JPH04500010A - ｔ―ＰＡ―変異体ＧＫ１Ｌ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｔ−ＰＡ−変異体ＧＫＬＬ ヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）は分子量６８．０００ダル トンのセリンプロテアーゼであり、酵素前駆体プラスミノーゲンを活性セリンプ ロテアーゼ１ラスミンに変換する。プラスミンは、血餅のタンパク質マトリック スの主成分であるフィブリンを溶解する。ｔ−ＰＡはフィブリンに対して高い親 和性を有し、またフィブリンによって活性化される（“Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉ ｓ”、　２　（１９Ｊ１８）、　１３３−１４２１９照）、従ってｔ−ＰＡは医 学的に極めて重要視される。

例えばウロキナーゼ又はストレプトキナーゼのような他の公知のプラスミノーゲ ン活性化因子に比べてｔ−Ｐ　Ａの利点は、その触媒活性がフィブリンによって 刺激されることである。（“Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、”　、２５７　（１９８ ２）、２９１２−２９１９　：　”Ｂｉｏｃｈｅｉ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃ ｔａ”　、７５Σ（１９８３）、５３１−５３３９照）。

ｔ−ＰＡ（アミノ酸配列、フェハール（Ｖｅｈａｒ）その他、′Ｂｉｏ／Ｔｅｃ ｈｎｏ　ｌｏｇｙ”、　２　（１９ｇ４＞、１０５１−１０５７参照）は、その 一本積形において１本の重Ｍ（Ｈ−ｊｌｌ）と１本の軽鎖（Ｌ−ｍ）とからなり 、これらはジスルフィド架橋によって結合されている。その二本鎖形は一本鎖前 駆体形から１ラスミン又は他の１０テアーゼでアミノａ　（Ａ、Ｓ、）　２７５ と　２７６の間で特異的に切断することによって生じる。３２，０００ダルトン のＬ−Ｍは、ウロキナーゼ又はプラスミンのような他のセリンプロテアーゼに対 して相同性を有する酵素活性範囲を含む（“Ｐｒｏｃ、　Ｎａ目、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ”　、８１　（１９ｇ４）　、５３３５−５３３９）、３９ ．ＯＱＯダルトンのＨ−鎖上の各領域はフィブロネクチン（Ａ、Ｓ、　１−４９ 　ンに対して相同性のフィンガー領域（Ｆ）、マウス−及びヒト表皮増殖因子（ Ａ、Ｓ、　５０−８７＞に対して相同性の増殖因子領域（Ｇ）及びプラスミノー ゲン中のクリングル構造に対して相同性の２つのクリングル領域Ｋ　１　（Ａ、 Ｓ、　８ｇ−１７５）及びＫ　２　（Ａ、Ｓ、　１７６−２６２）である。

Ｈ−鎖の個々の領域の機能に関してはすでに知られている。すなわち、フィブリ ンへのｔ−ＰＡの結合、従ってまたフィブリンの存在でｔ−ＰＡの触媒活性を刺 激するのｉこ関与するのは領域に２又は／及びＦのみで、領域に１はこれに関与 しない（欧州特許出願°公開第０２３４０５１号明細書）。

”Ｅ１４ＢＯ”　、　Ｌ　（１９Ｈ）、２７３１−２７４０からは、Ｈ−鎖から の完全な領域に１及びＦ、並びに領域に２の１部を含むｔ−ＰＡ変異体の活性も フィブリンによって刺激可能であることが公知である。

しかしＨ−鎖の個々の領域がフィブリンに対するｔ−ＰＡ−分子の活性をどの程 度生ぜしめまたプラスミノーゲン切断活性をどの程度刺激するのかは未解決であ る。

本発明の課題は、ｔ−ＰＡに比べてより大きなプラスミノーゲン切断活性を有し またその触媒活性を同機にフィブリン又はフィブリノーゲンによって刺激するこ とのできるｔ−ＰＡ−変異体を得ることにある。

