JPH06501616A - 同起源インヒビターによる阻害に対して抵抗性のキモトリプシンスーパーファミリーのセリンプロテアーゼ変異株及びそれをコードする遺伝子、ならびにセリンプロテアーゼインヒビター変異株及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 関連出願へのクロスリファレンス これは１９８９年３月６日出願のＵ、Ｓ、特許出願番号０７／３１９゜２１２の 一部継属出願である１９８９年１１月８日出願のＵ、　Ｓ、特許出願番号０７／ ４３４，７４８の一部継属出願である。

発明の分野 本発明は同起源インヒビターによる阻害に対して抵抗性であるキモトリプシン　 スーパーファミリーのセリン　プロテアーゼ変異株、及びそれをコードする遺伝 子に関する。本発明は又、本発明のセリン　プロテアーゼ変異株を阻害するセリ ン　プロテアーゼ　インヒビター変異株、及びそれをコードする遺伝子に関する 。セリン　プロテアーゼ変異株、及びセリン　プロテアーゼ　インヒビター変異 株は、例えば薬剤として有用である。

セリン　プロテアーゼ（Ｅ、　Ｃ，３，４，２１）はペプチド結合分裂における 核試薬としてセリンを使用するエンドペプチダーゼのサブ−サブクラスである（ Ｂａｒｒｅ　ｔ　ｔ、Ａ、Ｊ、、於：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏ ｒｓ、出版　Ｂａｒｒｅｔｔ、Ａ、Ｊ、等。

Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、３−２２頁：及びＨａｒｔｌｅｙ、Ｂ 、Ｓ、、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ７，２９：４５−７２　（１９６０） ）。

セリン　プロテアーゼは文献により周知であり、セリン　プロテアーゼの２つの スーパーファミリー、すなわちキモトリプシン　スーパーファミリー、及びスト レプトミセス　ズブチリシン　スーパーファミリーはこれまでに観察されていた （Ｂａｒｒｅｔｔ、Ａ、Ｊ、、於：Ｐｒ。

ｔｅｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、　出版　Ｂａｒｒｅｔｔ、Ａ。

Ｊｏ等、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、３−２２頁（１９８６）：及 びＪ　ａｍｅ　ｓ、　Ｍ、　Ｎ、　Ｇ、、於：Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓ　１ｓａｎｄ 　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、出版Ｒｉｂｂｏｎｓ、 Ｄ、Ｗ、等、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１２５−１４２ 頁（１９７６））。

キモトリプシン　スーパーファミリーのセリン　プロテアーゼの例には組織−型 プラスミノーゲン活性化因子（下文では“ｔ−ＰＡ”）、トリプシン、トリプシ ン一様プロテアーゼ、キモトリプシン、プラスミン、エラスターゼ、ウロキナー ゼ（又は尿−型プラスミノーゲン活性化因子（下文ではｕ−ＰＡ”）、アクロシ ン、活性化プロティンＣ，Ｃｌエステラーゼ、カテプシンＧ１チマーゼ、ならび にカリクレイン、トロンビン及び因子ＶＩＩａ、ＩＸａ、Ｘａ、Ｘｌａ及びＸＩ Ｉａを含む血液凝固カスケードのプロテアーゼが含まれる（Ｂａｒｒｅｔｔ、Ａ 、Ｊ、。

於：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、出版　Ｂａｒｒｅｔｔ、Ａ 、Ｊ、等、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、３−２２頁（１９８６）； Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇｅｒ、Ｗ、等、ＦＥＢＳ　Ｌｅｏ、、Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　 Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄ ａｔｉｏｎ、５ｆｌｖｅｒ　Ｓｐｒｉｎｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　（１９７２）； 及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｒ。

Ｄ、　等、Ｈｏｓ　、Ｐｒａｃ、、２１　二　１３１−１３７　（１９８６）） 　。

ｔ−ＰＡ、プラスミン、ｕ−ＰＡ、及び血液凝固カスケードのプロテアーゼを含 むキモトリプシン　スーパーファミリーのセリン　プロテアーゼのいくつかは巨 大分子であり、セリン　プロテアーゼ触媒ドメインの他にその活性の調節に一部 関与する構造ドメインを含む（Ｂａｒｒｅｔｔ、　Ａ、　Ｊ、　、於：Ｐｒｏｔ ｅｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ。

出版　Ｂａｒｒｅｔｔ、Ａ、Ｊ、等、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、 ３−２２頁（１９８６）；Ｇｅｒａｒｄ、Ｒ，Ｄ、等、Ｍｏｌ。

版　Ｂｌａｓｉ、Ｆ９等、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｌｔｄ、、３ ７７−４１４頁（１９８６））。

キモトリプシン　スーパーファミリーのすべてのセリン　プロテアーゼの触媒ド メインは配列相同性、及び構造相同性の両方を有する。配列相同性は以下： （ｉ）特徴的活性化部位残基（例えばトリプシンの場合Ｓｅｒ＋ｓｓ。

ＨｉＳｓｙ・及びＡＳ＋）１０２）　：（１１）オキシアニオン　ホール（例え ばトリプシンの場合ＧＩＹＨ３゜ＡＳｐ＋＊４）：及び （ｉｉｉ）構造中にジスルフィド架橋を形成するシスティン残基の全部の保持を 含む（Ｈａｒ　ｔ　ｌｅｙ、Ｂ、Ｓ、、Ｓｙｍｐ、Ｓ。

ｃ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｌ、２４：１５２−１８２（１９７４））。

構造相同性は以下： （１）２個のブリーフ鍵構造から成る共通折りたたみ（Ｒｉｅｈａｒｄｓｏｎ、 Ｊ、、Ａｄｖ、Ｐｒｏｔ、Ｃｈｅｍ、、３４；　１５７−３３９　（１９８１） ）； （ｉ　ｉ）触媒残基の共通の配置；及び（ｉｉｉ）分子のコア中の構造の詳細な 保持（Ｓｔ　ｒｏｕｄ、　Ｒ，Ｍ、。

Ｓｃ　ｉ、　Ａｍ、　、Ａ３１　二２４−８８　（１９７４））を含む。

キモトリプシン　スーパーファミリーのメンバーの配列を比較すると触媒ドメイ ン内のアミノ酸の挿入、又は欠失の存在が明らかになる（例えば図１を参照）。

すべての場合、これらの挿入又は欠失は折りたたまれた分子の表面にあり、従っ て分子の基本的構造に影響しない（Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇｅｒ、Ｗ、等、ＦＥＢ Ｓ　Ｌｅｔｔ、、１５７：２１９−２２３　（１９８３）’）。

Ｉｌ、セリン　プロテアーゼ　インヒビターセリン　プロテアーゼ　インヒビタ ーは文献により周知であり、以下の科（ファミリー）に分けられる：　（ｉ）塩 基性プロテアーゼ　インヒビターとしても知られる牛すい臓トリプシン　インヒ ビター（Ｋｕｎｉｔｚ）ファミリー（Ｋｅｔｃｈａｍ、Ｌ、に、等、於：Ａｔ　 Ｉａｓｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒ旦 、出版　Ｄａｙｈｏｆ　ｆ、Ｍ、０．．１３１−１４３頁（１９７８）（下文で は”　ＢＰＴＩ”　）、（ｉ　１）Ｋａｚａ　Ｉファミリー、（ｉｉｉ）ストレ プトミセス　ズブチリシンインヒビターファミリー（下文では“ＳＳビ）、（ｉ ｖ）セルビン　ファミリー、（Ｖ）大豆トリプシンインヒビター（Ｋｕｎ　ｉ　 ｔ　ｚ）ファミリー、（ｖｉ）ポテト　インヒビターファミリー、及び（ｖｉｉ ）ポーマン−バーク　ファミリー（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ、Ｍ、等、Ａｎｎ、Ｒｅ ｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、旦：５９３−６２６　（１９８０）；Ｒｅａｄ、Ｒ，Ｊ 、等、於：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、出版　ＢＢｒｒｅｔ ｔ、Ａ、Ｊ。

等、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、３０１−３３６頁（１９８６）； 及びＬａｓｋｏｗｓｋｉ、Ｍ、等、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｓｙ ｍｐ、Ｑｕａｎｔ、旧ｏ１．．　ＬＩＩ：５４５−５５３　（１９８７））。

ＢＰＴＩ、Ｋａｚａｌ、ＳＳＩ、大豆トリプシン、及びポテト　インヒビターフ ァミリーのメンバーを含む多くの完全な形のインヒビター、及びセルピン　アル ファー１−アンチトリプシンの分裂形に関して結晶Ｅ１５ｅｖｉ　ｅｒ、Ａｍｓ 　ｔｅｒｄａｍ、３０１−３３６頁（１９８６））。

これらのセリン　プロテアーゼ　インヒビターは大きさ及び配列が膨大なタンパ ク質であるにもかかわらず、これまでに研究された完全な形のインヒビターはす べて分子の表面から伸びる特徴的なループを共通して有しており、それは同起源 のセリン　プロテアーゼの活性化部位に対する認識配列を含む（Ｌｅｖｉｎ、Ｅ 、Ｇ、等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８０：６８０４−６８０８　（１９８３））。

異なるセリン　プロテアーゼ　インヒビターのループが構造的に類似しているこ とは驚くべきことである（Ｐａｐａｍｏｋｏｓ、Ｅ、等。

Ｊ、Ｍ（旦、ＢｉｏＪ、、１５８：５１５　５３７（１９８２））、インヒビタ ーのＫａＺａ　Ｉファミリー及びストレプトミセス　ズブチリシン　ファミリー はいくらか構造及び配列に類似性があるが、一般に異なるファミリーのセリン　 プロテアーゼ　インヒビターは活性化部位ループ以外に構造的関連性はない。

セリン　プロテアーゼ　インヒビターの多くは広範囲の特異性を持ち、血液凝固 セリン　プロテアーゼを含むプロテアーゼのキモトリプシンスーパーファミリー 、及びセリン　プロテアーゼのストレプトミセスズブチリシン　スーパーファミ リーの両方を阻害することができる（Ｌａｓｋｏｗｓｋ　ｉ、Ｍ、等、Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

↓旦・５９３−６２６　（１９８０））。各インヒビターの特異性はセリン　プ ロテアーゼによるインヒビターの潜在分裂の部位への直接のアミノ末端であるア ミノ酸の同定によりまず決定すると思われる。Ｐ１部位残基として知られるこの アミノ酸はセリン　プロテアーゼの活性部位内のセリンとアシル結合を形成する と思われる（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ。

Ｍ９等、Δｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、４９：５９３−６２６（１９８０ ））。

Ａ、ＢＰＴＩファミリー ＢＰＴＩファミリーに属するセリン　プロテアーゼ　インヒビターには、ＢＰＴ Ｉ、ヘビ毒インヒビター、インターアルファ　インヒビター、及びＡ４アミロイ ド前駆体Ａ４６９５が含まれる（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ。

Ｍ９等、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、４９：５９３−６２６（１９８０ ）；Ｒｅａｄ、Ｒ，Ｊ、等、於：ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、 出版　Ｂａｒｒｅｔ、Ａ、Ｊ、等、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、３ ０１−３３６頁（１９８６）；及びＰｏｎｔｅ、Ｐ、等、Ｎａｔｕｒｅ、３旦ユ ニ５２５−５２７　（１９８８））。セリン　プロテアーゼ、及びそれらと同起 源のＢＰＴＩファミリーインヒビターの例を下表■に挙げる。

表■ セリン　プロテアーゼ　同起源ＢＰＴＩインヒビターインターアルファ　インヒ ビター Ｋａｚａｌファミリーに属するセリン　プロテアーゼ　インヒビターには、すい 臓分泌インヒビター、オボムコイド、及び精漿アクロシンＢａｒｒｅｔｔ、Ａ、 Ｊ、等、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、３０１−３３６頁（１９８６ ）；及びＬａｓｋｏｗｓｋｉ、Ｍ、等。

ゼ、及びそれらと同起源のＫａｚａｌファミリーインヒビターの例を下表ＩＩに 挙げる。

表ＩＩ セリン　プロテアーゼ　同起源Ｋａｚａｌインヒビターアクロシン　オボムコイ ド 精漿アクロシン　インヒビター Ｃ，ストレプトミセス　ズブチリシン　インヒビターストレプトミセス　ズブチ リシン　インヒビター　ファミリーに属するセリン　プロテアーゼ　インヒビタ ーにはストレプトミセス　アルボグリセオルスから得られるインヒビター、及び プラスミノストレプチンゼ及びそれらと同起源のストレプトミセス　ズブチリシ ン　クラスのインヒビターの例を下表ＩＩＩに挙げる。

表ＩＩＩ セリン　プロテアーゼ　同起源ＳＳＩインヒビタープラスミン　ブラスミノスト レブチン トリブシン　プラスミノシトレプチン Ｄ、セルピン　ファミリー セルビン　ファミリーに属するセリン　プロテアーゼ　インヒビターにはプラス ミノーゲン活性化因子インヒビターＦＡＩ−１，ＦＡＩ−２及びＰＡＩ−３、Ｃ ｌエステラーゼ　インヒビター、アルファー２−アンチプラスミン、コントラブ シン、アルファー１−アンチトリプシン、アンチトロンビン　ＩＩＩ、プロテア ーゼ　ネクシン　１１アルファー１−アンチキモトリプシン、プロティンＣイン ヒビター、ヘパリン補因子　ＩＩ、及び成長ホルモン調節タンパク質が含まれる （Ｃａｒｒｅｌ。

セルビンによるセリン　プロテアーゼの阻害はＴｒａｖｉｓ、Ｊ、等。

１ｓｅｖｔｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８６）で調査されている。

セリン　プロテアーゼ、及びそれらと同起源のセルビン　インヒビターの例を下 表ＩＶに挙げる。

Ｂａｔ　ＰＡ　ＰＡＩ−１，ＦＡＩ−２，ＦＡＩ−３Ｃ１エステラーゼ　Ｃｌエ ステラーゼ　インヒビターカテプシン　Ｇ　アルファー１−アンチトリプシンア ルファー１−アンチキモトリプシン チマーゼ　アルファー１−アンチキモトリプシンキモトリプシン　アルファー１ −アンチキモトリプシンアルファー２−アンチプラスミン エラスターゼ　アルファー１−アンチトリプシンカリクレイン　Ｃｌエステラー ゼインヒビターアルファー１−アンチトリプシン プラスミン　アルファー２−アンチプラスミントロンビン　アンチトロンビン　 ＩＩＩヘパリン補因子　ＩＩ トリプシン一様プロテアーゼ　プロテアーゼ　ネクシン　■大豆から精製した大 豆トリプシン　インヒビター　ファミリーの唯一の例は配列が決定されている。

牛すい臓トリプシンとのその複合体が研究されている（Ｓｗｅ　ｅ　ｔ、　Ｒ， Ｍ、等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１３：４２１４−４２２８　（１９７４））。

Ｆ　ポテト　インヒビター　ファミリーポテト　インヒビター　ファミリーに属 するセリン　プロテアーゼインヒビターには、じゃがいも、大麦、及びひるから のインヒビターがｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、３０１−３３６頁（１９８６））、 セリンプロテアーゼ、及びそれらのポテト　インヒビターの例を下表Ｖに挙げる 。

表Ｖ セリンプロテアーゼ　ポテト　インヒビターキモトリプシン　大麦キモトリプシ ン　インヒビターズブチリシン　ノボ　大麦キモトリプシン　インヒビターズブ チリシン　力ルスベルグ　ひる阻害剤　ニグリンＧ、ボーマンーバーク　インヒ ビター ボーマン−バーク　インヒビター　ファミリーに属するセリン　プロテアーゼ　 インヒビターはマメからの相同タンパク質を含む（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ、Ｍ、等 、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、４９：５９３−６２６　（１９８０）’ Ｉ。セリン　プロテアーゼ、及びそれらのボーマン−バーク　インヒビターの例 を下表ＶＩに挙げる。

表Ｖｌ セリン　プロテアーゼ　ボーマン−バーク　インヒビターボーマンン　あおいま めインヒビター　ＩＶエラスターゼ　ガーデンビーンインヒビターキモトリプシ ン　アズキマメインヒビター　ＩＩＩ　Ｉ　１．セリン　プロテアーゼ−インヒ ビター複合体すべてのファミリーからのセリン　プロテアーゼ　インヒビターは それらと同起源のセリン　プロテアーゼと安定な１：１複合体を形成する。

これらの複合体の解離は非常におそい（数時間から数日）（Ｌａｓｋ。

Ａｃａｄ、Ｓｅ　ｉ、ＵＳＡ、８０　：　６８０４−６８０８　（１９８３）） 。

セルピンを除くすべてのセリン　プロテアーゼ　インヒビターの場合、解離生成 物は完全な形の、及び分裂したインヒビター分子の混合物である。他方、セリン 　プロテアーゼ−セルピン複合体は解離により分裂したインヒビター分子のみを 生ずるようなので、セルビンは他のセリンプロテアーゼ　インヒビターと多少異 なる機構を使用すると思われる。

