JPH04506897A

JPH04506897A - 修飾されたクリングルドメインを有する血栓溶解剤

Info

Publication number: JPH04506897A
Application number: JP1511225A
Authority: JP
Inventors: ハーツェンブーラー、ニコール・ティー; マロッティ、キース・アール; リーバーグ、エドオード・エフ; ヘルヘイエン、ヨハン・ハー
Original assignee: ネーデルランセ　オルハニサチエ　フォール　トゥーヘパスト―ナツールウェーテンシャッペ　ルック　オンデルズク　テーエヌオー
Priority date: 1988-10-27
Filing date: 1989-10-04
Publication date: 1992-12-03
Also published as: WO1990004635A1; AU4502589A; DE68922859T2; DE68922859D1; EP0440709A1; EP0440709B1; US5275946A; ATE123057T1; CA2001343A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は修飾されたクリングルドメインを有する血栓溶解剤の類似体に関する。

より詳しくは、本発明はクリングル１およびクリングル２ドメインにおいて修飾が生じているＴＰＡ型化合物に関する。本発明はまた、ウロキナーゼ型化合物のクリングルドメインにおいてひとつまたはそれ以上の変更を有する類似体にも関する。本発明の化合物はＴＰＡおよびウロキナーゼと同様な特別の用途を有しており薬学的に有用である。

発明の背景プラスミノーゲン活性化因子（ＰＡ）は繊維素溶解プロセスにおいて中心的役割を演じることが知られている。その作用機序には不活性な酵素前駆体であるプラスミノ−ケンを活性なセリンプロテアーゼであるプラスミンに変換すること、そして今度はそのプラスミンが血塊（ｃｌｏｔ）のフィブリンネットワークを分解することが含まれている。二つの型の生理学的に重要なＰＡが知られている。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）および組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）である。ＴＰＡはフィブリンに対してｕＰＡより高い親和性および血塊自身に対して特異性を有しており、その作用においてｕＰＡよりもはるかに特異的であることが見出されている。

組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）は、血管内皮細胞により生産される、５２７個のアミノ酸残基からなる、グリコジル化されたｓ６．ｎＯダルトンの血清プロテアーゼである。これは、フィブロネクチン　フィンガードメイン（ｆｌｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　ｆｉｎｇｅｒ　ｄｏｍａｉｎ）（Ｆｔ）　、グロースファクタードメイン（ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｄｏＩＩｌａｉｎ）（Ｇｔ）　、クリングル１ドメイン（ｋｒｉｎｇ！ｅ　１）　（Ｋ、　１　）およびクリングル２ドメイン（Ｋｔ２）ならびに活性部位（Ａｔ）の五つの主要ドメインからなる一末鎖ポリペプチドである。ＴＰＡがフィブリンと結合し、その上で活性化されるということもまた知られている。プラスミンにより消化されると一本鎖のＴＰＡはひとつの部位（＾ｒｇ　２７５−１ｉｅ　２７Ｂ）で開裂し、ジスルフィド架橋で結合したライト（Ｌｉｇｈｔ）鎖およびヘビー（Ｈｅａｖｙ）鎖の二本鎖の形になる。カルボキシ末端からなるライト鎖は触媒部位を含有している。また、他のセリンプロテアーゼとのたくさんの相同性を有し、フィブリンとは結合しない。アミノ末端からなるヘビー鎖はいくつかの他のセリン蛋白との相同性を有する複ドメイン体であり、フィンガードメイン、グロースファクタードメインおよび二つのクリングルドメインを含有している。それらのクリングルは、三重のジスルフィド構造である。ヘビー鎖はフィブリンと結合することが見出されている。ＴＰＡは肝臓によってヘビー鎖を通じて取り除かれる。

我々の最近の成果から、フィブリンのＴＰＡとの結合は二つのドメインに局在することがわかった。フィンガードメインは高親和性のフィブリン結合部位を含有し、クリングル２ドメインは低親和性のフィブリン結合部位を含有する。後者の部位の親和性はプラスミノーゲンによって増加する。しかしながら、フィブリンおよびフィブリノーゲン断片による刺激は主にクリングル２ドメインに局在する。他のグループ（ファン　ゾーンネフエルトおよびバーンネコーエーク、セーエルバ−（ｖａｎＺｏｎｎｅｖｅｌｄ　ａｎｄ　Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ、ＣＬＢ）、アムステルダム）によってえられた結果により、Ｋ１が直接ライト鎖と連結するときにはフィブリンによる刺激は起こらないことが示唆されている。これらの結果により、フィブリン刺激の活性におけるその役割にとって、クリングル２の位置（ライト鎖と隣接している）およびその構造が必須であるという結論が導かれる。我々がＴＰＡのに２のアミノ酸配列をＴＰＡのに１、ｕＰＡクリングルおよび五つのプラスミノーゲンクリングルと比較するとき、ＴＰＡのに２に独特のわずかに限られた数のアミノ酸が存在する。この点において、とくにこのクリングルの内側のループ中にある　２５０番の付近の一群のアミノ酸が興味深い。

ウロキナーゼは初め尿から単離された。それから、培養細胞たとえば腎細胞株から単離され、そして最近は大腸菌または培養ホ乳類細胞におけるｃＤＮＡの発現によってえられた。ウロキナーゼは大腸菌において発現されるとき、再生（ｒｅｎａｔｕｒｅ）されなくてはならない。

ウロキナーゼは５５．０００ダルトンの分子量を有する、４１１個のアミノ酸残基の一末鎖ポリペプチドである。この一本鎖の形は、ブローウロキナーゼ（ｐｒｏ−ｕ−ＰＡ）または−末鎖ウロキナーゼ（ｓｃｕ−ＰＡ）とも呼ばれるが、活性が低い。しかしたとえばプラスミンによって、二本鎖（ｔｕｃ−ＰＡ）の形に変換されうる。その二本鎖は一つのジスルフィド架橋により互いに結合したままである。ｕ−Ｐ＾においては、グロースファクタードメイン（Ｇ　）、クリＵングルドメイン（Ｋｕ）およびプロテアーゼドメイン（Ｐ　）の三つのドメインが識別されうる。

Ｇ　ドメインは細胞のレセプターと相互作用しうる。

Ｐ　ドメインは通常セリンプロテアーゼにおいて見られる活性部位残基セリン、ヒスチジンおよびアスパラギンを含有する。Ｋ　ドメインの機能は不明である。

相同なりリンゲルドメインは、プラスミノーゲン、第Ｘｌｌ因子、プロトロンビンおよびリポ蛋白においても存在する。ｔ−ＰＡおよびプラスミノーゲンの双方において、ひとつまたはそれ以上のクリングルドメインがフィブリン結合に必要とされる。このことはｕ−ＰＡにおいては見られない。ｔ−ｐ＾と同様に、ｕ− ＰＡは不活性な酵素前駆体であるプラスミノーゲンの活性なプロテアーゼであるプラスミノーゲンへの変換を触媒する。ｔ−ＰＡのばあいにおいて、この変換はフィブリンにより大いに増進（ｅｎｈａｎｃｅ）される。ところが、ｕ−ＰＡではそのようなことはない。それにもかかわらず、ｕ−ＰＡに対するフィブリンの特異性が観察されている。この観察は、ｕ−ＰＡが選択的に、フィブリンに結合されたプラスミノーゲンを活性化すると仮定することによって説明される。

ｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡのフィブリン特異性は異なる機序に基づくので、単一のハイブリッド分子において双方の分子の望ましい特性を結合することは理論的には可能であろう。そのようなハイブリッドが、ｕ−ＰＡの長い断片とｔ−ＰＡまたはプラスミノーゲンのフィブリン結合ドメインとを含有して構築された。結果は期待はずれだった。いくつかのハイブリッドではいくらかフィブリン親和性が存在するが、ｔ−ＰＡ自身の親和性とは比較にならない。

必要とされているのは、フィブリン血塊に対するより大きな親和性および長い半減期を有する新規なｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡ類似体である。

開示の情報１９８７年７月２日の公開の特許出願第ＰＣＴ　ＶＯ８７１０３９０８号中には活性部位すなわちプロテアーゼドメインならびにフィンガードメイン、グロースファクタードメイン、クリングル１ドメインおよびクリングル２ドメインより選ばれるひとつまたはそれ以上のドメインからなり、ドメイン領域がその順序、発生（ｃｉｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）またはその双方に関してその天然の配列から変更されており、蛋白の全体の分子量が９０，０００ダルトンをこえず、どのドメインも二回より多く現われないことを条件とする、ＴＰＡ類似体が開示されている。本発明の化合物は、クリングル　１ドメインおよびクリングルｔ２ドメインが修飾さすれていること、ＴＰＡにおいて見られるアミノ酸配列とは異なる配列を有することにおいて、ＶＯ８７１０３９０８に記載の化合物とは異なっている。さらに、ＰＣＴ　ＶＯ８７１０３９０６にはウロキナーゼ類似体は述べられていない。

発明の概要本発明はひとつまたはそれ以上の修飾されたクリングルドメインを有する血栓溶解剤を提供する。

本発明はまた、以下に示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する：Ｐ２Ｏ３：５“ＴＡＣＧＴＣＴＴＴＡＡＧＡＡＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＡＣＧＴＧＧＧＡＧ　３“Ｐ２Ｏ３：５°　ＧＣＡＧＡＡＣＴＣＣＣＡＣＧＴＣＡＧＣＣＴＧＣＧＧＴＴＣＴＴ　３’Ｐ１．０８：５°　ＧＡＴＣＣＧＴＴＡＡＣＧＡＣＴＧＣＴＡＣ１’ＴＴＧＧＣＡＡＴＧＧＴＴＣＡＧＣＣ−ＴＡＣＣＧＴＧ　３’ ！’ｆ０９　：　５’　ＧＣＡＣＧＣＡＣＡＧＣＣＴＣＡＣＣＧＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＴＧＣＣＴＴ−ＣＣＧＴＧＧＡＡＴ　３゜Ｐｌ、１０：５°　ＴＣＣＡＴＧＡＴＣＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＡＧＧＴＴＴＡＣＡＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡ−ＴＣＣＴＡＧＴＧＣＴＣ３“ ＰＩＬＬ：５’　＾ＧＧＣＡＣＴＧＧＧＡＣＴＣＧＧＣＡＡＡＣＡＴＡＡＴＴＡＣＴＧＣＣＧＧＡＡＴ−ＣＣＴ　３“ ｐＨ２：　５’　ＧＡＴＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＡＧＣＣＡＴＧＧＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＴＣ；ＡＡＧＧＣ−ＡＧＧＴ＾＾ＧＴ　３゜ＰＩｌ４　：　５’　ＧＣＧＴＧＣＣＡＣＧＧＴＡＧＧＣＴＧＡＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡＧＴＡＧＣＡＧ−ＴＣＧＴＴＡＡＣ’Ｇ　３゜ＰＩｌ５　：　５’　ＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧＧＡＡＧＧＣＡＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＧＧ−ＴＧＡＧＧＣＴＧＴ　３’ Ｆｉｌｅ　＋　５’　ＡＧＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＴＡＧＧＡＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧＴＡＡＡＣＣＴＴ−ＧＣＣＴＡＴＣＡＧＧＡＴ　３゜ＰＩｌ７　：　５’　ＣＧＣＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣＧＧＣＡＧＴＡＡＴＴＡＴＧＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴ−ＣＣＣ３’ ＰＩｌ、８：５°　ＧＡＧＣＴＧＴＡＣＴＴＡＣＣＴＧＣＣＴＴＣＡＧＣＡＣＧＴＧＧＣＡＣＣＡＴＧＧ−ＣＴＴＧＧＣＡＴ　３゜Ｐ１２０：５°　ＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＧＴＡＣＴＧＴＧＡＴＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＣＧＣＡＡＣＣ−ＧＣ＾　３“ Ｐ１２１　：　５’　ＴＧＣＧＧＣＣＧＧＡＧＡＴＡＣＡＧＣＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＴＴＣＧＣＡＴＣＡ＾−ＡＧＧＡＧＧＴ＾　３′ ＰＬ２２：５“　ＧＣＣＧＣＡＴＧＣＧＧＴＴＧＣＧＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＣＡＴＣＡＣＡＧＴＡＣＴ−ＣＴ　３°およびＰｌ、２３：５°ＡＧＣＴＴＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＧＣＧＡＡＡＣＴＧＡＧＧＣＴＧＧＣＴＧＴ＾−ＴＣＴＣＣＧ　３’ 本発明はさらにクリングル、ドメインがつぎに述べるように修飾されたＴＰＡ類似体化合物を提供する：クリングル１ドメインにおいて１６０から１６５の位置のアミノ酸がクリングルｔ２ドメインの２４８から２５３の位置に見られるアミノ酸によって置き換えられている；クリングル　２ドメインにおいて２４８から２５３の位置のアミノ酸がクリングル、１ドメインの１６０から１６５の位置に見られるアミノ酸に置き換えられている。さらに詳しくは、クリングル、１ドメインは、１６０から１６５の位置がそれぞれアスパラギンＮ、アルギニン（Ｒ）、アルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｌ）、スレオニン（１）、トリプトファン（ロ）で置換されることによって修飾されている。さらに詳しくはクリングル　２ドメインは、２４８から２５３の位置がそれぞれアラニン囚、グリシン（６）、リジン（Ｋ）、チロシン（ト）、セリン（ＳＬセリンＳ）で置換されることによって修飾されている。

このように、通常クリングル、１ドメイン中１６０から１６５の位置にあるアミノ酸すなわちＡ、ＧＳＫ、ＹＳＳ。

ＳはＮ％Ｒ，Ｒ，Ｌ、ＴＳＷによって置き換えられており、通常クリングル、２ドメイン中２４８から２５３の位置にあるアミノ酸すなわちＮ、Ｒ，Ｒ，Ｌ、Ｔ、、Ｗは、ＡｌＧ、に、Ｙ、Ｓ、Ｓで置き換えられている。以下、前記のように修飾されたクリングル１ドメインおよびクリングルｔ２ドメインをそれぞれ、自然に発生するドメインＫ　１およびＫ　２と区別して、ｋ　１およびに、　２と称する。