この課題ぼ本発明によれば、ｔ−ＰＡの領域ＧＫＩＬを有するタンパク質をコー ドし、そのＦｉＡ９ｊＡ域に２及びＦをコードする配列又は遺伝躇号の退行変性 の枠内でこれから誘導された配列、すなわち正確なエキジン／イントロン接触面 に相当する配列がｔ−ＰＡ−遺伝子上で完全に欠失されている、組撓えＤＮＡを 製造することによって解決される。従って本発明による組撓えＤＮＡではｔ−Ｐ ＡｃＤＮＡのヌクレオチド７１５〜９７２及び１９９〜３３９が欠けている（番 号は’Ｎａｔｏｒ″、　３０１　、　（１９８３）、２１４−２２１による）、 活性の刺激可能性にとって重要なものとみなされる。Ｈ−ｊｌの領域に２及びＦ は、本発明による組撓えＤＮＡの遺伝子生成物であるｔ−ＰＡ変異体ＧＫＬＬで は欠けているにもかかわらず、このＧＫＬＬには予想外にもフィブリンによる触 媒活性の刺激可能性は保持されている。ＧＫＩＬを表現する細胞からの上澄みの 触媒活性は驚くべきことには、ｔ−ＰＡを表現する細胞からの上澄みの活性より も明らかに高い。

本発明の１対象は、ｔ−ＰＡ又は領域Ｇ、Ｋｌ及びＬ以外の領域も含むｔ−ＰＡ 変異体をコードするＤＮＡ−配列から、ｔ−ＰＡ−遺伝子上における正確なエキ ラン／イントロン−接触面の維持下に、領域Ｇ、に１及びＬをコードしない各配 列を欠失させることにより、本発明のＭ＃ＱえＤＮＡを製造する方法である。領 異誘発によって起こさせる方法が特に有利である。

本発明の１対象は、本発明による組換えＤＮＡのコピー１つ以上を含む組撓えベ クターである。この場合優れた１実施態様は、真核細胞中に組換えＤＮＡを発現 させるのに適したベクターである０本発′明の特に優れた１実施態様は５Ｖ４０ −初期プロモータ及びマウス−ｄｈｆｒ−遺伝子を含むＧＫＩＬ−遺伝子を有す る真核ベクターである。しかし最も好ましいのは本発明によるプラスミドｐ　５ Ｖ−ＧＫ　Ｉ　Ｌである。

本発明の１対象は１本発明による組撓えＤＮＡ又は本発明によるベクターで形質 転換されている細胞系である。特に好ましいのは真核細胞系であり、最も好まし いのは、本発明による組換えＤＮＡ又は本発明によるベクターを含むＣＨＯ−ｄ ｈｆｒ−細胞系（例えばＥｃＡｃｃ　８８０７２１０３）である。

本発明の１対象はｔ−ＰＡの領域Ｇ、Ｋｌ及びＬの、この順序でのアミノ酸配列 からなりかつ場合によってはグリコジル化されている轄維素溶解特性を有するタ ンパク質である０本発明は同様に１本発明による組換えＤＮＡ又は本発明による 組換えベクターを適当な宿主細胞に表現し、この発現生成物を培地から又は宿主 細胞を溶解することによって回収することにより、繊維素溶解特性を有するタン パク質を製造する方法に間する。この場合本発明によるタンパク質を真核宿主細 胞、有利にはＣＨＯ−ｄｈｆｒ−宿主細胞からグリコジル化された形で得る方法 が有利である。驚くべきことには本発明によるプラスミドｐＳＶ−ＧＫ、ＬＬで 形質転換されまたＧＫＬＬを分泌するＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞からの上澄みは、 野生型ｔ−ＰＡ−遺伝子が存在する相応する発現ベクターｐＳＶ−ＦＧＫＩＫ２ Ｌで形質転換されている細胞からの上澄みよりも一層高い触媒活性を有する。

特に有利なのはアプロチニンを含む培地中で培養される宿主細胞を使用する方法 である。

この場合予想外にも、その培地がアプロチニンを含む宿主細胞の上澄みではその 活性及びフィブリンによる刺激の程度は一層高い。

最後に本発明の１対象は、本発明によるタンパク質を含む繊維素溶解剤である。

次の各実施例は本発明を第１図及び第２図との関連において詳述するものである 。

この場合第１図はプラスミドρＳ　Ｖ　−Ｇ、Ｋ　Ｉ　Ｌの製造法を示すもので あり、第２図は野生型−ｔ　−Ｐ　、Ａ及びＧＫＩＬの、フィブリノーゲンで刺 激された触媒活性を比較して示すグラフ図である。