トリプシン−ＢＰＴＩ、キモトリプシン−オボムコイド　インヒビター、キモト リプシン−ポテト　インヒビター、及びストレプトミセスズブチリシン−ストレ プトミセス　ズブチリシン　インヒビターを含む数種のセリン　プロテアーゼ− インヒビター複合体に関する構造データが得られる（Ｒｅａｄ、Ｒ，Ｊ、等、　 於：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　上旦ｈｉｂｉｔｏｒｓ、出版　Ｂａｒｒｅｔｔ、Ａ 、Ｊ、等、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、３０１−３３６頁（１９８ ６））、これらの構造を調べると、インヒビターの膨大な配列にもかかわらず、 各阻害剤とその同起源のセリン　プロテアーゼ間の特異的な相互作用において顕 著な類似性があることが明らかになる。本発明においてこの構造的類似性により 、結晶構造が得られない場合でもインヒビター及びそれと同起源のセリン　プロ テアーゼの間に起きるアミノ酸相互作用を予測することができるということを示 唆した。

上記の議論の通りインヒビターは活性中心を含み、それがセリン　プロテアーゼ の活性部位に対する拮抗基質となる。活性中心のＰ、−Ｐ、残基（例えばＦＡＩ −１の場合Ａ　Ｒ０３ｎ６Ｍ　ｅ　ｔ　３４７）間のペプチド結合への攻撃によ りセリン　プロテアーゼからの生成物の正常で迅速な解離が起こらず、おそらく プロテアーゼの活性部位のセリン及びインヒビターのＰ１残基の間の共有結合の 形成により安定なセリン　プロテアーゼこの機構は、ＦＡＩ−１などのインヒビ ターの活性中心がセリン　プロテアーゼの活性部位に緊密に、正確に適合しなけ ればならないこを示す。

しかしこれまでＦＡＩ−１、それと同起源のセリン　プロテアーゼ、を−ＰＡ、 又はｔ−ＰＡ／ＰＡＩ−１複合体についてのＸ−線結晶学的データはない。従っ てこのタンパク質の対の間の相互作用の正確な性質は未知である。他のセルビン 、又はセルビン−セリン　プロテアーゼ複合体の構造についての情報も同様に不 足している。

ＩＶ、セリン　プロテアーゼの利用 キモトリプシン　スーパーファミリーの特に重要なセリン　プロテアーゼはｔ− ＰＡである。セリンプロテアーゼのキモトリプシン　ファミリーのほとんどのメ ンバーは、チモーゲンの不活性な１本鎖前駆体として合成される。続いて特異的 ペプチド結合の分裂によりこれらの前駆体が完全に活性な２本鎖酵素に変換され る。対照的にｔ−ＰＡの１本鎖形態は有意な触媒活性を示し、そのプラスミノー ゲンからのプラスミン生成のｖｌ、８は２重鎖ｔ−ＰＡの場合よりわずか３−５ 倍低いだけである（Ｂｏｏｓｅ、Ｊ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２８ ：６３５−６４３　（１９８８）；及びＰｅｔｅｒｓｏｎ、Ｌ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ 。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、９５２：２４５−２５４（１９８ ８））。

ｔ−ＰＡは直接作用して血栓（血餅）を溶解するわけではないが、心筋梗塞、肺 塞栓症、及び重症の静脈血栓の治療に、冠動脈内又は静脈内投与によって現在使 用されている。ｔ−ＰＡはプラスミノーゲンのＡｒｇｓｓ。及びＶａ　ｌ、□の 間のペプチド結合の分裂を促進しくＲｏｂｂｉｎｓ、　Ｋ、　Ｃ等、Ｊ、Ｂｉｏ 　１．　Ｃｈｅｍ、、２４２　：　２３３３−２３４２　（１９６７））　、そ れにより不活性なチモーゲンを強力であるが非特異的なプロテアーゼ、プラスミ ンに変換し、それが血餅のフィブリンの網目を分解する（Ｂａｃｈｍａｎｎ、Ｆ 、等、Ｓｅｍ１ｎ、Ｔｈｒ。

２９−１５４１　（１９８６））。

ｔ−ＰＡは必ずしも全身的にフィブリノーゲンを枯渇させることなく局部的なフ ィブリン溶解現象を起こす。これはｔ−ＰＡがフィブリンに直接結合しフィブリ ン−ｔ−ＰＡ複合体を形成することができ、そのプラスミノーゲンに対する親和 力が約５００倍に増加するからである（Ｒａｎｂｙ、Ｍ、等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、ヱ旦このようにプラスミノーゲンも高濃度で存在す る（Ｗｉｍａｎ、Ｂ、等。

Ｎａｔｕｒｅ、２７２：５４９−５５０　（１９７８））冠動脈血栓に、静脈内 投与されたｔ−ＰＡが結合すると血栓の部位でプラスミンが有効に製造され、そ こで最高に働く。

現在、ｔ−ＰＡは最初にポーラスの形態で投与され、その後一定の注入を続ける 。３時間の標準の治療の間に投与される酵素の合計量は一般に約５０−１００ｍ ｇである。２つの理由でこのような大量を必要とすることが明白である：第１に 、肝細胞による循環からの急速なｔ−ＰＡのクリアランスの効果を補うため（Ｋ ｒａｕｓｅ、Ｊ、、Ｆｉｂｒｉｎｏ　Ｉｙｓ　ｉｓ、２　：１３３−１４２　（ １９８８））　、及び第２に、血漿及び血小板中に存在する比較的高１度のセリ ン　プロテアーゼ　インヒビターの影響を克服するため（Ｃａｒｒｅ　ｌ　１． 　Ｒ，Ｗ、等、於：２工ｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、　出版　Ｂ ａｒｒｅｔｔ、Ａ。

Ｊｌ等、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、頁４０３−４２０（１９８６ ））。

ｔ−ＰＡの主な生理学的インヒビターはセルビン、ＦＡＩ−１、約５０ｋｄの糖 タンパク質である（Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ、Ｈ，等、ＥＭＢＯＪ、、５　：２５３ ９−２５４４　（１９８６）：Ｇｉｎｓｂｅｒｇ、Ｄ。

等、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、ヱ旦：１６７３−１６８０　（１９８０） ；及びＣａｒｒｅ　ｌ　１．Ｒ，Ｗ　等、於：ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＩｎｈｉｂ ｉｔｏｒｓ、出版　Ｂａｒｒｅｔｔ、Ａ、Ｊ、等、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔ ｅｒｄａｍ、頁４０３−４２０　（１９８６））。

ＰＡＩ−１は心筋肉梗塞から生き残った人からの血漿のフィブリン溶解現象の能 力が減少している原因とされてきた（Ｈａｍｓ　ｔ　ｅ　ｎ、　Ａ、等。

Ｎ且異　旦旦工、主９Ｍ且旦９．旦１旦：　１５５７−１５６３（１９８５）） 。さらにＦＡＩ−１は急性ファーゼのりアクタントであり、心筋梗塞に伴いその 量が増加することにより、治療のためのｔ−ＰＡの注入後に血漿中に残った実質 的量のｔ−ＰＡのフィブリン溶解現象活性が増幅される（Ｌｕｃｏｒｅ、Ｃ，Ｌ 、等、Ｃ１ｒｃ、、ヱユ：６６０−６６９　（１９８８））。ＰＡＩ−１とｔ− ＰＡの結合の２次速度定数は非常に高＜（Ｈｅｋｍａｎ、Ｃ，等、Ａｒｃｈ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ九ヱ互０．λ旦２　：１９９−２１０　（１９８８）） 　、人の血漿によるｔ−ＰＡの最初の”急速相（ｆａｓｔ−ｐｈａｓｅ）”阻害 を説明しティる（Ｃｏ　１ｕｃｃ　ｉ、　Ｍ、等、Ｊ、Ｌａｂ、ＣＩ　ｉｎ、Ｍ ｅｄ、、１０８　：　５３−５９　（１９８６）’Ｉ。従ってインビボにおける ＦＡＩ−１によるｔ−ＰＡの急速な中和は、急性心筋梗塞の治療をした１０％か ら３５％の患者が冒される合併症である、血栓分解治療後の冠動脈レステノシス ニ帰することができる（Ｃｈｅｓｅｂｒｏ、Ｊ、Ｈ，等、Ｃ１ｒｃ、。

７６　：１４２−１５４　（１９８７））。

Ｃｌエステラーゼ　インヒビター、及びアルファー２−アンチプラスミンなどの 他のセルピンとｔ−ＰＡの結合定数はＦＡＩ−１の場合より低次数であるが（Ｒ ａｎｂｙ、Ｍ、等、Ｔｈｒｏｍ、Ｒｅｓ、、２ユニ１７５−１８３　（１９８２ ）；及びＨｅｋｍａｎ、Ｃ，等、Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、２旦２　：１９９−２１０　（１９８８） ）、それにもかかわらずこれらのセルピンは注入されたｔ−ＰＡと結合し、ｔ− ＰＡの有利な薬理学的性質を増幅することができる。

ｔ−ＰＡ及びＰＡＩ−１の他に多くのセリン　プロテアーゼ−セルピンの対が医 学的に非常に重要である。例えばｕ−ＰＡはｔ−ＰＡと同様に心筋梗塞の治療に 有用であり、ｔ−ＰＡと同様のセリン　プロテアーゼ　インヒビターによる阻害 を受ける。

傷における血餅形成の促進に局所的に使用されるセリン　プロテアーゼであるト ロンビンはプロ凝固剤である。それと同起源のセルピンである、アンチトロンビ ン　ＩＩＩは、トロンビン、及び因子ＩＸａ、Ｘａ。

Ｘｌａ及びＸ１ｌａを含む血液凝固カスケードに関与する多（のセリンプロテア ーゼを特異的に阻害する凝固防止剤である（Ｈｅｉｍｂｕｒｇｅｒ、Ｎ、等、於 ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏ工　工九旦　１ユ±Ｈ１等、Ｗａｉｔｅｒ　ｄｅ 　Ｇｒｕｙｔｅｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、頁１−２２　（１９７１）；Ｋｕｒａｃ ｈｉ、に、等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

ｕｄ、Ｂ、等、Ｓｅｍ１ｎ、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔ、、３５：２９５− ３０５　（１９７６））。アンチトロンビン　ＩＩＩは播種住血管内血液凝固の 治療に使用されてきた。トロンビンによりプロティンＣを活性化すると、活性化 プロティンＣが凝固因子Ｖａ及びＶＩ　Ｉ　Ｉａを不活性化し、それ自身はそれ と同起源のセルピン、プロティンＣインヒビターにより阻害されるので血液凝固 過程の自己制限が起こる。

子宮収縮を起こす、血管の浸透性を増す、及び血液凝固の内部経路を起こす機能 を持つカリクレインは、比較的重要なセルピンのひとつであるアルファー１−ア ンチトリプシンにより阻害を受ける。

アルファー１−アンチトリプシンはトリプシンと同様に白血球エラスターゼ、及 びカテプシンも阻害する（Ｈｅｉｍｂｕｒｇｅｒ、Ｎ、等。

ｔｅｒ　ｄｅ　Ｇｒｕｙｔｅｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、頁１−４７　（１９７１） ：Ｊａｎｏｆｆ、Ａ、、Δｍ、Ｒｅｖ、Ｒｅ５ｐ、Ｄｉｓ、。

Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、３６：４７３−４８１　（１９７３））。

アルファー１−アンチトリプシンの遺伝子欠失は直接気腫に関連しくＣａｒｒｅ ｌ　ｌ、Ｒ，Ｗ　等、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

ンチトリプンン置換が気腫の治療に使用されてきた（Ｍａｒｘ、Ｊ。

Ｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２４３：３１５−３１６　（１９８９））。

発明の要約 従って本発明の目的は、キモトリプシン　スーツ（−ファミリーの野生型セリン 　プロテアーゼ、特に野生型ｔ−ＰＡをタンパク質工学により改良し、必ずしも 池の有利な薬理学的性質を変えることなくその酵素有効性を増し、及び／又は必 要な投薬量を変えることである。

本発明のもうひとつの目的はキモトリプシン　スーツく一ファミリーの改良セリ ン　プロテアーゼをコードする遺伝子の提供である。

本発明のさらに別の目的は特にセルピン　ファミリーの野生型セリンプロテアー ゼ　インヒビター、特に野生型ＦＡＩ−１を変え、それらの阻害有効性を増し、 及び／又はその投薬必要量を変え、本発明の変異セリン　プロテアーゼを阻害す ることができるようにすることである。

本発明のさらに別の目的は改良セリン　プロテアーゼ　インヒビターをコードす る遺伝子を提供することである。

本発明のこれらの、及び他の目的は、同起源のインヒビターによる阻害に対して 抵抗性であるキモトリプシン　スーツ（−ファミリーのセリンプロテアーゼ　変 異株：及びそれをコードする遺伝子：ならびにセリン　プロテアーゼ　インヒビ ター抵抗性セリン　プロテアーゼを阻害するセリン　プロテアーゼ　インヒビタ ー　変異株：及びそれをコードする遺伝子により満たされ、これは下文に示す本 発明の詳細な説明により明らかとなるであろう。

図の簡単な説明 図１はキモトリプシン　スーパーファミリーの種々のセリン　プロテアーゼの配 列の比較を示す。配列は、保持されたアミノ酸の重複が示されるように並べた。

トリプシン上の数字はプロティン　データ　バンクのＰＤＢ３ｐｔｐ、ｅｎｔ　 エントリーで使用されている番号付による。

ｔ−ＰＡ上の数字は成熟ｔ−ＰＡ分子におけるアミノ酸による。

図２はセリン　プロテアーゼ　インヒビターのセルピン　ファミリーの種々のメ ンバーの配列の比較を示す。配列は保持されたアミノ酸の重複がわかるように並 べた。アルファー１−アンチトリプシン下の数字、及びＰＡＩ−１上の数字は成 熟分子におけるアミノ酸残基による。

図３は野生型ｔ−ＰＡ、及び本発明のｔ−ＰＡのセルピン−抵抗性変異株の変異 、及び発現に用いられたベクターの構築を図示したものである。

図４は野生型ｔ−ＰＡ及びｔ−ＰＡのセルピン−抵抗性変異株の活性の間接的色 素澱粉法における比較を示す。図４で■は野生型ｔ−ＰＡを示し、○はｔ　ＰＡ 　（Ｒ３０４−３）を示し、口はｔ　−Ｐ　Ａ　（Ｒ３１＋４→Ｅ）を示し、・ はｔ　−Ｐ　Ａ　（Ｄ　ｅ　１２ｅｅ−ｓｏ２）を示す。

図５は間接的色素澱粉法による野生型ｔ−ＰＡ１及びｔ−ＰＡのセルピン−抵抗 性変異株の活性に対するＦＡＩ−１の効果を示す。図５において、■は野生型ｔ −ＰＡを示し、○はｔ−ＰＡ　（Ｒｓ。４→Ｓ）を示し、口はｔ−ＰＡ　（Ｒ３ ０４−Ｅ）を示し、・はｔ　−Ｐ　Ａ　（Ｄ　ｅ　ｌ　２ｅａ−３ｏｚ）を示す 。

図６は間接的色素澱粉法による野生型ｔ−ＰＡ、及びｔ−ＰＡのセルビン−抵抗 性変異株の活性の比較を示す。図６において、口はｔ−ＰＡ（Ｈ２ｏ　７　＝　 Ｙ　）を示し、・は野生型ｔ−ＰＡを示し、＋はｔ−ＰＡ（Ｋ２９＾−Ｅ）を示 し、■はｌ−Ｅ重変異株ｔ−ＰＡ　（Ｋ、ｏａ、　Ｒ２９８，Ｒ２Ｇ＋１−Ｅ、 Ｅ、Ｅ）を示し、ムはｔ　−Ｐ　Ａ　（Ｒｕｅ→Ｅ）を示し、△はｔ−Ｐ　Ａ　 （Ｒｚ＊ｓ＝　Ｅ　）を示し、○はｔ−ＰＡ　（Ｐｓｏｉ→Ｇ）を示す。

図７は間接的色素澱粉法による野生型ｔ−ＰＡ、及びｔ　−Ｐ　Ａのセルビン− 抵抗性変異株の活性に対するＦＡＩ−１の効果を示す。図７において、口はｔ　 ＰＡ（Ｈ２ｓｙ→Ｙ）を示し、・は野生型ｔ−ＰＡを示し、＋はｔ−ＰＡ二に２ Ｇ＠→Ｅ）を示し、−はｔ−ＰＡ　（Ｋｚｓ＋ａ、　Ｒｚｓａ。