もうひとつの本発明の具体化物は、活性はまたはプロテアーゼ部位穴ならびにフィンガードメイン（Ｆ）、グロースフアクタ−ドメイン（Ｇ、　）　、修飾されたクリングル１ドメイン（ｋ、　１．）および修飾されたクリングル２ドメイン（ｋ、　２）から選ばれるひとつまたはそれ以上のドメインからなり、ドメイン領域がその順序、発生またはその双方に関してその天然の配列から変更されており、どのドメインも二回より多くは現われないことを条件とする、ＴＰＡ類似体に関する。天然の配列とは、ＦＧＫＩＫ２＾として知られる天然のまたは自然に発生するＴＰＡに対して同定されるドメインの関係を意味する。

本発明はまた、増加したフィブリン結合および／またはフィブリンまたは他の特性との組み合せによってよりよい刺激を示す、天然のｕ−ＰＡよりもよい血栓溶解剤であるヒトｕ−ＰＡ類似体をも提供する。本発明は、クリングル　が、ｕ− ＰＡに含まれる１１８〜１２３の位置のアミノ酸残基をｔ−ＰＡのＫｌ２に含まれる２４８〜２５３の位置にみられるアミノ酸と置き換えることにより修飾されたｕ−ＰＡのクリングル領域に焦点を当てたものである。さらに詳しくは、Ｋ　はグリシン（２）、ロイシン（Ｌ）、リジン［Ｋｌ、プロリン側１０イシン（Ｌ）およびバリンＭをそれぞれアスパラギン（へ））、アルギニン沢）、アルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｌ）、スレオニン（１）およびトリプトファン（ロ）で置き換えることにより修飾される。

本発明は、つぎの（１）天然のＴＰＡよりも半減期が長い、（２）フィブリン血塊に対する親和性が高い、および（３）プラスミノーゲン活性化因子阻害剤＃１のような内因性の阻害剤に対する結合性が低いかまたは結合しない、という特性の１つまたはそれ以上を示すということにおいて天然のＴＰＡよりも良好な血栓溶解剤であるヒトＴＰＡ類似体の開発について記載したものである。

本発明は比較的保存されたアミノ酸配列を有するｔ−ＰＡの両方のクリングル構造に焦点を当てたものである。

Ｋ　２だけがＴＰＡの効果がフィブリンにより増進された活性を有するのに重要であるようである。クリングル、１とクリングル、２との間の最も長い非保存配列の範囲は６個のアミノ酸である。この範囲がＫ　２のに、　１に対するフィブリン結合親和性に影響しうると考えられている。それゆえ、この領域はクリングル、１からクリングル　２へおよびその逆に転換される。これを達成するために、クリングル、の同構造は、目的とする変更部を含有するオリゴヌクレオチドから再構成されねばならない。

修飾されたクリングル、構造は固相ホスホラミシトトリエステルカップリング法を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチドの断片から、酵素的に組み立てられる。オリゴヌクレオチド断片を酵素的に組み立てたのち、各クリングル、構造はそれぞれクローニングされ、ジデオキシシーフェンス反応を用いて首尾よく配列決定される。

本発明の（修飾されたクリングル、を作製するのに用いらる）化合物を製するための重要な出発物資は、ここで参考として記載されているが、１９８７年７月２日に公開された特許出願第ＰＣＴ　ｖｏ　８７１０３９０ｆｉ号中に開示されている。

本発明では、フィブリン結合特性を高めるが、分子の構造をあまり変化させるものではないｕ−ＰＡのＫＵ　ドメインにおける小さな変更が記載されている。このようなＵ−ＰＡ分子は自然に発生するｔ−ＰＡやｕ−ＰＡのいずれよりも血栓治療に良好である可能性があり、より副作用の少ない低投与量（および安価な治療）を可能にしうるちのである。

発明の詳細な説明ここで用いられるように、ｔ−ｐ＾のドメインは下に記した文字（ｓｕｂｓｃｒｉｐｔ）ｔて示される。ｕ−ＰＡのドメインは下に記した文字Ｕて示される。

本発明の化合物の作成のための重要な出発物資は、前記のように特許出願第ＰＣＴ　ＷＯ８７１０３９０Ｂ号に記載されている。これらの重要な出発物資は、フィンガー、グロースファクター、クリングル１、クリングル２およびプロテアーゼもしくは活性部位のドメインとしてここでそれぞれＦ　％　Ｇ、Ｋｌ、Ｋ　２および＾、と表記したＴＰＡのドメイン間に、独特のエンドヌクレアーゼ制限部位を有した２つのプロトタイプの遺伝子である。２つのプロトタイプ遺伝子におけるクリングル１　（Ｋ、　１）およびクリングル２　（Ｋｌ２）のドメインが、ＴＰＡにみられるような天然アミノ酸配列を与えるヌクレオチド配列を有していることは注目すべきである。これらの２つのプロトタイプ遺伝子は、ブダペスト条約にしたがって寄託されている。宿主微生物は、ｐＴＰＡ−Ｂｌ、２，３．４（ａ）およびｐＴＰＡ−Ｂｌ、２．３．４と表記され、それぞれ図（ｃｈａｒｔ）　１および図２に示されたプラスミドを含有する大腸菌株である。寄託はアメリカ合衆国イリノイ州、ペオリア（Ｐｅｏｒｉａ。

１１１ｉｎｏｉｓ、ＵＳＡ）の北部リサーチセンター（ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ）に行なった。ｐｒｐ＾−Ｂｌ、２，３゜４（ａ）は１９８６年８月２９日に寄託され、寄託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１０８をえた。ｐＴＰＡ−ＢＬ、２，３．４は１９８６年１１月２８日に寄託され、寄託番号ＩＪｌ？ＲＬ　Ｂ−１８１４２をえた。

本発明化合物の製造のための出発物質は、固相ホスホラミシト　トリエステルカップリング法を用いて化学的に合成されたオリゴヌクレオチド断片から酵素的に組み立てられた、修飾されたクリングル、構造のためのＤＮＡ部分である。オリゴヌクレオチド断片を酵素的に組み立てられたのち、各クリングル、構造はそれぞれクローニングされ、ジデオキシシーフェンス反応を用いて配列決定された。

修飾されたクリングル１　（ｋ、　ｌ）ドメイン（ブロック３゛）のＤＮＡ配列を図３に示す。ここでは、修飾されたクリングル　１および天然のクリングルｔ１のＤＮＡ配列間の差異が下線で記されている。修飾されたクリングル２ドメイン（ｋ、　２）　（ブロック４°）のＤＮＡ配列を図４に示す。クリングル、２の２４８から２５３の位置のアミノ酸をコードしているＤＮＡを修飾したことに加えて、グアノシン（６）およびシチジン（０の長い範囲が削除された。それぞれのヌクレオチドの変更はアステリスク（★）で示した。配列の断続の下線を付した部分はクローニングの目的のための配列の３°−末端でのリンカ−示す。