例　ｌ フィンガー及びクリングル２−領域が欠失されているｔ−ＰＡ−誘導体の製造（ ＧＫ　Ｌ　Ｌ＞ｔ−ＰＡｃＤＮＡからの欠失変異体Ｆ、、Ｇ　Ｋ　Ｉ　Ｌを、” Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ！ｙ−，２（１９８４）、６３６−６３９から公知の 方法により意図的な変異誘発でクリングル２−領域を欠失することによって製造 した。出発プラスミドとしてはｔ−ＰＡヌクレオチド配列１９０−１８０９が存 在するｐｅＰＡ１３３　（その製造は欧州特許出即公開第０２４２８３６号明細 書を参照）を使用した。変異誘発プライマー１（５°ＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧ ＴＣＣＡＣＣＴＧＣＧＧＣ３°）を使用して、ヌクレオチド７１５〜９７２（エ キシン■及び■）を除去した（　”Ｎａｔｕｒ　”　、　３０１　（１９８３） 、２１４−２２１に記載されたｔ−ＰＡ−ｃＤＮ、Ａの番号に相応する）、次い で欠失変異＃ＦＧＫ　Ｉ　Ｌをコードするプラスミドｐ７７４５を、変異誘発プ ライマー１でコロニーハイブリッド形成により分離し、配列を決定した。真核細 胞に後に発現させるにはｔ−ＰＡシグナル配列の再構成が必要であった。

まずＦＧＫＩＬｃＤＮＡにリーダー配列及び３°ＵＴ（３゛非翻訳領域）　（原 ｃＤＮＡ−配列）を施した、このためｐｕｃ　ｌ　２のポリリンカー内に位置７ ７までの５”ＵＴ（５’非翻訳領域）、リーダー配列及びヌクレオチド位置２０ ８までのｔ−ｐＡのＮ−末端配列を含むプラスミドｐ７．１．．ＤＳＭ４７１９ をＰｓｔ−■及びＨ，ｉｎｄ［［ｌで切断した（約２．７ｋ　ｂ　＞　、付加的 に次のｔ−ＰＡｃＤＮＡ配列を、含む断片を分離した。

すなわちｐ７７４５から、ヌクレオチド位置２０９〜４２１を含むＰｓ、、ｔ／ Ｈ，ａｅｌｌ−断片並びにヌクレオチド位置４２１〜］　２７３を有するＨ　ａ 　ｅ　■／　Ｅ　’ｃ　ｏ　ＲＩ−断片（この場合変異誘発によってヌクレオチ ド位置７１５〜９７２は欠失されている）をまたｐｅＰＡ　’）８．１（その製 造は欧州特許出願公開第０２４２８３６号参照）からヌクレオチド位置１２７４ 〜２１６５を有するＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｌ［［−断片を分離した。

これらの断片を結合し、Ｅ−ｃｏ　Ｉ　ｉ、ＤＳＭ３６８９に形質転換しな。プ ラスミドを有する形質転換細胞を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加すること によって培地中で選択した。ｐ　ｅ　Ｐ　Ａ　１．５９で表される真正プラスミ ドは制限酵素−分析によって立証された。

このプラスミドからＦＧＫＩＬｃＤＮＡをＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩ［Ｉ−断片とし て分離することができた（シグナル配列を有するが、独自のポリアデニル化部位 を有さなイ）。コノ断片は位置２１６０　（“Ｎａｔｕｒｅ”　、　３０１（１ ９８３）　、２１４−２２１　）でＢｇｌＩＩ一部位までに７つのヌクレオチド ５°非翻訳領域（５’　ＵＴ）及び３′非翻訳領域（３°ＬＩＴ）を含む。