Ｒ１９→Ｅ、Ｅ、Ｅ）を示し、ムはｔ−ＰＡ　（Ｒｚｓｓ→Ｅ）を示し、△はｔ −ＰＡ　（Ｒ１８−Ｅ）を示し、Ｏはｔ−ＰＡ　（Ｐ３゜１→Ｇ）を示す。

図８は野生型Ｐ　Ａ　Ｉ−１、及び本発明のＦＡＩ−１の変異株の変異、及び発 現に使用したベクターの構築を図示したものである。

発明の詳細な説明 上記で議論した通り、本発明の上記の目的は、それらと同起源のインヒビターに よる阻害に対して抵抗性を持つキモトリプシン　スーツマーファミリーのセリン 　プロテアーゼ変異株：及びそれをコードする遺伝子を用いたひとつの具体化に より達成することができた。

本発明のもうひとつの具体化において、本発明のセリン　プロテアーゼ　インヒ ビター−抵抗性セリン　ブチアーゼを阻害するセリン　プロテアーゼ　インヒビ ター変異株；及びそれをコードする遺伝子により上記の目的を達成した。

さらに別の具体化において、本発明のセリン　プロテアーゼ　インヒビター変異 株はキモトリプシン　スーパーファミリーの野生型セリンプロテアーゼをも阻害 する。

エンドペプチダーゼのこのセリン　プロテア−・ゼ　サブ−サブクラスのメンバ ーはすべて相同タンパク質であり、共通の作用機構を有するので、本発明におい て使用するキモトリプシン　スーパーファミリーの特定のセリン　プロテアーゼ はここで重要ではない。そのようなキモトリプシン　スーパーファミリーのセリ ン　プロテアーゼの特別な例には上記で上げたセリン　プロテアーゼ、すなわち ｔ−ＰＡ、）リプシン、トリプシン一様プロテアーゼ、キモトリプシン、プラス ミン、エラスターゼ、ｕ−ＰＡ、アクロシン、活性化プロティンＣ，Ｃｌエステ ラーゼ、カテプシンＧ１チマーゼ、及びカリクレイン、トロンビン、及び因子Ｖ Ｉ　Ｉａ、ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩａ、ならびにＸ１１ａを含む血液凝固カスケード のプロテアーゼが含まれる。本発明で用いるキモトリブソンスーパーファミリー の好ましいセリン　プロテアーゼはｔ−ＰＡである。

キモトリプシン　スーパーファミリーの変異セリン　プロテアーゼが阻害に対し て抵抗性を示す特定のセリン　プロテアーゼ　インヒビターは本発明において重 要ではない。そのようなインヒビタターの例にはＢＰＴＩファミリー、Ｋａｚａ ｌファミリー、ＳＳ■ファミリー、セルビン　ファミリー、大豆トリプシン　イ ンヒビター（Ｋｕｎ　ｉ　ｔ　ｚ）ファミリー、ポテト　インヒビター　ファミ リー、及びボーマン−バーク　ファミリーのメンバーが含まれる。

キモトリプシン　スーパーファミリーの変異セリン　プロテアーゼが阻害に対し て抵抗性を示す特定のＢＰＴＩインヒビターは本発明において重要ではない。そ のようなりＰＴＩインヒビターの例にはＢＰＴＩ、ヘビ毒インヒビター、インタ ーアルファ　インヒビター、及びＡ４アミロイド前駆体Ａ４６９５が含まれる。

キモトリプシン　スーパーファミリーの変異セリン　プロテアーゼが阻害に対し て抵抗性を示す特定のＫａｚａｌインヒビターは本発明において重要ではない、 ３そのようなＫａｚａｌインヒビターの例にはすい臓分泌インヒビター、オボム コイド、及び精漿アクロシン　インヒビターが含まれる。

キモトリプシン　スーパーファミリーの変異セリン　プロテアーゼが阻害に対し て抵抗性を示す特定のセルビン　インヒビターは本発明において重要ではない。

そのようなセルビン　インヒビターの例にはＰＡＩ−１、ＦＡＩ−２，ＦＡＩ− ３，Ｃｌエステラーゼ　インヒビター（Ｃｌｉｒｌｈ）、プロティンＣインヒビ ター（ＰＣｉｎｈ）、ヘパリン　補因子　ＩＩ（ＨＣＩＩ）、アルファー２−ア ンチプラスミン（Ａ２ＡＰ）、アンチトロンビン　ＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、アル ファー１−アンチトリブシン（ＡＩＡＴ）、プロテアーゼ　ネクシン　Ｉ（Ｎｅ ｘ−１）、コントラブシン（Ｃｎｔｒｐｓ）、成長ホルモン調節タンパク質（Ｇ ＨＲＰ）　、及びアルファー１−アンチキモトリプシン（ＡＣｈｙｍ）が含まれ る。キモトリプシン　ファミリーのセリン　プロテアーゼが阻害に対して抵抗性 を示す好ましいセルビンはＦＡＩ−１である。

本発明のキモトリプシン　スーパーファミリーのセリン　プロテアーゼ　インヒ ビター−抵抗性セリン　ブロアテアーゼを阻害することができる変異セリン　プ ロテアーゼ　インヒビターをそれから誘導することができる特定のセリン　プロ テアーゼ　インヒビターは、本発明において重要ではない。そのようなセリン　 プロテアーゼ　インヒビターの例にはＢＰＴＩ、Ｋａｚａ　１、ＳＳＩ、Ｋｕｎ 　ｉ　ｔｚ１ポテト　インヒビター、ポーマン−バーク　インヒビター、及びセ ルビン　ファミリーのメンバーが含まれ、ＦＡＩ−１、ＦＡＩ−２、ＦＡＩ−３ 、Ｃｌエステラーゼ　インヒビター、プロティンＣインヒビター、ヘパリン　補 因子　ＩＩ、アルファー２−アンチプラスミン、アンチトロンビン　ＩＩＩ、ア ルファー１−アンチトリプシン、プロテアーゼ　ネクシン　Ｉ、コントラブシン 、成長ホルモン調節タンパク質、及びアルファー１−アンチキモトリプシンなど のセルビン　ファミリーのセリン　プロテアーゼインヒビターが好ましい。キモ トリプシン　スーパーファミリーのセリン　プロテアーゼ　インヒビター−抵抗 性セリン　プロテアーゼを阻害する好ましい変異セルビンはＦＡＩ−１である。

すべての周知のセリン　プロテアーゼ　インヒビターはその活性中心ループにお いて構造的に相同であり、それらと同起源のセリン　プロテアーゼと類似の相互 作用を行う（Ｒｅａｄ、　Ｒ，Ｊ、等、於：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂ ｉｔｏｒｓ、出版　Ｂａｒｒｅｔｔ、Ａ、Ｊ。

等、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、頁３０１−３３６　（１９８６） ）。セリン　プロテアーゼ、及びセリン　プロテアーゼ　インヒビターの間の構 造における対応はこれまでに研究されたことのない複合体のモデルの構築に利用 することができる。

ｔ−ＰＡｌ及び他のセリン　プロテアーゼの触媒ドメインの間の構造的相同性が 高いので（Ｂ　Ｉ　ｕｎｄｅ　Ｉ　ｌ、　Ｔ、等、Ｎａｔｕｒｅ、３２旦：　３ ４７−３５２　（１９８７））　、本発明においてトリプシン、及びＢＰＴＩ間 の複合体の周知の構造（Ｈｕｂｅｒ、Ｒ，等、Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｔｏｌ、、８９ニア３−１０１　（１９７４）：及びＢｏｄｅ、Ｗ、等。

於：Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｇｕｌ ａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙ。

ｒｋ、頁４３−７６　（１９７６））がｔ−ＰＡ及びＰＡＩ−１の間の相互作用 のモデルとなり得ると仮定した。主な認識部位のアミノ酸以外にＢＰＴＩと直接 接触するトリプシンのアミノ酸はポリペプチド鎖の２つの別の領域に位置する（ 残基３７−４１、及び２１０−２１３）（図１参照）。

アミノ酸残基ｚ＋４ｓＷＧｓｚ＋ｔの周囲の領域はキモトリプシン　スーパーフ ァミリーのすべてのメンバーの間に高度に保持されている。反対にアミノ酸残基 ｓ　ｓ　Ｎ　Ｓ　Ｇ　Ｙ　ＨＦ　４＋の周囲の領域は比較的変化し易（、インヒ ビターと相互作用を行う表面の部分を形成する。図１に示される通りこの領域の ｔ−ＰＡのアミノ酸配列は２つの大きな点でトリプシンのアミノ酸配列と異なる 。第１にトリプシンのＴｙ　ｒ　（Ｙ３ｓ）残基がｔ−ｐＡにおいてはＡｒｇＣ Ｒｓ。４）で置換されている。ｔ−ＰＡ及びＦＡＩ−１の開の相互作用がトリプ シン及びＢＰＴＩの間の相互作用を模倣しているという仮定に基づくモデリング はｔ−ＰＡのＲ、、、がＰＡＩ−１のＧｌｕ（Ｅ３ｓ。）残基と塩橋を形成する ことを示唆する。このＦＡＩ−１のＧｌｕ残基の位置は、トリプシンのＹ２Ｏと ファン　デル　ワールス結合を形成するＢＰＴＩの１１９に対応する（下表ＶＩ 　Ｉ）（Ｈｕｂｅ　ｒ。

Ｒ１等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、８９　ニア：３−１０１　（１９７４））； 及びＢｏｄｅ、Ｗ、等、於：Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｏｌ ｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　 Ｙｏｒｋ、頁４３−７６　（１９７６））　。従ってＦＡＩ−１のＥ　３５０は ｔ−ＰＡのＲ３０４とイオン対を形成すると思われる。

表Ｖｌｌ 第２にｔ−ＰＡは、ｔ−ＰＡ　（Ｒｓｏ４）及びＰＡＩ　１　（Ｅｓｓｏ）の間 の接点と思われる位置に隣接して位置する余分な７個のアミノ酸（ｕｓＫＨＲＲ ５Ｐ０３Ｇ！、図１を参照）を有する。これらの７個のアミノ酸の中の４個は正 に帯電しており、ＦＡＩ−１（ｓｓ。Ｅ　Ｅ　Ｉ　Ｉ　ＭＤ、、５）の相補的領 域と思われる領域は３個の負に帯電した残基を含む。本発明においては、これら の領域間の静電的相互作用がｔ−ＰＡ及びＰＡＩ−１の間の複合体の形成、及び 安定化に重要な役割を果たし得ると思われた。

逆にｔ−ＰＡがその基質である、同領域に負に帯電した残基を持たないプラスミ ノーゲン（ＰＬＧ）と相互作用を行う場合はこのような相互作用が起こり得ない （上記表ＶＩＩを参照）。

図１に示すようなキモトリプシン　スーパーファミリーの種々のセリン　プロテ アーゼの配列の比較は、キモトリプシン　スーパーファミリーの種々のセリン　 プロテアーゼの１種類又はそれ以上の変異を設計してそれらと同起源の野生型イ ンヒビターによる阻害に対して抵抗性とするための指針として使用することがで きる。ｔ−ＰＡと同様に図１に示すキモトリプシン　スーパーファミリーの他の セリン　プロテアーゼは、重要な結合残基（トリプシンのＹ３ｓ）　、及び結合 残基に隣接して位置する種々の大きさの挿入残基を含む点でトリプシンと異なる 。従って変異の候補の例には以下が含まれる： （１）他のセリン　プロテアーゼにおいてトリプシンのＴ　ｙ　ｒ　（Ｙ２Ｏ） （ＢＰＴＩの１ｉｅ（Ｉ＋９）と結合し、従って２個のタンパク質問の相互作用 において重要な役割を果たす残基）の位！に対応する位置を占めるアミノ酸残基 。例えばプラスミンにおいて、Ｍｅ　ｔ　（Ｍ）残基はトリプシンのＹ２Ｏに対 応する位置を占める。このＭｅｔ残基を電荷、又は大きさなどの性質の異なる他 のアミノ酸（例えばＧｌｕ（Ｅ））に変異させると、プラスミンのアンチプラス ミンによる不活性化に対する感受性がな（なるか、又は減少することが期待され るが、使用する特定の置換アミノ酸は本発明において重要でない。同様にトロン ビンのＧｉｎ（Ｑ）残基（トリプシンのＹ２Ｏに対応する位置を占める）を電荷 、又は大きさなどの性質が異なる別のアミノ酸（例えばＡｓｐ　（Ｄ）　）に変 異させると、トロンビンのアンチトロンビン　ＩＩＩによる不活性化に対する感 受性がなくなる、又は減少することが期待されるが、使用する特定の置換アミノ 酸は本発明において重要でない：及び（ｉｉ））リブシンには存在せず、分子の 表面の小さい挿入として活性部位の近辺に位置するキモトリプシン　スーパーフ ァミリーの他のセリン　プロテアーゼの残基（図１を参照）。例えばプラスミン は結合残基に隣接してｔ−ＰＡの。９８ＫＨＲＲ５ＰＧ３０２により占められて いる位置に対応する位置に、２個のアミノ酸（ＲＦ）の挿入を含む。これらの２ 個のアミノ酸のどちらか、又は両方の欠失、又は置換、あるいは少量の別のアミ ノ酸の挿入による変異により、必ずしもセリン　プロテアーゼの触媒部位に影響 することなくインヒビターとの相互作用を失わせる、又は減少させることが期待 される。もうひとつの例として、ｕ　−Ｐ　、Ａは結合残基に隣接してｔ−ＰＡ のｚｓｓＫＨＲＲ５ＰＧ、。２により占められている位置に対応する位置に６個 のアミノ酸（ＲＨＲＧＧＳ）の挿入を含む。これらの６個の残基の変異、又は欠 失は変異ｔ　−Ｐ　Ａ　（Ｄ　ｅ　ｌ　２１１８−８゜２）の場合に観察される 相互作用と類似の方法によるセリン　プロテアーゼ　インヒビターとの相互作用 が減少する、又はなくなることが期待される。

同様に、セリン　プロテアーゼ　インヒビターの活性中心内の領域は非常に変化 し易く、セリン　プロテアーゼと相互作用を行う表面の部分を形成する。図２に 示すようなセルピン　ファミリーの種々のセリンプロテアーゼ　インヒビターの 配列の比較は種々のセリン　プロテアーゼ　インヒビターにおいて、特にセリン 　プロテアーゼ　インヒビターのセルピン　ファミリーのメンバーに、本発明の キモトリプシン　スーパーファミリーのセリン　プロテアーゼ　インヒビター− 抵抗性セリンプロテアーゼを有効に阻害することができるような１種類かそれ以 上の変異を起こす設計の指針として利用することができる。ＦＡＩ−１と同様に 図２に示した他のセルピン　ファミリーのメンバーは、重要な結合アミノ酸残基 （ＦＡＩ−１のＥｓｓ。）における配列が異なり、結合残基に隣接した位置に種 々の大きさの挿入を含む（下表ＶＩＩＩを参照）。

３４４　Ｐｉ−ＰＬ’　３５８ ｈＰＡＩ−Ｉ　ＳＡ−ＲＭＡＰＥＥ−−−−−ＩＩＭＤＲＰＦｒＰＡＴ−Ｉ　Ｓ Ａ−ＲＭＡＰＴＥ−−−−−ＭＶＬＤＲ３ＦｈＰＡＩ−２ＴＧ−ＲＴＧＨＧＧ− −−ＰＱＦＶＡＤＨＰＦｈＡＩＡＴ　１１”ＭＳＩＰＰＥ−−−−−−ＶＫＦＮ ＫＰＦｂ　Ａ　ＩＡＴ　Ｉ　Ｐ　−ＭＳ　Ｉ　ＰＰＥ−−〜−−−ＶＫＦＮＫＰ Ｆｗｒ　Ａ　ＩＡＴ　ＶＰ−ＹＳＭＰＰ　Ｉ　−−−一一−ＬＲＦＤＨＰＦｒＧ ＨＲＰ　Ｌ　＝−−ＫＳＬＰＱＴＩ　−−ＰＬＬＮＦＮＲＰＦｈ　ＡＣｈｙｍ　 ＴＬ−ＬＳＡＬＶＥＴＲＴＩ−ＶＲＦＮＲＰＦｍ　Ｃｎｔｒｐｓ　ＧＩＲＫＡＩ 　ＬＰＡ−−−−−ＶＨＦＮＲＰＦｈＡＴＩｉＩ　ＡＧ−Ｒ８ＬＮＰＮ−−ＲＶ ＴＦＫＡＮＲＰＦｈ　ＨＣＩ　Ｉ　ＭＰ−ＬＳＴＱＶＲ−−−−−ＦＴＶＤＲＰ ＦｂＡ２ＡＰＳ−−Ｒ〜ｌ５ＬＳＳ−−−−〜ＦＳＶＮＲＰＦｈ　Ｃ１１ｎｈ　 ＡＡ−ＲＴＬＬＶ−−−−−−ＦＥＶＱＱＰＦｈ　ＰＣｉｎｈ　ＴＦ−Ｒ８ＡＲ ＬＮ−−３ＱＲＬＶＦＮＲＰＦｒ　Ｎｅｘ−Ｉ　Ａ−−Ｒ３ＳＰＰＷ−−−−− Ｆ　ＩＶＤＲＰＦ（ｈ＝ヒト：ｒ；ラット、ｂ−ひひ；およびｍ−マウス）従っ て変異の候補の例には以下が含まれる：（ｉ）他のセリン　プロテアーゼ　・イ ンヒビターにおいて、ＰＡＩ−１のＧｌｕ　（Ｅ３ｓｏ）　（ｔ　ＰＡのＡ　ｒ 　ｇ　（Ｒ８ｏａ）と結合し、従って２個のタンパク質の相互作用において重要 な役割を果たす残基）の位置に対応する位置（Ｐ４°）を占めるアミノ酸残基。