修飾されたクリングルドメインを製するのに用いられる物質および酵素はづきのようにしてえられる。オリゴヌクレオチド合成の試薬は、パーティツク　アンド　ジャクソン（Ｂｕｒｄｌｃｋ　ａｎｄ　Ｊａｃｋｓｏｎ）から入手するアセトニトリルおよびメタノール（ＨＰＬＣグレード）以外は、すべてアプライド　バイオシステムズ（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（ＡＢＣ）から入手する。アセトニトリルは水素化カルシウム上を還流させることによって乾燥し、蒸留する。アクリルアミド、ビス−アクリルアミド、ブロモフェノールブルー、キシレンシアツールおよびＴＥＭＥＤ　（テトラメチレンジアミン）はいずれもバイオラド（Ｂｌｏｒａｄ）より購入する。尿素はベセスダ　リサーチ　ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅＳｒＣｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製である。シンザイム、グルコースおよびアンピシリンはシグマ　（Ｓｉｇｍａ）より入手する。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＴ４ＯＮ＾リガーゼはすべての制限酵素と同様、ニュー　イングランド　バイオラブダ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）より購入する。）ｉＮアーゼＡはファルマシア（Ｐｈａｒｗａｃｌａ）製、および逆転写酵素はセイカガク　アメリカ社（ＳｅｉｋａｇａｋｕＡｍｅｒｉｃａ、　Ｉｎｃ、）製である。ｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰはファルマシアより購入する。γ　−””　ＡＴＰおよびα　−”２ＰｄＡＴＰはアマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｉ）より入手する。大腸菌ＡＧＩ応答性（ｃｏｌｌｐｅｔｅｎｔ）の細胞はストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）より入手する。寒天プレート用の抗生培地２であるレックス　ブロス（Ｌｅｎｎｏｘ　Ｂｒｏｔｈ）のためのトリプトンおよび酵母エキスはいずれもディフコ　ラブダ（Ｄｌｆｃｏ　Ｌａｂｓ）より購入する。ニトロセルロースのフィルターはシニライヒ＋−７ンド　シュエル（Ｓｃｈｌｅｔｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｅｈｕｅｌｌ）より入手する。

修飾されたクリングル１　（ｋｔｌ）およびクリングル２（ｋ、　２）の組み立てに必要な新規なオリゴヌクレオチド（ＰｌｏＢ、　Ｐｌ０７．　Ｐｌ０８〜ｐＨ２，Ｐｌｌ、４〜Ｐ１１８．　Ｐｌ、２Ｏ−Ｐｌ２３）はすべて、固相ホスホラミシト　トリエステルカップリング法をＪ［Ｔテ、ｆｆ−−１：’−フイ　３ｇ（１”−（ＡＢＩ　３８０Ｂ）　ＤＮＡシンセサイザーで合成される（ニス・エル　ビューケージ（Ｓ、Ｌ、　Ｂｅａｕｃａｇｅ）　、エム中エイチ　カルサーズ（Ｍ、Ｈ。

Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）　、テトラヘドロン　レターズ（Ｔｅｔ　ｒａｈｅｄ　ｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ）第２２巻、１８５９〜Ｌ８Ｂ２頁、Ｌ９８１年）。オリゴヌクレオチドの支持部を切断し、シンセサイザーのデプロテクションプログラムを用いて部分的に保護をはずしたのち、濃水酸化アンモニウムを用いて、５０℃ で一晩処理する。それを、前に詳細に記載したように変性条件下でポリアクリルアミド　ゲル電気泳動によって精製する（エヌー’フイ　テリオルト（Ｎ、Ｙ、　Ｔｈｅｒｌａｕｌｔ）ら、ヌクレオシド　アンド　ヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、第５巻、１５〜３２頁、１９８６年）。オリゴヌクレオチドはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの存在下でγ− ３２Ｐ　ＡＴＰで標識し、既知の標品に対して変性条件下でポリアクリルアミドゲルを泳動させることにより大きさで分類される。

ｋ、　Ｉ　ＤＮＡ（ブロック３′）は、前記のような６個のアミノ酸を変更するためにオリゴヌクレオチドＰ３２およびＰ４２をそれぞれＰｌｏＢおよびＰｌ０７で置き換えるほかは、第ＰＣＴ　ｖｏ　８７１０３９０６号中に記載サレタクリンクルｔＩＤＮ＾のために用いられるのと同じオリゴヌクレオチドを用いて作製する。修飾されたに、　１ブロツク３°は、２１単位（−ａｖｅｒ）から３３単位まで長さの異なる全部で２０のオリゴヌクレオチドからなりたっており、図４に示しただ構造を有している。ｋ、２ＤＮＡ（ブロック４“）は、４１単位から５０単位まで長さの異なる全部で１２のオリゴヌクレオチドを外用いて作製する。オリゴヌクレオチドの構造を図４に示す。オリゴヌクレオチドＰ２４からＰ３１　、Ｐ３３からＰ４１およびＰ４３はニュー　イングランド　バイオラブダより購入する。３０単位から５０単位までの長さ範囲のそのほかのオリゴヌクレオチドＰ１０Ｂ、　Ｐｌ、０７．　Ｐ１０８〜Ｐ１．１２．　Ｐ１１４〜Ｐｌｆ、、！ｌ、　Ｐｌ２（１〜Ｐ１２３はすべて、非常に良好な収率（１カップリング当り９９．０％以上）で合成される。

オリゴヌクレオチドは保護をはずされ、エヌ・ワイテリオルトらの同文献に開示された条件を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製される。それらをウォータース　セブバック（Ｗａｔｅｒｓ　５ｅｐＰａｋ）Ｃ−１，８カートリツジで脱塩する。それらの大きさおよび純度は、γ−３２Ｐ　ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼで標識し、それらを既知の標品に対してポリアクリルアミドゲル上を泳動させることにより確認する。

ｋ１〕（ブロック３゛）は図５の練られた計画にしたがって組み立てられる。フラグメントを二群に分け、連結させて目２＋、　Ｊ１２５およびに１４８　Ｌ１４Ｂをえる。精製および単離ののち、これらをアニーリングして連結させ、ブロック３°をえる。非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％）により精製し単離したのち、ブロック３゛をｐＢＲ３２２中に首尾よくクローニングし、ジデオキシ反応により配列決定する（イー・ワイ　チェノ（Ｅ、Ｙ。

Ｃｈｅｎ）、ビー・エイチ　シーバーブ（Ｐ、Ｈ，Ｓｅｅｂｕｒｇ）、ＤＮＡ第４＠、１６５〜１７０頁、１９８５年、ニー・エム　マクサム（＾、Ｍ、　Ｍａｘａａ）　、ダブリュー　ギルバート（ＬＧｌｌｂｅｒｔ）、メソッズ　イン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）　、第６５巻、４９９〜５６０頁、１９８０年）。

ｋ、２（ブロック４′）の酵素的な組み立ては図６に示すように行なわれ、Ｍ− １８２Ｎ−１８５および０−１３３　Ｐ−１３０かえられる。これらを精製単離したのち、アニーリングして連結させブロック４゛をえる。非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％）により精製し、単離したのち、ブロック４′をｐＢＲ３２２中にクローニングし前記のように配列決定する。