ＦＧＫＩＬからフィンガー領域Ｆ（エキシン■）を欠失させるために変異誘発プ ライマー？（５°ＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＡＧＣＣＡＧＣ３’）を使用し た。意図的な変異誘発によってｔ　−Ｐ　Ａ　−’ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ上のヌクレオ チド　１９９〜３３９を除去した。領域組成ＧＫ　Ｉ　Ｌ；を有する組換えＤＮ Ａを・有するプラスミドを変異誘発プライマー２でコロニーハイブリッド形成す ることにより分離し、配列を決定した。この場合次のようにして処理した。固定 化Ｄ　Ｎ　Ａ、を有するフ達ルタを６５℃で４時７間、０．２％ＳＤＳ、１．０ ％サルコシル（５ａｒｋｏ、ｓｙｌ’　）、４　Ｘ　Ｓ　Ｅ　Ｔ　（ＮａＣｌ　 Ｏ，６ｍモル／ρ、トリス−ＨＣｌ　０．２モル／１、ｐ）（８，０，ＥＤＴＡ ４ｍモル／ｉり及び４×デンハーツ溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ−Ｌ５ｓｕｎｇ） 　（０，０８％フィコｌしくＦｉｃｏｌｌ”ン、ｏ、ｏｓ％ポリビニｌレビロリ ドン、０゜０８％ウシ血清アルブミン）中で前ハイブリッド処理した。

ハイブリッド形成は４６℃で１２時間０．２％ＳＤＳ、１゜０％サルコシル、４ ＸＳＥＴ、４×デンハーツ中でまたフィルタ当たり５・１０’　ｃ　ｐ、ｍのキ ナーゼ化変異誘発プライマーを用いて行った。フィルタを室温で３×５分間、引 続き３７℃で１×１０分間及び５０℃で１８５分間、４ＸＳＥＴ及び０．２％Ｓ ＤＳ中で洗浄した。

例　２ ＣＨＯ−４１＋１胞からのＧＫＩＬの免疫学的特性化ｔ−ＰＡ−ｃＤＮＡ及びＧ ＫＩＬ−ｃ、ＤＮＡを、プラスミドｐＫＣＲ（“Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ”、　７ｇ　（１９８１）　、、　１５２７−１５３ １　）の唯一のＢａｍＨＩ−切断部位に、Ｘｂａ　Ｉ−Ｈｉ　ｎｄ［Ｉ−断片と して挿入し、これからプラスミドｐＫＣＲ−ＦＧＫＩＫ２Ｌ及びｐＫＣＲ−ＧＫ ＩＬを得た。このため各断片の端部を重合酵素■フレノウ断片で補充した。双方 のｃ−ＤＮＡは５°−末端で７つの真正ヌクレオチドを含み、その固有のポリア デニル化部位を欠いていた０両プラスミドは抗生物質アンピシリン（Ａｍｐ＞に 対し細菌抵抗性を付与した。双方のｃ−ＤＮＡの発現はＳＶ４０初期−プロモー タによって促進される。このプラスミドではｃ−ＤＮＡの後に家兎−β−グロビ ンの大きなイントロン及び、家兎−β−グロビン及びＳＶ４０のポリアデニル化 部位が続く、この発現カセットを分離するため、ｐＫＣＲ−ＦＧＫＩＫ２Ｌ及び ｐＫＣＲ−ＧＫＩＬを５ａｌＩで部分切断することによって直線状にし１次いで Ａａｔ［で切断し、突出している端部をヌクレアーゼＳ１で分解した。この断片 を低融点アガロースゲルから分離し、ρＡｄＤ２６ＳＶ（Ａ＞（”Ｊ、Ｍｏ１． ｂｉｏｌ、　”　、　１５９　（１９８２＞、６０１−６２１　＞の充填された 唯一のＥｃｏＲＩ−切断部位に結合挿入した。ｐＡｄＤ２６ＳＶ　（Ａ）は、ア デノウィルス２（ＡＭＬＰ）の主要後期−１０モータによって促進されるマウス −ＤＨＰＲ−ｃＤＮＡ用の発現カセット及びＳＶ４０−複製起点を含み、抗生物 質テトラサイクリンに対して細菌抵抗性を付与する０合成プラスミドＰＳＶ−Ｆ ＧＫＩＫ２Ｌ及びｐＳＶ−ＧＫＩＬ内でのｔ−ＰＡ用発現カセットの配向を制限 分析によって検査した。第１図は１ラスミドｐＳＶ−ＧＫ　Ｌ　Ｌの製造並びに このプラスミド上の個々の要素の位置を暗示するものである。