本発明においては、を−ｆ）ＡにおけるＲ５゜、−４Ｅ変異の構築によりこわれ た静電的相互作用を復活させるためニＦＡＩ−１（Ｅ３ｓｏ）のＧｌｕ残基をＡ ｒｇ（Ｒ）に変異させた。このセルビンにおける特異的な変異は、セリン　プロ テアーゼに導入され野生型セルビンによる阻害に対する抵抗性を与えた変異と相 補的であるように構築された。セルビンにおけるこの相補的Ｅ３５゜→Ｒ変異は セルビンに本発明のキモトリプシン　スーパーファミリーのセリン　プロテアー ゼ　インヒビター−抵抗性セリン　プロテアーゼを阻害する能力を与えるために 特別に選んだ：しかし使用した特定の置換アミノ酸は本発明に対して重要ではな い。例えばトリプシンのＹ３９に対応するプラスミンのＭｅｔ（Ｍ）残基（図１ 参照）を電荷又は大きさなどの性質の異なる別のアミノ酸（上記の例のようにＧ ｌｕ（Ｅ））に変え、変異プラスミンが野生型アルファー２−アンチプラスミン による阻害に対する感受性の減少を示した場合、アルファー２−アンチプラスミ ンのＰ４°　５ｅｒ（Ｓ）残基を、プラスミンにおいて代わったＧｌｕ残基と相 互作用のできる他のアミノ酸（例えばＡｒｇ（Ｒ））に変異させると、変異アル ファー２−アンチプラスミンによる不活性化に対する変異プラスミンの感受性が 復活することが期待される。同様にトロンビンの変異に関する上記の例のように トロンビンのＧｉｎ（Ｑ）残基Ａｓｐ（Ｄ）ｌ：：変えた場合、アンチトロンビ ニ／　ＩＩＩのＰ６’　Ａｒｇ　（Ｒ）残基をＧｌｕ（Ｅ）に変異させると変異 アンチトロンビン　ＩＩＩによる阻害に対する野生型インヒビター−抵抗性トロ ンビンの感受性が復活することが期待される： （ｉ　ｉ）同種のセリン　プロテアーゼとの相互作用表面を形成する、種々のフ ァミリーのセリン　プロテアーゼ　インヒビターの他のメンバーの活性中心内の 余分な残基。セリン　プロテアーゼ　インヒビターのセルビン　ファミリーに関 してこれらの残基を上記の表ＶＩＩＩに示す。

例えばアルファー２−アンチプラスミンは活性中心のＦＡＩ−１の５４ａＡ　Ｐ 　Ｅ　Ｅ　Ｉ　Ｉ　ＭＤ３ｓｓニ対応する位ｔ、：配列ｓ　Ｌ　Ｓ　Ｓ　Ｆ　Ｓ 　ＶＮヲ含ム。

これらの８個のアミノ酸のいずれかの置換により、又は少量の別のアミノ酸の挿 入により変異を起こすと、これらの置換又は挿入が電荷、太きさ、あるいは嫌水 性などの性質において、セリン　プロテアーゼに導入されて最初に野生型セルビ ンに対する抵抗性を与えたアミノ酸残基と相補的であればセリン　プロテアーゼ との相互作用を復活することが期待される。

他の多くのセリン　プロテアーゼと異なり、ｔ　−Ｐ　Ａは不活性前駆体又はチ モーゲンとして細胞から分泌されない。１重鎖ｔ−ＰＡと対照的に、キモトリプ シノーゲンなどの真のチモーゲンは完全に蛋白質分解活性がなく、その同起源イ ンヒビターに対する反応性が減少している。これは、基質−結合ポケットが正し く形成されていないか（キモトリブシ７−３７４　（１９７９））ためである。

構造が既知のすべてのチモーゲンにおいて、Ａ　Ｓ　９１ｇ　４の側鎖はＨｉｓ 、。と決定的な極性相互作用を形成する（トリプシン番号系）。このため側鎖が 埋没し、Ｇｌ）’ｕ、及び５ｅｒｅ、５の主鎖アミド基による正しいオキシアニ オンホールの形成が妨害される。活性化するとＡ　ｓ　ｐ　（（Ｈ及びＨｉｓ４ ゜の側鎖間の相互作用がＡｓｐ残基のＣＯＯ−基及びＩｌｅｌｇの活性化分裂に より形成された遊離のＮ８２基の間の強い極性結合に置換される。新規の静電的 結合が最初のＨｉｓ＜。−ＡＳＩ）＋ｓｎ結合を破壊し、その結果機能性オキシ アニオンホールが形成される。Ａｓｐ−１１ｅ極性結合はｔ−ＰＡの２本鎖形態 にほとんど確実に存在する。しかし酵素の１本鎖形態では、Ａｓｐ残基の帯電し た側鎖は、明らかに決定的なＨｉｓ残基（ｔ−ＰＡにおける位置３０５）がＰｈ ｅに置換されているために、触媒的−活性配置をとるとは限らない。Ｐ　ｈ　ｅ 　ｓｏｓがＨｉｓにより置換される特定部位の突然変異誘発、従って“チモーゲ ン一様”性質を示すｔ−ＰＡを生産する突然変異が本発明において仮定された。

“チモーゲン一様”性質を有するｔ−ＰＡを生産する突然変異のための他の候補 には、位置３０５における他の塩基性アミノ酸の使用が含まれる。

本文で用いる“チモーゲン一様”性質は、酵素の１本鎖形態により基質及び同起 源インヒビターの両方に対する反応性が減少するが、酵素の２本鎖形態により正 常な反応性を示すことを意味する。この仮定に基づき、変異酵素ｔ　−ＰＡ　（ Ｆ、。５→Ｈ）を本発明で構築し、この酵素の１本鎖形態とその同起源インヒビ ター、ＦＡＩ−１との相互作用を下記の実施例１で調べた。

さらに本発明で、ｔ　−Ｐ　Ａ　（Ｆ　３０５−Ｈ）のＡｌａｚｓ２の５ｅｒ（ Ｓ）への突然変異がこの変異酵素の“チモーゲン一様″性質を増大させることを 仮定する。ｔ−ＰＡのＡ　１　ａ　２１２はキモトリプシノーゲン及びトリプシ ノーゲンにおけるＳ３２の相同染色体（ｈｏｍｏｌｏｇ）である。これらの２種 類のチモーゲンにおいてＳ３２はＨ４０と水素結合を形成する。

従って本発明の場合、Ｓ３□及びＨ４０の間の相互作用が、Ａｓｐ、、４との最 適交互作用のための立体配置においてＨ４０の側鎖を安定化すると思われる。

本発明の変異セリン　プロテアーゼ及び変異セリン　プロテアーゼインヒビター は、点変異株、欠失変異株、付加変異株又は３種類の変異の組み合わせを含む変 異株であることができる。

本発明の変異セリン　プロテアーゼ、及び変異セリン　プロテアーゼインヒビタ ーは、例えばオリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発などの周知の方法により製 造することができる（Ｚｏ　Ｉ　１　ｅ　ｒ、　Ｍ、等。

（１９８５）；及びＫｕｎｋｅｌ、Ｔ、等、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉ ｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　＆　ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８７））ｏしかしセリン　プロテアーゼ、又はセリン　プ ロテアーゼ　インヒビターに変異を起こす正確な方法は本発明にとって重要では ない。

本発明の変異セリン　プロテアーゼは、Ｌｏｔｔｅｎｂｅｒｇ、Ｒ。

等、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、８０：３４１−３６１　（１９８１）に記載 の方法などの周知のアッセイを用いて所望の性質、すなわちセリン　プロテアー ゼ活性、及び同起源のインヒビターによる阻害に対する抵抗性を持つセリン　プ ロテアーゼに関してスクリーニングを行うことができる。

本発明の変異セリン　プロテアーゼ　インヒビターは、Ｌｏｔｔｅｎｂｅｒｇ、 Ｒ，等、Ｍｅ　ｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏ　１．．８０　：　３４１−３６１（１９８ １）；Ｈｏｌｍｅｓ、Ｗ、Ｅ、等、Ｂｉ　ｌｃｈｅｍ、、２６：５１３３−５１ ４０　（１９８７）；及びＨｅｋｍａｎ、Ｃ，Ｍ、等。

Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ　１ｐｈｙｓ、、２６２：１９９−２１０　（ １９８８）に記載の方法などの周知のアッセイを用いて所望の性質、すなわち本 発明のセリン　プロテアーゼ　インヒビター−抵抗性セリンプロテアーゼに対す るセリン　プロテアーゼ　インヒビター活性を有するセリン　プロテアーゼ　イ ンヒビターに関してスクリーニングを行うことができる。

本文に記載する研究は、セリン　プロテアーゼ　インヒビターを突然変異誘発に より修正し、キモトリプシン　スーパーファミリーのセリンプロテアーゼ、及び それと同起源のインヒビターの間の相互作用を減少させる、又はなくすことが可 能であることを初めて示すものである。

これにより変異セリン　プロテアーゼは同起源のインヒビターの存在下で野生型 の酵素より酵素活性が多く残り、残留活性の量はそれと同起源のインヒビターと の相互作用が阻害される程度に依存している。そのような変異セリン　プロテア ーゼの投与は多種類の臨床的、及び商業的用途において有益であると思われる。

例えば活性化プロティンＣの変異型は、血液の凝固を阻害するのが有利である場 合有用であると思われ、本文の実施例１に記載のｔ−ＰＡの変異型が、フィブリ ン溶解現象を延長する必要がある場合に血栓性の異常のある患者の循環における ｔ−ＰＡの有効寿命を延ばすのに有用であると思われるのとちょうど同じである 。

本文に記載した研究は又、セリン　プロテアーゼ　インヒビターを突然変異誘発 により修正し、セリン　プロテアーゼ　インヒビターの構造を適切に変化させる ことにより、キモトリプシン　スーパーファミリーのセリン　プロテアーゼ　イ ンヒビター−抵抗性変異セリン　プロテアーゼ、及びそれと同起源のセリン　プ ロテアーゼ　インヒビター間の相互作用を機能的に復活させることが可能である ことを初めて示すものである。これにより同起源の野生型セリン　プロテアーゼ 　インヒビターが存在する場合より急速に変異セリン　プロテアーゼを不活性化 することができ、阻害の速度は変異セリン　プロテアーゼとの相互作用が復活し た程度に依存する。このような変異セリン　プロテアーゼ　インヒビターの投与 は、多種の臨床的及び商業的用途においてセリン　プロテアーゼ　インヒビター −抵抗性セリン　プロテアーゼの活性を制限するのに有益であると思われる。例 えばプロティンＣインヒビターの変異型は、活性化プロティンＣの変異型の存在 下で血液の凝固を促進するのが有利であるような場合に有用であると思われる。

同様にＦＡＩ−１の変異型は、侵入的な方法が必要な場合に、血栓性異常の治療 をした患者の循環においてセリン　プロテアーゼ　インヒビター−抵抗性ｔ−Ｐ Ａ。

例えばｔ　ＰＡ　（Ｒ３ｏ４＝Ｅ）の有効寿命を短縮するのに有用であると思わ れる。従ってこのような変異セリン　プロテアーゼ　インヒビターはセリン　プ ロテアーゼ　インヒビター−抵抗性セリン　プロテアーゼの解毒薬として使用す ることができる。

１本鎖形態のｔ−ＰＡの酵素活性はおそらく、薬剤を与えられている多（の患者 の場合の循環フィブリノ−ケンの存在量の３０−５０％の減少（Ｃｏｌｌｅｎ、 　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｃ１ｒｃ、　、　７３：５１１−５１７　（１９８６） ；及びＲａｏ、　Ａ、　Ｋ、ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Δｍ、旦立±１、Ｃａｒｄｉｏｌ 、、１１：１−１１　（１９８８））、及びおそらく非常に少数で起こる出血性 合併症の一因である。従って本発明において、１本鎖形態でその触媒活性が非常 に低下しているｔ−ＰＡの変異株を形成することにより、これらの問題を軽減す る可能性を探査する。さらにこれらのｔ−ＰＡの変異株は、１本鎖形態で同起源 インヒビターに対して反応性の低下を示すことが本発明で示された。しかし本発 明の場合それらの変異株は血栓のフィブリン網目に付着すると、患者自身のｔ− ＰＡにより局部的に生成されるプラスミンにより切断され、完全な触媒活性を示 すと予言される。

臨床的用途において投与するべき本発明の変異セリン　プロテアーゼの量は使用 する特定の変異セリン　プロテアーゼ、所望するセリンプロテアーゼの治療効果 、及び性別、年令、体重、ならびにプロテアーゼを投与する患者の生理学的条件 などの因子に依存するであろう。変異セリン　プロテアーゼの使用量は日常的実 験により決定することができる。

臨床的用途において投与するべき本発明の変異セリン　プロテアーゼインヒビタ ーの量は使用する特定の変異セリン　プロテアーゼ　インヒビター、所望するセ リン　プロテアーゼ　インヒビターの治療効果、及び性別、年令、体重、ならび にセリン　プロテアーゼ　インヒビターを投与する患者の生理学的条件などの因 子に依存するであろう。変異セリン　プロテアーゼ　インヒビターの使用量は日 常的実験により決定することができる。

本発明の変異ｔ−ＰＡは適したインビトロ、及びインビボ　モデルにおける試験 、ならびに臨床試験により決定した通りに投与しなければならない。必要な投薬 量は野生型ｔ−ＰＡの場合の必要量の１０−１０００分の１となるであろうと思 われる。　゛本発明の変異ＰＡＩ−１も適したインビトロ、及びインビボ　モデ ルにおける試験、ならびに臨床試験により決定した通りに投与しなければならな い。必要な投薬量は変異ｔ−ＰＡの場合に必要な量と大体同じであろうと思われ る。

本発明の変異セリン　プロテアーゼは文献により周知のいずれの製薬上許容でき るキャリヤー、又は希釈剤、例えば生理食塩溶液と共にでも投与することができ る（Ｌｕｃｏｒｅ、Ｃ，Ｌ、等、Ｃ４ｒｃ６，７７：６６０−６６９　（１９８ ８）；及びＣｈｅｓｅｂｒｏ、Ｊ、Ｈ，等。

Ｃｉｒ馴　、７６　：１４２−１５４　（１９８７））。

本発明の変異セリン　プロテアーゼ　インヒビターは文献により周知のいずれの 製薬上許容できるキャリヤー、又は希釈剤、例えば生理食塩溶液と共にでも投与 することができる（Ｌｕｃｏｒｅ、Ｃ，Ｌ、等。

Ｃ１ｒｃ、、７７：６６０−６６９　（１９８８）；及びＣｈｅｓｅｂｒｏ、Ｊ 、　Ｈ，等、Ｃ１ｒｅ、、ヱ６　：　１４２−１５４　（１，９８７））。

本発明の変異セリン　プロテアーゼの特定の投与形態はその特定の用途に依存す る。そのような投与形態の例には、静脈内又は腹腔内注射、冠動脈的注入、局所 的適用、及びエーロゾル吸入が含まれる。

本発明の変異セリン　プロテアーゼ　インヒビターの特定の投与形態はその特定 の用途に依存する。そのような投与形態の例には、静脈内又は腹腔内注射、冠動 脈的注入、局所的適用、及びエーロゾル吸入が含まれる。

以下の実施例は説明のみを目的としており、本発明の範囲をどのようにも制限す るものではない。

実施例１ ｔ−ＰＡ変異株 本実施例に記載する方法はセリン　プロテアーゼとしてｔ−ＰＡを使用し、同起 源のセリン　プロテアーゼ　インヒビターとしてＰＡＩ−１を使用する場合を対 象とするが、上記のようなキモトリプシン　スーパーファミリーの他のセリン　 プロテアーゼ、及び上記のようなそれと同起源のインヒビターも本発明の精神と 範囲から逸脱することなく本文に記載の方法により容易に使用することができる 。