修飾されたクリングル、１および修飾されたクリングルｔ２のＤＮＡのクローニングにおいては、プラスミドｐＢＲ３２２／Ｂａａ旧およびＣ１ａｌ、ｐＢＲ３２２／Ｂａａ旧およびＨｔｎｄｌｌｌを調製する。環状のｐＢＲ３２２は、適当な制限酵素を用いて、用いる酵素の供給者によって説明された条件にしたがって切断する。そののち、１×Ｅ緩衝液（ＬＸＥ　ｂｕｆ’ｆ’ｅｒ）　（０，０４Ｍ　トリスアセテート、　０．００２Ｍ　ＥＤＡ）中に水平に備えた１％アガロースゲル上で、３０Ｖ　、　１晩、精製を行なう。ＤＮＡは０．５ＸＥ緩衝液中のアガロースバンドから５０Ｖ　、４時間で電気溶離し、フェノールで抽出し、さらにエタノールで沈澱させた。

オリゴヌクレオチドを酵素的に組み立てて目的とする配列としたのち、それぞれのクリングル１構造を、ＴＡＤＮ入りガーゼ、１１００ｎのプラスミドＤＮＡおよび約１００倍モル過剰のインサートＤＮＡを用いてその各々の直線プラスミドに連結させる。連結は２０Ｍｇの連結緩衝液（ｐＨ７，４の０．５Ｍトリス−塩酸、０．１Ｍ塩化マグネシウム、０．ＩＭＤＴＴ　、　ＬＯｍＭ　ＡＴＰ）中で１５℃にて一晩行なう。等モル量（０，２ｎ■ｏｆ）の遺伝子断片を標識、アニーリング、連結させ、えられる連結生成物を前に詳細に記載したように精製する（エヌ・ワイ　テリオルトらの同文献およびバイオテクニークス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）第６巻、４７０〜４７４頁、１．９８８年、ジェイ（Ｊａｙ）ら、ジャーナル　オフ　バイオロジカル　ケミストーリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ　、ｃｈｅｍ、）第２５９巻、６３１１〜６３１７頁、１９８４年）。

ストラタジーン製の大腸菌ＡＧＩ応答性細胞はプラスミド／インサート連結反応混合物の形質転換に用いる。各連結反応混合物の形質転換は、各形質転換に対して５ｎｇの反応混合ＤＮＡを用いて行なう。形質転換は氷上で３０分間行ない、４２℃の熱衝撃を４５秒与え、それから、アンピシリンを含有する寒天プレートにブレーティングする前に、３７℃のＩ、−ブロス中で１時間生長させる。方法の詳細は、マニアチスらのモレキュラー　クローニング、アラポラトリー　マニュアル、コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−（Ｍａｍｉａｔｉｓ、ｅｔａｌ、、ＭｏｌｅｃａｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、＾Ｃａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　１９８２年およびストラタジーンの製品情報にみられる。

陽性の形質転換株はすべて、クリングル、構造の構築に用いられるオリゴを用いるハイブリダイゼーション実験によって確認される。ハイブリダイゼーションのために選ばれるオリゴは２５ベース（ｂａｓｅ）よりも小さい長さであり、Ｇ／Ｃがおおよそ５０％である塩基構成を有している。

ハイブリダイゼーションおよびフィルター洗浄は、用いるオリゴヌクレオチドの長さによって異なる温度で行なう。修飾されたクリングル、１は４２℃で１２時間行ない、ｏ、ｉ　ｘｓｓｃで５０℃３０分および新鮮なＳＳＣで５５℃３０分洗浄する。用いるオリゴは２４単位で６３％のＧ／Ｃ含量を存するＰ２５である。修飾されたクリングルｔ２は、２３単位でＧ／１Ｃ含量が４３％のＰＡ８を用い、４２℃で７２時間行なう。洗浄は修飾したクリングルｔ１のばあいと同じ方法で行なう。

それを最終的には０．２　Ｘ５ＳＣで４２℃にて１回洗浄する。

これらのプロトコールの詳細はマニアチスらの同文献にみられる。陽性の形質転換体はオートラジオグラフィーにより確認される。

確認された陽性の形質転換体が、突然変異が全くない正確な配列を有することを確かめるために、修飾されたクリングル１（ｋ、１）および修飾されたクリングル２（ｋ、２）の各々の少なくとも１クローンを、ジデオキシシーフェンス反応により完全に配列決定する（アール・ビー　ワラス）　（ｌｉ、１３．ｖａｌ　１ａｃｅ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）第１６巻、２１〜２６頁、１９８１年、イー・ワイ　チェノ、ビー・エイチ　シーバーブの同文献）オートラジオグラフィーから陽性のものを、アンピリジンを含有する５　ｍｌのＬ−ブロス中３７℃で一晩生長させる。プラスミドＤＮＡをアルカリ溶解法により、これらの−晩の培養物から単離する。詳細はマニアチスらの同文献にみられる。これらの−晩の培養物各々から、３セツトの配列決定反応を行なうのに充分なりＮＡ　（約２５０ｎｇ　）を単離する。小規模調製（ｉｉｎｌ−ｐｒｅｐｓ）からのＤＮＡは、ＤＮアーゼフリーの膵臓ＲＮアーゼＡ（総容量４０μｇ中にｌＯμｇを使用）で、３７℃にて１時間処理する。ＲＮアーゼはフェノール抽出により除去し、ＤＮＡはエタノールで沈澱させた。ＤＮＡは２Ｎ水酸化ナトリウム／　２　ｍＭ　ＥＤＴＡを用いて室温で１０〜２０分間変性させる。

配列決定鋳型とのプライミングはエタノールでの沈澱中に行なう。ジデオキシ配列決定は逆転写酵素を用いて二本鎖ＤＮＡの配列決定のための標準的な方法にしたがって行なう。配列決定のためのプライマーは、ニュー　イングランド　バイオラブズから入手できるものおよび／またはブロック３゛および４°の組み立てに用いられたオリゴヌクレオチドである。

ｔ−ｐ＾のクリングルくＫｔｌ、Ｋ、２）はｕ−ＰＡのそれ（ＫＵ）に非常に似ている。それゆえ、ｔ−ＰＡのＫ　１においてなされたのと類似の変更およびそれにフィブリン結合特性を付与することがｕ−ＰＡのＫにおいて行なわれる。詳しくは、ｕ−ＰＡにおける第　１１８番目から　１２３番目までの残基、グリシン、ロイシン、リジン、プロリン、ロイシン、バ！Ｊ　ン（ＧＬＫＰＬＶ）カ、ｔ−ＰＡ１７）　Ｋ２ｆ７）類似の部位における第２４８番目から　２５３番目のアスパラキン、アルギニン、アルギニン、ロイシン、スレオニンおよびトリプトファン（ＮＲＲＬＴＷ）によって置き換えられる。このような変更は異なる方法で達成されつるが、ｕ−ＰＡをコードするＤＮＡの変更が、最も好都合な方法である。変更された蛋白は、細菌や哺乳類の発現系においてこの変更ＤＮＡを発現させることにより製することができる。ＤＮＡは、出発物質としてｕ−ＰＡをコードするＤＮＡに突然変異を起こさせるオリゴヌクレオチドを用いて、変化させることができる。Ｕ−ＰＡをコードするｃＤＮＡは記載した。少なくとも突然変異させるべきクリングル　の部分をコードするｕ−ＰＡのｃＤＮＡの断片は、１つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いてｃＤＮＡから切断され、アガロースゲル電気泳動で単離され、市販のクローニングベクターにおいてクローニングされる。えられたプラスミドは公表されているプロトコールまたは市販のキットを用いて突然変異誘発のために用いられる。そのほかには、変更ｕ−ＰＡをコードする完全な合成ｃＤＮＡが構築される。このような構築には利用可能なプロトコールにより合成されたオリゴヌクレオチドが必要である。後者の方法の利点は、ＤＮＡ配列が天然のものと異なることおよび、さらなる変更を大いに可能にする１つまたはそれ以上の独特の制限酵素認知配列からなることが可能であるということである。