組換えベクターｐＳＶ−ＦＧＫＩＫ２Ｌ及びｐＳＶ−ＧＫ　Ｉ　ＬｒＣＨＯｄ　 ｈ　ｆ　ｒ−細胞（ＥＣＡＣＣ８８０７２１０３）を形質転換した（“Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ”、７６　（１９７９）　、　４３５ ０−４３５４）、　、ニー１７）たメｐｓＶ−ＦＧＫＩＫ２Ｌ又４．ｔｐＳＶ− ＧＫ　Ｉ　Ｌ　２０　ｔｔｇを宥する燐酸カルシウム−沈殿物を４ｍｇの容量で 製造した（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”　、　５２　（１９７３）　、４５６−４６７＞ 、沈殿物１ｍｆを培養液Ｉｏｎ　ｉＪ中の細胞３×ＩｏＳ〜ｌＸ１ｏ６に加えた 。細胞を８−１６時間インキュベートし、その後培養液を除去し、＃ｉ胞をＴＢ Ｓ（トリス−ＨＣｌ　２５　ｍモル／１．ｐＨ７，４、ＮａＣｌ　１１３７　ｍ モル／ｊ）、ＫＣｌ５ｍモル／　ｉ！、ＮａＨ２ＰＯ４０，６ｍモル／ｆり１０ ｍ１＋で洗浄し、次いで適当な培地でインキュベートした。ＣＨＯ−ｄｈｆｒ− 細胞（ＥＣＡＣＣ８８０７２１０３）をトランスフェクシゴン４８時間後１：１ ０に変え、その後選択培地で培養したく“Ｊ、！４ｏ１．Ｂｉｏ１．”、１５９ 　（１９ｇ２＞、６０１−６２１＞、生じたクローンをトランスフェクション２ 〜３週間後にクローン化シリンダを用いてトリプシン処理し、大量培養のため引 き上げ、その上澄みをＥＬＩＳＡによりｔ−ＰＡ−免疫反応性に関して検査した く“Ｇｅｎｅ”　、　５１（１９８７）、３１−４１＞、ポジのクローンをメト トレキセート２０ｎモル／βを有する培地中でインキュベートした。２週間後メ トトレキセートー耐性コロニーが生じた。これを全面培養し、培地内でメトトレ キセート１０ｎモル／ｐに曝した。附性縛胞を徐々に高くなるメトトレキセート 濃＃ｉｌ液＜　３００ｎモル／ｉ！、５００ｎモル／ｇ、１μモル／！！及び５ μモル／ｌ）に曝した。各クローンを限界希釈法により分離し、最良のｔ−ＰＡ 生産者を選出した。

野生型ｔ−ＰＡ又はＧＫＬＬの構成性、分泌を示したＣＨＯ−細胞を、１０％ウ シ胎児血清で補足されたＤ　ＭＥＭ−培地（ダルベツコの修飾イーグル培地）中 で、アプロチニン（５０μｇ／ｍｌ）の存在及び不存在において培養した。上澄 みをアルギニン０．３モル／Ωに施し、ＨＣＩでｐＨ７，５に調整し、ＥＴＩ− セファロース゛・・カラムに施した（　”Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＠、、”、 　２５９　（１９８４）、１１６３５〜１１６３８）、タンパク質をクエン酸塩 ｔｕ液２０ｍモル／ｆｌ　＜ｐＨ２，５）で溶出し、引続きトリス−ＨＣｌ　２ ０ｍモル／ｌ！（ｐロア、５）に対して透析した。