ｔ−ＰＡの残基Ａ　ｒ　ｇ　３６４及び（２１１６ＫＨＲＲ８ＰＧ３０２）がＰ ＡＩ−１と相互作用をするという仮定を試験するため、オリゴヌクレオチド−媒 介突然変異誘発を用いて下表ＩＸに示すｔ−ＰＡの３種類の変異型を製造した。

表ＩＸ 野生型ｔ−ＰＡ　ＦＡＫＨＲＲ３ＰＧＥＲＦＬＣｔ−ＰＡ　（Ａｒｇ３ｏ４−８ ）　ＦＡＫＨＲＲ８ＰＧＥＳＦＬＣｔ−ＰＡ（Ａｒｇ３ｏ４−Ｅ）　ＦＡＫＨＲ Ｒ３ＰＧＥＥＦＬＣｔ−ＰＡ　（Ｄｅ　Ｌｅｇ−ｓｏｗ）　ＦＡ、、、、、、、 ＥＲＦＬＣ変異ｔ　−Ｐ　Ａ　（Ｄ　ｅ　ｌ　２Ｑ６−３゜２）は上記で議論し た、トリプシンには存在しない７個のアミノ酸挿入を含まず、同起源のセリン　 プロテアーゼ　インヒビター、ＦＡＩ−１と相互作用する部分のｔ−ＰＡ配列を 完全に除去して構築した。変異株ｔ　−Ｐ　Ａ　（Ｒ３゜４→Ｓ）及びｔ−ＰＡ （Ｒ３０４−Ｅ）はＡｒｇ３０４がそれぞれＳｅｔ及びＧｌｕに置換されており 、正に帯電したＡｒｇ残基を選択的に変え、それと同起源のセリンプロテアーゼ 　インヒビター、ＦＡＩ−１との相互作用を除去するように選んだ。Ｒ２Ｏ３に 対して、電荷対相互作用の欠落のために同起源のセリン　プロテアーゼ　インヒ ビターに対する感受性の減少したｔ　−ＰＡを与える種々の他の置換を行うこと ができる。例えばループ中の正に帯電した残基（残基２９６−３０２）を負に帯 電した、又は中性のアミノ酸に変える点変異は、ｔ−ＰＡ及びＰＡＩ−１の間の 相互作用を妨げる、減少させる、又は不安定化すると予測される。Ｒ３゜１をＧ ｌｙ（Ｇ）以外の他のアミノ酸で置換することにより類似の結果を得ることがで きる。

さらに残基３０４と３０５の間、又は残基２９６と３０５の間のどこかに、ＰＡ Ｎ−１の残基と全く相互作用しない約１−６個のアミノ酸の系列を挿入するよう に挿入変異を行うことができる。異なる置換、及び／又は置換、挿入及び欠失の 組み合わせは、ｔ−ＰＡとＦＡＩ−１の相互作用に異なる程度で影響し、それに よって特定の用途、又は臨床的条件に適する性質を持った種々のｔ−ＰＡを製造 することができるであろう。

Ｂ、ｔ−ＰＡのオリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発ｔ−ＰＡのオリゴヌクレ オチド−媒介突然変異誘発は基本的にＺｏｌＢｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕ ｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　＆　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉ ｅｎｃｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７）による修正により行った。

第１に、ヒトのｔ−ＰＡ全全長コードするｃＤＮＡをクローニングした複写を含 むプラスミドｐＳＶＴ７　（Ｒヒ）／１−ＰＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、等 、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、、３：４５９−４８１（１９８６）に従って用 意した。ｐＳＶＴ７　（Ｒ１→／ｌ−Ｐ、ＡはｐＳＶＴ７の誘導体である（Ｂ　 ｉ　ｒ　ｄ、Ｐ、　Ｍ、等、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ旦±、、１旦５：２９０５−２ ９１４　（１９８７））（図３を参照）。

ｐＳＶＴ７はｐＫＣ３から構築した。ｐＫＣ３は、ＡｖａＩ部位からＥｃｏＲＩ 部位までのｐＢＲ３２２−誘導配列（これは複製の源、及びβ−ラクタマーゼ遺 伝子を含む）がｐＵＣ８（Ｍｅｓｓ　ｉｎｇ、Ｊ、。

Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１旦↓：２０−７８　（１９８３））の配旦８、 旦：６０６−６１４　（１９８４））の誘導体である。さらに独特のＨｉｎｄｌ １１部位にポリ１月カーが挿入されており、５Ｖ４ＱオリジンのＰｖｕ１１部位 上流がＣｌａｌ部位に変換されている。ベクターｐＳＶＴ７はバクテリオファー ジ　Ｔ７　ＲＮＡ　ポリメラーゼ特異性プロモーターを含む２０個の塩基対フラ グメント（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｐｉｓｃａｔ ａｗａｙ、ＮＪ）をｐＫＣ３の独特の５ｔｕ１部位に挿入することによって得た 。この５ｔｉＩ部位は５Ｖ４Ｑの初期領域から誘導した配列内のＳＶ４０配列の ヌクレオチド５１９ｏの位置、初期転写の開始点から下流約３０塩基対にある（ Ｔｏｏｚｅ、Ｊ、等、ＤＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、頁８１３（１９８１）） 。

その後Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントを用いてくぼ んだ３′　−末端を満たすことにより単一のＥｃｏＲＩ部位をｐＳＶＴ７から除 去した。得られた発現ベクターをｐＳＶＴ７　（Ｒ１→と称する（図３を参照） 。

次に野生型ｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡをプラスミドｐＬ６１１がら切り出し くＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、等、Ｍｏ上、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、。

３：４５９−４８１（１９８６）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　ｅ、 Ｂｏ　ｓ　ｔ　ｏｎ、　ＭＡから提供）　、ｐＳＶＴ７　（Ｒヒ）に挿入した。

ｐＬ６１１はｔ−ＰＡのＡＵＧ開始コドンからすぐ上流にＮｃｏｌ及びＢａｍＨ Ｉの切断部位を導入する合成オリゴヌクレオチドを含む。

ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡの３゛非１１１Ｎ配列内の、ＴＧＡ終結コドンの下流約２８ ０塩基対の位置にＢａＸＩ部位がある。プラスミド　ｐＬ６１Ｊから切り出した ｔ−ＰＡ　ＤＮＡの約１９６５塩基対Ｎｅｏｌ−Ｂａｌｌフラグメン［・にＸｂ ａＩリンカ−を加えた。このＢｃｏＩ−Ｂａｌｌフラグメントは完全なｔ〜ＰＡ タンパク質をコードする配列を含むが、（ｉ）ｔ−ＰＡ　ｍＲＮＡの末端３°　 −非翻訳領域、及び（ｉｉ）ｔ−ＰＡ　ｍＲＮＡの５゛−非翻訳領域全体、すな わちＳｃｉ１部位及びＡＴＧ開始コドンの間の配列に対応する配列が欠けている （Ｐｅｎｎｉｃａ、Ｄ、等、Ｎａｔｕｒｅ、３０１　：２１４−２２１　（１９ ８３））。

各末端にＸｂａ　１部位を持つｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡのフラグメント（Ｓａｍｂｒ ｏｏｋ、Ｊ、等、　Ｍｏ　１．　Ｂ　ｉｏ　１．〜ｆｅｄ、、３　：４５９−４ ８１　（１９８６））をｐＳＶＴ７／１−ＰＡの製造に使用した（図３を参照） ６得られたプラスミドからＸｂａＩを用いた消化、０．８％（Ｗ／Ｖ）アガロー スゲル電気泳動による精製により約１９７０塩基対ＤＮＡフラグメントを切り出 し、ｔ−ＰＡのＮ−末端をコードする配列がバクテリオファージ　Ｔ７及びＳＶ ４０初期プロモーターのすぐ下流におかれるようにしてプラスミドｐＳＶＴ７　 （ＲＩ−）のＸｂａ１部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＳＶＴ７　（Ｒ Ｉ−）／１−ＰＡと称した（図３を参照）。

その後ｐＳＶＴ７　（ＲＩ→、／１−ＰＡをＥｃｏＲＩを用いて完全に消化した 。ｔ−ＰＡの４７２塩基対フラグメント（アミノ酸２０６−３６４を含む領域を コードするヌクレオチド８４２−１．３１４）を１．２％（Ｗ／Ｖ）アガロース ケル電気泳動により精製した。このフラグメントを、前辺てＥｃｏＲＩで消化し 、牛腸アルカリホスファターゼを用いて脱ホスホリル化したバクテリオファージ Ｍ１３ベクターＭｉ３ｍｐ１８　（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、（：　等、Ｇ ｅｎｅ、３３：１０３−１１９（１，９８５）の復製型Ｄ　Ｎ　Ａと連結した（ 図３を参照）。

他に特定しない場合は本文に記載するこれらの、及び他の標準的組み替えＤＮＡ 法は（ｉ）Ｍａｎｔａｔｉｓ、Ｔ、等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｇ：Δ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ±、第１版。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　（１９８２）、及び（ｉ　ｉ）Ｍｅｔ ｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１５２巻、出版Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓ、等。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７）に記載の要領で 行った。

連結ＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ株ＴＧ−１（Ｇｉｂｓｏｎ、Ｔ、、Ｔｈｅｓｉｓ、Ｕ ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ　（１９８４ ））にトランスフェクションした。組み替えバクテリオファージにより形成され た白いプラークを採取し、適切な４７２塩基対ＥｃｏＲＩフラグメントの存在を 制限マツピング、サザンハイブリッド形成、及びＤＮＡ配列決定により確認した 。

Ｋｕｎｋｅｌ、Ｔ、等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ、８２ ：４８８−４９２　（１９８５）；及びＫｕｎｋｅ　１．Ｔ、。

Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　、　１５４：３６７−３８２　（１９８７）の 記載に従い、５゛　−ホスホリル化合成突然変異誘発プライマーを用いて４７２ 塩基対ＥｃｏＲＩフラグメントにおける変異を導入した。ｔ−ｐＡ変異株の構築 に使用した３種類の突然変異誘発プライマーの配列は以ｔ　Ｐ　Ａ　（Ｄ　ｅ　 ｌ　ｚｓｓ−３゜２）　ＧＣＣＡＴＣＴＴＴＧＣＣＧＡＧＣＧＧＴＴＣＣＴＧ上 記原案はｄｕｔ−、ｕｎｇ−Ｔある旦、ｃｏｌｉの株、すなわち株ＣＪ２３６に おいて製造したＤＮＡ鋳型を使用する（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｔ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ 　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２：４８８−４９２（１９８５）：及びＫ ｕｎｋｅ　ｌ、Ｔ、、〜１ｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ。

±、、１亙４　：　３６７−３８２　（１９８７）　）。ＤＮＡ鋳型はチミンの 位置に少量のウラシル残基を含む。

突然変異誘発プライマーをインビトロで伸ばした後、部分的充填環状ＤＮＡをｄ ａｔ”、ｕｎｇ”′？：′ある旦、ｃｏｌｉの株、すなわちＴＧ−１にトランス フェクトした（Ｇｅｂｓｏｎ、Ｔ、、Ｔｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏ ｆ　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８４））。鋳型らせん中のウラ シル残基を酵素ウラシル　Ｎ−グリコシラーゼの作用によりインビボで除去した 。これにより鋳型らせんに致死損害が加えられ、変異株を迅速に、及び有効に回 収することができる。

特に、ウラシル含有鋳型ＤＮＡを上に示した５゛ホスホリル化突然変異誘発プラ イマーにアニールした。プライマーの伸長はＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼの フレノウフラグメントを用いて１５℃にて１２〜１６時間行った。新規に合成し たらせんをバクテリオファージＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて突然変異誘発プラ イマーの５゛末端に連結し、不適正を持つ環を形成した。得られたＤ　Ｎ　Ａを 用いてＥ、ｃｏｌｉ株ＴＧ−１（Ｇｉｂｓｏｎ、Ｔ、Ｔｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙ　ｏｆＣａｍｂｒ　ｉｄｇｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ　（１９８４））のト ランスフェクションを行い、多くのプラークから一重鎖ＤＮＡを製造した。これ らのＤＮＡの配列を完全に決定した。その後立証された変異株の複製型２重鎖Ｄ ＮＡを、ＥｃｏＲＩによる消化、及び１．２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルによる 電気泳動により単離した。下記に詳細に記載する通り、変異を含むこれらのフラ グメントを使用して問題のｔ−ＰＡ変異株をコードするｔ−ＰＡ　ｅＤＮＡのバ ージョンを構築した。

Ｃ９変異株ｔ−ＰＡのための発現ベクターの構築プラスミド１）ＳＶＴ７　（Ｒ Ｉ−）／１−ＰＡｉ：おけるｔ−ＰＡの！異株は以下のようにして構築した： ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡの中心４７２塩基対ＥｃｏＲｒフラグメントをＥｃｏＲＩに よる消化、及び１．２％（Ｗ／　Ｖ　）アガロースゲルによる電気泳動によりｐ ＳＶＴ７　（Ｒ１っ／１−ＰＡから除去した。その後残ったプラスミドＤＮＡの 直線状フラグメントをオリゴヌクレオチド−媒介−突然変異誘発によって作った ４７２塩基対フラグメントのバージョンに連結した（図３を参照）。得られたプ ラスミドをｐＳＶＴ７（ＲＩ　−）　／　ｔ　ＰＡ　（Ｒｚｏ＜＝Ｓ）　、ｐＳ ＶＴ７　（ＲＩ→／ｌ　−ＰＡ（Ｒ３ａ４→Ｅ）、及びｐＳＶＴ７　（Ｒ１→／ 　ｔ　−Ｐ　Ａ　（Ｄ　ｅ　ｌ　ｔｅａ−ｓｏ２）ｓｓ、０ｘｆｏｒｄ、頁１０ ９−１３５　（１９８５））を上記の変異株プラスミドを用いて形質転換し、得 られた株をそれぞれｐＳＶＴ７（ＲＩ）／ｌ　ＰＡ（Ｒ３１１４−３）　［ＤＨ １］　：ｐＳＶＴ７　（Ｒ１−）／ｌ　ＰＡ　（Ｒ３０４−Ｅ）［ＤＨ−１］　 ：及びｐＳＶＴ７　（Ｒ１−）／ｌ−ＰＡ（ＤｅｌＢｓ−ｓｏｚ）ＣＤＩ４　１ Ｆと称した。正しいフラグメントの存在は適した放射標識突然変異誘発オリゴヌ クレオチドとのハイブリツド形成により確認し、フラグメントの配向は適した突 然変異誘発オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた制限マツピング、及び ＤＮＡ配列決定により確認した。

ｐＳＶＴ７　（Ｒ１→／１−ＰＡ（Ｒｓ。４→Ｓ）［ＤＨ−１１、ｐＳＶＴ７　 （ＲＩ　−）　／　ｔ−ＰＡ　（Ｒ３゜４→Ｅ）［ＤＨ−１１、及びｐＳＶＴ７ 　（Ｒ１−）　／　ｔ−ＰＡ　（Ｄｅ　１ｚｅｓ−ｓｏｚ）　［：ＤＨ−１］は Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎにそれぞ れＡＴＣＣ番号６７８９４．６７８９６及び６７８９５として供託した。

Ｄ、ＣＯ３細胞のトランスフェクション次にＬＯＯｍｍの皿当たり約１０６個の ＣｏＳ細胞（Ｇ　Ｉ　ｕ　ｚｍａ　ｎ。

Ｙ９等、Ｃｅ　Ｉ　］、２３　：１７５−１８２　（１９８１））をアルカリリ シス法により精製した１、０μｇのＮＡを用いてトランスフェクトした（Ｍａｎ 　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ、　Ｔ、等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Δ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第１版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　（１９８２））、特に、吸引により培地をＣｏＳ細胞から除去し、単 層を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，１５）（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏ、）を含む５．Ｏｍｌのダルベラコノ培地（ＧＩＢＣＯｌＩｎｃ、）で１ 回洗浄した。洗浄液を除去した後、３００、ｃｚｇのＤＥＡＥ−デキストラン（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ、）を含む１．５ｍｌの洗浄液中の単層にプラスミ ドＤＮＡを加えた。その後単層を６．０％のＣＯ２を含む湿潤大気中、３７℃に て１時間インキュベート（，７′こ。この間２０分毎に単層をおだやかに撹拌し た。単層をプラスミドＤＮＡに１時間暴露した後、Ｊ、ＯｒｎＭのＩ−ＩＥＰＥ Ｓ　（ｐＨ７゜１５）を含むダルベツコの培地で１回洗浄し、１０％（Ｖ／Ｖ） の牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ，Ｉｎｃ、）を含む】Ｏｍｌのダルベツコの培地、及 び１００μＭ（７）りｏｏキンｃｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）を加 えた。その後単層を上記に従い３７℃にて４時間インキュベー・トし、牛胎児血 清を含まず１０ｍＭのＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，１，５）を含むダルベツコの培地 ５．Ｏｍｌで２回洗浄した。その後１０％（Ｖ／Ｖ）の牛胎児血清を含む１０ｍ １のダルベツコの培地を加え、単層を上記に従い３７℃にて１２時間インキュベ ートした。そして単層を牛胎児血清を含まないそれぞれ５．Ｏｍｌのダルベツコ の培地で３回洗浄し、同培地中、３７℃にてさらに３０−６０時間インキュベー トした。ＤＥＡＥ−デキストランを含む溶液からプラスミドＤＮＡを省略する以 外は同様の方法で偽−トランスフェクション細胞を処理した。インキュベーショ ン期間の最後に上澄み培地を細胞から集め下記に従い分析した。