Ａ、　ｔ−ＰＡ類似体の作製以下に示した特定の実施例は、実例となる修飾されたクリングル１　（ｋｔｌ）または修飾されたクリングル２（ｋ。

２）を有するＴＰＡ類似体をコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドの作製を教示するものである。図１がら７においてプラスミドおよびフラグメントを表わすために用いた取り決めは、プラスミドおよびそのフラグメントの従来の表示と同じ意味を示す。従来の環状の図とは異なった、図の単一の線状の形態は、環状および線状の両方の二本鎖ＤＮＡを表わしている。レニン配列の方向づけについては、転写のイニシェーションを、左から右へ（５′から３゛へ）起こるようにのみ表示する。アステリスク（★）はプラスミドの環状の形状を完成させるためのヌクレオチドの架橋を示す。フラグメントは、二本鎖ＤＮＡの線状部分であるためアステリスクの記載はない。エンドヌクレアーゼ制限部位は線の上方に示す。遺伝子マーカーは線の下に示す。

図１〜７で用いられる種々の記号は、ｔ−ＰＡに関してっぎのことを意味する。

Ｆ−フィンガードメインＧ−グロースファクタードメインに１−クリングル１ドメインに２−クリングル２ドメインＮ−非コード３“配列に１−修飾されたクリングル１ドメインに２−修飾されたクリングル２ドメインＡ　−活性部位Ｌ−ＴＰＡリーダー配列Ｔ　−ＴＰＡｃＤＮＡの５°領域Ｐ　−ＴＰＡｃＤＮＡの中間領域ａ　−ポリアゾニレ−ジョンシグナル配列ＡｓｐＲ−アンピシリン耐性０ｒｉ−復製のｐＢＩ？３２２第１，１ジン５ｖ４０−復製のシミアン　ウィルス　オリジンｄｈｆｒ−マウス　ジヒドロフオレート　リダクターゼマーカーＣＭＶ−サイトメガロウィルス　プロモーター実施例Ｉ　ＦＧｋｌＡプラスミドの構築プラスミド９ＴＰＡ−Ｂｒ、２．３．４Ｃ図２参照）をＨｐａｌおよびＭｓｔｌを用いて部分的に消化し、４キロベース（ｋｂ）の断片を単離する。この消化によりに２領域は除かれる。そののち、４ｋｂの断片をつなぎ合わせＦＧＫＩ＾プラスミドを生じる。ＦＧＫＩＡプラスミドをＣ１ａｌおよびＢａ１ｔ（Ｉを用いて消化しＫｌ領域が削除された３、８ｋｂの断片をえる。そこで削除されたＫｌ領域はＣ１ａ／Ｂａａ＋ＨＩ　ｋｌ断片を（Ｋｌ領域が削除された）　３．８に、ｂの断片に連結することによりＣ１ａ／Ｂａｏ＋ＨＩ　ｋｌ断片に置きかえられうる。それによって類似体ＦＧｋｌＡを生プラスミドｐＴＰ＾−〇ｌ、２．３．４をＥｃｏＲＶおよびＸｍａｌｌｌを用いて消化する。４ｋｂの断片を単離し、ブロック４°（ｐＢＲ３２２Ｂａｍ旧／Ｈｉｎｄｌｌｌ）を含有するプラスミドをＨｐａ　ＩおよびＸｓａ　Ｉ　Ｉ　１を用いて消化することによりえられた２３０　ｂｐのに２断片に連結する。えられたプラスミドはＦＧｋ２Ａ構造を含有する。

プラスミドＩ）ＴＰＡ−Ｂｌ、２，８．４をＣ１ａｌおよびＢａ１ＨＩを用いて消化し４ｋｂの断片を単離する。ブロック３′を含有するプラスミドをＣ１ａｌおよびＢａ＠旧を用いて消化し、ｋ、１を含有する２７０ｂｐの断片を単離する。そこで４ｋｂのＣ１ａｌ／Ｂａｇ旧を２７０ｂｐのＣ１ａｌ／Ｂａｍ旧断片に連結しＦＧｋｌＫＺＡを含有するプラスミドをえる。

実施例４　ｐＴＰＡ−ＩＥ−ＦＧｋｌＡの構築ｐＴＰＡＯＩＥ−ＦＧｋｌＡの構築は２ステツプ工程である。ステップ１は目的物であるＴＰＡ類似体、ＢＧ）ｌよりのポリアデニル化シグナル配列、ならびにｐｓＶｃＯＶのレプリコンおよび選択マーカーを含有するｐＴＰＡ−ＦＧｋｌＡの創作を含む。ステップ２はＣＭＶ　１．Ｅ、プロモーターの挿入を含む。以下の実施例ではＴＰＡの類似体ＦＧｋｌＡの挿入について述べるが、他の類似体（たとえば、ＦＧｋｌＫＺＡまたはＦＧｋ２Ａ）は同様の酵素および手順を用いて挿入しうる（図７参照）。

プラスミド［）ＴＰＡ−ＣＤＮＡ（ＰＣＴ／ＵＳ８Ｂ１０２６８４の７７頁、図２１に記載）をＢａ−旧およびＢｇｌｌｌを用いて切断しゲルで単離して１２０ベースベアの断片をえる。プラスミドｐｓＶｃＯＷ７（ＰＣＴ／１Ｊｓ８６１０２６８４の７８頁、図２０に記載）をＥｃｏＲＩおよびＰｖｕｌｌを用いて切断し、ゲルで単離してウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列を含有する６００ベースベアの断片をえる。ＴＰＡ類似体配列はプラスミドｐＦＧｋｌＡ　（前記実施例１）をＢｇｌｌｌおよびＢａ１ｌを用いて切断しゲルで単離して１．７キロベ一ス断片をえることによりえられる。

ｐｓＶｃＯＶ７の第２の試料をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて切断しゲルで単離してｐｓＶｃＯＶ７のレプリコンおよびマーカーを含有する５、８キロベースの断片をえる。４つの単離された断片をＴ４リガーゼを用いて連結し、プラスミドｐＴＰＡ−ＦＧｋｌＡ（８，２ｋｂ）をえ、それをＢａ５ｅ）ＩＩを用いて切断し、モしてＣＭＶ−ＩＥプロモーター（７６０ベースペア（ｂｐ））を挿入シテプラスミドｐＴＯＡ−ＩＥ−ＦＧｋｌＡを形成スル。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターはヒトＣＭＶゲノムをＰｓｔｌおよび５ａｕ３Ａて消化してえられる。