精製したタンパク質の分割量を、シトクロムｃｌｏμｇを添加しながら一２０℃ でア七トン４容量で１時間沈殿処理し、引続きレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）試料榎 衡液に溶かした。タンパク質試料を３分間煮沸し、１２．５％ＳＤＳ−ポリアク リルアミドゲル上で不達Ｍ［ｆｆｉ系を使用して分離した（レムリ、“Ｎａｔｕ ｒｅ”、　２２７（１９７０＞　、　６．！１０−ｂｇ５）、　＠気に勤処理後 グルをニトロセルロースフィルターに電気プロットした。フィルタをＴＢＳで洗 浄し、次いで室温で３０〜６０分間Ｔ　Ｂ　Ｓ　＋　０．０５トウイーン（Ｔｖ ｅｅｎ）＋　３％ゼラチンで飽和し、最後に水で短時間洗浄した９その後メンブ ランフィルタをヒトｔ−ＰＡに対するペルオキシダーゼ−複合ヤギ杭体の１　： 　１０００希釈液でＴＢＳ−１−０，５％ウシ血清アルブミン中において室温で １時間処理した。免疫複合体を可視化するため、フィルタを更にＴＢＳ、メタノ ール中のテトラメチルベンジジン２．５ｍモル／ｇ及びナトリウムジオクチルス ルホサクシネート４．５ｍモル／ρからなる１：１溶液及び過酸化水素ｏ、ｏｏ ｓ％で３回洗浄した後、クエ７　ｒＪｔｉｅｌｌ衡Ｍ　Ｏ，１モル／　Ｒ中”Ｃ ’　Ｐ　Ｈ５ティ：／　キュヘ−）した。ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動用 標識としては次のタンパク質、すなわちミオシン２００ｋＤ、ホスホリラーゼ（ ｂ）９２．５ｋＤ、ウシ血清アルブミン６９ｋＤ、オボアルブミン　４６ｋＤ、 カルボアンヒドラーゼ３０ｋＤ、トリプシンインヒビター　２１．５ｋ　Ｄ及び リゾチーム　１４ｋＤを含むレインボーミックス（Ｒａ−ｉｎｂｏｗ−旧ｘ）［ アメルシャム（Ａ＠ｅｒｓｃｈａｓ＋）　”２．を使用したＧＫＬＬを発現する プラスミドｐＳＶ−ＧＫＩＬを含む細胞の培養上澄みはｔ−ＰＡに対する状体で の処理に際して約５０，０００ダルトンの免疫反応バンド（ＧＫＩＬの一本鎖形 に相当）、約３１，０００ダルトンのバンド（Ｌ−鎖に相当）及び約１９，００ ０ダルトンのバンド（Ｈ−鎖に相当）を生じる。ｌｓＩ胞培地が１０テアーゼ阻 害物質アプロチニンを含む場合、二本鎖分子の量は一本鎖分子に比べて減少する 。

これに対しｔ−ＰＡは６５．０００〜６８．０００ダルトンのバンド（−重鎖形 に相当）１本と、　３４．０００又は３１．０００ダルトンのバンド（Ｈ−又は し−鎖に相当）２本を有する。

例　３ ｔ−ＰＡ及びＧＫＬＬのフィブリノーゲンで刺激された触媒活性の比較 ｔ−ＰＡ及びＧＫＬＬを、例２に記載したようにしてＣＨＯ−細胞の上澄みから 増殖させた。この場合を−ＰＡ又はＧＫＬＬを分泌するｃＨｏ−ｓ胞をアプロチ ニン（５０μｇ　／　ｍ　ｉ’　）の存在又は不存在で培養した。活性試験を実 施するため上澄みをｌ：２５０に希釈した。これは無視し得る程度に僅少な阻害 剤の濃縮化をもたらした。プラスミノーゲン分離活性は間接的な分光光度計テス トによって測定したく“Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓ−ｔａｓｉｓ”、４ｇ　（ １９ｇ２＞　、　２６６−２６９）、　ｔ　−Ｐ　Ａはプラスミノーゲンを、色 素原基質の結合を加水分解する活性セリンプロテアーゼプラスミンに変換し、そ の４０５ｎｍでの吸収を３時間までの期間測定した。変更された実験でトシル化 されたＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド（クロモシム（Ｃｈｒｏｍ ｏｚｙｍ’）Ｐ　Ｌ　）を色素原基質として使用した。この試験は２５℃で、Ｃ ＮＢｒで分離されたフィブリノーゲン（１２０μｇ　／　ｍ　ｌ　）の不存在又 は存在において、トリス−ＨＣｌ　０．１モル／Ｒ１ｐＨ７，５、トフイーン８ ０　０．１５モル／β及びプラスミノーゲン　０，１３μモル／ｆ！及びクロモ シムＰＬＯ，３０ｍモル／β中で実施した０色素原基質からのｐ−二トロフェノ ールの遊離に対する尺度として４０５ｎｍでの吸光を測定し、インキュベート期 間の関数として示した。結果は第２図に示す。