固相ラジオイムノアッセイは基本的にインフルエンザＨＡに関して記載されてい る方法に従い（Ｇｅ　ｔ　ｈ　ｉ　ｎｇ、　Ｍ、Ｊ、等、Ｎａｔｕｒｅ。

２９３　：　６２０−６２５　（１９８１））　、精製ヒトｔ−ＰＡに対するう さぎの抗血清のＩｇＧフラクションを用いて行い、ＣＯ８細胞中の製造された野 生型、及び変異ｔ−ＰＡの量を定量した。この方法によって決定したｔ−ＰＡの 濃度は０．５−１．０μｇ／ｍｌであった。

Ｆ、野生型、及び変異ｔ−ＰＡの酵素によるアッセイＣＯ８細胞中に製造された 野生型、及び変異株ｔ−ＰＡの活性を決定するため、間接的色素澱粉法を行った 。このアッセイにおいては、遊離のｐ−ニトロアニリンが色素澱粉法の基質、ス ペクトルザイムＰＬ（Ｈ−Ｄ−ノルロイシルヘキサヒドロチロシル−リシン−ｐ −ニトロアニリド　ニ酢酸塩ＸＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、Ｉ ｎｃ、）から、プラスミノーゲン上のｔ−ＰＡの作用により生成されたプラスミ ンの作用により放出される。遊離のｐ−ニトロアニリンの放出は分光光度分析に よりＯＤ　４゜ｓｎｍにて測定した。

特に、１．５０−２００　ｐ　ｇの試験するべきｔ−ＰＡ、０．４ｍＭのスペク トルザイムＰＬ、Ｏ，ｌｕＭのＬｙｓ−プラスミノーゲン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　 Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、Ｉｎｃ、）、及び０．５−２５μｇ／ｍｌの可溶性フ ィブリン（Ｄｅｓ−Ａ−フィブリノーゲン）（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏ ｓｔｉｃａ、Ｉｎｃ、）を、５０ｍＭのトリス−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　、０ ．１ＭのＮａＣ１１１，ＯｍＭのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ及び０．０１％（ｖ　／　ｖ　 ）のツイーン８０から成る緩衝液中に含む反応混合物を９６ウエルの平底ミクロ タイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｉｎｃ、）中で３７℃にてインキュベートし 、２時間の間１５又は３０分間隔でＢｉｏ−ｔｅｃミクロプレートリーダーを用 いてＯＤ　４゜５ｎｍを測定した。偽−トランスフェクション細胞からの緩衝液 、又は適切に希釈した試料のアリコートを標準として分析し、得られたＯＤ値（ ＜０．０１単位）を対応する試験値から差し引いた。デルタＯＤ値を３０分と６ ０分の間の光学濃度の変化として、すなわち反応の遅滞期、及び１末鎖ｔ−ＰＡ から２本鎖の形態への完全な変換による変化として測定した。標準的アッセイに 使用する条件下で（０，１μＭのＬｙｓ−プラスミノーゲン及び２５μｇ／ｍｌ のＤｅｓ−Ａ−フィブリノーゲン）、可溶性フィブリンはｔ−ＦＡの活性を２０ −４０倍賦活した。結果を図４に示す。

図４に示す通り、上記の本発明のｔ−ＰＡ変異株の３種類全部が酵素として活性 であり、その活性の特異性は野生型の活性と大きく異なるものではないことが見 い出された。さらに上記の本発明のｔ−ＰＡ変異株は野生型ｔ−ＰＡと類似の方 法でＤｅｓ−Ａ−フィブリノーゲンの濃度の変化に応答することが見い出された 。Ｄｅｓ−Ａ−フィブリノーゲンによる最適刺激は２０−４０倍であった。これ はＤｅｓ−Ａ−フィブリノーゲン製造を用いた野生型ｔ−ＰＡについての他の観 察と一致する（Ｋａ　ｒ　ｌ　ａｎ、　Ｂ、等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ ｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｎ、、１４２　：１４７−１５４　（１９８７））　。それソレノ場合、 Ｄｅｓ−Ａ−フィブリノーゲンの濃度が約１．０μｇ／ｍｌの場合に半一最適刺 激が起きた。

次に飽和濃度のＤｅｓ−Ａ−フィブリノーゲン（２５μｇ／ｍｌ）、及び種々の 濃度（０，０２−０，１６μＭ）の基質、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンの存在下に おける種々の形態の酵素のアッセイにより、野生型及び変異株ｔ−ＰＡのに、、 及びＫｃｌｌ＋値を決定した。結果を下表Ｘに示す。

表Ｘ 酵素　Ｋ６（８Ｍ）　Ｋｅ、ｔ　（ｓ−’）野生型ｔ　−ＰＡ　Ｏ，０２４０， ２２ｔ−ＰＡ　（Ｒｓ。４→Ｓ）　０．０１９　０．２３ｔ−ＰＡ（Ｒ３゜４→ Ｅ）　領０２３　領２２ｔＰ　Ａ　（Ｄ　ｅ　Ｉ　ｚｏｏ−ｓｏｚ）　領０２９ 　０．１７上記の表に示す通り、異なるｔ−ＰＡ変異株に関するに、及びに、□ 値９　（１９８２）により報告されている野生型ｔ−ＰＡに関する値とも類似し ている。

図４及び表Ｘに示されたデータは（ｉ）ｔ−ＰＡのアミノ酸２９６−３０２の欠 失、及び（ｉ　１）３０４位のＡｒｇのＳｅｒ又はＧｌｕへの置換が、プラスミ ノーゲンを活性化する、及び可溶性フィブリン　フラグメントにより賦活される ｔ−ＰＡの能力にほとんど影響しないことを示している。

アミノ酸２９６−３０２の欠失、及びＡｒｇ３０４の置換がｔ−ＰＡとＰＡＮ− １の相互作用に影響するかどうかを調べるために、それぞれ２５０ｐｇ　（３， ８フ工ントモル）の野生型、及び変異株ｔ−ＰＡを〇−４８０フェントモル（ｆ ｅｍｔｏｍｏｌｅｓ）の部分的に精製した組み替えＰＡＩ−１と共に２０分間予 備的にインキュベートした。その後上記の間接的色素澱粉法により残留酵素活性 を測定した。部分的精製組み替えＰＡＩ−１は下記の実施例２の記載にしたがっ て得た。結果を図５に示す。

図５に示す通り、３種類の本発明のｔ−ＰＡ変異株のすべてが野生型ｔ−ＰＡと 全（異なる挙動を示した。すなわち野生型ｔ−ＰＡ　（■）がＰＡＩ−１により 完全に阻害される条件下で（２４フ工ントモルのＰＡＩ−ＩＬ欠失変異株ｔ−Ｐ Ａ　（Ｄｅ　１２ｓｓ−ｓｏｗ）　（）はその活性の約９５％を保持していた。

高濃度のＰＡＮ−１（４８０フ工ントモルのＰＡ　ｌ−１）が存在する場合に初 めて変異株ｔ　−ＰＡ　（Ｄ　ｅ　Ｉ　ｚｅａ−ｓｏ２）（・）の酵素活性がか なりの減少を示した。２種類の置換変異株、すなわちｔ−ＰＡ　（Ｒ３１＋４→ Ｓ）　（○）及びｔ−ＰＡ　（Ｒ３６４−Ｅ）　（ロ）も程度は異なるがＦＡＩ −１による阻害に対して抵抗性であった。又、図５に示す通り、Ａｒｇの代わり にＳｅｒ又はＧｉｕを含む２種類の置換変異株がその酵素活性の半一最適阻害に 要するＦＡＩ−１の量は野生型ｔ−ＰＡのそれぞれ４及び２５倍であった。

上記データは、アミノ酸２９６−３０２及び３０４がｔ−ＰＡの酵素機能に含ま れておらず、同種のセリン　プロテアーゼ　インヒビター、ＦＡＩ−１と酵素の 相互作用に重要な役割を果たすことを示している。

モデルとしてトリプシンの構造を用いて、これらのアミノ酸がセリンプロテアー ゼの活性部位の近辺、及び触媒性３回回転軸がらある程度能れた位置にあること が予想される。したがってｔ−ＰＡとＦＡＩ−１の接触面積はｔ−ＰＡとその本 当の基質であるプラスミノーゲンノ相互作用より広い。

変異株ｔ−ＰＡ（Ｄｅｌ□６１．。２）もヒトの血漿中に存在するセリンプロテ アーゼ　インヒビターの複合混合物に対して抵抗性を示すかどうかを調べるため に、上記の原案において部分的精製組み替えＦＡＩ−１をヒトの血漿の１　：　 １００希釈液に置換した。この条件下で野生型ｔ−ＰＡの活性の約７０％が阻害 されたがｔ　−Ｐ　Ａ　（Ｄ　ｅ　ｌ　ｚｓａ−ｓｏ２）の活性は影響を受けな かった。

さらに野生型ｔ−ＰＡ及びｔ　−Ｐ　Ａ　（Ｄ　ｅ　ｌ　２ｅ卜５ｏ２）を、希 釈しないヒトの血漿と共にインキュベートし、混合物を酸性化してｐＨ５，０と し、１２．ＯＯＯｘｇで５分間遠心した。透明になった上澄みを希釈し、残留ｔ −ＰＡ活性に関して分析すると変異ｔ　−Ｐ　Ａ（Ｄ　ｅ　１２９６−３゜２） の場合９０％であり、野生型ｔ、−ＰＡの場合２０％以下であった。上記の結果 は変異ｔ　ＰＡ（Ｄｅｌｔ９ｓ−ｓｏ２）がヒトの血漿中に存在するセリン　プ ロテアーゼ　インヒビターの複合混合物に対して抵抗性であることを示しており 、したがって治療薬として野生型ｔ−ＰＡより優れていると思われる。

Ｇ、別のｔ−ＰＡ変異株 上節Ｆに示したデータはｔ−ＰＡの残基２９６−３０２及び３０４が酵素、及び 同起源のインヒビター、ＦＡＩ−１の相互作用に重要な役割を果たすが、基質、 Ｌｙｓ−プラスミノーゲンとの相互作用には影響しないことを示す。トリプシン の周知の構造に基づいたｔ−ＰＡの触媒ドメインのモデリングは、残基２９６− ３０２が酵素の活性部位の端において表面ループを形成することを示唆している 。このループは正の高い電荷を帯びている。節Ａ及びＦで議論した通り、この領 域の効果がＦＡＩ−１との静電的結合の形成に媒介されているという考えが本発 明において提出された。この仮定の試験のために、ループ内の帯電した残基のそ れぞれを変え、酵素のＦＡＩ−１との相互作用に与えるその変異の効果を下記に 従って評価した。ループ中の正に帯電した残基がセリン　プロテアーゼ　インヒ ビター、ＦＡＩ−１の相補的領域と塩橋を形成するならば、負に帯電した残基で 置換すると、これらの２個のタンパク質の会合の際に同一に帯電した残基が並列 するためｔ−ＰＡとＰＡＩ−１の相互作用は崩壊すると予想される。

特に、節Ｂに記載した要領で特定部位の突然変異誘発を行い、Ｌｙｓｔａｇ、　 Ａ　ｒ　Ｒ２，、、又はＡｒｇＨ，がＧｌｕ残基により置換されたｔ−ｐＡ変異 株をコードするｃＤＮＡの構築に使用した。これらの３個の残基のすべてがＧｌ ｕに置換された、ｔ−ＰＡの３重変異株をコードするＣＤＮＡも構築した。さら に２個のｃＤＮＡを製造した；ひとっはＨｉ　ｓ２９フがＴｙｒ残基により置換 されたｔ−ＰＡ変異株をコードし、他方はＰｒｏ３゜１がＧｌｙにより置換され た酵素をコードする。

これらのｔ−ＰＡ変異株の構築に使用した６種類の突然変異誘発プライマーの配 列は以下である： ｔ−ＰＡ（Ｌｓｇ→Ｅ）　＋５’−＾ＴＣＴＴＴＧＣＣＧＡＧＣＡＣＡＧＧＡ− ３’ｔ−ＰＡ（■２，７→Ｙ）　＋　５’　−ＴＴＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＡＧＧ ＡＧＧＴ−３’ｔ−ＰＡ（Ｒ２１１８→Ｅ）　：　５’　−ＧＣＣＡＡＧＣＡＣ ＧＡＧＡＧＧＴＣＧＣＣＣ−３’ｔ−ＰＡ（Ｒｚｔｓ−Ｅ）　：５’−＾ＡＧＣ ＡＣＡＧＧＧＡＧＴＣＧＣＣＣＧＧ−３’ｔ−ＰＡ（Ｐｓ　ａ　＋　−Ｇ）　： ５’　−ＡＧＧＡＧＧＴＣＧＧＧＣＧＧＡＧＡＧＣＧ−３’ｔ−ＰＫ（Ｋ２ｅａ ・Ｒ２９８・Ｒ２ＩＱ−変異酵素ｔ−ＰＡ　（Ｋｚｏａ→Ｅ）、ｔ−ＰＡ　（Ｈ ｚ＊ｔ→Ｙ）、ｔ−ＰＡ−（ＲＨ８→Ｅ）及びｔ−ＰＡ　（Ｒ３゜１→Ｇ）を上 記の要領で遷移発現ベクターｐＳＶＴ（ＲＩ−）に連結した。

変異酵素ｔ−ＰＡ　（Ｋ２９ｇ、　Ｒｚｔｓ−Ｒｚ＊ｓ＝Ｅ、　Ｅ、　Ｅ）　、 及びｔ−Ｐ　Ａ　（Ｒ２ｓｅ→Ｅ）をコードするｃＤＮＡを遷移発現ベクターｐ ＳＴＥに連結した。ｐｓＴＥはｐｓＶＴ７（７）誘導体であり、ｐｓＴＶ７の３ ５０ｂｐ　Ｃ１ａｌ−ＨｉｎｄＩＩＩプロモーター／オリジンフラグメントをＳ Ｖ４０　ｃｓ１０８５のプロモーター／オリジン領域からの４３．８ｂｐ　Ｈｐ ａＬＬ−ＨｉｎｄＪＩＩフラグメントで置換することに旦：１２９−１４２　（ １９８０））。

得うレタプライマーをｐＳＶＴ７　（ＲＩ→／　ｔ　−Ｐ　Ａ（Ｋｚｓｓ−Ｅ） 。

ｐＳＶＴ７　（ＲＩ−）／１−ＰＡ　（Ｈｕｙ＝Ｙ）：　ｐＳＶＴ７　（ＲＩ− ）／１−ＰＡ（Ｒｕｓ→Ｅ）；　ｐＳＴＥ７　（ＲＩ−）／ｌ　ＰＡ　（Ｒｚｓ ｉ→Ｅ）：　ｐＳＶＴ７　（ＲＩ）／１−ＰＡ　（Ｒｓｏ＋−Ｇ）；及びｐＳＴ Ｅ７（ＲＩ）／１−ＰＡ　（Ｋｕｇ、Ｒｔｅｓ、Ｒ２１Ｈ→Ｅ、Ｅ、Ｅ）と称し た。

Ｅ、ｃｏｌｉ株ＤＨ−１（Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ、等、ＤＮＡＣ１゜ｎｉｎｇ、１ 巻、Ｇｌｏｖｅｒ、Ｄ、Ｍ、、１．Ｒ，Ｌ、Ｐｒｅｓｓ。

０ｘｆｏｒｄ、頁１０９−１３５　（１９８５））を上記の変異プラスミドを用 いて形質転換し、得られた株をそれぞれｐＳＶＴ７（ＲＩつ／１−ＰＡ　（Ｋｘ ｓｓ→Ｅ）　［ＤＨ−１コ　、ｐＳＶＴ７　（Ｒ１−）／１−ＰＡ（Ｈ２ｏ　ｙ →Ｙ）［ＤＨ−１１；ｐＳＶＴ７（ＲＩつ／　ｔ　ＰＡ　（Ｒｚｓｓ→Ｅ）［Ｄ Ｈ−１］　；ｐＳＴＥ７　（ＲＩ〜）　／　ｔ　ＰＡ　（Ｒ２１Ｈ→Ｅ）［ＤＨ １］　；　ｐＳＶＴ７　（ＲＩ−）／１−ＰＡ　（Ｒ３０１−Ｇ）［ＤＨ−１］ 　：及びｐＳＴＥ７　（ＲＩＱ　／１−ＰＡ　（Ｋｚｓｇ、Ｒｔｅｓ、Ｒｚ＋ｎ →Ｅ。