実施例５　ＣＨＯ細胞のトランスフェクションおよび培養グラハムら（Ｇｒａｈａｍ、ｅｔ　ａｔ、）によって（イントロダクション　オフ　マクロモレキュールズ　イントウ　バイアプル　アンマリアン　セルズ、アラン　アール　リス社、ニューヨーク、１９８０年、３〜２５頁（ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｒＭａｃｒｏｍｏｔｅｃｕｌｅｓ　ｔｎｔｏ　Ｖｉａｂｌｅ　Ｍａｏ＋ｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ、ＡＩａｎ　Ｒ。

Ｌｔｓｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　ｙｏｒｋ、１９８０．ｐｐ、３−２５）において）詳細に記載された細胞中へＤＮＡをトランスフェクションするためのリン酸カルシウム法を用いてジヒドロ葉酸リダクターゼ（ｄｈｒｒ）が欠失しているチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞中にプラスミドｐＴＰＡ−ＩＥ− ＦＧｋｌ＾をトランスフェクションする。用いる細胞株はコロンビア大学のエル・キャシン（Ｌ、Ｃｈａｓｌｎ）より元来入手しうる変異株ＤＸＢ−１１であり、プロシーディング　オフ　ナショナルアカデミ−オフ　サイエンス　オフ　ユナイテッドオフ　アメリカ、７７巻、４２１６〜４２２０頁（１９８０年）　（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ＾７７：４２１Ｂ−４２２０（１９８０））に充分に記載されている。前記のトランスフェクションの方法はトランスフェクションされるプラスミドを取り込む細胞がちはやｄｈｆｒ欠失ではなくプロリンを加えたダルベツコ−変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＩＩｏｄｉｆｌｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｌｌｅｄｉｕｍ）中で生育するという事実に依存する。

ｐＴＰＡ−ＩＥ−ＰＧｋｔＡでトランスフェクションされた細胞からクローンを単離する。クローンを２日間モルイヤーで生育させると　１００万の細胞に対して少なくともｌｏｎｇのＦＧｋｉＡを合成する。ｐｌＥＴＰ＾−ＦＧｋｉＡ−ｄｈｆ’ｒをともなう細胞からクローンが単離され、１００万の細胞に対して少なくとも１１００ｎのＴＰＡを合成する。ＴＰＡ類似体の発現はラジオイムノアッセイ、酵素的アッセイまたはウェスタンプロット技法により検出されつる。

以下の表１はＣ）１０細胞によるＴＰＡ類似体の生成を証明する。以下の表２にはクリングルｔ１における６個のアミノ酸をクリングル、２からの６個のアミノ酸で置き換えることによりＫｔ２に類似のｋｔｌの性質を示す。すなわち、ＦＧｋｌＡ活性が今やフィブリンの存在下で刺激される。

ＦＧｋｌ、Ａ　９２．３ＦＧｋｌＫ２Ａ　１１２．９されたフィブリノーゲン（ＣＮＢｒ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）を含む色素産生アッセイ（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ　ａｓａｙ）を用いることにより測定される。

Ｂ、　ｕ−ＰＡ類似体の作製以下に説明する特定の実施例は実例となる修飾されたクリングル　を含有するｕ −ＰＡ類似体をコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドの作製を教示する。

実施例６１、バーリンガー　マンハイム　キット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｒ＋ｎｈｅｌｓ　ｋｌｔ）お誹びプライマーとしてオリゴｄＴを用い、ｃＤＮＡを）ＩＴ１０８０および＾４３１細胞（アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション、　１．２３０１バークラウン　ドライブ、ロックビル、エムディー２０８５２　、各々受託ＡＴＣＣ＄ＣＣＬ１２１およびＡＴＣＣ雰ＣＲＬ　１５５５（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｆｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ２０８５２、ａｃｃｅｓｓｌｏｎ　ＡＴＣＣ専ＣＣＬ１２１　ａｎｄ　ＡＴＣＣＪＦＣＲＬ　ｌりり５゜ｒｅｓｐｅｃｔｉｒｅｌｙ））から単離されたポリＡ＋Ｉ？Ｎ＾より作製する。このｃＤＮＡからｕ−ＰＡをコードするｃＤＮＡを５　’　−ＡＧＣＡＧＡＴＣ−ＧＧＡＧＡＣＣＧＣＡＧ−３’　（オリゴヌクレオチド　Ｈ）および５゛ −ＴＧＧＣＣＡＧＡＧＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡ−３°（オリゴヌクレオチド　＃２　）を用いてポリメラーゼ　チェーンリアクション（ｐｏ）ｙａｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ−ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＰＣＲ）技法で増幅する。これらのオリゴヌクレオチド類はｕ−ＰＡ　ｃＤＮＡの公表された配列に由来する。

２、市販の旧ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ認識配列を含有するリンカ−をｕ−ＰＡをコードする増幅されたｃＤＮＡに連結する。えられた断片を旧ｎｄｌｌｌを用いて切断し旧ｎｄ　ｌ　Ｉ　Ｉで消化されたｐＵｃプラスミドに挿入する。えられたプラスミドｐＵＣｕ−ＰＡは突然異変誘発に関係する部位に用いられる。

３、発現プラスミドは、ρＩＪＣｕ−ＰＡ（ＰＵＣはファルマシアから入手可能である）およびｐｅＶ２　ｔ−ＰＡ　、ジェイ・エイチバーヘイジェンら、イーエムビーオー　ジャーナル、５巻、３５２５〜３５３０頁（、１９８８年）（Ｊ、Ｈ，Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ　ｅｔ　ａｔ。

ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、　Ｖｏｌ、５．　ｐｐ、３５２５−３５３０（１９８６））にすでに記載されたｔ−ＰＡ発現プラスミド、より構築される。プラスミドｐＵｃ　ｕ−ＰＡを旧ｎｄ　Ｉ　ｌ　ｌおよび５ｔｕｌを用いて切断しＵ−ＰＡをコードする配列を含有する小断片を単離する。ｔ−ＰＡシグナル配列およびウサギβ−グロブリンｐｏ　Ｉ　ｙ−Ａシグナルを下流にともなうＳＶ４０プロモーターを含有するがｔ−ｐ＾をコードする配列の大部分を欠損している、ｐｅＶ２　ｔ−ＰＡの誘導体（バーへイジエンら）プラスミド　ｐｅＶ２ブレーｔ− ＰＡ（ｐｌａｓｍｉｄ　ｐｅＶ２　ｐｒｅ−ｔ−ＰＡ）、をＢｇｌｌｌを用いて切断しヌクレアーゼを用いて平滑末端とし旧ｎｄｌｌ＋を用いて切断する。大きい断片を単離しｐＵｃ　ｕ−ＰＡよりの旧ｎｄｌｌｌ−８ｔｕｌ断片と連結する。えられたプラスミド　ｐ２Ｖ２　ｕ−ＰＡはｕ−ＰＡをコードする配列およびウサギβ−グロビン　ポリＡシグナルをともなうＳＶ４０プロモーターを含有する。