ｔ−ＰＡ（アプロチニンを含まない上澄みから分離した）のプラスミノーゲン分 離活性は塗り潰した円で示されており、ｔ−ＰＡ（アプロチニンを含む上澄みか ら分離）の活性は白地の円で、ＧＫＩＬ（アプロチニンを含む上澄みから分離〉 の活性は塗り潰した四角でまたＧＫＩＬ（アプロチニンを含まない上澄みから分 離）の活性は白地の四角で示されている。±ＣＮＢｒはテスト中ＣＮＢｒで処理 されたフィブリノーゲン−断片の存在又は不存在を示す。（＋）又は（−）はア プロチニン含有又はアプロチニン不含の組織培養上澄みからのタンパク質が精製 されたか否かを示す。

第２図から、フィブリノーゲンの存在でＧＫＬＬの触媒活性が刺激されることは 明白である。

この場合驚くべきことには、ＧＫＬＬを発現する細胞からの上澄みの触媒活性は フィブリノーゲンを有する場合もまた有さない場合も、野生型ｔ−ＰＡを発現す る１胞からの上澄みのそれよりも明らかに高い、培地中、にアプロチニンが存在 する場合、ＧＫＬＬの活性はフィブリノーゲンの存在する場合には高く、フィブ リノーゲンが存在しない場合にはアプロチニンが存在しない場合よりも低い。

ｒｉｇ、　、Ｌ −ｙ旦−＋εｌて列 Ｆ工ｑ、２ 国際調査報告 １１１．ア　＋ｍ　ＰＣＴ／ＥＰ　９０１０１４０４国際調査報告

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．ｔ−ＰＡの領域ＧＫｌＬを有するタンパク質をコードし、その際野生型ｔ− ＰＡ−遺伝子の領域Ｋ２及びＦをコードする配列又は遺伝暗号の退行変性の枠内 でこれから誘導された配列が正確なエキソン／イントロン接触面でｔ−ＰＡ−遺 伝子から完全に欠失していることを特徴とする組換えＤＮＡ。
2. ２．野生型ｔ−ＰＡ又は領域Ｇ、Ｋ１及びＬ以外の領域をも含むｔ−ＰＡ変異体 をコードするＤＮＡ−記列から、ｔ−ＰＡ−遺伝子上における正確なエキソン／ イントロン−接触面の維持下に領域Ｇ、Ｋ１及びＬをコードしない各配列を欠失 させることを特徴とする請求項１記載の組換えＤＮＡの製法。
3. ３．領域Ｆ及びＫ２をコードする配列の欠失を意図的な変異誘発によって実施す る請求項２記載の方法。
4. ４．請求項１記載の組換えＤＮＡのコピー１個以上を組込まれた状態で含むこと を特徴とする組換えベクター。
5. ５．ＳＶ４０初期プロモータ及びマウスｄｈｆｒ−遺伝子を含む請求項４記載の 組換えベクター。
6. ６．プラスミドｐＳＶ−ＧＫ１Ｌ。
7. ７．請求項１記載の組換えＤＮＡ又は請求項４から６までのいずれか１項記載の ベクターで形質転換されていることを特徴とする細胞系。
8. ８．真核、有利にはＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞系である請求項７記載の細胞系。
9. ９．レＰＡの領域Ｇ、Ｋ１及びしの、この順序でのアミノ酸配列からなり、場合 によってはグリコシル化されていることを特徴とする繊維素溶解特性を有するタ ンパク質。
10. １０．請求項１記載のＰＮＡ又は請求項４から６までのいずれか１項記載のベク ターを適当な宿主細胞に表現し、発現生成物を培地から又は宿主細胞を溶解する ことによって回収することを特徴とする、繊維素溶解特性を有するタンパク質の 製法。
11. １１．真核の、有利にはＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞（ＥＣＡＣＣ８８Ｑ７２１０３ ）を宿主細胞として使用し、グリコシル化された生成物を得る請求項１０記載の 方法。
12. １２．アプロチニンを含む培地中で培養される宿主細胞を使用する請求項１０又 は１１記載の方法。
13. １３．請求項９記載のタンパク質を含むことを特徴とする繊維素溶解剤。