Ｅ、Ｅ）［ＤＨ−１］と称した。正しいフラグメントの存在を、適した放射活性 突然変異誘発オリゴヌクレオチドへのハイブリッド形成により確認し、フラグメ ントの配向を、適した突然変異誘発オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用 した制限マツピング、及びＤＮＡ配列決定により確認した。

ｐＳＶＴ７　（ＲＩ−）／１−ＰＡ　（Ｒｕｇ−Ｅ）［ＤＨ１］　：　ｐＳＴＥ ７（ＲＩ→／　ｔ　ＰＡ　（Ｒｚ＊＊→Ｅ）［ＤＨ−１］　；及びｐＳＴＥ７（ ＲＩ−）／１−ＰＡ　（Ｋ２！１６・　Ｒ２９８・　Ｒ２９９″Ｅ・　Ｅ、Ｅ） ［ＤＨ−１］をＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉ。

ｎにてそれぞれＡＴＣＣ番号６８１５７．６８１５４及び６８１５３として供託 した。

Ｈ，ｔ　−ＰＡのチモーゲン一様変異味上記の通り本発明において、Ｐ　ｈ　ｅ 　ｓｏｓがＨｉｓにより置換されたｔ−ＰＡの変異株はチモーゲン一様性質を示 すことが仮定された。この仮定に基づき上記Ｂ節に記載した要領で特定部位の突 然変異誘発を行い、Ｐｈｅ、。ＳがＨｉｓ残基により置換されたｔ−ＰＡ変異株 をコードするｃＤＮＡの構築に用いた。このｔ−ＰＡ−ｙｅ株の構築に用いた突 然変異誘発プライマーの配列は： ｔ−ＰＡ（Ｒ３゜、→■）：５°ＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧ− ３゜であった。

変異酵素ｔ−ＰＡ　ＣＦｓ。、→Ｈ）をコードするｃＤＮＡを上記Ｃ及びＧ節に 記載の要領で発現ベクトルｐＳＴＥに連結した。得られたプラスミドをｐＳＴＥ ／１−ＰＡ　（Ｆｓｏｓ−Ｈ）と称する。

旦、ｃｏｌｉ株ＤＨ−１（Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ、等、ＤＮＡＣ１゜ｎｉｎｇ、１ 巻、Ｇｌｏｖｅｒ、Ｄ、Ｍ、、１．Ｒ，Ｌ、Ｐｒｅｓｓ。

０ｘｆｏｒｄ、頁１０９−１３５　（１９８５））を上記の変異プラスミドを用 いて形質転換し、得られた株をｐ　Ｓ　Ｔ　Ｅ　／　ｔ　−Ｐ　Ａ　（Ｆ　ｓ。

、→Ｈ）［ＤＨ−１１と称した。正しいプラスミドの存在を、制限マツピング及 び適した放射性標識突然変異誘発オリゴヌクレオチドへのハイブリッド形成によ り確認した。４７２塩基対ＥｃｏＲＩフラグメントの配向を制限マツピングによ り証明した。

ｐＳＴＥ／ｌ　ＰＡ　（Ｒ３゜、→Ｈ）［ＤＨ−１コを、１９９０年９月２７日 にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｔｏｎにＡＴ ＣＣ番号６８４２８として供託した。

■、変異ｔ−ＰＡの速度論的特性化 上記Ｇ及びＨ節に記載したプラスミドＤＮＡはその後上記の要領でＣＯ８細胞の トランスフェクションに使用した。得られた条件下の培地の希釈液（典型的には １：３００Ｌ及び免疫精製酵素の両方を用いて上記の要領でアッセイを行った。

次に飽和濃度のＤｅｓ−Ａ−フィブリノーゲン（２５μｇ／ｍ＋）及び種々の濃 度（０，０２−０，１６μＭ）の基質、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンの存在下にお ける種々の形態の酵素のアッセイにより野生型、及び変異株ｔ−ＰＡのに、及び ＫＨａｌ値を決定した。結果を下表ＸＩに示す。

野生型ｔ−ＰＡ　Ｏ，０２４０，２２ ｔ　−ＰＡ　（Ｋ２９６→Ｅ）　０．　０２６　０．　２２ｔ　−ＰＡ　（Ｒ２ ９７−Ｙ）　０．　０１７　０．　１４ｔ　−Ｐ　Ａ　（Ｒ２１Ｈ→Ｅ）　０． 　０２７　０．　２４ｔ　ＰＡ　（Ｒｚｏ＊＝Ｅ）　０．０３３　領２６ｔＰＡ （Ｒ３゜１→Ｇ）　０．　０２７　０．　２４ｔ−ＰＡ　（Ｒ３０５−Ｈ）　０ ．　０１８　０．　２１上記の表ＸＩの示す通り、上記で議論したいずれの変異 もｔ−ＰＡとその基質との相互作用を変化させなかった。

同様に図６に示したデータは、変異がｔ−ＰＡとその正のエフェクターであるＤ ｅｓ−、Ａ−フィブリノーゲンとの相互作用を変えなかったことを示している。

逆に図７に示したデータは野生型ｔ−ＰＡと変異１−ＰＡのい（つかの挙動にお ける明確な差を示している。特に３種類の変異株ｔ−ＰＡ、すなわちｔ　ＰＡ　 （Ｒｕａ＝Ｅ）、ｔ−ＰＡ　（Ｒｚ＊ｏ→Ｅ）及びｔ−ＰＡ　（Ｋ２Ｈ，Ｒｕｇ 、Ｒ２９Ｑ→Ｅ、　Ｅ、　Ｅ）の場合、セルビン、ＦＡＩ−１と正常に相互作用 する能力が実質的に変化した。特に三重変異株の挙動は顕著である；２００倍モ ル以上過剰のＦＡＩ−１と共に予備的インキュベートを行った後でさえ活性の損 失を示さない。これらの発見はｔ−ＰＡの表面ループ、すなわち残基３９６−３ ０２が特異的に同起源のインヒビターＦＡＩ−１と相互作用するという提案を支 持しており、この相互作用にＡ　ｒ　ｇ　２９８及びＡｒｇ２ｓｅが含まれるこ とを示唆している。これらの観察はｔ−ＰＡ、及びＰＡＩ−１の間の特異的相互 作用に静電的結合が含まれるという仮定を満足する。これらの相互作用に含まれ るｔ−ＰＡの残基はＡ　ｒ　ｇｚｅｓ、　Ａ　ｆ”　ｇ２ｅｅ及びＡｒｇ３゜４ である。

１本鎖形態のｔ−ＰＡ　（Ｆｓ。、→Ｈ）はその同起源セルビンによる阻害に対 して抵抗性を示す。この酵素は、野生型ｔ−ＰＡより約８倍遅（ＦＡＩ−１と反 応する。

“チモーゲン一様”性質を有するこのｔ−ＰＡ変異株は、従ってセルビン抵抗性 酵素のもうひとつの例である。本発明の他の変異酵素と対照的に１本鎖形態のｔ −ＰＡ　（Ｆｓ。、→Ｈ）のみがセルピンによる阻害に対して抵抗性を示すと思 われる。

実施例２ ＦＡＩ−１変異株 本実施例に記載する方法はセリン　プロテアーゼとしてｔ−ＰＡを、及びセリン 　プロテアーゼ　インヒビターとしてＰＡＩ−１を使用する場合を対象としてい るが、上記のようなキモトリプシン　スーパーファミリーの他のセリン　プロテ アーゼ、及び上記のような他のセリン　プロテアーゼ　インヒビターを、本発明 の精神及び範囲から逸脱することなく本文の方法を用いて容易に使用することが できる。

ＦＡＩ−１をコードする３、２ｋｂ及び２．２ｋｂ　ｍＲＮＡから誘導した２種 類のｃＤＮＡクローン（Ｎｙ、　Ｔ、等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、旦９±、見旦Δ、８３：６７７６−６７８０　（１９８６）；及びＰ ａｎｎｅｋｏｅｋ、Ｈ，等。ＥＭＢＯＪ、、５：２５３９−２５４４　（１９８ ６）　）を使用して哺乳類発現ベクター中に全長のｃＤＮＡを構築した。第１の クローン、ラムダＰＡＩ−１は、ヒトの胎盤性ＣＤＮＡライブラリからスクリー ニングにより得たｃＤＮＡの先端を切り取ったバージョンであり（Ｄｒ、Ｃａｒ ｏｌ　Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ　Ｃｅｎｔ、ｅｒ、Ｄｗｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅ ｎｔｅｒ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸより提供）ＦＡＩ−１の以下の８アミノ酸配列に 対応する合成オリゴヌクレオチドを有する（ＡＶＤＱＬＴＲＬ）（ＮＬ　Ｔ、等 。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ、８３：６７７６−６７８０（ １９８６）＋及びＰａｎｎｅｋｏｅｋ、Ｈ，等、ＥＭＢＯＪ、。

５　：　２５３９−２５４４　（１９８６））。ＥｃｏＲＩを用いた消化により このクローンから放出されるＤＮＡの７ラグメントはＮ　ｙ　、、　Ｔ、等。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３：６７７６−６７８０　 （１９８６）に報告されているＰＡＮ−１配列のヌクレオチド１４７−２０１３ に対応した。このフラグメントをプラスミドベクターｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｅ ｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，等、Ｇｅｎｅ、３３：１０３−１１９　（１９８５）） にサブクローニングし、組み替えプラスミドｐＰＡＩ−１を得た。このプラスミ ドからの挿入を、バクテリオファージ　ラムダ　ｇｉｌｌに構築したヒトの内皮 細胞ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングに使用した（Ｈｕｙｎｈ、Ｔ、等、Ｄ ＮＡ　Ｃ１゜ｎｉｎｇ、１巻、出版　Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ、　Ｍ、　、１．　Ｒ ，Ｌ、Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ、頁４９−８８　（１９８５）’）。このよう にして単離したｃ　ＤＮＡ　クローンのひとつ、すなわちラムダ　ＰＡＩ−１− １１Ａは、５′末端に２個の余分なヌクレオチドが存在する以外既報の（Ｐａｎ ｎｅｋｏｅｋ、Ｈ，等、ＥＭＢＯＪ、、旦：　２５３９−２５４４　（１９８６ ））ＰＡＩ−１ｃＤＮＡと同一配列の挿入を持つ。このクローンの５′末端、ヌ クレオチド５２−１４７９から誘導したＥｃｏＲＩ−８ｇ１１１フラグメントを ＤＰＡＩ−１の３’ＢｇｌｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントに融合させ、ｐＰＡＩ −１−ＲＢＲを得た。

哺乳類細胞におけるＦＡＩ−１の発現に使用したＳＶ４０ベクターは以下の要領 で構築した。ｐＰＡＩ−１−ＲＢＲから放出されたＥｃｏＲＩフラグメントの末 端にＥ、ｃｏｌｔ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントを満たし、合成 Ｘｂａｌ　リンカ−に連結し、プラスミドｐＳＶ／１−ＰＡａ中のｔ−ＰＡフラ グメントの代わりに挿入し、ｐＳＶＬ−ＦＡＩ−１を得た（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 Ｊ、等、性旦±、旦土ｏ　１．Ｍｅｄ、、３　：　４５９−４８１　（１９８６ ））、５ＶＬ−ＰＡＩ−１の株を製造し、Ｄｏｙｌｅ、Ｃ，等、Ｊ、Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、。

以前にＰａｎｎｅｋｏｅｋ、Ｈ等、ＥＭＢＯＪ、、５：２５３９−２５４４　（ １９８６）及びＧｉｎｓｂｅｒｇ、Ｄ、等、Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、７８：１６７３−１６８０　（１９８６）に記載されたＰＡｌｌ 　クローンはｐＰＡＩ−１−ＲＢＲによりコードされる配列と同一配列のＦＡＩ −１タンパク質をコードし、ＳＶ、、−ＦＡＩ−１の構築にｐＰＡＩ−１−ＲＢ Ｒの代わりに使用することができた。

ＣＶ−１シミアン細胞の単層を３７℃で成長させ、５ＶＬ−ＰＡＩ−１を注入し た。２４時間後、培地を血清を含まないダルベツコの培地（ＧＩＢＣＯ，Ｉｎｃ 、）に置換し、さらに４８時間インキュベーションを続けた。その後分泌された ＦＡＩ−１を含む上澄み培地を０．４５ミクロンのフィルター（Ｎａ　ｌ　ｇｅ 　Ｃｏ、　）を通して濾過した。Ｎ。

ｎ１ｄｅｔ　Ｐ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、Ｌ及び１、ＯＭの リン酸ナトリウム（ｐＨ７，２）緩衝液をそれぞれ０．１％（ｖ／ｖ）　、及び １０ｍＭの濃度まで加えた。安定化した培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ ｐＨ７，２）　、１３５ｍＭのＮａＣ１，７，０ｍＭのＫＣＩから成る緩衝液（ 後文では”ＰＢＳ“）を用いて１時間当たり５Ｑｍｌの流量で平衡化したコンカ ナパリアン　Ａ−セファロース４Ｂのアフィニティー　カラム（充填床容量１． ０ｍ１）に適用した。

カラムを０．　１％（ｖ　／　ｖ　）のＮｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ２Ｏを含むＰＢＳ。

２５容量、０．１％（Ｖ／Ｖ）のＮｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ２Ｏ、及び１．ＯＭのＮａ Ｃ１を含むＰＢＳ２５容量、及び最後に２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ Ｈ７，２）１０容量で連続的に洗浄した。結合ＦＡＩ−１は２０ｍＭのリン酸ナ トリウム緩衝液（ｐＨ７，２）中の０．５Ｍのアルファーメチル−Ｄ−グルコシ ド（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、）で特異的に溶離した。ＦＡＩ−１を 含む留分（上記間接的色素澱粉法においてＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｉｎｃ、から のウロキナーゼの阻害により分析して）をプールした。その後Ｎｏｎ１ｄｅｔ　 Ｐ２Ｏを０．１％　（ｖ／ｖ）の濃度まで加え、プールした溶離物１ｍｌ当たり ０．５７ｇ（Ｄグアニジン　ヒドロクロリド（Ｕ、Ｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｂ ｓ）を加えた。このようにして得た部分的精製ＰＡＩ−１を２０ｍＭのリン酸ナ トリウムから成る緩衝液（ｐＨ７，２Ｌ及び１０％（Ｖ　／　Ｖ　）のグリセロ ールに対して透析し、使用まで一８０℃にてアリコートとして保存した。

このようにして製造したＦＡＩ−１は４０μｇ／ｍｌの全タンパク質（Ｂｉｏｒ ａｄ　Ｉｎｃ、販売によるＢｒａｄｆｏｒｄの試薬により分析）、及び１２．５ ％（Ｗ／　Ｖ　）の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの染色により分析して１５ μｇ／ｍ１のＦＡＩ−１を含んでいた。ウロキナーゼ（それ自身は３Ｈ−ジイソ プロピルフルオロホスフェート（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｉ ｎｃ、からのＮＥＴ−０６５）を用いた滴定により活性５２％）に対する滴定に より、本文の記載に従って製造したＰＡｒ−１の活性は１６．６％であり、活性 ＦＡＩ−１の濃度は４８μＭであることが明らかになった。

Ｂ、突然変異誘発のためのＰＡＮ−１部位の選択ＰＡＩ−１の残基ＧＩｕ３５ｏ 及びＧｌｕｓｓ＋がｔ−ＰＡと相互作用するという仮定を試験するため、特定オ リゴヌクレオチドの突然変異誘発を使用して下表ＸＩＩに示すＰＡＩ−１の２種 類の変異株を形成した。

表Ｘｌｌ ３４６・　・３５５ 野生型ＰＡＩ−Ｉ　ＲＭＡＰＥＥＩ　ＩＭＤＰＡＩ　１　（Ｅｓｓ。−＞Ｒ）　 ＲＭＡＰＲＥＩＩＭＤＰＡＩ　１　（Ｅｘｓ＋　＞Ｒ）　ＲＭＡＰＥＲＩ　ＩＭ Ｄ変異株Ｐ　Ａ　Ｉ−Ｉ　ＣＥｓ５゜−〉Ｒ）、及びＦＡＩ−１（Ｅ３５１　＞ Ｒ）はそれぞれＧｌｕ、５゜及びＧｌｕｓｓ＋のＡｒｇへの置換を含み、負に帯 電したＧｌｕ残基を正に帯電したＡｒｇ残基に代え、ｔ　−Ｐ　Ａ　（Ｒｓ。４ −＞Ｅ）に存在する負に帯電したＧｌｕ残基との有力な相互作用を促進するため に選択的に選んだ。置換がｔ−ＰＡの残基Ａｒｇ３゜４に導入された特異的変異 と相補的であれば、Ｇｌｕｓｓｏをｔ　ＰＡ　（Ｒ３０４−＞Ｅ）変異株などと の相互作用が強化されたＦＡＩ−１を形成する他のいろいろな置換基に、本発明 の精神及び範囲から逸脱することなく置換することができた。