４、突然変異誘発は、マロッティ、ケーら、ジーン　アナリシス　テクニークス、６巻、６７〜７０頁、１９８９年（Ｍａｒｏｔｔｌ、　Ｋ、ｅｔ　ａｌ、Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｅｅｈｎｌｇｕｅｓ、　６：６７−７０１９８９）のプロトコールを用いてｐＵｃ　ｕ−ＰＡにおいて行なわれる。以下のオリゴヌクレオチドの１つ、５°ＴＧＧＴＧＣＴ−ＡＴＧＴＧＣＡＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＧＴＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣ−３’　（オリゴヌクレオチド３　）または５−ＧＣＡＣＧＣＴＴＧＣＣＡＣＧＴＣＡＧＧＣＴＧ−ＣＧＧＴＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＴＡＧＣＡＣＣＡ−３°（オリゴヌクレオチド４　）を突然変異誘発のために用いる。

４、もう１つの方法は、マロッティらのプロトコールを用いて２つのステップにおける手順で行ないうる。まず、υ−ＰＡに本来存在する６個のアミノ酸（ＧＬＫＰＬＶ）をコードするヌクレオチドをオリゴヌクレオチド５　’　−ＴＧＧＴＧＣＴＡＴＧ−ＴＧＣＡＧＧＴＧＣ＾＾ＧＡＧＴＧＣＡＴＧＧＴＧＣＡＴ−３’ 　（オリゴヌクレオチド＄５ｕ）ｔ　タハ、ｔ　’）　コヌ’）　レオｆド５’ −ＡＴＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＴＣＴＴＧ−ＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＴＡＧＣＡＣＣ＾−３゛（オリゴヌクレオチド　＃６　）を用いて除きそしてオリゴヌクレオチド３　または４　をＵ　ｕ用いて（ＮＲＲＬＴＷ）を挿入する。

５、突然変異の存在および二次的突然変異の非存在をべ一リンガー　マンハイム　キットを用いて配列決定することにより確認する。

６、プラスミドをＣ）１０細胞中にトランスフェクションし、クローン化され発現されたウロキナーゼ類似体をジェイ・エイチ　バーヘイジエンら、イーエムビーオー　ジャーナル、５巻、３５２５〜３５３０頁（１９８８年）の方法にしたがって単離する。

遷ニプラスミド　−４Ｈ１ｎｄ工ＩＩ　ＸｂａＩ　５ｐｈＩ　Ｃ１ａ工　ＢａｍＨ工５ｃａＩ　ＥｃｏＲＩ　ＢｇｌＩ工Ｓ（：ＪＬＩ　ＩＢｇｌＩＩＩ　ＨｐａＩ　ＩＥｃｏＲＶ　Ｉ　ＳＩ！ＩＡ工Ｉ　ＨｐａＩ　ｌ　ｊ　Ｂａ１Ｉ　Ｉ　ＡＪＬＣＩ工４．２ｂ図２Ｈ１ｎｄＸエエＸｂａＩ　５ｐｈＩ　（：１ａＩ　ＢａａｆＬＩ　ＳｅａニーａＺＩ　ＥｃｏＲ工　ＢｇｌＩＩＡａｅＩ工ｌＢｇＬ１ｍｌ　Ｈｐａ工ＩＥｃｏＲＶＩ　５ａｓｎＸｊ　ＨｐａＺＩ　ＭｇｅＸＩ　５ｐｈＸｌ　ＢａＬＩＩ　５ｃａｌｐＴＦＡ−ＢＬ、２，３．４区１１　２２４　ｌ　１’２５　ｌ　１”２６−−Ｐ３６　１□Ｆ３７　１　Ｆ３８ □ １　２３９　＋　ＩＰ４Ｌ　Ｉ　Ｆ１０７　１１互 ”　ｌ　ｐｕ６− □ｌ□１１　Ｐｌ、２３　□ ｌ　ＨＬｎｄＩＩ工Ｑ＝ム３′ Ｑ−エフエΔ　５１ ■ ２２４　Ｆ２５　Ｆ２６　Ｆ２７　Ｐ２８Ｐ３４　Ｆ３５　Ｆ３６　２３７　２３８Ｅ’２９　２３０　Ｆ３１　ＰｔＯ２Ｆ３３　Ｂ７１ｌ至２１０８　ＰｕＯ２Ｐｌｌｏ　１’１ｌｌＰＩＬＡ　ＰＬ１５　Ｆ１１６　Ｐ１１７？１１２　Ｐ１２０　！’１２１皿１Ｂａａ）Ｉ工　ＥｇｌエエＥＣｏＲエ　トーエＩＣ１ａｌ　５ｐｈｌ　ＸＭＩ工よりｇ３．、Ｘ工Ｘｂａ　ＨｐａＩ　！！ｐｈ工　ＥｃｏＲＶ　ｌ　Ｂａ−工　１１ｎａｕＳｐｈ工ＥｃｏＲ工　ＢａｕａＨ工　ＢｇｌＩよりａｎｋ（Ｉ　Ｉ　ＸｍａＩエエＥｃｏＲＩ　５ａｕ３Ａ　Ｂａ　Ｘ　５ａｕ３Ａ　ＢａＨＸ　ＢｇｌＩ工補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成３年４月２６日

Claims

【特許請求の範囲】１．以下のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド。Ｐ１０６：【配列があります】Ｐ１０７：【配列があります】Ｐ１０８：【配列があります】Ｐ１０９：【配列があります】Ｐ１１０：【配列があります】Ｐ１１１：【配列があります】Ｐ１１２：【配列があります】Ｐ１１４：【配列があります】Ｐ１１５：【配列があります】Ｐ１１６：【配列があります】Ｐ１１７：【配列があります】Ｐ１１８：【配列があります】Ｐ１２０：【配列があります】Ｐ１２１：【配列があります】Ｐ１２２：【配列があります】およびＰ１２３：【配列があります】２．活性部位（Ａ）ならびにフィンガードメイン（Ｆ）、グロースファクタードメイン（Ｇ）、修飾されたタリングル１ドメイン（ｋＴ１）および修節されたタリングル２（ｋＴ２）ドメインより選ばれるひとつまたはそれ以上のドメイン領域からなり、それらのドメイン領域は順序、発生（ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）またはその双方に関してその天然の配列から変更されており、いずれのドメイン領域も二回より多くは現われないことを条件とする、組織プラスミノーゲン活性化因子様化合物。８．分子量が９０．０００ダルトンをこえない請求項２記載の化合物。４．ドメインがアミノ末端から以下の順に配列されている群より選ばれる請求項３記載の化合物：Ｆｋ１Ａ，Ｆｋ２Ａ，ＦＧｋ２Ａ，ｋ１ｋ２Ａ，ＦＧｋ２Ａ，Ｆｋ１ｋ２ＡおよびＧｋ１ｋ２Ａ。５．ドメインがアミノ末端から以下の順に配列されている群より選ばれる請求項３記載の化合物；Ｆｋ２ｋ２Ａ，ＦＧｋ２ｋ２Ａ，ＰＧｋ１ｋ１Ａ，ＦＧｋ２ｋ１Ａ，ＦＦｋ１ｋ２ＡおよびＦＦＧｋ１ｋ２Ａ。６．請求項２記載の組織プラスミノーゲン活性化因子様化合物をコードしているヌクレオチド塩基よりなるＤＮＡ化合物。７．天然ウロキナーゼに含まれる１１８〜１２３の位置に位置するアミノ酸残基がそれぞれａｓｎ，ａｒｇ，ａｒｇ，ｌｅｕ，ｔｈｒ，ｔｒｐで置き換えられているウロキナーゼ型化合物。