ管内で３０ｐｌの１２０と混合し、そして沸騰水浴に１０分間入 れることができる。次にそれら管を冷水浴（４℃）に２分間移し、次いで微量遠 心機（■ｉｃｒｏｃｅｎ−ｔｒｉｆｕｇｅ）で１０秒間遠心分離することができ る。

２）ハイブリダイゼーション： 二検体ずつ実験できるように変性処理した検体を（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管を用い て）　２０ｒｒｌずつに部分することができる。次に３７℃で１０分間予め平衡 させた１００ａＪのハイブリダイゼーション・ミックスを添加することができる 。ハイフリタイセーション緩衝液は、３　ｍＡ’（７）２０Ｘ　ＳＳＣ，ｐＨ７ ，０，０、１ｍｌのＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（９〜ｌＯ個のエトキシ単位を有 するアルキルアリールポリエーテルアルコール）、１．ｏ＋＋Ｊの脱イオンされ たホルムアミド、６．３７５冒ｌのＲ２０および２５μｌの１、ＯＮ　ＩＣ１を 混合することにより調製することができる。

次いで、米国特許第４．６６１．４０８号に記載の如く調製された二酸化クロム 粒子（１２μ９）に結合した捕捉オリゴヌクレオチド１２ａｌを検体に添加し、 ３７℃で１０分間インキュベートし、微量遠心機（Ｉｌｉｃｒｏｆｕｇｅ）で５ 秒間遠心分離し、Ｃｏｒｎｉｎｇ磁性ラックに２５℃で２分装置（ことができる 。

次ニヘレットハ２００１１（７）ＬＸ　ＳＳＣ，ｐＨ７，０および０．１７％Ｔ ｒｉｔｏｎ　Ｘ〜１００を含む洗浄緩衝液を添加し、混合し、検体を磁性ラック に２分間置きそして前記洗浄緩衝液を除去することにより、２５℃で３回洗浄す ることができる。

３、　検出 検出は、各検体に２０ｈ／の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，０を添加し、そし てそれらを沸騰水浴に１００分間置ることにより行うことができる。次にそれら 管を冷水浴（４℃）に２分間移しそして微量遠心機で１０秒間遠心分離すること ができる。次いで６管より２００ｕ’ずつ取り出し、そして増幅核酸生成物を直 接蛍光目視により検出することができる。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．所定の核酸配列を含む核酸を含むと思われる検体中の前記所定の核酸配列を 検出および／または測定するための核酸アッセイであって以下の工程、すなわち 、（Ａ）標的核酸を一本鎖化する； （Ｂ）所定の核酸配列内に含まれる少くとも一つの特定の核酸配列を、相当する ｄＮＴＰをすべて置換する量以下の量のレポーター部分を含有する少くとも一種 のデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートの存在下に、下記の工程（１）〜 （４）により増幅する：（１）前記一本鎖を、増幅される各々異なる特定配列に ついて、二種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、増幅される各々異な る配列について各核酸鎖に対して相補的な各プライマーの延長生成物が合成され るような条件下に処理し、その際前記プライマーは各々特定配列を有する異なる 核酸鎖に対しそれらとハイブリダイズするのに十分相補的であるように選択して 、一方のプライマーから合成される延長生成物が、その相補体から分離されたと きに他方のプライマーの延長生成物の合成のための鋳型として役立ち得るように する； （２）プライマー延長生成物をそれらの合成の基礎とされた鋳型から分離して一 本鎖化された分子を生成させる； （３）工程（２）で生成させた一本鎖化された分子を、工程（１）のプライマー を用いて、プライマー延長生成物が工程（２）で生成させた一本鎖の各々を鋳型 として用いて合成される条件下に処理する；そして（４）工程（２）および（３ ）を繰り返して検出および／または測定に十分なプライマー延長生成物を生成さ せる； （Ｃ）工程（Ｂ）（４）の生成物を一本鎖化する；（Ｄ）工程（Ｃ）の生成物を 、固体支持体に結合しそして両プライマーにより規定される核酸配列を含まない プライマー延長生成物の一部分に対して相補的なオリゴヌクレオチドと接触させ る； （Ｅ）ハイブリダイズしなかった物質を除去する；および （Ｆ）固体支持体に固定されたレポーター部分を検出および／または測定する より成る前記核酸アッセイ。 ２．所定の核酸配列がＨＩＶＩＤＮＡである請求項１記載のアッセイ。 ３．レポーター部分が蛍光部分である請求項１記載のアッセイ。 ４．レポーター部分が抗原性部分である請求項１記載のアッセイ。