Ｃ，ＰＡＩ−１のオリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発第１に、メチオニル− ＦＡＩ−１を直接発現し、１方で発現ベクターからのシグナル配列及びｃＤＮＡ の３°非翻訳領域を除去するための、プラスミド　ｐＰＡＩＳＴ７と称するＦＡ Ｉ−１発現プラスミドの構築が必要であった。この達成のため、合成りＮＡリン カ−を使用してＰＡｌ−１コ一ド配列の両末端の再構築、及び成熟ＦＡＩ−１の 第１残基をコードするトリプレットの直前にＡＴＧタンパク質合成開始コドンの 導入を行った。さらにプラスミドｐＢＲ３２２へのｃＤＮＡコード領域の挿入を 容易にするため、ＰＡＩ−１ｃＤＮＡフラグメントのそれぞれ５゛及び３′末端 に、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を形成する リンカ−を設計した。

特にＡｐａＬｉ及びＰｆｌＭＩを用いてｐＰＡＩ−１−ＲＢＲを消化することに よりプラスミドｐＰＡＩＳＴ７を得た。得られたＦＡＩ−１の残基１のための２ ｂｐのコドン、及び３７９残基タンパク質の残基２−３７６のための全コード配 列を含む１１２７ｂｐフラグメントをゲル電気泳動により精製した。次に合成リ ンカ−（５°末端にて１０　ｂ　ｐ。

及び３°末端にて１３ｂｐ）を１１２７ｂｐ　ＡｐａＬＩ、及びＰｆｌＭＩ　Ｄ ＮＡ７ラグメントと連結し、ＥＣ０ＲＬ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、１ １４６ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−及びＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−消化ＤＮＡフラグメントを ゲル電気泳動により単離した。その後このフラグメントをＥｃｏＲＩ−及びＨｉ ｎｄｌＩＩ−消化ｐＢＲ３２２ｉ：クローニングした。

発現プラスミドの構築の開始のために、サブクローンをＥｃｏＲＩで消化し、直 鎖プラスミドを細菌のアルカリホスファターゼを用いて脱ホスホリル化した。そ の後ｔｒｐプロモーター、及びリポソーム結合部位を含むｐＣ５Ａ−４８からの ３６０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡフラグメント（Ｆｒａｎｋｅ、Ａ、等、Ｍｅｔ ｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１６２：６５３−６６８　（１９８８））を用いて、ニ フラグメントを連結することによりＦＡＩ−１発現プラスミドを構築した。次に 、得られたプラスミドを用い、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃ１旦ｎｉｎｇ：Δ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第１版、Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　（１９８２）に記載の要領で旦、旦旦１１の 形質転換を行った。得られた形質転換物のプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄｌｌｌを 用いた制限分析によりｔｒｐプロモーターフラグメントの存在、及び配向に関し てスクリーニングを行った。多（の形質転換物がｔｒｐプロモーターに隣接して インヒビターの直接の発現に必要な立体配置でＦＡＩ−１遺伝子を持つプラスミ ドを含むと同定された。それらのプラスミドのひとつをｐＰＡＩＳＴ７と称した 。

アミノ酸残基Ｖａ１２，４からＰｒ０ｓｖ＊までをコードするＰＡＩ−１のヌク レオチド配列を含むプラスミドｐＰＡＩＳＴ７の５ａｉｌ−ＨｉｎｄＩＩＩフラ グメントを５ａｌｌ−Ｈｉｎｄｌｌ　Ｉ消化複製型Ｍ１３ｍｐ１８（図８を参照 ）に連結した。連結ＤＮＡを旦、ｃｏｌｉ株ＴＧ−１にトランスフェクトした。

組み替えバクテリオファージにより形成された白色プラークを採取し、適した２ ９０塩基対５ａｌｌ−ＨｉｎｄｌＩＩフラグメントの存在をサザン　ハイブリッ ド形成、制限マツピング、及びＤＮＡ配列決定により確認した。

２９０塩基対Ｓａ　ｌ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉフラグメントにおける変異を ｔ−ＰＡについての上記の記載の要領で５°−ホスホリル化合成突然変異誘発オ リゴヌクレオチドブライマーを用いて導入した（図８を参照）。

これらのＦＡＩ−１変異株の構築に使用した２個の突然変異誘発プライマーの配 列は以下である： ＰＡＩ（（Ｅ３ｓ。−＞Ｒ）：５’ＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＴＣＴＴＧＧＧＧＣ３ ’ＦＡＩ−１（Ｅ３ｓ＋−＞Ｒ）：５’ＣＣＡＴＧＡＴＧＡＴＴＣＴＣＴＣＧＧ ＧＧ　３’得られたＦＡＩ−Ｉ　ＤＮＡの変異株Ｓａ　Ｉ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　 Ｉ　Ｉ７ラグメントの配列を完全に決定した。立証された変異株のＤＮＡの二重 鎖複製型を単離し、変異２９０塩基対Ｓａ　Ｉ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉフラ グメントを５ａｌｌ−ＨｉｎｄｌｌＩ消化、及び６．０％（ｗ／ｖ）の非変性ポ リアクリルアミドゲルを通した電気泳動により単離した。下記に詳細に記載する 通り、変異を含むこれらのフラグメントを使用し、問題のＦＡＩ−１変異株をコ ードするＰＡＴ−１ｃＤＮＡのバージョンを再構築した。

Ｄ、変異株ＦＡＩ−１のための発現ベクターの構築プラスミド　ｐＰＡＩ　５Ｔ ７Ｈ３（ヌクレオチド対１におけるＨｉｎｄＩＩＩ部位、及びヌクレオチド対２ １０６における５ａｉｌ部位の欠落したプラスミドｐＰＡＩＳＴ７の誘導体であ り、ＰＡＩ−１ｃＤＮＡコード配列における変異５ａｉｌのＨｉｎｄｌＩＩフラ グメントへの交換を容易にするために構築された）におけるＦＡＩ−１の変異株 を以下の要領で構築した： ＰＡＩ　１　ｃＤＮＡの中心２９０塩基対の５ａｌＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの フラグメントを、５ａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いた消化、及び１．０％（Ｗ ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動によりプラスミドｐＰＡＩＳＴ７Ｈ８から除去し た。その後ベクターＤＮＡの残留直鎖フラグメントを特定オリゴヌクレオチドの 突然変異誘発で製造した上記の２９０塩基対５ａｌＩからＨｉｎｄｌｌＩフラグ メントの変異株バージョンに連結した（図８を参照）。得られたプラスミドをｐ ＰＡＩＳＴ７Ｈ３（Ｅ８．。→Ｒ）及びｐＰＡＩＳＴ７Ｈ３（Ｅｓｓ＋→Ｒ）と 称した。

ｓｓ、０ｘｆｏｒｄ、頁１０９−１３５　（１９８５））を上記変異プラスミド を用いて形質転換し、得られた株をそれぞれｐＰＡＩｓＴ７Ｈ３［ＤＨ１］　； 　ｐＰＡＩｓＴ７Ｈ５（Ｅ３５゜→Ｒ）　［ＤＨ−１１：及びｐＰＡ　Ｉ　５Ｔ ７Ｈ３（Ｅ３５１→Ｒ）　［ＤＨ−１］と称した。旦、−色９」ユ」−株ＴＧ− １（Ｇｉｂｓｏｎ、Ｔ、、Ｔｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｍ ｂｒｉｄｇｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１，９８４））を上記変異プラスミドを用いて 形質転換し、得られた株をそれぞれｐＰＡＩＳＴ７Ｈ３［ＴＧ　１］　；Ｉ）Ｐ ＡＩＳＴ７Ｉ（Ｓ　（Ｅｓｓ、ｏ→Ｒ）［ＴＧ−１］　：及びｐＰＡＩ　５Ｔ７ Ｈ３（Ｅｓｓ＋−Ｒ）［ＴＧ　１］　と称した。

正しいフラグメントの存在を適した放射標識突然変異誘発オリゴヌクレオチドへ のハイブリッド形成、及び核酸配列決定により確認した。　ｐＰＡＩＳＴ７Ｈ８ （Ｅｓｓ。→Ｒ，）　［ＤＨ−１］　；及びｐＰＡＩＳＴ７Ｈ３（Ｅｓｓ＋＝Ｒ ）　［ＤＨ１］をＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉｏｎにてそれぞれＡＴＣＣ番号６８１５５及び６８１５６として供託した。

Ｒ３（Ｅ３５゜→Ｒ）［ＴＧ−１］、及びｐＰＡＩｓＴ７Ｈｓ　（Ｅｓｓ＋→Ｒ ）［ＴＧ−１１を、ルリアーベルタニ　ブイヨン中で３７℃にて飽和濃度まで終 夜成育した。５０ｕ　ｌの培養物を使用して、１リツトル当たり６．０ｇのＮａ ２ＨＰＯａ、３．０ｇのＫＨｚＰ０４．０．５ｇのＮａＣ＋、０．５ｇのＮｇＳ Ｏ４・７Ｈ２０，１，０ｇのＮＨ４Ｃｌ。

５．０ｇのカサミノ酸、１０．０ｇのグルコース、１０．０ｍｌのグリセロール 、１．０ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、及び２５ｍｇのアンピシリンを含む修正Ｍ９ 培地（ｐＨ７，４）５０ｍｌに接種した。２５０ｍ１のアーレンメイヤーフラス コ中、３７℃にて培養細菌を２２時間成育した。抽出細胞を以下の要領で培養物 から得た。

リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）　、及び１．０ｍＭのＥＤＴＡ中で遠心により洗 浄し、氷上の３．５ｍｌの同緩衝液中に再懸濁した。１．ｍ１当たり１０ｍｇの リソチーム０．４ｍｌを添加して２０分間、０．１ｍｌ＋７１１０％（ｖ／ｖ） Ｎｏｎ　ｉｄｅ　ｔ　Ｐ−４０を添加して１０分間、及び０．２ｍｌの５．０Ｍ 　ＮａＣ１を添加して１０分間抽出を行った。聴音器（ｓｏｎｉｆｉｅｒ）／細 胞切断器のミクロチップを５０％使用サイクル、及び設定７　（Ｂｒａｎｓｏｎ 　５ｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　Ｃ。

ｍｐａｎｙ）で使用して細胞を短く切断し、粘度を下げ、４℃にて３０分間１５ ，０００ｘｇの遠心を行った。透明な溶菌体に１０％（ｖ　／　ｖ　）までグリ セロールを加え、ＦＡＩ−１を含む抽出物を使用まで一８０℃にてアリコートと して保存した。

哺乳類細胞に発現したＰＡＩ−１に関して上記に記載した要領でウロキナーゼを 用いて２４℃にて３時間インキュベートすることにより、抽出物を活性ＦＡＩ− １に関して滴定した。野生型ＦＡＩ−１、ＰＡＩＩ（Ｅｓｓ。→Ｒ）、及びＰＡ Ｎ−１（Ｅｓｓ＋→Ｒ）の抽出物はそれぞれ８０３ｎＭ、５９３ｎＭ、及び１６ ２ｎＭの活性ＦＡＩ−１を含んでいた。

野生型、及び変異株ｔ−ＰＡと野生型、及び変異株ＦＡＩ−１の相互作用の速度 に関する速度論的測定を、０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％（ｖ／ｖ）のツイ ーン２０を含む領　１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，４）中、２４℃にて行 った。上記のｔ−ＰＡに関する間接的色素澱粉法を用いて残留酵素活性を時間の 関数として決定した。

ｔ−ＰＡに対して過剰のＦＡＩ−１の偽−１次条件下で、時間に対する残留ｔ− ＰＡ活性の直線状片対数プロットの傾きから各インヒビター濃度に関して半減期 （ｔ　ｌ／２）を決定した。見掛けの速度定数（ｋ、ａｐ＝０．６９３／ｌ＋ｚ □）をインヒビター濃度で割って速度定数、ｋ、を算出した。

６０ｕＭのｔ−ＰＡの阻害の速度を、偽−１次条件下で０．６−１００ｎ〜１の 範囲のインヒビター濃度にて研究した。ｔ−Ｐ、Ａ−ＰＡＩ−１混合物をマイク ロタイタープレートウェル中、２４℃にて種々の時間（０−３０分）予備的にイ ンキュベートし、その後Ｌｙｓ−プラスミノーゲン、スベクトロザイム　ＰＬ、 及びＤｅｓ−Ａ−フィブリノーゲンをそれぞれ最終濃度３００ｎＭ、０．４ｎＭ 及び１２．５μｇ／ｍｌまで添加した。基質の添加後、マイクロタイタープレー トを３７℃にてインキュベートし、４０５ｎｍにおける吸収を２次間追跡して残 留ｔ　−Ｐ　Ａ活性を決定した。

野生型、及び変異株ＰＡＩ−１による野生型、及び変異株ｔ−ＰＡの阻害の最高 速度定数（Ｍ−１ｓ−’）を下表ＸｌＴｌに示す。

野生型ＦＡＩ−１１ｘｌＯ’　３ｘｌＯ’　１ｘｌＯ’上記の表ＸＩＩＩに示す 通り、ＰＡＩ　１　（Ｅ３５゜→Ｒ）及びＦＡＩ−１（Ｅ３５１→Ｒ）の両方と も、野生型ＦＡＩ−１と比較してｔ−ＰＡ（Ｒｓ。４−Ｅ）との相互作用の速度 定数が増加しており、変異によりセリン　プロテアーゼ　インヒビター−抵抗性 ｔ−ＰＡ　（Ｒ３゜４→Ｅ）の阻害に関するＦＡＩ−１の能力が復活したことを 証明している。

本発明を特別な具体化を参照して詳細に説明したが、種々の変化及び修正が本発 明の精神、及び範囲から逸脱することなく可能であることが同業者には明らかで あろう。

Ｓ　謳　謳 謳　謳　謳 ヒ ＦＩＧ、４ 活性ＦＡＩ−１（ｆｍｏｔ） 活性　ＦＡＩ−１（ｆｍｏｌ） ＦＩＧ、８ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ 、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，ＤＥ、　ＤＫ 、　ＥＳ。

ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、ＭＣ，ＭＧ、　ＭＷ、　Ｎ Ｌ、　ＮＯ，ＰＬ、　ＲＯ，ＳＤ、　ＳＥ、ＳＵ ＦＩ （７２）発明者　ゴールドスミス、エリザベス・ジエイアメリカ合衆国テキサス 州７５２０９ダラス・チェロキートレイル４６２６ （７２）発明者　ゲシング、　メアリジエーン・エイチアメリカ合衆国テキサス 州７５２２９ダラス・アービンシモンズドライブ４３２０ （７２）発明者　ジエラード、ロバート・ディアメリカ合衆国テキサス用７５２ ５２ダラス・フェザ−ウッドドライブ１８６２０

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．自身と同起源のセルピン　インヒビターによる阻害に対して抵抗性であるｔ −ＰＡのチモーゲン一様変異株。
2. ２．該セルピン　インヒビターがＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２及びＰＡＩ−３から成 る群より選ばれる請求の範囲第１項記載の変異株。
3. ３．該セルピン　インヒビターがＰＡＩ−１である請求の範囲第２項記載の変異 株。
4. ４．該変異株がｔ−ＰＡ（Ｆ３０５→Ｈ）及びｔ−ＰＡ（Ｆ３０５→Ｈ．Ａ２９ ２→Ｓ）から成る群より選ばれる請求の範囲第１項記載の変異株。
5. ５．自身と同起源のセルピン　インヒビターによる阻害に対して抵抗性であるｔ −ＰＡのチモーゲン一様変異株をコードする遺伝子。
6. ６．該セルピン　インヒビターがＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２及びＰＡＩ−３から成 る群より選ばれる請求の範囲第５項記載の遺伝子。
7. ７．該セルピンがＰＡＩ−１である請求の範囲第６項記載の遺伝子。
8. ８．該変異株がｔ−ＰＡ（Ｆ３０５→Ｈ）及びｔ−ＰＡ（Ｆ３０５→Ｈ、Ａ２９ ２→Ｓ）から成る群より選ばれる請求の範囲第５項記載の遺伝子。
9. ９．プラスミドｐＳＴＥ／ｔ−ＰＡ（Ｆ３０５→Ｈ）。
10. １０．ＡＴＣＣ番号６８４２８の同定特性を有するｐＳＶＴＥ／ｔ−ＰＡ（Ｆ３ ０５→Ｈ）［ＤＨ−１］。